Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Polymerprobe , wobei das Verfahren die Durchführung einer Flüssigchromatographie-Analyse an einer Chromatographiesäule mit einer mobilen Phase enthaltend eine Mischung aus mindestens einem Nichtlösungsmittel (Sl) und mindestens einem Lösungsmittel (S2) für die Polymerprobe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenanteil an S2 in der mobilen Phase während des Elutionsprozesses stufenweise variiert wird und die Stufen abwechselnd auf- und absteigen.

Laut IUPAC wird Chromatographie folgendermaßen definiert: „Chromatographie ist eine physikalische Trennmethode in welcher die zu trennenden Komponenten sich zwischen zwei Phasen verteilen, wobei die eine Phase stationär ist (stationäre Phase) und die andere (mobile Phase) sich in eine definierte Richtung bewegt."

Zur Flüssigchromatographie (= liquid chromatography, LC) sagt die IUPAC: „Flüssigchromatographie ist eine Trennmethode, bei der die mobile Phase eine Flüssigkeit ist. Flüssigchromatographie kann in einer Säule oder auf einer Platte durchgeführt werden." Zur Flüssigchromatographie zählen Trennmethoden wie SEC (size exclusion chromatography) , HPLC (high pressure liquid chromatography) und IC (Ionenchromatographie) .

Die Flüssigchromatographie kann noch einmal anhand der Zusammensetzung der mobilen Phase unterteilt werden in isokratische Analyse und Gradientenanalyse.

Bei der isokratischen Analyse bleibt die Zusammensetzung der mobilen Phase über den gesamten Elutionsprozess konstant, wohingegen bei der Gradientenanalyse die Zusammensetzung kontinuierlich oder stufenweise variiert wird.

Polymere sind Makromoleküle die aus Monomeren aufgebaut sind. Durch den sequentiellen Aufbau bzw. die einzelnen Wiederholeinheiten und die entsprechende Reaktionsführung entstehen so Makromoleküle, die in Bezug auf verschiedene Stoffgroßen Verteilungen aufweisen. Je nach chemischer Zusammensetzung können Verteilungen bezüglich der chemischen Funktionalität, der molaren Masse oder in der Struktur auftreten. Die Polydispersität gibt zum Beispiel an, wie eng oder breit die Molmassenverteilung ausfällt.

Da Polymere, insbesondere Copolymere, modifizierte Polymere oder Polymermischungen industriell eine große Bedeutung haben, ist eine effiziente Trennmethode aufgrund der chemischen Struktur von höchstem Interesse. Bisherige Methoden liefern häufig nur Durchschnittswerte (z.B. Größenausschlusschromatographie, SEC) , aus diesem Grund wird gerade an der Polymer-HPLC basierend auf einer Gradientenelution intensiv geforscht.

Aus dem Stand der Technik sind HPLC-Analyseverfahren für Polymere mittels Gradientenanalyse bekannt. Insbesondere W.J. Staal (Dissertation, Universität Eindhoven, 1996) liefert einen guten Überblick über die Entstehung und Entwicklung der Gradientenelutionschromatographie (GPEC) . Eine weitere Übersicht ist in „Gradient HPLC of Copolymers and Chromatographie Cross-Fractionation" von Gottfried Glöckner (Springer Verlag, 1991) zu finden.

EP3170836A1 offenbart eine RP-HPLC (reverse phase) Analysemethode mit einem Stufengradienten, die allerdings für komplexe Polypeptidmischungen wie Glatirameracetat oder ähnliche Mischungen beschrieben wird. Hier wird eine stufenweise Veränderung des Lösungsmittel -

/Nichtlösungsmittelgemisches über die Zeit eingesetzt. In einer besonderen Ausführungsform wird das weniger polare Lösungsmittel alle 4 bis 6 Minuten um 2-4 Vol.-% erhöht. Das Profil gleicht hier also einer Treppenfunktion.

Kajdan et al . (J. Chromatogr . A 1189 (2008) 183-195) offenbaren eine zweidimensionale Gradientenmethode mit einem zackenförmigen Gradienten („spike" gradient) zur Analyse von Polypeptiden. Bei dieser Methode wird die Zusammensetzung der mobilen Phase für eine definierte Zeit beibehalten, bevor wieder die Ursprungszusammensetzung (100% mobile Phase A) hergestellt wird. Dieser Gradient wird jedoch zum Kationenaustausch in der ersten Dimension eingesetzt, wohingegen bei der RP-LC (reversed-phase LC) in der zweiten Dimension ein gewöhnlicher Lineargradient angewendet wird.

