MICROSCOPE A PLASMON DE SURFACE A HAUTE RESOLUTION AVEC INTERFEROMETRE HETERODYNE EN POLARISATION RADIALE

Domaine technique de l'invention

La présente invention concerne un microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant un interféromètre hétérodyne et utilisant une polarisation radiale du faisceau de génération du plasmon de surface.

Le domaine technique de l'invention est celui de la conception de systèmes d'imagerie permettant la détection de faibles variations d'indice de réfraction dans un milieu d'observation et/ou d'objets diélectriques de l'ordre de quelques nanomètres ne présentant pas nécessairement des propriétés optiques remarquables (fluorescence, luminescence, résonance plasmonique localisée ou encore résonance Raman) et localisés près d'une surface et immergés dans tout milieu d'indice de réfraction inférieur à 1,5 et notamment dans l'air ou dans un milieu aqueux.

Etat de la technique

Un plasmon de surface est une onde électromagnétique de surface qui se propage au niveau d'une interface métal/ milieu diélectrique d'observation.

La naissance de cet effet, c'est à dire l'excitation du plasmon de surface nécessite des conditions de couplage optique particulières. Il faut en effet un milieu de couplage et une lumière incidente à l'interface métal/milieu diélectrique sous un angle particulier qu'on appelle généralement angle de résonance plasmon θ _p .

De part les propriétés de résonance des plasmons de surface, l'angle θ _p (en d'autres termes la condition de couplage) est très sensible aux moindres modifications des propriétés optiques au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique. Cette sensibilité rend exploitable le plasmon de surface pour la réalisation d'images d'objets de très petites tailles situés au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique, lesdits objets modifiant les propriétés optiques du

plasmon de surface au niveau de cette interface ce qui permet d'obtenir un contraste entre l'objet et son milieu.

En outre le plasmon de surface étant une onde évanescente, il permet de s'affranchir des effets de volume au sein du milieu d'observation. Le principe d'excitation du plasmon dans la microscopie de plasmon de surface est très souvent illustré dans la littérature en référence à la configuration dite de Kretschmann-Raether. Celle-ci prévoit le dépôt sur une face d'un prisme de verre, en contact avec un milieu diélectrique tel que l'air, d'une couche métallique de l'ordre de 50 nanomètres d'épaisseur. Lorsqu'un faisceau lumineux de forte intensité traverse le prisme et rencontre la couche métallique sous l'angle d'incidence θ _p un plasmon de surface prend alors naissance dans le métal et l'onde évanescente qui en résulte est confinée sur quelques centaines de nanomètre au niveau de l'interface métal/ milieu diélectrique.

Parmi tous les rayons arrivant à la surface, uniquement ceux qui ont un angle d'incidence suffisamment proche (typiquement inférieur à 2 degrés) de l'angle de résonance plasmon θ _p excitent le plasmon de surface et contribuent à l'imagerie par plasmon de surface. Les plasmons de surface sont à ce jour essentiellement utilisés comme capteurs chimiques et/ou biologiques, et il existe d'ailleurs des systèmes commerciaux basés sur la configuration de Kretschmann. Cependant, la résolution de ces systèmes, limitée par la propagation latérale du plasmon, est relativement faible, de l'ordre de quelques dizaines de microns seulement dans les longueurs d'onde visibles.

Depuis une dizaine d'années, quelques groupes de recherche fondamentale ont développé une génération de microscopes à plasmons de surface dont la résolution n'est plus limitée, comme auparavant, par la propagation latérale du plasmon, mais simplement par la diffraction.

Ces différents microscopes ont tous pour idée commune de focaliser un faisceau laser avec un objectif à forte ouverture numérique et à fort grossissement au niveau d'une surface qui présente une couche métallique (or, argent, cuivre, aluminium etc) de quelques dizaines de nanomètres d'épaisseur. Ceci permet à la fois d'exciter et de confiner le plasmon de surface de film mince.

On peut cependant différencier ces techniques d'une part par le profil d'illumination à l'entrée de l'objectif et d'autre part par le mode de détection du signal.

En effet quand un faisceau arrive à l'entrée de l'objectif du microscope, seul un anneau très fin de lumière contribue à l'excitation du plasmon de surface. La partie du faisceau réfléchi qui contient l'information liée au plasmon de surface est très fine et se retrouve noyée dans le reste du faisceau lumineux. Sans traitement particulier du faisceau, l'imagerie serait quasiment impossible.

Dans certaines publications, notamment dans la demande de brevet japonais JP 2003083886, l'illumination et la détection reposent sur un filtrage spatial, à l'entrée de l'objectif, des rayons lumineux qui contribuent à l'excitation plasmon et sur l'élimination de ceux qui n'y contribuent pas.

