Wellenlängenbereiche

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe, wobei die Probe mit Beleuchtungsstrahlung derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung an einen Punkt in oder auf der Probe zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck gebündelt wird, der Punkt beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild auf einen ortsauflösenden Flächendetektor abgebildet wird, wobei der

Flächendetektor eine Ortsauflösung aufweist, die eine Struktur des Beugungsbildes auflöst, der Punkt relativ zur Probe in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks, der Flächendetektor ausgelesen und aus den Daten des Flächendetektors und aus den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen ein Bild der Probe erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist, wobei zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen mittels eines spektral selektiven Moduls auf dem Flächendetektor eine der Zahl Wellenlängenbereichen entsprechende Anzahl von

Beugungsstrukturen erzeugt wird, die jeweils punktsymmetrisch zu einem Symmetriezentrum sind und vollständig auf dem Flächendetektor liegen und beim Erzeugen des Bildes der Probe die Beugungsstrukturen ausgewertet werden.

Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, einer Optik, die eine im Probenraum liegende Fokalebene und eine

Auflösungsgrenze hat, einer Beleuchtungseinrichtung, die einen Eingang zum Zuführen von Beleuchtungsstrahlung aufweist und die über die Optik den Probenraum mit der

Beleuchtungsstrahlung derart beleuchtet, dass die Optik die Beleuchtungsstrahlung an einem Punkt in der Fokalebene zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck bündelt, und einer Abbildungseinrichtung zum beugungsbegrenzten Abbilden des Punktes in der Fokalebene durch die Optik in ein Beugungsbild auf einem ortsauflösenden Flächendetektor, der in einer zur Fokalebene konjugierten Bildebene liegt, wobei der Flächendetektor eine Ortsauflösung aufweist, die eine Struktur des Beugungsbildes auflöst, einer Scaneinrichtung zur Verschiebung des Punktes in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks, und einer Auswerteeinrichtung zum Auslesen des Flächendetektors, zum Auswerten der Struktur des Beugungsbildes aus Daten des

Flächendetektors und aus den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen und zum Erzeugen eines Bildes der Probe, das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze gesteigert ist, wobei das Mikroskop zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten

Wellenlängenbereichen ein spektral selektives Modul aufweist, das auf dem Flächendetektor eine der Zahl an Wellenlängenbereichen entsprechende Anzahl von Beugungsstrukturen erzeugt, der Flächendetektor und das spektral selektive Element so ausgebildet sind, dass die Beugungsstrukturen vollständig auf dem Flächendetektor liegen, und die Auswerteeinrichtung beim Erzeugen des Bildes der Probe die Beugungsstrukturen auswertet.

Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z. B. von Zellteilen, verwendet. Die Probe wird mit als Anregungsstrahlung wirkender Beleuchtungsstrahlung beleuchtet und die angeregte Lumineszenzstrahlung mit geeigneten Detektoren erfasst. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Mikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Farbstoffzugabe lumineszieren. Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und

Fluoreszenz verstanden, erfasst also beide Prozesse. Soweit hier von Fluoreszenz gesprochen wird, ist das pars pro toto und nicht einschränkend zu verstehen.

Zur Probenuntersuchung ist es auch bekannt, Laser-Scanning-Mikroskope (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene der Probe abbilden, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es, ein

dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das dann aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Natürlich wird auch eine Kombination von

Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet, bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen mit Hilfe eines LSM abgebildet wird. Prinzipiell ist die optische Auflösung eines Lichtmikroskops, auch die eines LSM, durch die physikalischen Gesetze beugungsbegrenzt. Der Begriff„hochauflösend" wird hier für

Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze verwendet. Die US 5043570 B1 beschreibt einen Versuch, die Auflösung durch "oversampling" zu erhöhen. Dies führt nicht zu einer deutlich verbesserten Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze des Mikroskops.

Mit Hilfe nicht-linearer Entvölkerungsprozesse kann die Auflösung auf einen Faktor von bis zu 10 über die eines beugungsbegrenzten konfokalen LSM angehoben werden. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der US 586691 1 B1 beschrieben. Für die

Entvölkerungsprozesse sind verschiedene Ansätze bekannt, beispielsweise wie in der

DE 4416558 C2, US 6633432 B1 oder DE 10325460 A1 beschrieben. Ein weiteres hochauflösendes Mikroskopieverfahren wird in US 5867604 B1 angesprochen, in der ein Objekt mit einer periodischen Struktur abgetastet wird. Ein ähnliches Verfahren zur Auflösungssteigerung schildert auch die EP 1 157297 B1 . Strukturierte Beleuchtung nutzt nichtlineare Prozesse, z. B. eine Sättigung der Fluoreszenz. Der Ansatz erfordert einen Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild.

Ein Verfahren, das im Weitfeld eine Hochauflösung erreicht, ist aus der WO 2006/127692 A1 und der DE 102006021317 A1 bekannt. Dieses mit PALM abgekürzte Verfahren (Photo Activated Light Microscopy) verwendet eine Markierungssubstanz, welche mittels eines optischen Aktivierungssignals aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die

Markierungssubstanz zur Abgabe von bestimmter Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Die Aktivierung wird so vorgenommen, dass zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten

Markierungsmoleküle von benachbarten aktivierten Molekülen so beabstandet ist, dass die Markierungsmoleküle des Anteils gemessen an der optischen Auflösung der Mikroskopie getrennt oder nachträglich trennbar sind. Nach Aufnahme der Lumineszenzstrahlung wird für diese isolierten Moleküle dann das Zentrum deren auflösungsbegrenzt bedingter

Strahlungsverteilung ermittelt und daraus rechnerisch die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit bestimmt, als es die optische Abbildung eigentlich zulässt. Zur Abbildung der gesamten Probe wird die Isolierung der Markierungsmoleküle durch Aktivierungsstrahlung, nachfolgende Anregung und Fluoreszenzstrahlungsabbildung so lange wiederholt, bis möglichst alle Markierungsmoleküle einmal in einer Teilmenge enthalten und isoliert waren. Weitere hochauflösende Verfahren sind in Hell, "Far-Field Optical Nanoscopy", Science 316, 1153 - 1 158, 2007, beschrieben.