Spranger et al . (Environ. Sei. Technol . 2017, 51, 5061-5070) offenbaren ein zweidimensionales Analyseverfahren für atmosphärische HULIS (humic-like substances) , dass SEC (size- exclusion chromatography) in der einen Dimension und RP-HPLC in der anderen Dimension kombiniert. Für die RP-HPLC wird ein neuartiger zackenförmiger Gradient („spike" gradient) angewendet, bei dem der Anteil an organischem Lösungsmittel an der mobilen Phase regelmäßig ansteigt, abfällt und konstant bleibt .

Der Stand der Technik weist jedoch folgende Nachteile auf:

- weiterhin ungenügende Auftrennung von Polymeren gerade in

Bezug auf die Oligomerenauflösung

lange Elutionsdauer

- Verfahren nicht auf Polymere angewendet Es bestand somit der Bedarf, ein Verfahren zur Analyse eines Polymers bzw. einer Polymermischung zur Verfügung zu stellen, das diese Nachteile nicht aufweist.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Analyse einer Polymerprobe, wobei das Verfahren die Durchführung einer Flüssigchromatographie-Analyse an einer Chromatographiesäule mit einer mobilen Phase enthaltend eine Mischung aus mindestens einem Nichtlösungsmittel (Sl) und mindestens einem Lösungsmittel (S2) für die Polymerprobe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenanteil an S2 in der mobilen Phase während des Elutionsprozesses stufenweise variiert wird und die Stufen abwechselnd auf- und absteigen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass ein Gradient mit abwechselnd auf- und absteigenden Stufen, ein sogenannter „Sägezahngradient", eine verbesserte Trennwirkung bei Polymeren und Polymermischungen bewirkt und auch hochmolekulare Polymere gut aufgetrennt werden können.

Figuren :

Figuren 1A-C zeigen den schematischen Aufbau eines 2- dimensionalen Stufengradienten („Sägezahngradient" ) in

Trapezform (1A), in Zickzackform (1B) und in Säulenform (IC). Figur 2A zeigt ein Chromatogramm von PVC gemessen mit einem Lineargradienten, Figur 2B zeigt ein Chromatogramm von PVC gemessen mit einem Stufengradienten, Figur 2C zeigt ein Chromatogramm von PVC gemessen mit einem Sägezahngradienten in Trapezform (vgl. Beispiel 1).

Figur 3A zeigt ein Chromatogramm von PMMA gemessen mit einem Lineargradienten, Figur 3B zeigt ein Chromatogramm von PMMA gemessen mit einem Sägezahngradienten in Trapezform (vgl. Beispiel 3 ) .

Figur 4A zeigt ein Chromatogramm von PPG gemessen mit einem Lineargradienten, Figur 4B zeigt ein Chromatogramm von PPG gemessen mit einem Sägezahngradienten in Trapezform (vgl. Beispiel 3 ) .

Figur 5A zeigt ein Chromatogramm von PDMS gemessen mit einem Lineargradienten, Figur 5B zeigt ein Chromatogramm von PDMS gemessen mit einem Sägezahngradienten in Trapezform (vgl. Beispiel 3 ) .

Figur 6A zeigt ein Chromatogramm von PMMA 690.000 gemessen als 2-dimensionaler Sägezahngradient in Trapezform, Figur 6B zeigt ein Chromatogramm von PMMA 690.000 gemessen als 3 -dimensionaler Sägezahngradient in Trapezform (vgl. Beispiel 4).

Figur 7 zeigt ein Chromatogramm einer Mischung von PDMS, PMMA und PPG ähnlicher mittlerer molarer Masse gemessen mit Sägezahngradient in Trapezform (vgl. Beispiel 5).

Def initionen :

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse einer Polymerprobe, wobei das Verfahren die Durchführung einer Flüssigchromatographie-Analyse an einer Chromatographiesäule mit einer mobilen Phase enthaltend eine Mischung aus mindestens einem Nichtlösungsmittel (Sl) und mindestens einem Lösungsmittel (S2) für die Polymerprobe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenanteil an S2 in der mobilen Phase während des Elutionsprozesses stufenweise variiert wird und die Stufen abwechselnd auf- und absteigen.