Dans certaines autres publications telles que le brevet américain US 6,970,249 Bl ou mieux encore dans l'article de M. G, Somekh, S. G Liu, T. S Velinov and C. W See, « Optical V(z) for high-resolution plasmon microscopy », Optics Letters 25, 823 (2000) et, « High-resolution scanning surface-plasmon microscopy », Applied Optics 39, 6279 (2000), il a été proposé l'utilisation d'un interféromètre. Bien que plus lourde à mettre en œuvre cette méthode apporte cependant une bien meilleure sensibilité. L'article de Somekh et al. propose comme représenté aux figures IB et 2A un dispositif de microscopie qui permet une mesure de la phase mais qui ne filtre pas les rayons lumineux ne contribuant pas à l'excitation plasmon en éliminant sa partie inintéressante. Le couplage de ces deux aspects techniques présente l'avantage d'avoir une résolution et une sensibilité inégalée par rapport aux autres techniques connues à ce jour

Toutefois dans cette forme de mise en œuvre particulière, on constate, comme cela est représenté à la figure 2B qui représente la distribution de l'intensité du faisceau laser au niveau du plan focal arrière de l'objectif après rétro- diffusion et repassage par l'objectif, deux anneaux en forme de croissant qui correspondent à la zone du faisceau de départ qui a participé à l'excitation du plasmon de surface. La zone des rayons concernés présente une orientation privilégiée qui est celle de la direction de polarisation de la lumière à l'entrée de

l'objectif. Dans le dispositif proposé par Somekh, aucun rayon ne contribue à l'excitation du plasmon de surface dans la direction orthogonale (verticale passant par 0 dans la figure 2B) et il n'y a qu'une fraction de l'énergie lumineuse incidente qui participe à l'excitation du plasmon de surface. On connaît enfin du document US 2004/0100636 la possibilité d'obtenir de meilleures résolutions d'images avec un faisceau d'excitation polarisé radialement. Toutefois, ce document ne divulgue aucun exemple d'une structure de microscope mettant en œuvre ce principe ni aucune mesure effectuée avec une polarisation radiale qui permette de valider ce principe de mesure évoqué. Un but de la présente invention est de procurer un microscope à plasmon de surface à haute résolution qui présente une résolution et une sensibilité accrue par rapport aux microscopes à plasmon de surface existant.

Un autre but de l'invention est de fournir un microscope à plasmon de surface qui permette l'observation de molécules et particules dans des milieux diélectriques aqueux, et notamment dans des liquides biologiques.

L'invention vise notamment à procurer un microscope à plasmon de surface à haute résolution qui permette la détection et la visualisation d'objets de très faibles tailles, de l'ordre du nanomètre, tels que des molécules biologiques par exemple, sans avoir recours à des marqueurs chimiques, optiques ou radioactifs de ces objets.

Un autre but de l'invention est enfin de fournir un microscope à plasmon de surface simple à réaliser et à utiliser.

Exposé de l'invention Les différents objectifs ainsi définis sont atteints conformément à la présente invention grâce à un microscope à plasmon de surface à balayage à haute résolution comportant essentiellement : a) une source de lumière cohérente, et b) un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif à grande ouverture numérique, une huile à immersion et une lamelle de verre, et

c) une couche métallique recouvrant une surface de la lamelle de verre du milieu de couplage qui n'est pas en en contact avec l'huile d'immersion de ce dernier, la couche métallique étant apte à être mise en contact avec un milieu d'observation contenant un échantillon à observer et à émettre un plasmon de surface généré par excitation d'au moins un faisceau lumineux issu de la source de lumière, et d) un interféromètre de Twyman-Green en mode hétérodyne apte à diviser un faisceau lumineux émis par la source de lumière en au moins un faisceau de référence et au moins un faisceau de mesure dirigé vers le milieu de couplage et la couche métallique pour générer un plasmon de surface, l'interféromètre étant positionné entre la source lumineuse et l'objectif du milieu de couplage pour former un faisceau interférométrique entre le faisceau de référence et du faisceau de mesure après réflexion de chacun d'eux respectivement par un miroir et par la couche métallique, et e) des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, et f) des moyens de détection du faisceau interférométrique issu de l'interféromètre, et g) des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique.

Le microscope de l'invention se caractérise par le fait qu'il comporte, disposé entre la source lumineuse et l'interféromètre, au moins un convertisseur de polarisation linéaire en polarisation radiale des faisceaux lumineux émis par la source lumineuse, et permettant la détection d'objets diélectriques et métalliques d'un diamètre inférieur à 10 nm, sans marquage desdits objets.

Ainsi, le microscope de l'invention se distingue par rapport à l'état de la technique en ce qu'il permet une conversion en polarisation radiale du faisceau de génération du plasmon de surface.

L'introduction d'une telle faculté d'illumination par un faisceau polarisé radialement de l'interface couche métallique/milieu diélectrique d'observation procure un progrès significatif par rapport à l'état de la technique parce qu'elle

permet, comme il sera présenté par la suite, une amélioration de la résolution des images obtenues d'un facteur 3 et de la sensibilité d'un facteur 4.

L'invention a également pour objet un procédé de microscopie de plasmon de surface à haute résolution par interférométrie hétérodyne développé pour la mise en œuvre du microscope de l'invention. Selon ce procédé :

- on illumine par un faisceau lumineux dit de mesure produit par un faisceau de lumière cohérente introduit dans un interféromètre de Twyman-Green en mode hétérodyne, un échantillon à imager disposé sur une couche métallique revêtant une lamelle de verre d'un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant également un objectif (à grande ouverture numérique et une huile à immersion , et

- on balaye la surface de la couche métallique à l'aide du faisceau de mesure guidé par des moyens de balayage, et

- on détecte par des moyens de détection un faisceau lumineux interférométrique en sortie dudit interféromètre de Twyman-Green, et

- on traite ledit faisceau interférométrique et on forme une image du plasmon de surface émis par le surface métallique au contact de l'échantillon à imager par des moyens de traitement et de formation d'une image

Ce procédé se caractérise selon l'invention par le fait que l'on polarise radialement le faisceau de lumière cohérente par un convertisseur de polarisation avant son entrée dans rinterféromètre de manière à illuminer l'échantillon à imager sur la couche métallique du milieu de couplage à l'aide d'un faisceau de mesure présentant une symétrie radiale par rapport à son axe de propagation.