Aus der EP 2317362 A1 ist die sogenannte Airy-Scan-Mikroskopie bekannt. Diese kombiniert in der dort in Fig. 5 dargestellten und beschriebenen Ausführungsform eine beugungsbegrenzte Beleuchtung der Probe mit einem Flächendetektor, wobei eine Scaneinrichtung so ausgebildet ist, dass das Beugungsbild des mit dem Beleuchtungsfleck beleuchteten Punktes auf dem Flächendetektor ruht. Man bezeichnet diese Anordnung als sogenannte„de-scanned"

Detektoranordnung. Sie wird üblicherweise dadurch erreicht, dass ein Scanner zwischen der Probe und dem Vereinigungspunkt von Beleuchtungseinrichtung und Abbildungseinrichtung angeordnet ist, der den Strahlengang ablenkt. Ein solcher Scanner wirkt sowohl auf den Beleuchtungsfleck als auch auf die Abbildung des mit dem Beleuchtungsfleck beleuchteten Punktes, so dass in Abbildungsrichtung nach dem Scanner der Strahlengang ruht. Eine Alternative zu einem solchen Scanner ist die Verwendung eines bewegbaren Probentischs, der die Probe verschiebt. Auch dann ruht das Beugungsbild auf dem Flächendetektor. Im Konzept der EP 2317362 A1 ist der Flächendetektor mit einer Ortsauflösung versehen, die bezogen auf den Abbildungsmaßstab eine Überabtastung des Beugungsbildes bewirkt und es somit erlaubt, die Struktur des Beugungsbildes aufzulösen. Die EP 2317362 A1 sieht auch eine

Ausführungsform vor, bei der eine Farbanalyse möglich ist. Dazu werden mehrere Detektoren vorgesehen, die in entsprechenden Spektralkanälen liegen, welche durch einen dichroitischen Farbteiler gebildet werden. Dieser Ansatz ist für die Laser-Scanning-Mikroskopie schon seit langem bekannt. Er hat jedoch den Nachteil, dass für jeden Farbkanal ein entsprechender Farbteiler mit entsprechendem Detektor nötig ist. Bei der herkömmlichen Laser-Scanning- Mikroskopie, die einen nicht ortsauflösenden Detektor hinter einer konfokalen Lochblende (sogenanntes Pinhole) verwendet, ist diese Anforderung weitgehend unproblematisch; bei der Verwendung eines überabtastenden Flächendetektors gemäß EP 2317362 A1 entsteht jedoch ein erheblicher Aufwand, zumal solche Flächendetektoren teuer sind. Im Überabtastungsprinzip gemäß EP 2317362 A1 müssen diese mehreren Flächendetektoren sub-pixelgenau zueinander justiert werden, da ansonsten ein Farbfehler zwischen den erzeugten Bildern der einzelnen Farbkanäle entstünde. Nur wenn die Flächendetektoren in allen Farbkanälen zur optischen Achse sub-pixelgenau justiert sind, passen die Bilder der einzelnen Farbkanäle übereinander.

Die gattungsbildende WO 2016/020459 A1 bildet die Airy-Scan-Mikroskopie dahingehend weiter, dass für mindestens zwei vorbestimmte Wellenlängenbereiche das Beugungsbild mittels eines spektral selektiven Elementes mit einer entsprechenden Anzahl von Beugungsstrukturen versehen wird, die jeweils als punktsymmetrische Beugungsscheibchen ausgebildet sind und vollständig auf demselben Flächendetektor lateral nebeneinanderliegen. Durch eine entsprechende Auswertung der Beugungsstrukturen ist es möglich, ein farbiges Bild entsprechend den mindestens zwei Wellenlängenbereichen zu erzeugen. Dieser Ansatz benötigt nur einen Flächendetektor. Die Beugungsscheibchen liegen auf ihm nebeneinander. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bzw. ein Mikroskop dieser Art so weiterzubilden, dass die Bildqualität in den mindestens zwei vorbestimmten

Wellenlängenbereichen verbessert ist.

Die Erfindung ist in den Ansprüchen 1 und 9 definiert.

Bei einem Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe wird die Probe mit Beleuchtungsstrahlung derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt, dass die Beleuchtungsstrahlung an einen Punkt in oder auf der Probe zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck gebündelt wird. Der Punkt wird beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild auf einen ortsauflösenden Flächendetektor abgebildet, wobei der Flächendetektor eine

Ortsauflösung aufweist, die eine Struktur des Beugungsbildes auflöst. Der Punkt wird relativ zur Probe in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks. Aus den Daten des Flächendetektors und den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen wird ein Bild der Probe erzeugt, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist. Zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen wird mittels eines spektral selektiven Moduls das Beugungsbild mit einer Anzahl von Beugungsstrukturen versehen, die der Zahl an vorbestimmten Wellenlängenbereichen entspricht. Die Beugungsstrukturen liegen auf dem Flächendetektor und werden beim Erzeugen des Bildes der Probe ausgewertet. Ein Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, umfasst eine Optik, die eine im

Probenraum liegende Fokalebene und eine Auflösungsgrenze hat, und eine

Beleuchtungseinrichtung, die einen Eingang zum Zuführen von Beleuchtungsstrahlung aufweist und die über die Optik den Probenraum mit der Beleuchtungsstrahlung derart beleuchtet, dass die Optik die Beleuchtungsstrahlung an einem Punkt in der Fokalebene zu einem

beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck bündelt. Eine Abbildungseinrichtung bildet den Punkt in der Fokalebene durch die Optik in ein Beugungsbild auf einen ortsauflösenden

Flächendetektor ab, der in einer zur Fokalebene konjugierten Detektorebene liegt. Der Flächendetektor hat eine Ortsauflösung, die eine Struktur des Beugungsbildes auflöst. Eine Scaneinrichtung verschiebt den Punkt in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks, und eine

Auswerteeinrichtung liest den Flächendetektor aus und wertet in dessen Daten die Beugungsstruktur des Beugungsbildes aus. Dabei berücksichtigt sie natürlich auch die diesen Daten zugeordneten Scanpositionen. Sie erzeugt ein Bild der Probe, das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze gesteigert ist. Das Mikroskop weist zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen ein spektral selektives Modul auf, das auf dem Flächendetektor das Beugungsbild mit einer der Zahl an zwei vorbestimmten Wellenlängenbereichen entsprechenden Anzahl von Beugungsstrukturen versieht, wobei der Flächendetektor und das spektral selektive Modul so ausgebildet sind, dass die

Beugungsstrukturen vollständig auf dem Flächendetektor liegen, und die Auswerteeinrichtung beim Erzeugen des Bildes der Probe die Beugungsstrukturen auswertet.

Die Beugungsstrukturen sind bei Betrachtung eines auf der optischen Achse liegenden Punkts in oder auf der Probe jeweils punktsymmetrisch zu einem Symmetriezentrum. Die

punktsymmetrischen Beugungsstrukturen überdecken unterschiedliche Bereiche des

Flächendetektors, haben jedoch das gemeinsame Symmetriezentrum , das für den betrachteten Punkt ebenfalls auf der optischen Achse liegt. Durch die Wirkung auf einen auf der optischen Achse liegenden Punkt wird der Begriff„Symmetriezentrum" des optischen Systems bzw. des Verfahrens charakterisiert. Dies schließt nicht aus, dass Punkte neben der optischen Achse abgebildet werden. Es zeigte sich, dass solche Beugungsstrukturen eine Farbauflösung liefern, welche die Ortsauflösung geringstmöglich beeinträchtigt. Ein Beispiel für solche

Beugungsstrukturen sind koaxiale Strukturen, bei denen eine innere Beugungsstruktur ein Beugungsscheibchen ist, die eine äußere Beugungsstruktur ringförmig umgibt. Ein anderes Beispiel wären zwei oder mehrere längliche Beugungsstrukturen, die z. B. jeweils die Form einer Acht oder Hantel haben, gegeneinander aber auf dem Flächendetektor um einen Winkel, im Falle von zwei Beugungsstrukturen z. B. 90°, verdreht sind.