Eine Polymerprobe im Sinne der vorliegenden Erfindung kann ein Polymer oder eine Polymermischung sein.

Unter einem Polymer im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein chemischer Stoff zu verstehen, der aus konstitutionellen Repetiereinheiten besteht und eine mittlere molare Masse in einem Bereich von einigen Tausend bis zu mehreren Millionen g/mol aufweist, dies umfasst sowohl Homopolymere als auch Copolymere. Beispiele für solche Polymere sind organische synthetische Polymere wie Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylacetat, Polycarbonat, Poly (meth) crylate, Polystyrol, Polyacrylnitril, Polyvinylidenchlorid, Polyvinylfluorid, Polyvinylidenfluorid, Polyvinylidencyanid, Polybutadien, Polyisopren, Polyether, Polyester, Polyamid, Polyimid, Polysiloxane, Polysilane, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Polyethylenglykol sowie deren Derivate und Copolymere, und natürliche Polymere wie Cellulose, Stärke, Casein und natürliches Gummi, sowie halbsynthetische hochmolekulare Verbindungen wie Cellulosederivate, z. B. Methylcellulose, Hydroxymethylcellulose und Carboxymethylcellulose . Eine Polymermischung enthält vorzugsweise mindestens zwei Polymere dieser Gruppe.

Unter Poly (meth) acrylaten im Sinne der vorliegenden Erfindung sind sowohl Polyacrylate und Polymethacrylate als auch Polyalkylacrylate und Polyalkylmethacrylate zu verstehen, wobei Alkyl bevorzugt ein linearer oder verzweigter Ci-C ₂ o- Kohlenwasserstoffrest ist. Beispiele für Poly (meth) acrylate sind Polymethyl (meth) acrylate , Polyethyl (meth) acrylate ,

Polybutyl (meth) acrylate, Polyisobutyl (meth) acrylate .

Unter Polysiloxanen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zu verstehen

( Si0 ₄ / ₂ ) _a (R ^x Si0 _{3 /2} ) _b (R ^x ₂ Si0 _{2 /2} ) _c ( R ^x ₃ S i0 _1/2 ) _d (I) , wobei R ^x unabhängig voneinander Wasserstoff, unverzweigter, verzweigter, acyclischer oder cyclischer, gesättigter oder einfach oder mehrfach ungesättigter C _1- C ₂₀ - Kohlenwasserstoffrest , Hydroxyrest, Vinylrest, Alkoxyrest, Aminogruppe, Halogen oder Silyloxyrest der allgemeinen Formel (II )

(Si0 _4/2 ) _e (R ^y Si0 ₃ / ₂ ) _f (R ^y ₂ Si0 ₂ /a) _g (R ^y ₃ Si0i/ ₂ ) _h (II) , in der R ^y unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, unverzweigter, verzweigter, linearer, acyclischer oder cyclischer, gesättigter oder mehrfach gesättigter Ci-C ₂₀ - Kohlenwasserstoffrest bedeuten, wobei einzelne Kohlenstoffatome durch Sauerstoff, Halogen, Stickstoff oder Schwefel ersetzt sein können,

bedeuten, und a, b, c , d, e, f, g und h j eweils unabhängig voneinander ganzzahlige Werte im Bereich von 0 bis 100.000 bedeuten, wobei die Summe aus a, b, c, und d bzw. e, f, g und h jeweils mindestens den Wert 1 annimmt. Bevorzugte Reste R ^x bzw. R ^y sind die Reste Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, Phenyl und Chlor, wobei Methyl am meisten bevorzugt ist. Beispiele für Polysiloxane sind Polydimethylsiloxan und Aminopolydimethylsiloxan .

Die Polymere werden üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 1.000-2.000.000 g/ ol eingesetzt. Polyvinylchlorid wird üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 20.000-1.000.000 g/mol eingesetzt, Pol (meth) acrylate werden üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 15.000-2.000.000 g/mol eingesetzt, Polysiloxane und Polysilane werden üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 1.000-500.000 g/mol eingesetzt, Polystyrol wird üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 8.000-2.000.000 g/mol eingesetzt, Polypropylenglykol wird üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse in einem Bereich von 4.000-30.000 g/mol eingesetzt, Polyvinylalkohol und Polyvinylacetat werden üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse in einem Bereich von 1.000-100.000 g/mol eingesetzt.