La conversion de polarisation induite par le procédé de l'invention permet une variante tout à fait nouvelle et avantageuse dans le domaine de la microscopie de plasmon de surface à haute résolution qui consiste à réaliser une imagerie en mode différentiel, qui permet d'améliorer encore le contraste et la dynamique des images obtenues. Selon cette variante avantageuse du procédé de l'invention, on polarise alternativement à l'aide du convertisseur de polarisation le faisceau de lumière cohérente en mode pur p (polarisation radiale) et en mode pur s (polarisation azimutale) et l'on balaye linéairement de façon alternative et synchrone de la polarisation alternative du faisceau de lumière cohérente la

surface de la couche métallique par le faisceau de mesure polarisé alternativement en mode pur p et en mode pur s.

Description des dessins D'autres caractéristiques et avantages du microscope de l'invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faite en référence aux figures annexées parmi lesquelles :

- la Figure IA représente le principe d'excitation et de confinement du plasmon de surface dans un microscope de l'art antérieur avec un faisceau lumineux focalisé à l'interface métal/milieu diélectrique ;

- la Figure IB représente le principe d'excitation et de confinement du plasmon de surface dans un microscope de l'art antérieur avec un faisceau lumineux défocalisé dans l'interface métal/milieu diélectrique ;

- la Figure IC représente une courbe expérimentale V(z) dans l'eau obtenue avec un microscope à plasmon de surface de l'art antérieur en polarisation linéaire ;

- la Figure 2A représente un microscope à plasmon de surface à haute résolution tel que connu de l'art antérieur mettant en œuvre une excitation et un confinement du plasmon de surface tel que représenté à la Figure IB ; - la Figure 2B représente le profil de distribution de lumière réfléchie par la surface métallique de génération du plasmon de surface à la sortie de l'objectif du microscope de la Figure 2A ;

- la Figure 2C représente la réponse impulsionnelle du microscope de la Figure 2A en polarisation linéaire par calcul numérique de la distribution de la lumière focalisée au niveau d'un l'interface entre une couche métallique d'or et un milieu diélectrique formé par de l'eau, avec un objectif d'ouverture numérique égale à 1.65 ;

- la Figure 3A, représente schématiquement un microscope à plasmon de surface à haute résolution conforme à la présente invention ; - la Figure 3B représente le profil de distribution de lumière réfléchie par la surface métallique de génération du plasmon de surface à la sortie de l'objectif du microscope de l'invention représenté à la Figure 3A ;

- la Figure 3C représente la réponse impulsionnelle du microscope de la Figure 3A en polarisation radiale par calcul numérique de la distribution de la lumière focalisée au niveau d'un l'interface entre une couche métallique d'or et un milieu diélectrique formé par de l'eau, avec un objectif d'ouverture numérique égale à 1.65 ;

- les Figures 4A et 4B représentent respectivement l'image d'une particule de Latex de 50 nanomètres de diamètre obtenue avec le microscope de l'art antérieur représenté à la Figure 2A et avec le microscope de l'invention représenté à la Figure 3A ; - la Figure 5 représente schématiquement l'effet de conversion de polarisation du champ électrique du faisceau lumineux de génération du plasmon de surface mis en œuvre dans le microscope de la présente invention

- la Figure 6 représente en détail un mode de réalisation préféré du microscope de la présente invention, tel que représenté schématiquement à la Figure 3A.

Description détaillée de modes de réalisation de l'invention

La présente invention propose un microscope à plasmon de surface à balayage à haute résolution fonctionnant selon le principe de l'effet dit V(z) qui prévoit que la réponse V du microscope varie en fonction de la distance de défocalisation z par rapport à l'interface couche métallique/milieu diélectrique d'observation du microscope.

Les premières expérimentations concluantes d'exploitation de ce principe de l'effet V(z) ont été présentées notamment dans les articles de M. G, Somekh, S. G Uu, T. S Velinov and C. W See, « Optical V(z) for high-resolution 2p plasmon microscopy », Optics Letters 25, 823 (2000) et, « High-resolution scanning surface-plasmon microscopy », Applied Optics 39, 6279 (2000) précédemment cités pour les mesures dans l'air et dans l'article L. Berguiga, S. Zhang, J. Elezgaray and F. Argoul "High resolution Surface Plasmon imaging in air and in liquid: V[z) curve and operating conditions", Optics Letters 32, 509 (2007) pour les mesures dans l'eau.

Les éléments essentiels de ces expérimentations sont présentés rapidement ci-après en référence aux Figures IA à 2B et permettent de mieux comprendre l'effet V(z) en microscopie à plasmon de surface à haute résolution ainsi que par la suite le microscope de la présente invention qui sera décrit en référence aux Figures 3A à 6 plus particulièrement.

En référence aux Figures IA et IB, le principe d'excitation du plasmon de surface dans la microscopie de plasmon de surface à haute résolution est analogue à la configuration dite de Kretschmann. Il met en œuvre en premier lieu un milieu de couplage qui remplace le prisme de verre de la configuration dite de Kretschmann. Ce milieu de couplage est constitué d'un objectif O à forte ouverture numérique, typiquement au moins 1.2 NA, baignant par la surface d'un de ses dioptres sur une huile à immersion Hi qui elle-même est en contact avec une première face d'une lamelle de verre Gs. La face libre de la lamelle de verre Gs (c'est-à-dire celle non en contact avec l'huile) est recouverte d'une couche métallique M _s d'environ 45 nm d'épaisseur, par exemple d'or ou d'argent.