Die Erfindung erreicht eine simultane Auflösungssteigerung und eine spektrale Bildinformation mit nur einem einzigen Flächendetektor, indem das Beugungsbild auf dem Detektor in mindestens zwei Beugungsstrukturen aufgeteilt wird. Dazu wird das spektralselektive Modul verwendet, das durch Betrachtung eines auf der optischen Achse liegenden Punktes in oder auf der Probe charakterisiert ist. Jede Beugungsstruktur ist einem Wellenlängenbereich (auch als Farbkanal bezeichnet) zugeordnet. Das Verfahren und das Mikroskop erlauben es damit, mindestens zwei Wellenlängenbereiche zu unterscheiden. Das Bild der Probe entsteht, wie beim Airy-Scan üblich, durch Abtasten der Probe mit dem Spot aus einer Vielzahl von

Einzelbildern, die jeweils einem anderen Abtastort, also einer anderen Scanposition, zugeordnet sind. Durch die unterschiedlichen, jedoch zu einem gemeinsamen

Symmetriezentrum punktsymmetrischen Beugungsstrukturen der Farbbereiche ergibt sich überraschend bei der Auswertung und Erzeugung des optischen Bildes eine verbesserte räumliche Auflösung im Bild. Die Auflösung ist insbesondere gegenüber der Version gemäß WO 2016/020459 A1 , bei der Beugungsscheibchen auf dem Detektor nebeneinanderliegen, gesteigert. Die Beugungsstrukturen können dadurch unterschiedlich gestaltet werden, dass die Strahlung eines Wellenlängenbereichs in der Bildebene räumlich umverteilt wird, die des anderen nicht. Hält man dabei die Beugungsstrukturen koaxial, wird maximale Auflösung im Bild erhalten. Es ist deshalb in einer Ausführungsform bevorzugt vorgesehen, dass die Beugungsstrukturen koaxial sind, insbesondere in Form einer nicht räumlich umverteilten Beugungsstruktur für einen ersten Wellenlängenbereich und einer diese umgebenden, ringförmigen Beugungsstruktur für einen zweiten Wellenlängenbereich.

In einer anderen Ausführungsform ist es vorgesehen, alle vorbestimmten Wellenlängenbereiche unterschiedlich phasenzumanipulieren.

Eine besonders einfache Bauweise kombiniert im Modul eine Phasenbeeinflussungseinrichtung mit einem spektralselektiven Filter, beispielsweise derart, dass der spektralselektive Filter die Strahlung eines Wellenlängenbereiches durch eine Phasenmaske leitet, die Strahlung eines anderen Wellenlängenbereiches hingegen durch keine oder eine andere Phasenmaske. Die Wellenlängsbereiche werden dadurch unterschiedlich phasenmanipuliert.

Bei der Beugung eines optischen Strahls an einer kreisförmigen Blende entsteht ein

Beugungsscheibchen. Es erscheint ein zentrales Maximum, das Beugungsscheibchen, das umgeben ist von Ringen abnehmender Strahlungsintensität. Selbst ein nach den Gesetzen der geometrischen Optik perfektes Mikroskop, also auch ohne Abbildungsfehler, kann einen Punkt nicht genau auf einen Punkt abbilden, sondern durch die Beugung des Lichts an der Apertur nur auf einen unscharfen Fleck. Dies wird als beugungsbegrenzte Abbildung bezeichnet. Gleiches gilt bei beugungsbegrenzter Beleuchtung eines Punktes. Zwei Punkte lassen sich in klassischer Strahlenoptik nach dem sog. Rayleigh-Kriterium trennen, wenn die Maxima ihrer Abbilder im Beugungsbild mindestens um den Radius r des Beugungsscheibchens auseinander liegen. Die Form des Flecks hängt reziprok von der Form der Apertur ab, insbesondere ist seine Größe umgekehrt proportional zur Größe der Apertur. Die Größe des Beugungsscheibchens ergibt sich aus der ersten Nullstelle der Besselfunktion erster Art, die bei etwa r = 0,6098 liegt. Das Beugungsscheibchen (also der zentrale Beugungsfleck) wird nach dem englischen Astronomen George Biddell Airy auch Airy-Scheibchen genannt. Im Scanning-Mikroskop ist sowohl bei Beleuchtung als auch bei Abbildung die Apertur, gegeben durch die runde Fassung der Optiken, kreisförmig. Da Größe des Beugungsscheibchens zudem von der Wellenlänge abhängt, ist es bei der zu Anregung dienenden beugungsbegrenzten Beleuchtung kleiner als bei der stokesverschobenen, also langwelligeren Fluoreszenzstrahlung.

Der Begriff„beugungsbegrenzt" soll hier nicht auf die Beugungsgrenze gemäß der Abbe'schen Theorie beschränkt sein, sondern auch Fälle erfassen, in denen auf Grund realer

Unzulänglichkeiten oder Einschränkungen das theoretische Maximum um 20 % verfehlt wird. Auch dann hat das Einzelbild eine Struktur, die hier als Beugungsstruktur bezeichnet wird. Sie wird überabgetastet. Die Erzeugung punksymmetrischer Beugungsstrukturen für die Wellenlängenbereiche kann auf verschiedene Art und Weisen erfolgen, wobei jedes Mal das spektralselektive Modul auch eine Beeinflussung des Beugungsbildes vornimmt, beispielsweise indem es eine

Phasenbeeinflussungseinrichtung aufweist, die für die beiden unterschiedlichen Wellenlängen verschieden wirkt, oder indem das spektralselektive Modul die Wellenlängenbereiche durch unterschiedliche Phasenbeeinflussungselemente führt. Grundsätzlich ist es bevorzugt, die spektrale Selektion nahe einer Pupille, auf jeden Fall nicht in einem Zwischenbild des

Strahlengangs auszuführen. Soweit nachfolgend vom spektralselektiven Modul bzw. der spektralen Auftrennung die Rede ist, ist damit auch die unterschiedliche Formung der

Beugungsstrukturen gemeint, so dass diese jeweils punktsymmetrisch sind und mit einem gemeinsamen Symmetriezentrum auf dem Flächendetektor liegen. In einer ersten Variante wird das spektralselektive Modul bzw. die spektrale Auftrennung im Abbildungsstrahlengang und nicht in einem Teil des Strahlenganges angeordnet bzw. vorgenommen, durch den auch die Beleuchtungsstrahlung läuft. Die Abbildungsstrahlung durchläuft dann den Strahlengang bis zum spektralselektiven Modul, an dem die Formung der unterschiedlichen Beugungsstrukturen der einzelnen Wellenlängenbereiche erfolgt. In einer zweiten Variante erfolgt die spektrale

Auftrennung in der Beleuchtung bzw. der Beleuchtungseinrichtung so, dass die Abbildung nicht von der spektralen Auftrennung betroffen ist. Auf diese Weise entsteht der Beleuchtungsfleck in der Probe bereits in Form von mehreren unterschiedlichen Beugungsstrukturen, die zu einem gemeinsamen Symmetriezentrum punksymmetrisch sind.