Bei den Chromatographiesäulen gibt es im Allgemeinen keine Einschränkungen. Als Chromatographiesäulen können alle dem Fachmann für die Flüssigchromatographie bekannten Säulen, insbesondere handelsübliche Säulen, eingesetzt werden, also SEC-Säulen, HPLC-Säulen und IC-Säulen. Bevorzugt sind SEC- Säulen und HPLC-Säulen, wobei HPLC-Säulen besonders bevorzugt sind .

Die mobile Phase, die für die Flüssigchromatographie-Analyse eingesetzt wird, enthält eine Mischung aus mindestens einem Lösungsmittel (S2) und mindestens einem Nichtlösungsmittel (Sl) für die Polymerprobe. Unter Nichtlösungsmittel sind dabei alle Flüssigkeiten zu verstehen, in denen die Löslichkeit einer Polymerprobe geringer ist als im Lösungsmittel. Aus der Fachliteratur (z.B. Polymer Data Handbook, 2. Auflage, 2009, Oxford University Press) kann der Fachmann entnehmen, welche Flüssigkeiten für welches Polymer oder welche Polymermischung jeweils als Lösungsmittel oder Nichtlösungsmittel eingesetzt werden können.

Lösungsmittel und Nichtlösungsmittel können beispielsweise unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Tetrahydrofuran (THF) , Toluol, Cyclohexan, Diethylether , Tetrachlormethan, Dichlormethan, Chloroform, 1,4- Dioxan, N, -Dimethylacetamid, N, -Dimethylformamid , Benzylalkohol, Methylethylketon, Ethylacetat, Aceton, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Hexafluorisopropanol , 2- Propanol, Methanol, Wasser und Mischungen derselben. Bevorzugt werden Lösungsmittel und Nichtlösungsmittel unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus THF, Hexafluorisopropanol , Methanol, Aceton, Wasser und Mischungen derselben .

Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird mit S1 das

Nichtlösungsmittel und mit S2 das Lösungsmittel bezeichnet. Zu Beginn der Elution wird eine Mischung eingesetzt, bei der S2 einen bestimmten Anteil in Volumen-% aufweist, dieser Anteil wird Startanteil (SA) genannt. Üblicherweise wird zu Beginn der Elution eine Mischung von S1 : S2 = 100 : 0 Vol.-% eingesetzt.

Das erfindungsgemäße Analyseverfahren kann mehrdimensional durchgeführt werden und kann daher als n-dimensional bezeichnet werden, wobei sich die Anzahl der Dimensionen auf die Anzahl der eingesetzten flüssigen Komponenten der mobilen Phase bezieht .

Die Variation des Volumenanteils an S2 erfolgt stufenweise, wobei die Stufen abwechselnd auf- und absteigen (vergleiche Fig. 1) . Die Form der Stufen kann vom Fachmann beliebig gewählt werden, indem verschiedene der nachfolgend beschriebenen Parameter verändert werden.

Um die Stufen zu beschreiben, wird über das Säulenvolumen t' ein Zeitabschnitt t berechnet (Formeln 1 und 2), der dem Gradienten zugrunde liegt. Im Allgemeinen ist t' frei wählbar in einem Bereich von 0,1 mL bis 1,2 mL .

t = - (2)

F Tabelle 1: Definition der Parameter

Über die Parameter A, B, C, D und E ist es möglich, Stufen in Säulenform, in Trapezform, in Zick- Zack oder „Sägezahnform" zu definieren (vergleiche Fig. 1A-C) .

In einer besonderen Ausführungsform (2 -dimensional ) besteht die mobile Phase aus einem Nichtlösungsmittel S1 und einem Lösungsmittel S2 und die Zusammensetzung der mobilen Phase wird über die Zeit folgendermaßen variiert,

wobei die Parameter A, B, C, D und E frei aus den folgenden Bereichen ausgewählt werden A: 0,01 - 100 Vol.-% S2 und B: 0,01 - 100 Vol . - % S2 und C: 0 - 100 und D: 0 - 100 und E: 0 - 100.

Die Zusammensetzung der mobilen Phase berechnet sich anhand der nachfolgenden Formeln (3-5), die den 2 -dimensionalen Sägezahngradienten beschreiben (vergleiche Fig. 1 und Tabelle 2) :

L = t + C - t + D - t + E - t (3)

H— A + B ( 5 )

Jede Stufe x beginnt mit einem Zeitabschnitt t, für dessen Dauer der Anteil an S2 auf dem „Startanteil" (SA _n ) für die jeweilige Stufe gehalten wird, SA _n = SA + (x-l)*B.