Au contact de la couche métallique et s'étendant dans le sens de Taxe Z sur la Figure IA s'étend un milieu diélectrique D d'analyse ou d'observation dans lequel sont immergés les objets que l'on souhaite observer. Ce milieu d'analyse D peut être l'air, l'eau ou une solution aqueuse ou plus généralement tout milieu diélectrique présentant un indice de réfraction inférieur ou égal à 1,5.

Un faisceau lumineux L tel qu'un faisceau laser, représenté par les doubles flèches sur les Figures IA et IB, est envoyé en direction de la couche métallique M ₅ au travers du milieu de couplage. Parmi tous les rayons atteignant la couche métallique M _s et l'interface de celle-ci avec le milieu diélectrique D, uniquement ceux qui se réfléchissent sur la couche métallique avec un angle d'incidence proche de l'angle de résonance plasmon θ _p excitent le plasmon de surface, représenté par les rayons en trait plein sur la Figure IA, à l'interface entre la couche métallique Ms et le milieu d'observation diélectrique D.

Comme cela est représenté sur la Figure IA, lorsque que le faisceau lumineux L est focalisé dans le plan de l'interface métal Ms/milieu diélectrique D, tous les rayons lumineux du faisceau incident sont réfléchis et arrivent à un photodétecteur (non représenté) placé à l'infini. Il est alors nécessaire pour

exploiter le plasmon de surface et obtenir une image de supprimer tous les rayons réfléchis ne participant pas à la génération du plasmon, c'est-à-dire tous les faisceaux représentés en pointillés sur le Figure IA.

Afin de contourner cette difficulté, grâce à une défocalisation du plan de l'objectif O derrière la surface métallique Ms comme l'indique la figure IB, par construction d'optique géométrique, tous les faisceaux réfléchis qui ne passent pas par le point O n'atteignent pas le photodétecteur placé à l'infini. En l'occurrence seul le faisceau en incidence normale et les rayons qui participent à la naissance du plasmon de surface arrivent au photodétecteur. Sur la Figure IB, la défocalisation du plan focal de l'objectif O derrière la surface métallique M _s à observer permet au plasmon de surface, excité par le rayon Ri de se propager, de réémettre, pendant toute sa propagation à l'interface des rayons avec un angle θ _p et seul celui qui passe par O, c'est à dire Rp se propage en direction du photodétecteur. Le rayon Rp présente un retard de phase par rapport au rayon Rn, qui est le rayon normal réfléchi dans l'axe de l'objectif. Ce retard de phase qui vaut Aφ =p + 4π n _o z{L -cosθ _p ), où n ₀ est l'indice de réfraction du milieu de couplage, est introduit par la propagation du plasmon de la surface à l'intérieur du spot de focalisation. Ce retard de phase varie avec la distance de défocalisation z selon l'axe Z dans le repère XOZ et la vitesse de propagation du plasmon de surface. En fixant la distance de défocalisation z, ce déphasage entre les rayons Rn et Rp est en conséquence uniquement lié à la condition de couplage, en d'autres termes à l'angle θ _p .

Une mesure de ce déphasage et un balayage sur la surface point par point permettent de sonder les variations locales de la résonance plasmon et permettent donc de visualiser, avec une résolution de la taille du spot de lumière focalisée, les variations locales des propriétés optiques au niveau de l'interface. L'image est alors formée point par point.

Cette technique a été mise en œuvre dans le microscope proposé dans la publication précédemment présentée, et dont le schéma est reproduit à la Figure 2A.

Comme le montre cette figure, le dispositif comporte une source laser LG dont le faisceau L est divisé en deux par un séparateur de faisceau BS, formant ainsi un interféromètre. Un des deux faisceaux après agrandissement par un élargisseur de faisceau BE passe par un milieu de couplage comprenant un objectif O qui permet l'excitation du plasmon grâce à sa très grande ouverture numérique et qui confine le plasmon grâce à son fort grossissement, une huile à immersion Hi et une lame de verre recouverte sur sa surface externe d'une couche métallique M _s d'or ou d'argent au contact d'un milieu diélectrique d'observation D. Le faisceau réfléchi par la couche métallique M _s repasse par l'objectif O et est recombiné avec l'autre faisceau qui a été réfléchi par un miroir M. Les deux faisceaux génèrent un signal d'interférence présentant une modulation temporelle générée par un décalage de la fréquence optique différent dans chaque bras de l'interféromètre. Le signal interférométrique est collecté par un détecteur optique PD et une électronique démodule le signal modulé. Le signal ainsi obtenu représente l'intensité d'un pixel de l'image. En déplaçant le faisceau incident sur la surface métallique M ₅ on peut ainsi réaliser un balayage complet de l'interface couche métallique Ms/milieu d'observation D et reconstituer une image complète.

Toutefois, comme le montre la Figure 2B, la distribution de lumière réfléchie par la surface métallique à la sortie de l'objectif du microscope n'est pas uniforme et seul deux croissants latéraux participent à la génération du plasmon de surface. Ceci présente l'inconvénient de procurer un microscope dont la réponse impulsionnelle se compose de deux lobes distincts de lumière. Alors, dans le cas d'observation de molécules uniques ou d'objets de taille inférieure à celle du faisceau lors du passage de celui-ci sur l'objet, chaque lobe passe sur l'objet, générant ainsi une image dédoublée de l'objet comme cela est par exemple représenté sur la Figure 2C.