Bei der erstgenannten Variante wirkt die spektrale Auftrennung nur auf die

Fluoreszenzstrahlung von der Probe. Bei der zweitgenannten Variante nur auf die

Fluoreszenzanregung zur Probe. Die erste Variante trennt damit Farbkanäle einer in verschiedenen Farben fluoreszierenden Probe. Die zweite Variante unterscheidet hingegen Bestandteile der Probe, die bei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen anregbar sind.

Beiden Varianten ist es gemein, dass das spektralselektive Modul in einem Teil des

Strahlengangs liegt, der nur von der Abbildung oder der Beleuchtung bestrahlt wird, nicht jedoch von beiden. In Abweichung davon ist auch eine Anordnung in einem gemeinsamen Teil des Strahlenganges möglich.

Der Kern der Erfindung liegt darin, die Wellenlängenbereiche räumlich über die Lage der Beugungsstrukturen auf dem Flächendetektor zu unterscheiden und durch die Punktsymmetrie zum gemeinsamen Symmetriezentrum eine besonders gute Auflösung sicherzustellen. Bei der Erzeugung des Bildes ist eine Entmischung der simultan aufgenommenen

Wellenlängenbereiche bei besonders hoher Auflösung möglich. Auf diese Weise wird eine simultane Aufnahme mehrerer Farbkanäle mit einem einzigen Flächendetektor erreicht.

Da im Rekonstruktionsverfahren gemäß WO 2016/020459 A1 oder EP 2317362 A1 aufgrund der scannenden Verschiebung mit einer Schrittweite, die kleiner ist als die Größe des

Beleuchtungsflecks, eine Vielzahl an Messungen für jeden einzelnen Punkt in der Probe vorliegt, ergibt sich eine Überbestimmtheit im aufzustellenden und zu lösenden

Gleichungssystem , so dass nicht nur die Ortsangaben und Intensitäten für die einzelnen Punkte mit einer Hochauflösung angegeben werden können, sondern auch die Angabe der

Wellenlängenbereiche, d. h. der Farbe.

Die Rekonstruktion verwendet eine Punktbildverwaschungsfunktion (PSF), die

wellenlängenabhängig ist und das Symmetriezentrum für den eingangs erwähnten Punkt auf der optischen Achse hat.

Die Abbildung eines gewünschten Bereichs der Probe erfolgt wie in einem üblichen LSM scannend. Das erfindungsgemäße Konzept kann auch in parallelisierter Form für mehrere Flecken gleichzeitig durchgeführt werden, wie dies aus der WO 2016/020459 A1 bekannt ist.

Soweit hier ein Verfahren beschrieben wird, realisiert ein Steuergerät des Mikroskops diese Verfahrensschritte im Betrieb des Mikroskops. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen

Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops zur hochauflösenden Mikroskopie,

Fig. 2 bis 4 Darstellungen von Beugungsbildern, die beim Betrieb des Mikroskops der Fig. 1 in verschiedenen Ausführungsformen auf dem Flächendetektor auftreten,

Fig. 5 einen Strahlengang einer spektralen Aufteilung, und

Fig. 6 eine Darstellung eines Beleuchtungs-Beugungsbildes, das bei der Beleuchtung einer Probe in einer Ausführungsform des Mikroskops der Fig. 1 auftreten kann.

Fig. 1 zeigt schematisch ein Laserscanningmikroskop 1 , das zum Mikroskopieren einer Probe 2 ausgebildet ist. Das Laserscanningmikroskop (nachfolgend als LSM abgekürzt) 1 wird von einem Steuergerät C gesteuert und umfasst einen Beleuchtungsstrahlengang 3 sowie einen Abbildungsstrahlengang 4. Der Beleuchtungsstrahlengang 3 beleuchtet einen Spot in der Probe 2, und der Abbildungsstrahlengang 4 bildet diesen Spot beugungsbegrenzt auf einen Detektor ab. Beleuchtungsstrahlengang 3 und Abbildungsstrahlengang 4 teilen sich optische Elemente.

Die Beleuchtung der Probe 2 erfolgt im LSM 1 mittels eines bereitgestellten Laserstrahls 5, der über einen nicht weiter funktionell erforderlichen Umlenkspiegel 6 und eine Linse 7 auf einen Spiegel 8 eingekoppelt wird. Der Spiegel 8 sorgt dafür, dass der Laserstrahl 5 unter einem Reflexionswinkel auf ein Einkoppelelement, z. B. einen Emissionsfilter 9, fällt. Zur

übersichtlicheren Darstellung ist für den Laserstrahl 5 lediglich dessen Hauptachse

eingezeichnet.

Nach Reflexion am Emissionsfilter 9 wird der Laserstrahl 5 von einem Scanner 10 zweiachsig abgelenkt und mittels Linsen 1 1 und 12 durch ein Objektiv 13 als beugungsbegrenzter Beleuchtungsfleck 14 in eine Fokalebene 29 in der Probe 2 fokussiert. Der Beleuchtungsfleck 14 ist dabei in der Darstellung der Fig. 1 punktförmig, es ist jedoch auch ein anders geformter Beleuchtungsfleck möglich, wie nachfolgend anhand der Fig. 6 noch erläutert werden wird. Fluoreszenzstrahlung, die am Ort (z. B. Punkt) des Beleuchtungsflecks 14 angeregt wurde, wird aus der Fokalebene 29 über das Objektiv 13, die Linsen 1 1 und 12 wieder zum Scanner 10 geleitet, nach dem in Abbildungsrichtung wiederum ein ruhender Lichtstrahl vorliegt. Dieser fällt durch das Emissionsfilter 9, welches dadurch zusätzlich die Funktion hat, von der

Fluoreszenzstrahlung im Beleuchtungsfleck 14 spiegelnd rückreflektierte

Beleuchtungsstrahlung, die beispielsweise als Anregungsstrahlung dienen kann, abzublocken. Anschließend durchläuft die Strahlung ein später zu erläuterndes Modul 15. Eine Linse 16 sorgt abschließend dafür, dass insgesamt der Ort des Beleuchtungsflecks 14 in ein

beugungsbegrenztes, noch näher zu erläuterndes Beugungsbild abgebildet wird, welches in einer Bildebene 18 liegt. Die Bildebene 18 ist eine konjugierte Ebene zur Fokalebene 29, in welcher der Beleuchtungsfleck 14 in der Probe 2 liegt.