Während des anschließenden Zeitabschnitts C-t wird der Anteil an S2 um den Anteil A (z.B. 6 Vol.-%) verringert, er beträgt

(SA + (x-1) *B - A) .

Während des anschließenden Zeitabschnitts D-t werden diese Anteile konstant gehalten.

Während des anschließenden Zeitabschnitts E-t wird für S2 der Startanteil um den Anteil B (z.B. 0,2 Vol.-%) erhöht und beträgt somit (SA + x*B) . Diese Anteile entsprechen den Endwerten der jeweiligen Stufe und gleichzeitig dem Startanteil für die nächste Stufe. Anschließend beginnt die nächste Stufe. Der Anteil an S1 beträgt jeweils (100 - S2) Vol.-%.

Mehrere Stufen lang werden am Anfang wegen der absteigenden Stufen negative Werte für den Anteil S2 berechnet. Diese negativen Werte sind allerdings mathematisch unsinnig und werden daher mit dem Startanteil an S2 gleichgesetzt bis ein positiver Wert für S2 berechnet wird.

In Tabelle 2 ist diese Veränderung der Zusammensetzung noch einmal mathematisch exemplarisch für die ersten zwei Stufen wiedergegeben. Diese Berechnung setzt sich entsprechend weiter fort bis zur letzten Stufe, bei der ein Anteil an S2 von 100 Vol.-% erreicht ist.

Die Anzahl der notwendigen Stufen kann über Formel 4 berechnet werden .

Tabelle 2 : Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase über die Zeit für den 2 -dimensionalen Sägezahngradienten

Tabelle 3 : Beispielrechnung des Anteils an S2 für A = 6 Vol . -%, B = 0,2 Vol . - %, C = 1, D = 3, E = 1

Bei Verwendung eines 2 -dimensionalen Sägezahngradienten sind die flüssigen Komponenten vorzugsweise THF und Methanol.

In einer weiteren Ausgestaltung dieser Ausführungsform wird das Verfahren mindestens einmal jeweils mit einer anderen mobilen Phase wiederholt, indem jeweils das vorherige Lösungsmittel als Nichtlösungsmittel dient und ein neues Lösungsmittel gewählt wird .

Dieses spezielle Verfahren eignet sich besonders für die Analyse von Polymermischungen. Dabei wird das Nichtlösungsmittel jeweils so gewählt, dass es zumindest für einen Teil der Polymere in der Polymermischung als Lösungsmittel geeignet ist. Auf diese Weise wird über die unterschiedliche Löslichkeit der Polymere in den verschiedenen mobilen Phasen eine Auftrennung der Polymermischung in die einzelnen Polymere erreicht. So wird beispielsweise im ersten Durchgang Methanol als Nichtlösungsmittel eingesetzt und Aceton als Lösungsmittel, im zweiten Durchgang wird Aceton als Nichtlösungsmittel eingesetzt und THF als Lösungsmittel. Dieses Verfahren ist ein Spezialfall des 2 -dimensionalen Gradienten.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform ( 3 -dimensional) besteht die mobile Phase aus zwei Nichtlösungsmitteln S1 und Sl' und einem Lösungsmittel (S2), und die Zusammensetzung der mobilen Phase wird über die Zeit folgendermaßen variiert,

wobei die Parameter A, B, C, D und E frei aus den folgenden Bereichen ausgewählt werden A: 0,01 - 100 Vol.-% S2 und B: 0,01 - 100 Vol . - % S2 und C: 0 - 100 und D: 0 - 100 und E: 0 -

100.

Die Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase berechnet sich anhand der nachfolgenden Formeln (6) und (7), die den 3- di ensionalen Sägezahngradienten beschreiben (vergleiche Tabelle 4 ) : 0,01 + t + E t (6)

100 % S2

Lges ~ ^ (7)

B

Jede Stufe x beginnt mit einem Zeitabschnitt t, für dessen Dauer der Anteil an Sl, S2 und S1 ' auf dem „Startanteil" (SA _n ) für die jeweilige Stufe gehalten wird, SA _n = SA + (x-l)*B, Bei Stufe 1 entspricht der Anteil an S2 dem Startanteil SA.