La présente invention apporte un perfectionnement significatif à la technique antérieure, notamment en permettant l'obtention d'une distribution de lumière uniforme en sortie d'objectif du microscope, ce qui procure une résolution et une sensibilité grandement améliorée comme il va être présenté ci-après.

Un exemple particulier de réalisation du microscope de l'invention est présenté schématiquement à la Figure 3A dans lequel les éléments communs avec le microscope de la Figure 2A portent les mêmes références.

Le microscope de l'invention, de façon similaire au microscope de la Figure 2A, comporte une source de lumière cohérente LG, par exemple une source de type L.A.S.E.R., et notamment un laser à gaz hélium-néon (He-Ne).

à la sortie du laser se trouve un polariseur P complété d'un agrandisseur de faisceau BE pour élargir le faisceau laser L avant son entrée dans un interféromètre de Twymann-Green fonctionnant en mode hétérodyne qui comprend en premier lieu un diviseur de faisceau BS pour former deux faisceaux lasers L _Re f et L _Mes se propageant dans deux bras distincts de l'interféromètre.

Un premier faisceau laser L _Ref se propage dans un premier bras, dit de référence, qui comporte un miroir de réflexion M _R e _f de ce premier faisceau lumineux de référence. Le second faisceau laser L _M es _/ que nous appellerons de mesure se propage dans un second bras, dit de mesure, vers un milieu de couplage et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif O à grande ouverture numérique, une huile à immersion Hi et une lamelle de verre G ₅ .

De façon préférée, le bras de mesure comporte également au moins un agrandisseur de faisceau BE placé entre le séparateur de faisceau BS et le milieu de couplage.

De plus, il est également préférable et avantageux de prévoir dans chaque bras de l'interféromètre au moins un modulateur acousto-optique AOM _Ref ,

AOMMθS, par exemple constitué d'une cellule de Bragg, apte à introduire un décalage de la fréquence optique des faisceau lumineux L _Ref et L _Mes de référence et de mesure respectivement.

De façon privilégiée, l'objectif O du milieu de couplage présente une ouverture numérique supérieure ou égale à 1.2 dans l'air et à 1.55 dans une solution aqueuse et un grossissement supérieur à soixante fois. Ces caractéristiques de l'objectif O assurent ainsi une bonne excitation et un bon confinement du plasmon de surface.

Une surface extérieure de la lame de verre G _s du milieu de couplage est recouverte d'une couche métallique M _s au contact d'un milieu d'observation diélectrique D d'indice de réfraction inférieur à 1,5, par exemple de l'air ou de l'eau, contenant un échantillon à observer. Le faisceau de mesure L _Mes est ainsi dirigé vers le milieu de couplage et la couche métallique M ₅ pour générer un plasmon de surface à l'interface couche métallique/milieu diélectrique D.

Le faisceau de mesure L _Mes réfléchi par la surface métallique M _s repasse par l'objectif O et est ensuite recombiné avec le faisceau L _Rβf réfléchi par le miroir M _Ref dans le bras de référence. Les deux faisceaux génèrent un signal interférométrique collecté par des moyens de détection optique PD tel qu'un photomultiplicateur ou une caméra CCD par exemple ou encore un compteur de photons, ou une photodiode à avalanche.

Ce signal interférométrique présente une modulation temporelle générée par un décalage de la fréquence optique de chaque faisceau lumineux réfléchi dans chaque bras de rinterféromètre.

Pour démoduler ce signal et l'exploiter, le microscope comporte une électronique de démodulation appropriée ainsi que des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique essentiellement constitués de moyens informatiques de traitement et de visualisation.

Conformément à une caractéristique essentielle, le microscope de l'invention se distingue des microscopes de l'art antérieur et notamment de celui de Someck et al. en ce qu'il comporte, disposé entre la source lumineuse LG et l'interféromètre, au moins un convertisseur CP de polarisation linéaire en polarisation radiale du faisceau laser L émis par la source lumineuse LG.

Le passage en polarisation radiale du faisceau laser L émis par la source lumineuse LG permet en effet d'illuminer l'entrée de l'objectif O du milieu de couplage avec une polarisation qui présente, comme représenté à la Figure 5, une symétrie radiale par rapport à l'axe du faisceau. Le convertisseur de polarisation CP permet avantageusement de modifier la polarisation, et donc l'orientation de tous les vecteurs champ électrique Eo par rapport à l'axe de propagation du faisceau L de sorte que ces vecteurs soient tous orientés

radialement à l'axe de propagation afin que la contribution à la génération des plasmon de surfaces par les front d'ondes incidents sur la surface métallique Ms soit uniforme et optimale.

Ainsi, comme le représente la Figure 3B, la distribution de lumière réfléchie à la sortie de l'objectif est bien uniforme et circulaire, ce dont on peut conclure, par simple comparaison des Figures 2B et 3B, que la zone du faisceau qui contribue à l'excitation du plasmon est plus importante et sa surface sensiblement multipliée par deux par rapport aux microscopes de l'art antérieur.

En outre, le fonctionnement en polarisation radiale du microscope de plasmon de surface de l'invention permet d'améliorer de façon sensible la résolution et la sensibilité du microscope comme cela apparaît distinctement des Figures 2C et 3C qui représentent l'intensité lumineuse au niveau de l'interface calculée respectivement en polarisation linéaire et en polarisation radiale.