Das Beugungsbild wird in der Bildebene 18 von einem Flächendetektor 19 aufgenommen. Es löst das Beugungsbild in der Bildebene 18 räumlich auf, bewirkt also eine Überabtastung. Der Flächendetektor 19 umfasst rein exemplarisch ein Lichtleitfaserbündel, welches ein

Detektorarray speist. Die Ausdehnung des Lichtleitfaserbündeleingangs ist so groß, dass damit die Ausdehnung des Beugungsbildes abgedeckt wird. Die einzelnen Lichtleitfasern im

Leichtleitfaserbündel sind an ihren Ausgängen in eine andere geometrische Anordnung gebracht, als am Lichtleitfaserbündeleingang, nämlich in Form eines längserstreckten Steckers, in dem die ausgangsseitigen Enden der Lichtleitfasern nebeneinander liegen. Der Stecker ist passend zur geometrischen Anordnung einer Detektorzeile ausgebildet, d. h. jedes

ausgangsseitige Ende einer Lichtleitfaser liegt genau vor einem Pixel der Detektorzeile. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Ausführung des Flächendetektors 19 rein exemplarisch ist. Grundsätzlich genügt für das Mikroskop 1 ein Flächendetektor 19, der in der Bildebene 18 eine Überabtastung des Beugungsbildes vornimmt. Insbesondere kann es sich beim

Flächendetektor 19 auch um eine rechteckige Detektorfläche in der Bildebene 18 handeln, wie es in den nachfolgend beschriebenen Fig. 2 bis 4 der Fall ist. Das Steuergerät C steuert alle Komponenten des LSM 1 , insbesondere Scanner 10 und

Flächendetektor 19. Das Steuergerät nimmt für verschiedene Scanstellungen die Daten des Beugungsbildes auf, analysiert dessen Beugungsstruktur und erzeugt ein hochaufgelöstes Gesamtbild der Probe 2. Da der Beleuchtungsfleck 14 in der Ausführungsform der Fig. 1 exemplarisch ein Punkt-Spot ist, wäre das Beugungsbild ein Airy-Scheibchen. Im Mikroskop 1 kommt jedoch durch das Modul 15 eine spektrale Selektion derart zum Einsatz, dass das Beugungsbild

wellenlängenabhängig modifiziert wird und somit, in der Ausführungsform der Fig. 1 zwei Beugungsstrukturen enthält, die zwei Wellenlängenbereichen zugeordnet sind. Das dadurch in der Bildebene 18 entstehende Beugungsbild 23 besteht also aus mehreren

Beugungsstrukturen, deren Art und Geometrie nachfolgend noch erläutert werden wird. Das Modul 15 umfasst ein spektralselektives Element 20 und ist in der Abbildungseinrichtung 4 oder alternativ in der Beleuchtungseinrichtung 3 angeordnet. Nachfolgend wird zuerst die Wirkung und Anordnung des spektralselektiven Moduls 15 in der Abbildungseinrichtung 4 erläutert.

Ohne spektralselektives Modul 15 entstünde, wie bereits erwähnt, bei beugungsbegrenzter Abbildung des mit dem Beleuchtungsfleck 14 beleuchteten Punktes in der Fokalebene 29 in der zugeordneten konjugierten Bildebene 18 ein Beugungsbild, das aufgrund der kreisförmigen Appertur des Objektivs 13 ein Beugungsscheibchen ist. Die Entstehung solcher

Beugungsscheibchen wurde im Allgemeinen bei der Beschreibung bereits erläutert. Bei der Mikroskopie, wie sie in der EP 2317362 A1 beschrieben ist, wird durch Überabtastung des Beugungsbildes dessen Struktur analysiert, und im Zusammenhang mit den Scanpositionen, die eine Schrittweite haben, welche klein gegen die minimale Abmessung des

Beleuchtungsflecks 14 ist, kann eine Strukturaufklärung erfolgen, die über die

Auflösungsgrenze der beugungsbegrenzten Abbildung hinaus geht. Zur Erläuterung seien gedanklich zwei Stellen betrachtet, die in der Fokalebene 29 so eng beieinander liegen, dass sie mit der beugungsbegrenzten Auflösung nicht erfasst werden können. Beim Scannen des Beleuchtungsflecks 14 mit Schrittweiten, die klein gegen den Durchmesser des (in diesem Gedankenexperiment kreisförmigen) Beleuchtungsflecks sind, gelangt zuerst eine der beiden Stellen in den Beleuchtungsfleck. Die Strahlungsintensität im Beugungsbild steigt je mehr diese erste Stelle in den Beleuchtungsfleck 14 gerät. Der Beleuchtungsfleck 14 hat aufgrund seiner beugungsbegrenzten Eigenschaften eine Intensität, die zum Zentrum hin steigt. Somit steigt die Intensität der Strahlung im Beugungsbild in dem Maß, in dem die betrachtete erste Stelle mehr und mehr ins Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 rückt. Wenn das Zentrum des

Beleuchtungsflecks 14 über die betrachtete Stelle hinweggewandert ist, nimmt die Intensität der Strahlung von dieser ersten Stelle wieder ab. Wäre die gedanklich angenommene zweite Stelle nicht benachbart, würde die Strahlungsintensität im Beugungsbild wieder abklingen, wobei das Ansteigen und das Abnehmen der Strahlungsintensität im Beugungsbild exakt mit dem Verlauf der Beleuchtungsintensität des Beleuchtungsflecks 14 (unter Berücksichtigung der Schrittweite und der Fluoreszenzempfindlichkeit der ersten Stelle) korreliert. Da nun aber eine zweite Stelle in enger Nachbarschaft vorhanden ist, beginnt diese zweite Stelle ebenfalls

Fluoreszenzstrahlung zum Beugungsbild beizusteuern, und zwar umso mehr, je näher ihr das Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 rückt. Ansonsten gilt für die zweite Stelle natürlich genau das gleiche, wie für die erste Stelle. Im Ergebnis erhält man für die Schrittpositionen

Beleuchtungsintensitäten im Beugungsbild, die anders sind, als wenn nur eine einzelne fluoreszierende Stelle vorhanden wäre. Durch die Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 und Berücksichtigung der aktuellen Scanposition lässt sich damit mathematisch ermitteln, dass und auch in welchem Abstand zwei Stellen in der Fokalebene 29 fluoreszierten, obwohl diese zwei Stellen mit einer beugungsbegrenzten Auflösung für sich alleine nicht identifizierbar wären. In der dem Fachmann technisch bekannten Umsetzung wird zur Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 für jede Scanposition eine Gleichung aufgestellt, die mehrere

Unbekannte enthält, insbesondere Intensität und Abstand der Stellen in der Fokalebene 29. Durch die Vielzahl an Scanpositionen erhält man ein Gleichungssystem , das überbestimmt ist und es erlaubt, Strahlungsintensität und Abstand, d. h. damit auch die Lage, der

fluoreszierenden Stellen zu ermitteln. Dies wird nachfolgend noch erläutert werden.