Während des anschließenden Zeitabschnitts C-t wird der Anteil an S2 um A verringert auf (SA + (x-l)*B - A) . Der Anteil an Sl beträgt (100 - S2) Vol-%. Der Anteil an Komponente Sl' beträgt 0 Vol

Während des anschließenden Zeitabschnitts D-t werden die vorherigen Anteile an Sl, S2 und Sl' konstant gehalten.

Während des anschließenden Zeitabschnitts wird 0,01 Sekunden lang S2 weiterhin konstant gehalten. Der Anteil an Sl' beträgt nun jedoch (100 - S2) Vol.-% und der Anteil an Sl beträgt 0 Vol. -%.

Während des anschließenden Zeitabschnitts t werden die vorherigen Anteile an Sl, S2 und Sl ' konstant gehalten.

Während des anschließenden Zeitabschnitts E-t wird der Startanteil an S2 um den Anteil B (z.B. 0,2 Vol.-%) erhöht auf (SA + x*B) . Der Anteil an Sl' beträgt nun (100 - S2) Vol.-% und der Anteil an Sl beträgt weiterhin 0 Vol.-%.

Diese Anteile entsprechen den Endwerten der jeweiligen Stufe und gleichzeitig dem „Startanteil" für die nächste Stufe.

Anschließend beginnt die nächste Stufe.

Mehrere Stufen lang werden am Anfang wegen der absteigenden Stufen negative Werte für den Anteil S2 berechnet. Diese negativen Werte sind allerdings mathematisch unsinnig und werden daher solange mit dem Startanteil SA an S2 gleichgesetzt bis ein positiver Wert für S2 berechnet wird.

In Tabelle 4 sind diese Veränderungen der Zusammenset ung noch einmal mathematisch exemplarisch für die ersten zwei Stufen wiedergegeben. Diese Berechnung setzt sich entsprechend weiter fort bis zur letzten Stufe, bei der ein Anteil an S2 von 100 Vol.-% erreicht ist.

Die Anzahl der notwendigen Stufen kann über Formel 7 berechnet werden .

Tabelle 4: Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase über die Zeit für den 3 -dimensionalen Sägezahngradienten

Die Parameter A, B, C, D und E können im Allgemeinen frei aus den folgenden Bereichen ausgewählt werden

A: 0,01 - 100 Vol. -% S2

und B: 0,01 - 100 Vol.-% S2

und C: 0 - 100

und D : 0 - 100

und E : 0 - 100.

Die einzige Beschränkung stellen hier möglicherweise die technischen Details des LC-Gerätes sowie der Pumpe dar. Bevorzugt sind die Werte C, D und E größer als 0.

Bevorzugt werden die Parameter A, B, C, D und E aus den folgenden Bereichen ausgewählt

A: 3,0 - 12,0 Vol . -% S2

und B: 0,2 - 1,0 Vol. -% S2

und C : 0,5 - 3,0

und D : 0,5 - 3,0

und E : 0,1 - 2,0.

Besonders bevorzugt weisen die Parameter A, B, C, D und E die folgenden Werte auf: A: 6,0 Vol.-% und B : 0,2 Vol . und C : 1,0 und D : 3,0 und E : 2,0.

Beispiele

Verwendete Materialien:

HPLC : 1) ThermoFisher Scientific Ultimate 3000 mit binärer

Pumpe

2) ThermoFisher Scientific Ultimate 3000 mit quaternärer Pumpe

3) ThermoFisher Scientific Vanquish UHPLC mit

Diodenarray Detektor HL (Detektionswellenlänge 215 nm)

Detektor : Agilent 385 ELSD

Säule 1: Poroshell C18 , 50 x 4,6 mm, 2,7 pm (Agilent)

Säule 2 : Poroshell C18, 100 x 4,6 mm, 2,7 pm (Agilent)

Säule 3 : Hypersil BDS C18, 100 x 4,6 mm, 2 , 4 pm (ThermoFisher) Säule 4 : Luna C18 , 100 x 4,6 mm, 5 pm (Phenomenex)

Säule 5: Hypersil Gold C18 aQ, 100 x 10 mm, 5 pm

(ThermoFisher)

Säule 6 : Accucore C18, 50 x 4,6 mm, 2,6 pm (ThermoFisher) Säule 7 : Poroshell HILIC, 50 x 4.6 mm, 2.7 pm (Agilent)

Für die mobile Phase wurden verwendet:

Tetrahydrofuran (nicht stabilisiert, HPLC grade, Merck Darmstadt) , Methanol (HPLC grade, Merck Darmstadt) und Reinstwasser (Leitfähigkeit 18.5 MOhrrucm, TOC-Wert <4 ppb) .