Comme cela ressort de la Figure 2C ₇ en polarisation linéaire, la distribution en intensité lumineuse au niveau de la surface du spot focalisé est constituée de deux pics intenses. En conséquence la réponse impulsionnelle du microscope d'un objet nanométrique individuel est donnée par deux pics brillants de part et d'autre de l'objet.

Par opposition, comme cela ressort de la Figure 3C, en polarisation radiale, le spot ne présente qu'un seul pic intense qui permet d'une part de reconcentrer le faisceau de lumière et d'autre part d'améliorer la réponse impulsionnelle du microscope. L'intensité du spot focalisé obtenue avec le microscope de l'invention est en conséquence quatre fois plus intense.

On constate par cette expérimentation que le microscope de l'invention procure une amélioration du profil de la réponse optique puisque l'on obtient un seul pic au lieu de deux avec les microscopes antérieures, mais également une augmentation par 3 de la résolution, qui passe de 600 nm à 200 nm.

Les profils d'intensité lumineuse calculés numériquement dans les Figures 2C et 3C ont été confirmés expérimentalement par l'imagerie plasmon de nanoparticules de Latex (50 nm) illustrées dans les Figures 4A et 4B pour des polarisations linéaire et radiale respectivement.

Afin de pouvoir réaliser des images complètes du plasmon de surface, le microscope de l'invention comporte des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, notamment des moyens piézoélectriques de déplacement en translation de la lamelle et/ou de l'objectif du milieu de couplage selon deux directions X, Y orthogonales dans un même plan.

Afin de garantir le contraste des images, les moyens de balayages du microscope de l'invention comprennent des moyens piézoélectriques de déplacement de l'objectif en translation selon une direction Z normale au plan de chacune des surfaces de la lamelle de verre du milieu de couplage et de la couche métallique, assurant ainsi une connaissance de la distance de l'objectif par rapport à la lamelle.

Pour compléter plus précisément la description du microscope de la présente invention, la Figure 6 représente en détail un microscope à plasmon de surface dans un mode préféré de réalisation conforme à l'invention. II comporte en premier lieu une source de lumière LG formée par un laser

He-Ne de longueur d'onde de 633 nm non polarisé, de puissance 5mW et d'une longueur de cohérence d'une vingtaine de centimètres.

Cette source lumineuse LG émet un faisceau laser L en direction de deux miroirs de renvoi successifs Ml et M2 avec un angle d'incidence de 45° environ. Ces deux miroirs Ml, M2 permettent un ajustement précis de la hauteur et du parallélisme du faisceau L par rapport à un plan horizontal et un axe qui définira le centrage de tous les composants optiques et notamment l'axe de symétrie de l'objectif de focalisation et la direction de l'incidence normale de la surface de la lamelle. Le faisceau L passe ensuite par un polariseur P qui polarise le faisceau verticalement, puis un diaphragme D ₀ . Le faisceau L est collimaté et agrandi au moyen d'un premier télescope Ti composé d'un objectif Oi et d'une lentille Li. Son facteur de grandissement est de 2,3. Le faisceau L passe ensuite au travers d'un convertisseur de polarisation CP qui convertit la distribution uniforme de la polarisation linéaire verticale initiale en une distribution spatiale de symétrie radiale de la polarisation par rapport au centre du faisceau.

II existe différentes techniques de conversion. A titre d'exemple, un système composé de trois couches de cristaux liquides a été choisi pour le microscope de l'invention car il présente l'avantage d'être compact. Cette solution technique n'est toutefois pas exclusive et d'autres types de convertisseurs peuvent être employés pour autant qu'ils permettent une conversion radiale du faisceau laser d'excitation.

En sortie de convertisseur CP, le faisceau laser L passe par un diaphragme Di puis entre dans un interféromètre de type Twyman-Green en mode hétérodyne dont la description est donnée ci-dessous. Le positionnement du convertisseur CP avant l'interféromètre est un critère important parce qu'il limite les défauts optiques du front d'onde, ceux ci étant éliminés par la suite par la technique interférométrique.

L'interféromètre comporte en premier lieu un cube séparateur BS par lequel le faisceau L passe et est divisé en deux faisceaux L _Me s, L _Re f d'égales intensités. Le premier faisceau L _Mes n'est pas dévié et continue sa trajectoire dans un premier bras de l'interféromètre que l'on nomme le bras de mesure (à droite du cube sur le schéma de la Figure 6). Le deuxième faisceau L _Ref est dévié de 90° par rapport au faisceau initial L. Il continue sa propagation dans un second bras que l'on nomme le bras de référence (en dessous du cube sur le schéma de la Figure 6).

Dans le bras de référence, le faisceau entre dans un modulateur acousto- optique AOM _Ref constitué par exemple d'une cellule de Bragg avec un angle d'incidence de 6,95 milliradians. Une onde acoustique de fréquence ω _ref = 75 MHz générée et envoyée dans AOM _Rβf par un synthétiseur S permet d'y générer un réseau de diffraction du faisceau L _Ref . Ainsi, au passage du faisceau L _Rβf dans AOM _Ref , la lumière subit un décalage de sa fréquence optique ω _op t de +ω _ref . L'angle d'incidence du faisceau est alors ajusté à l'angle de Bragg afin de transférer toute l'intensité lumineuse dans l'ordre +1 de diffraction. L'ajustement permet d'obtenir 85% de l'intensité de départ, le reste étant distribué par ordre d'intensité décroissante dans les ordres 0,-1, 2,-2 etc. Cet ajustement est possible par une platine de rotation (non représentée) fixée sous le modulateur AOM _Re f et nécessite une précision de positionnement supérieure à 0.1 milliradian.