Dieses Prinzip einer hochauflösenden Mikroskopie ist mit dem Mikroskop 1 nun dahingehend fortgebildet, dass das spektralselektive Modul 15 das Beugungsbild 23 in der Bildebene 18, welche der Fokalebene 29 konjugiert ist, so beeinflusst, dass es für zwei Wellenlängenbereiche (Farbkanäle) zwei unterschiedliche, punksymmetrische Beugungsstrukturen aufweist, die ein gemeinsames Symmetriezentrum haben. Dies ist in der Ausführungsform gemäß Fig. 1 dadurch erreicht, dass ein spektralselektiver Filter 20 Strahlung eines ersten

Wellenlängenbereichs reflektiert und Strahlung eines zweiten Wellenlängenbereichs transmittiert. Die Strahlung des reflektierten Wellenlängenbereichs wird über eine Optik 16 sowie einen lediglich der Kompaktheit des Strahlenganges dienenden Umlenkspiegel in die Bildebene 18 und damit auf den Flächendetektor 19 abgebildet. Für den ersten

Wellenlängenbereich entsteht damit als Beugungsstruktur das bereits erwähnte

Beugungsscheibchen. Die Strahlung des zweiten Wellenlängenbereichs wird hingegen vom spektralselektiven Filter 20 transmittiert und gelangt auf ein phasenmanipulierendes Element, beispielsweise eine Phasenmaske 17 oder ein LCOS-SLM. Die Strahlung des zweiten

Wellenlängenbereichs wird dann reflektiert und gleichermaßen über den Umlenkspiegel und die Optik als beugungsbegrenztes Bild in die Bildebene 18 abgebildet. Aufgrund der Wirkung der Phasenmaske 17 oder des LCOS-SLM ist die Beugungsstruktur hier nun kein

Beugungsscheibchen, sondern hat die Form eines Donut, ist also ringförmig in der Bildebene 18. Damit umgibt die Beugungsstruktur des zweiten Wellenlängenbereichs die des ersten Wellenlängenbereichs. Beide sind koaxial, haben also ein gemeinsames Symmetriezentrum in der Mitte der Bildebene 18 und damit auf dem Flächendetektor 19. Fig. 2 zeigt diese

Ausführungsform exemplarisch für einen quadratischen Flächendetektor 19, der mittels Pixel 22 das Beugungsbild 23 überabtastet. Das Beugungsbild besteht aus der ersten Beugungsstruktur 30, die dem ersten Wellenlängenbereich und damit Farbkanal zugeordnet ist. Sie hat die Form eines Beugungsscheibchens und ist punktsymmetrisch zu einem Symmetriezentrum 40, das in der Fig. 2 exemplarisch als weißer Punkt eingezeichnet ist. Die erste Beugungsstruktur 30 wird von einer ringförmigen, zweiten Beugungsstruktur 31 umgeben, die von der Strahlung gebildet wird, welche am spektralselektiven Filter 15 transmittiert und durch die Phasenmaske 17 oder das LCOS-SLM hinsichtlich der Phase beeinflusst wurde. Auch die zweite Beugungsstruktur 31 ist punktsymmetrisch zum Symmetriezentrum 40, umgibt die erste Beugungsstruktur 30 also koaxial. Die Wellenlängengrenzen der Farbkanäle sind durch den spektralselektiven Filter 15 definiert, der deshalb in einer Ausführungsform passend zu vorbestimmten Farbkanälen (Wellenlängenbereichen) gewählt ist. Die Kombination aus den Beugungsstrukturen 30, 31 bilden das Beugungsbild 23, d. h. die Beugungsstrukturen 30, 31 bewegen sich während der Mikroskopie räumlich nicht. Die ursprünglich nebeneinanderliegenden Beugungsscheibchen des Mikroskops gemäß WO 2016/020459 A1 sind nun durch die zwei koaxialen Beugungsstrukturen 30, 31 ersetzt.

Betrachtet man wieder gedanklich zwei in der Fokalebene 29 liegende Stellen, die so eng beabstandet sind, dass sie mit der beugungsbegrenzten Abbildung per se nicht auflösbar wären, stellt sich im Mikroskop 1 aufgrund des spektralselektiven Elementes 15 folgendes Verhalten ein, wenn man annimmt, dass die erste Stelle im ersten Farbkanal, dem die erste Beugungsstruktur 30 zugeordnet ist, und die zweite Stelle im zweiten Farbkanal dem die zweite Beugungsstruktur 31 zugeordnet ist, fluoresziert: Sobald der Beleuchtungsfleck 14 die erste Stelle erfasst, beginnt im Beugungsbild 23 das Zentrum , also die erste Beugungsstruktur 30, aufzuleuchten. Die Peripherie, also die zweite Beugungsstruktur 31 , bleibt hingegen noch dunkel, da keine Strahlung im zweiten Farbkanal ankommt, so lange nicht auch die zweite Stelle vom Beleuchtungsfleck 14 beleuchtet wird. Die Intensität in der ersten Beugungsstruktur

30 steigt so lange an, bis die erste Stelle vom Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 erfasst wird. Dann ist die Intensität im Zentrum , also der Beugungsstruktur 30, des ersten Farbkanals maximal. Analoges gilt für die Beugungsstruktur 31 und den zweiten Farbkanal sowie die zweite Stelle, wenn der Beleuchtungsfleck 14 weitergerückt ist. Im Ergebnis erhält man beim

Überfahren der beiden Stellen mit dem Beleuchtungsfleck 14 ein Hellerwerden und Verblassen der ersten Beugungsstruktur 30 und ein zeitlich etwas später auftretendes Hellerwerden und Verblassen der zweiten Beugungsstruktur 31 . Ein gleichzeitiges Heller- und Dunklerwerden würde sich hingegen zeigen, wenn an einem Ort eine Fluoreszenz in beiden Farbkanälen emittiert würde. Durch die Bildauswertung kann somit sowohl die Ortsinformation als auch die Farbinformation extrahiert werden. Durch die koaxiale Lage der beiden Beugungsstrukturen 30,

31 ist die Ortsauflösung von der Farbauflösung nicht beeinträchtigt.