Tabelle 5: Übersicht der eingesetzten PolymerStandards

Vorversuche Parameteroptimierung

Als Testanalyt wird Polystyrol (Mp = 19.600 g/mol, Polydispersität 1,03 von PSS Polymer Standard Services, Mainz) eingesetzt. Polystyrol wird mit einer Konzentration von c = 25 mg/ml in THF gelöst, das Injektionsvolumen beträgt 5 mΐ . Die Analyse findet an HPLC-Gerät 2 statt.

Die Parameter zur Optimierung des Sägezahngradienten werden basierend auf Taguchis L16 (4 ⁵ ) Versuchsplandesign abgewandelt

(„The Taguchi Approach to Parameter Design", 1986, ASQC Conference Proceedings ; „Taguchi 's quality engineering handbook", 2011, John Wiley & Sons), siehe Tabelle 2.

Als Zielgrößen wurden (1) die Anzahl der abgetrennten Peaks, (2) die Auflösung, (3) die Asymmetrie und (4) die Peakbreite in halber Höhe optimiert. Die Variation der Parameter kann Tabelle 2 entnommen werden. Zudem wurde die Versuchsreihe an fünf verschiedenen kommerziell erhältlichen Ghromatographiesäulen durchgeführt .

Es zeigt sich, dass für die Anzahl der Peaks und damit die Qualität der Polymer-Auflösung hauptsächlich der Parameter B verantwortlich ist. Die anderen Zielgrößen zeigten im Vergleich dazu einen geringeren Einfluss.

Die optimierten Parameter können für jede Säule Tabelle 6 entnommen werden. Es zeigt sich, dass die optimalen Werte für die Parameter A-E recht ähnlich sind und somit eher nicht von der Säule abhängig sind. Daher wird ein allgemein anwendbares Optimum angenommen (vgl. letzte Zeile in Tabelle 6) . Tabelle 6 : Parameter zur Optimierung des Sägezahngradienten

Tabelle 7 : Bestätigungsexperimente des Versuchsplans zur

Optimierung

Beispiel 1

In Bezug auf die Gesamtlaufzeit ist ebenfalls die effektive Stufenhöhe B von entscheidender Bedeutung. Je mehr Schritte durchlaufen werden, desto besser wird die Auflösung, desto länger aber auch die Gesamtmesszeit. Soll die Messzeit bei kleinster effektiver Stufenhöhe verkürzt werden, muss die effektive Stufenlänge betrachtet werden. Dadurch, dass diese Größe sich aus den einzelnen fest definierten Teilschritten zusammensetzt, welche auf Grund der Genauigkeit des Gradientenmischers der eingesetzten Pumpe, nicht mehr weiter verkürzt werden können, muss eine andere Möglichkeit gefunden werden. Ein weiterer entscheidender Parameter, der in die Berechnung der effektiven Stufenlänge eingeht, ist der LC- Fluss .

HPLC-Gerät 1 mit Säule 6

Konzentration Polymer: 90 mg/ml PDMS mit Mp = 36500 g/mol

Injektionsvolumen: 5 mΐ

Flussrate: 1 ml/min, 2 ml/min, 3 ml/min t = 0 , 1 min

A = 6 Vol . -%

B = 0,2 Vol . - %

C = 1

D = 3

E 1 L = 0,2 min/ 0 , 3 min / 0,6 min

H = 6 , 2 Vol . -%

Es zeigt sich, dass sich durch eine Erhöhung der Flussrate von 1 mL/min auf 3 mL/min die Messzeit um den Faktor 3 reduzieren lässt, ohne eine Verschlechterung der Auflösung zu erhalten.

Beispiel 2

Es wird ein Vergleich von Lineargradient, Stufengradient mit ausschließlich ansteigenden Stufen und Sägezahngradient durchgeführt, wobei PVC 45.500 als Testanalyt dient (PVC 45.500 g/mol, Polymer Laboratories).