A la sortie d'AOM _Re f, Le faisceau passe par un diaphragme D _Rβf de 2mm diamètre afin d'éliminer tous les faisceaux diffractés excepté l'ordre 1, qui est décalé en fréquence de ω _Ref . Ce faisceau arrive ensuite en incidence normale sur un miroir de référence M _Ref de qualité optique maximale et d'une planéité de λ /20, λ étant bien entendu la longueur d'onde du faisceau laser L.

Le faisceau L _Ref réfléchi repasse par le diaphragme D _Ref et arrive sur le modulateur acousto-optique A0M _Ref avec le même angle de Bragg qu'à l'aller. Le faisceau est à nouveau diffracté et décalé de +ω _Ref à la sortie du modulateur acousto-optique AOM _Re f. Ce faisceau est donc décalé en fréquence de 2xω _ref par rapport au faisceau initial, et se propage sur le même axe optique que celui-ci à la sortie du cube séparateur BS. Il repasse par le cube séparateur sans déviation et arrive sur un photodétecteur optique PD qui présente un diaphragme D ₂ à son entrée éliminant ainsi tous les ordres diffractés différents de l'ordre 1.

Dans le bras de mesure, le faisceau L _Me s entre dans un modulateur acousto-optique AOM _Mes , également de type cellule de Bragg. Une onde acoustique de fréquence ω _Me s=75,05 Mhz générée et envoyée dans AOM _Mes par le synthétiseur S permet d'y générer un réseau de diffraction du faisceau L _Mes - Au passage du faisceau L _Mes dans le modulateur A0M _MeS/ la lumière subit un décalage de sa fréquence optique ω _op t de +ω _M es- L'angle d'incidence du faisceau est ajusté à l'angle de Bragg afin de transférer toute l'intensité lumineuse dans l'ordre +1 de diffraction. A nouveau l'ajustement de AOM _Mes permet d'obtenir 85% de l'intensité de départ, le reste étant distribué par ordre d'intensité décroissante dans les ordre 0,-1, 2, -2 etc.

Cet ajustement est possible par une platine de rotation fixée sous le modulateur et non représentée sur la Figure 6.

Ici le principe de sélection de l'ordre 1 est différent de celui du bras de référence, pour des raisons d'encombrement et pour préserver un équilibrage des longueurs des deux bras (mesure et référence).

Les faisceaux lumineux diffractés aux différents ordres de L _Me s passent par un objectif O ₂ d'un grossissement de 10 fois et un filtre spatial F _s constitué d'un trou de 50 μm de diamètre, placé dans le plan focal image de l'objectif O ₂ .

Le filtre F ₅ permet d'une part de ne garder que l'ordre 1 de diffraction et d'autre part de nettoyer le faisceau L _Mes par un filtrage spatial. Le faisceau divergent est collimaté par une lentille L ₂ de focale 100 mm. Le télescope T ₂ ainsi formé par l'objectif O ₂ et la lentille L ₂ permet un agrandissement du diamètre du faisceau L _Mes d'un facteur 6,06.

A l'entrée de l'objectif du microscope O _M le diamètre du faisceau de mesure L _Mes est ainsi de 19 mm environ. Cette largeur de faisceau permet de recouvrir la pupille d'entrée de l'objectif avec une distribution de l'intensité lumineuse optimisée dans l'exemple présenté pour le fonctionnement du microscope en milieu liquide, afin d'observer notamment des molécules organiques en solution.

L'objectif de microscope OM choisi pour un fonctionnement en liquide possède une ouverture numérique de 1.65. Il s'agit d'un objectif particulier qui nécessite l'emploi de lamelles Gs de microscope d'indice de réfraction n= 1.78450 à 633 nm, supérieur au verre optique standard. Pour avoir le meilleur ajustement possible entre l'indice des lamelles Gs et celui de l'huile à immersion Hi nécessaire à la réalisation du milieu de couplage du microscope, une huile à immersion Hi telle que l'huile commerciale GEM refractometer liquid n(5893A)=1.81 ±0.005 de Cargille Laboratories est de préférence utilisée. Une couche métallique M ₅ d'or de 45 nanomètres est déposée sur une face externe de la lamelle G _s utilisée afin de permettre la génération d'un plasmon de surface à l'interface de cette couche métallique avec un milieu diélectrique d'observation D.

Dans ces conditions, le faisceau L _Mes pénétrant dans l'objectif O _M est focalisé exactement au niveau de l'interface entre la couche métallique Ms recouvrant la lamelle de verre Gs et le milieu diélectrique d'observation D, choisi en l'espèce pour être un liquide.

La lumière L _Mes après avoir traversé le milieu de couplage est réfléchie par la surface métallique M ₅ et repasse en sens inverse par l'objectif OM- La position du point de focalisation du faisceau laser de mesure L _Mes par rapport à la couche d'or M _s étant un paramètre fondamental pour le contraste des images obtenues par le microscope et c'est pourquoi cette position est contrôlée

au moyen d'un dispositif de positionnement piézo-électrique avec une résolution de quelques dizaines de nanomètres sur une gamme de 100 μm.