Die Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 in Kombination mit den Scanpositionen erlaubt es, für jede Scanposition eine Gleichung aufzustellen, die nicht nur Lage und

Fluoreszenzintensität der beiden Stellen beinhaltet, sondern auch eine Aussage darüber, ob die erste oder zweite Stelle im ersten oder zweiten Farbkanal leuchtet. Durch die Vielzahl an Scanpositionen ergibt sich ein überbestimmtes Gleichungssystem, das es erlaubt, auch die zusätzliche Zuordnung der leuchtenden Stellen zu den beiden Farbkanälen zu ermitteln. Auf diese Weise kann das Mikroskop 1 und das zugeordnete Mikroskopieverfahren zwischen zwei Wellenlängenbereichen (Farbkanälen) im hochaufgelösten Bild unterscheiden und gewinnt ohne zusätzliche Detektoren ein zweifarbiges Bild. Es sei betont, dass die koaxiale Lage der Beugungsstrukturen 30, 31 bei der Mikroskopie konstant bleibt, insbesondere skaliert die Lage keine Farbinformation. Sie dient lediglich dazu, dass die Beugungsstrukturen 30, 31 räumlich nicht vollständig übereinanderliegen und somit in der Bildauswertung unterscheidbare Farbinformationen liefern.

Die Beugungsstrukturen 30, 31 sind bei der Ausführungsform des spektralselektiven Moduls 15, wie es für die Fig. 1 zur Anwendung kommt, kreisrotationssymmetrisch. Der beschriebene Ansatz ist nicht auf die Verwendung solcher Strukturen oder von nur zwei

Wellenlängenbereichen (Farbkanälen) eingeschränkt. Fig. 3 und 4 zeigen andere

punktsymmetrische Formen für die Beugungsstrukturen.

Gemäß Fig. 3 sind die Beugungsstrukturen jeweils längsverzeichnete Flecke 32, 33, die rein zur Veranschaulichung als elliptische Flecke dargestellt sind. Sie sind jeweils punktsymmetrisch zum Symmetriezentrum 40, erstrecken sich aber entlang unterschiedlicher Achsen. In der Ausführungsform der Fig. 3 sind die Achsen orthogonal. Fig. 3 zeigt weiter, dass die

Beugungsstrukturen der Wellenlängenbereiche nicht zwingend disjunkt, d. h. nicht überlappend ausgeführt sein müssen. Aufgrund der Überbestimmung des Gleichungssystems sind durchaus überlappende Bereiche möglich, wie dies auch aus der WO 2016/020459 A1 , dort für den Fall nebeneinanderliegender Beugungsscheibchen, dem Fachmann bereits bekannt ist. Fig. 3 zeigt zusätzlich eine Option, die für alle Ausführungsformen, insbesondere mit der Verwendung eines Lichtleiter aufweisenden Flächendetektors 19, in Frage kommt. Hier weist der Flächendetektor 19 ausschließlich an denjenigen Stellen Pixel 22 auf, an denen auch Strahlungsintensität des Beugungsbildes 23 auftrifft. Da das Beugungsbild 23, wie bereits erwähnt, in der Bildebene 18 ruht, ist eine entsprechende Anpassung des Flächendetektors 19 möglich.

Fig. 4 zeigt, dass auch mehr als zwei Farbkanäle möglich sind. Die Beugungsstrukturen 34-37 haben hier die Form einer Hantel, wiederum symmetrisch zum Symmetriezentrum 40. Die Drehlage der Beugungsstrukturen 34-37 hängt von der Wellenlänge ab, so dass in der

Ausführungsform der Fig. 4 vier Wellenlängenbereiche, also Farbkanäle, realisiert sind. Die mehreren Farbkanäle sind deshalb möglich, da aufgrund der Vielzahl von Scanpositionen das erhaltene Gleichungssystem derart überbestimmt ist, dass sozusagen noch Platz für weitere Unbekannte im Sinne von Farbkanälen ist.

In den Ausführungsformen der Fig. 3 und 4 ist das spektralselektive Modul 15 und der ihm nachfolgende Strahlengang so ausgestaltet, dass alle Wellenlängenbereiche einer

Phasenmanipulation unterzogen werden und nicht nur, wie in Fig. 1 dargestellt, ein

Wellenlängenbereich. Fig. 5 zeigt eine Ausführungsform für ein solches spektralselektives Modul 15, bei der zwei Wellenlängenbereiche, also Farbkanäle, getrennt und unterschiedlich phasenmanipuliert werden, wie dies beispielsweise in der Ausführungsform der Fig. 3 der Fall ist. Das spektralselektive Modul 15 weist einen spektralselektiven Filter 20a auf, der die einfallende Strahlung nach zwei Wellenlängenbereichen trennt, die durch unterschiedliche Strichlierung angedeutet sind. Die Strahlung des einen Wellenlängenbereichs fällt durch ein erstes phasenmanipulierendes Element 17a, die Strahlung des anderen Wellenlängenbereichs durch ein zweites, anderes phasenmanipulierendes Element 17b. Anschließend werden die derart unterschiedlich manipulierten Strahlungen von einem Vereinigungselement 20b wieder überlagert und gelangen von dort zur Optik 16.

In der bisherigen Beschreibung wurde davon ausgegangen, dass das spektralselektive Modul 15 in der Abbildungseinrichtung 4 und dort in dem Teil des Strahlengangs liegt, der ausschließlich für die Abbildung wirkt. Mit anderen Worten, das spektralselektive Modul 15 wird in diesen Ausführungsformen nicht von Beleuchtungsstrahlung durchsetzt. Die Farbkanäle, welche vom spektralselektiven Modul 15 durch die unterschiedlichen Beugungsstrukturen erzeugt werden, sind damit Farbkanäle der fluoreszierenden Probe. Die Ausführungsformen des Mikroskops bzw. Mikroskopieverfahrens unterscheiden folglich die fluoreszierende Strahlung hinsichtlich deren Wellenlängenbereich (Farbkanal). Das spektralselektive Modul 15 kann jedoch auch in der Beleuchtungseinrichtung 3 angeordnet werden. Diese Anordnung ist in Fig. 1 gestrichelt gezeichnet. Das spektralselektive Modul 15 liegt dann in einem Bereich des Strahlengangs, der ausschließlich von Beleuchtungsstrahlung durchsetzt wirkt. Es wirkt nicht auf die Abbildung, sondern nur auf die Beleuchtung. Das spektralselektive Modul 15 teilt dann den Beleuchtungsfleck 14 in zwei Beleuchtungs- Beugungsstrukturen 38, 39 auf, wie es in der Darstellung der Fig. 6 gezeigt ist. Sie

unterscheiden sich und haben das gemeinsame Symmetriezentrum 40. Das spektralselektive Modul 15 im Beleuchtungsstrahlengang schafft damit Beleuchtungsfarbkanäle, wohingegen die Anordnung des spektralselektiven Elementes 15 im Abbildungsstrahlengang

Detektionsfarbkanäle erzeugte. Die Probe wird dadurch nicht mehr mit einem z. B.