HPLC-Gerät 1 mit Säule 6

Konzentration Polymer: 100 mg/ml

Injektionsvolumen: IpL (Fig. 2A und 2B) , 3 mΐ (Fig. 2C)

Flussrate: 1 ml/min

Startbedingung 0% THF/ 100% Methanol, Endbedingung 100% THF/0% Methanol (für alle Gradienten) t = 0 , 1 min

A = 6 Vol . -%

B = 0,2 Vol.-% (sowohl Stufengradient als auch Sägezahngradient haben eine effektive Stufenhöhe von 0,2 Vol.-%)

C = 1

D = 3

E = 1

L = 1 , 5 min

H = 6 , 2 Vol . - %

Das Auflösungsvermögen des Sägezahngradienten ist im Vergleich zu den anderen Analysetechniken signifikant verbessert, was an der erhöhten Peakanzahl deutlich zu erkennen ist (vergleiche Figur 2 ) .

Beispiel 3

Es wird ein Vergleich von Lineargradient und Sägezahngradient an verschiedenen Polymeren an unterschiedlichen Säulen durchgeführt, die Versuchsbedingungen können Tabelle 8 entnommen werden . HPLC-Gerät 1 mit Säule 6 oder Säule 7

Konzentration Polymer: 15 mg/ml

Injektionsvolumen: 4 mΐ

Flussrate: 1 ml/min t 0,25 min

A = 6 Vol . - %

B = 1 Vol . -%

C = 1

D = 3

E = 1

L = 0 , 6 min

H = 7 Vol . -%

Tabelle 8 : Versuchsbedingungen Beispiel 3

Für alle Polymere zeigt sich eine deutlich verbesserte Auflösung bei Anwendung des Sägezahngradienten, die sich in erhöhter Peakanzahl und verbesserter Peakform äußert . Dies wird exemplarisch an PMMA und PPG auf Säule 6 und an PDMS auf Säule 7 gezeigt (vgl. Figuren 3-5) .

Beispiel 4

Es wird eine HPLC-Analyse mit 3 -dimensionalem Sägezahngradienten zur Trennung von PMMA 690.000 durchgeführt. Die Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase erfolgt wie zuvor für den 3 -dimensionalen Sägezahngradienten beschrieben (Tabelle 4) . Als flüssige Komponenten werden eingesetzt: S2 = THF , S1 = Wasser, Sl' = Methanol. Zum Vergleich wird dieselbe Analyse auch mit 2 -dimensionalem Sägezahngradienten durchgeführt (vgl. Figur 6).

HPLC-Gerät 2 mit Säule 6

Konzentration Polymer: 15 mg/ml

Injektionsvolumen: 4 mΐ

Flussrate: 2 ml/min t = 0,25 min

A = 6 Vol . -%

B = 1 Vol . -%

C = 1

D = 3

E = 1

L = 0,6 min

H = 7 Vol . -%

Beispiel 5

Es wird eine HPLC-Analyse zur Trennung von 3 Polymeren (PMMA 19.700, PPG 18.000, PDMS 20.800) ähnlicher mittlerer molarer Masse durchgeführt (vgl. Fig. 7) . Hierzu wird ein 2- dimensionaler Sägezahngradient zweimal hintereinander mit einer anderen mobilen Phase angewendet. Sägezahngradient 1 läuft von 100 Vol.-% Methanol (0 Vol.-% Aceton) nach 100 Vol.-% Aceton (0 Vol.-% Methanol) in 30 Minuten. Anschließend läuft

Sägezahngradient 2 von 100 Vol.-% Aceton (0 Vol.-% THF) nach 100 Vol.-% THF (0 Vol.-% Aceton) ebenfalls in 30 Minuten.

(Gesamtlaufzeit 60 Min) .

HPLC-Gerät 2 mit Säule 6

Konzentration der Polymere: jeweils 20 mg/mL Injektionsvolumen: 5 pL

Flussrate: 2 mL/min

Parameter :

t = 0,25 min

A = 6 Vol . -%

B = 1 Vol . -%

C = 1

D = 3

E = 1

L = 0 , 6 min

H 7 Vol . -%

Die Beispiele 1-5 zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren auf eine Vielzahl von Polymeren auch mit sehr großen mittleren molaren Massen anwendbar ist und auch eine Vielzahl von

Chromatographiesäulen eingesetzt werden kann. Einzige Voraussetzung für die Eignung ist, dass eine grundsätzliche Retention des zu untersuchenden Analyten an der Säule gewährleistet ist. Dies zählt jedoch zum allgemeinen Fachwissen des Fachmannes.