L'alignement de l'axe de l'objectif O _M avec la normale de la surface de la lamelle Gs est réalisé pour cette raison par un système de positionnement (non représenté sur la figure 6) quatre axes manuels sur l'objectif O _M et deux axes manuels contrôlant le support de la lamelle G _s .

L'objectif comme la platine sont en outre portés sur deux platines PLi, PL ₂ de déplacement piézoélectrique permettant une précision dans le déplacement selon deux directions X, Y orthogonales dans un même plan et en positionnement supérieure à 10 nm. Ces platines PLi, PL ₂ sont avantageusement commandées par des moyens de pilotage électroniques EC reliés à un ordinateur de commande et de contrôle COMP.

Le microscope de l'invention comporte également des moyens piézoélectriques de déplacement de l'objectif OM en translation selon une direction Z normale au plan de chacune des surfaces de la lamelle de verre G _s et de la couche métallique M _s recouvrant l'une d'elle

Si l'alignement est correct, le faisceau réfléchi par la couche métallique M _s revient alors par le filtre spatial F ₅ , l'objectif O ₂ et l'acousto-optique AOM _Mes , pour être mélangé avec le faisceau de référence L _ref dans le cube séparateur BS. Ce faisceau est décalé en fréquence de 2xω _Mes par rapport au faisceau initial.

En sortie de rinterféromètre on obtient un faisceau lumineux L _v unique formé de la somme les faisceaux de référence et de mesure L _Rθf , L _MθS et passe par un diaphragme D ₂ pour arriver sur un détecteur optique tel que par exemple un photodétecteur PD. Le signal optique V résultant de la détection du faisceau L _v présente une modulation temporelle à la somme et à la différence des fréquences optiques des deux faisceaux, c'est à dire 2ω _mes +2ω _re f et 2ω _mes -2ω _r ef.

étant donnée la réponse temporelle du détecteur PD seule la composante du signal V dont la fréquence correspond à la différence 2ω _m es-2ω _re f, dont la valeur vaut 100 kHz dans la configuration choisie est utilisée. Le signal de sortie V du photodétecteur PD est filtré par un filtre approprié

(non représenté) est ensuite démodulé par des moyens de détection synchrone Dtec qui reçoivent également le signal de référence de la détection synchrone

V _Re f, issu du mélange en fréquence et du filtrage des deux signaux modulant les acousto-optiques A0M _Ref et AOM _Mes par le mélangeur et filtre passe-bas F. Le signal démodulé V _d est envoyé pour conversion numérique-analogique sur le micro-ordinateur COMP lequel permet alors de former les images. Celles-ci sont construites point par point en balayant la position dans un plan parallèle à celui de la lamelle Gs par rapport à l'objectif 0 _M au moyen des platines PLi ₇ PL ₂ .

Le contraste de ces images s'appuie sur la technique de définition de profils V(z), obtenus par un balayage dans la direction Oz (normale à la lamelle Gs) et dont les variations sont fortement corrélées au plasmon de surface.

Le balayage se faisant à une position z fixe, il est ainsi possible d'obtenir des images du type de celle de la Figure 4B de particules de quelques dizaines de nanomètres, comme par exemple une particule de Latex de 50 nm de diamètre sur la Figure 4B, avec une résolution de l'ordre de 200 nm. Le microscope 1 de l'invention présente en outre l'avantage d'une grande versatilité d'utilisation et de configuration.

En particulier, le microscope de l'invention permet de réaliser une imagerie en microscopie plasmon à haute résolution en mode différentiel. Pour ce faire, on utilise le convertisseur de polarisation CP pour scanner linéairement de façon alternative et synchrone avec les platines PLi, PL ₂ par des faisceaux polarisés en mode pur p (polarisation radiale) et en mode pur s (polarisation azimutale), l'échantillon que l'on souhaite observer. On gagne ainsi en contraste des images dans la mesure ainsi qu'en dynamique.

Une autre utilisation du signal optique obtenu des faisceaux polarisés en mode pur s peut également être faite aux fins d'asservissement de la position verticale de l'objectif par rapport à l'échantillon à observer. En effet, l'analyse des signaux électriques établis à partir des faisceaux de lumière réfléchis polarisés en mode s permet de déterminer la valeur absolue de la position de l'objectif O _M , et à partir de cette position, il est ensuite possible de corriger tous les drifts mécaniques et thermiques inhérents à une microscopie de haute résolution.

Une telle technique de correction de la position de l'objectif du microscope n'est pas en soit totalement nouvelle en microscopie cependant, avec le

microscope de l'invention la particularité réside dans le fait que c'est le système d'imagerie lui même qui permet de faire la correction et non un système rapporté en parallèle au système d'imagerie. De ce fait, on ne complexifie point le microscope ni n'augmente de façon importante son coût d'ajustement, le tout sans perturber la mesure optique de plasmon. De plus, une telle faculté d'asservissement de la position de l'objectif OM par rapport à l'échantillon observé permet d'avoir une plus grande précision dans les mesures d'intensité de la fonction V(z).

Un autre avantage du microscope de la présente invention est de permettre la construction d'images en trois dimensions de la fonction V(z) mesurée. La construction de telles "cartes" tridimensionnelles de la fonction V(z) permet de trouver le plan optique de coupe où le contraste de l'image sera le meilleur. Pour ce faire, on réalise un post-traitement de ces images 3D puis par interpolation on détermine le plan Z où le contraste est optimum.