Beugungsscheibchen beleuchtet, sondern mit mehreren, unterschiedlichen Beleuchtungs- Beugungsstrukturen 38, 39. Im Ergebnis erhält man damit auch auf dem Flächendetektor 19 eine Situation wie in Fig. 3, wobei die Beugungsstrukturen 30, 31 nun nicht mehr

unterschiedlichen Farbkanälen der Fluoreszenzstrahlung, d. h. einer Fluoreszenzantwort, der Probe 2 entsprechen, sondern unterschiedlichen Farbkanälen der Anregung, d. h. einer Fluoreszenzempfindlichkeit, der Probe 2. Ansonsten können alle Varianten, die anhand der Fig. 2 bis 4 für die Ausbildung der Beugungsstrukturen erläutert wurden, gleichermaßen auch für die der Anordnung des spektralselektiven Moduls 15 in der Beleuchtungseinrichtung 3 verwendet werden. Aufgrund der anderen geometrischen Lage wird jedoch in der Regel die Ausgestaltung des spektralselektiven Moduls 15 bei Anordnung in der Abbildungseinrichtung 4 etwas anders aussehen, als bei der Anordnung in der Beleuchtungseinrichtung 3. Grundsätzlich kommen für den spektralselektiven Filter 20 und das phasenmanipulierende Element 17 des Moduls 15 eine Vielzahl von Elementen in Frage, die einen chromatischen Effekt haben, beispielsweise ein Keil, ein Prisma, eine Einspiegelung oder ein Linsen-Dublett.

In einer Variante zu den oben genannten Alternativen kann das spektralselektive Modul 15 auch in einen Teil des Strahlenganges gelegt werden, der sowohl bei der Beleuchtung als auch bei der Abbildung durchlaufen wird, oder es werden zwei spektralselektive Module 15 verwendet. Auf diese Weise kann ein Übersprechen bei der simultanen Anregung zweier Farbstoffe mit einer Wellenlänge unterdrückt werden. Zusätzlich ergeben sich Möglichkeiten für Kalibrationsmessungen. Da Beleuchtung und die Abbildung bzw. die entsprechenden Einrichtungen eine gemeinsame optische Scaneinrichtung haben, welche den Beleuchtungsfleck über die Probe führt und zugleich den mit dem Beleuchtungsfleck zusammenfallenden Punkt, an dem die Probe abgebildet wird, in Bezug auf den Detektor wieder descannt, kann man eine Zoomoptik 21 in den Abbildungsstrahlengang setzen. Sie erlaubt es, eine Anpassung des Beugungsbildes 23 an die Größe des Flächendetektors 19 vorzunehmen.

Bei Anordnung des spektralselektiven Moduls 15 in der Beleuchtungseinrichtung 3 kann der Fall eintreten, dass bei Beleuchtung mit zwei oder mehr Beleuchtungsfarbkanälen die kürzere Beleuchtungswellenlänge ein Fluoreszenzsignal im Wellenlängenbereich der erzeugten Fluoreszenz von der langwelligeren Beleuchtung generiert. Die Folge davon wäre, dass eine der Strukturen als verschobenes Schattenbild noch einmal auftaucht. Mittels einer geeigneten Korrelationsrechnung kann der Schattenbildanteil bestimmt und eliminiert werden.

Zur genaueren Erläuterung der mathematischen Analyse der Aufstellung des oben genannten Gleichungssystems sei zur Einführung zuerst der Fall betrachtet, dass nur eine Farbe auftritt, d. h. das spektralselektive Modul 15 fehlt. Bezeichnet man mit ö(r) das Objekt, mit £(r) die Punktbildverwaschungsfunktion (PSF) der Anregung und mit / (r) die PSF der Detektion, erhält man als Signal ö(r,p) für jeden Bildpunkt folgende Gleichung, wobei r den Abstand vom Ort p des Beleuchtungsflecks bezeichnet:

Eine Fourier-Transformation von bezüglich des Ortes p liefert:

Das Produkt im Realraum wird im Fourier-Raum die folgende Faltung:

Führt man eine Trägerfunktion am Ort r ein:

ergibt sich als Gleichung (2) Unterschiedliche Orte r am Flächendetektor werden mittels eines Wiener-Filters kombiniert wobei die entsprechenden spektralen Leistungsdichten des Signals

("O") und des Rauschens (n) sind. Dies vorausgeschickt erhält man für mehrere Farbkanäle, also eine wellenlängenabhängige PSF mit verschiedenen H _c (r, ω), die an jedem Pixel des Flächendetektors 19 gemischt werden, die durch die PSF vorgegebenen Gewichte wie folgt:

In dieser Gleichung ist c der Farbkanalindex. Schreibt man die Gleichung (7) als Matrix erhält man:

Berücksichtigt man zusätzliches Rauschen nimmt Gleichung (8) folgende Form an:

Das Objekt kann man mittels eines Operators gewinnen, der eine

Frequenzfilterung und eine Farbkanalentmischung kombiniert:

Wie bei der Ableitung des Wiener-Filters muss nun der quadratische Abstand zwischen dem rekonstruierten und dem wirklichen Objekt für jede Frequenz und jeden Farbkanal minimiert werden:

Unter Verwendung der Gleichung (9) erhält man damit:

Unter Anwendung derselben Grundsätze wie bei der Ableitung des Wiener-Filters, die dem Fachmann beispielsweise aus http://en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution bekannt sind, erhält man:

Hierin sind die spektralen Leistungsdichten des Signals für jeden Farbkanal und

das Rauschen:

Wenn Emissionsspektren von Fluorophoren überlappen, kann es sein, dass in einem Farbkanal Schatten eines Objekts aus dem anderen Farbkanal auftreten. Solche Schattenbilder werden mit derselben Detektions-PSF verzerrt, wie das Hauptbild im eigentlichen Farbkanal. Dadurch ist ein im Kanal detektiertes Bild eine Überlagerung der Bilder

entsprechend den den unterschiedlichen Farbkanälen zugeordneten Objekten:

Hier ist eine Entmischungsmatrix. Bei beispielsweise zwei Farben erhält man dann:

Die wahren Bilder zu gewinnen ist einfach, wenn deren Mischungsmatrix

bekannt ist. Ist dies nicht der Fall, kann sie durch Minimierung einer Kreuzkorrelation zwischen den erzeugten Bildern gewonnen werden, d. h. die Matrix ist so zu bestimmen, dass ihre Werte die niedrigste Kreuzkorrelation für die am besten entmischten Objekte sicherstellt. Ein weiteres und auch alternatives Vorgehen zur Analyse der Daten des Flächendetektors 19 basiert auf dem von Sheppard et al., Optik 80, Nr. 2, S. 53, 1982, beschriebenen Ansatz.