TIAN GENG (CN)
JIANG HUI (CN)
LI JIAN (CN)
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JIANG HUI (CN)
| CN101921840A | 2010-12-22 | |||
| CN101921842A | 2010-12-22 | |||
| US20100086914A1 | 2010-04-08 | |||
| CN101654691A | 2010-02-24 |
中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 (CN)
| 权利要求 1. 一种 HLA分型方法， 其包括： 1 )提供 n个样品， n为大于等于 1的整数， 所述样品优选地来 自哺乳动物， 更优选是人， 特别是人的血样； 2 )将待分析的 n个样品分成 m个小组， m为整数且 n > m > l ; 3 )扩增： 对于每一个样品， 使用一对标签引物， 在存在来自 该样品的模板时， 在适于扩增目的核酸的条件下进行 PCR扩增， 其中， 每一对标签引物由包含引物标签的正向标签引物和反向标 签引物 （均可以是简并引物）构成， 其中正向标签引物和反向标 签引物所包含的引物标签可以相同或者不同； 不同样品所用标签 引物对中的引物标签彼此不同； 4 ) 混合： 将各样品的 PCR扩增产物混合在一起， 获得 PCR 产物文库； 5 )打断： 将所得的 PCR产物文库进行不完全打断； 6 )建库： 结合文库接头标签技术， 将打断后的 PCR产物文库 构建 PCR-Free测序文库， 可以对文库添加不同的文库接头 ( adapter ) 以区分不同的 PCR-Free测序文库， 回收位于所用测 序仪最大读长长度到所用测序仪适用的最长 DNA长度范围之间 的所有 DNA条带， 具体而言是 450-750bp长度范围的 DNA片段； 7 )测序： 将回收的 DNA混合物利用二代测序技术， 优选的 是 Pair-End技术（例如 Illumina GA、 Illumina Hiseq 2000 )进行 测序， 获得打断后的 DNA的序列； 8 )拼接： 基于各个文库不同的文库接头序列和每个样品独特 的引物标签将获得的测序结果与样品一一对应，利用比对程序（例 如 Blast, BWA程序）把各个测序序列定位到 PCR产物的相应 DNA 参考序列上， 通过序列重叠和连锁关系， 从打断后的 DNA的序列 拼接出完整的目的核酸； 和 9 )分型： 将测序结果与 HLA数据库 （如 IMGT HLA专业数 据库） 中 HLA-DRB1 2号外显子的序列数据比对， 序列比对结果 100 %匹配的即为对应样本的 HLA-DRB1基因型别。 2. 权利要求 1所述的方法，其中每一对引物标签与 PCR引物对 组合成一对标签引物， 正反 PCR引物的 5，端分别具有 （或者任选 通过连接序列连接） 正向引物标签和反向引物标签。 3. 权利要求 1所述的方法，其中所述 PCR引物是用于扩增 HLA 的特定基因的 PCR引物， 优选是用于扩增 HLA-A/B的 2， 3, 4号 外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物， 更优选的所述 PCR引物如表 2所示。 4. 权利要求 1所述的方法， 其中所述引物标签针对用于扩增 HLA的特定基因的 PCR引物进行设计， 优选针对用于扩增 HLA-A/B的 2， 3, 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR 引物，特别是如表 2所示的 PCR引物进行设计，特别是所述引物标 签特别是包括表 1所示 95对引物标签中的至少 10对， 或至少 20对， 或至少 30对， 或至少 40对， 或至少 50对， 至少 60对， 或至少 70对， 或至少 80对， 或至少 90对， 或 95对（或者所述一组引物标签由表 1 所示 95对引物标签中的 10 - 95对 （例如 10 - 95对， 20 - 95对， 30 - 95对， 40 - 95对， 50 - 95对， 60 - 95对， 70 - 95对， 80 - 95 对， 90 - 95对， 或 95对）组成） ， 并且 所述一组引物标签优选地至少包括表 1所示 95对引物标签中 的 PI-1至 PI-10 , 或 PI-11至 PI-20 , 或 PI-21至 PI-30 , 或 PI-31至 PI-40,或 PI-41至 PI-50,或 PI-51至 PI-60,或 PI-61至 PI-70,或 PI-71 至 PI-80, 或 PI-81至 PI-90, 或 PI-91至 PI-95, 或者它们任何两个 或者多个的组合。 5. 权利要求 1所述的测序方法，其中所述 DNA打断包括化学打 断方法和物理打断方法， 其中所述化学方法包括酶切方法， 所述 物理打断方法包括超声波打断方法或机械打断方法。 6. 权利要求 1所述的测序方法， 其中所述纯化回收方法包括但 不限于电泳割胶回收， 也可以是磁珠回收。 7. 权利要求 1所述的测序方法，所述结合文库接头标签技术， 将打断后的 PCR产物文库构建 PCR-Free测序文库是指使用 m 种文库接头给 2 ) 中得到的 m个 PCR产物文库加上接头， 其中 每一个 PCR产物文库使用一种不同的文库接头， 从而构建 m个 接头标签测序文库；将 m个接头标签测序文库等摩尔混合在一起 构建混合接头标签测序文库。 其中连接文库接头的方法是指不通 过 PCR程序直接采用 DNA连接酶进行连接。 8. 一组引物标签， 其包括表 1所示 95对引物标签中的至少 10 对， 或至少 20对， 或至少 30对， 或至少 40对， 或至少 50对， 至少 60对， 或至少 70对， 或至少 80对， 或至少 90对， 或 95对 （或者所 述一组引物标签由表 1所示 95对引物标签中的 10 - 95对 （例如 10 - 95对， 20 - 95对， 30 - 95对， 40 - 95对， 50 - 95对， 60 - 95 对， 70 - 95对， 80 - 95对， 90 - 95对， 或 95对）组成） ， 并且 所述一组引物标签优选地至少包括表 1所示 95对引物标签中 的 PI-1至 PI-10 , 或 PI-11至 PI-20 , 或 PI-21至 PI-30 , 或 PI-31至 PI-40,或 PI-41至 PI-50,或 PI-51至 PI-60,或 PI-61至 PI-70,或 PI-71 至 PI-80, 或 PI-81至 PI-90 , 或 PI-91至 PI-95, 或者它们任何两个 或者多个的组合。 9. 权利要求 8所述的一组引物标签用于 PCR测序方法的用途， 其中特别是， 每一对引物标签与用于扩增待测目的序列的 PCR引 物对组合成一对标签引物， 正反 PCR引物的 5，端分别具有 （或者 任选通过连接序列连接）正向引物标签和反向引物标签。 10. 权利要求 9所述的用途， 其中 PCR引物是用于扩增 HLA的 特定基因的 PCR引物， 优选是用于扩增 HLA-A/B的 2， 3 , 4号外 显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物， 优选的所述 PCR引 物如表 2所示。 11. 权利要求 8的一组引物标签与用于扩增待测目的序列的 PCR引物对组合成的一组标签引物， 其中每一对引物标签与 PCR 引物对组合成一对标签引物， 正反 PCR引物的 5，端各具有 （或者 任选通过连接序列连接）一个引物标签。 12. 权利要求 11所述的标签引物，其中所述 PCR引物是用于扩 增 HLA的特定基因的 PCR引物，优选是用于扩增 HLA-A/B的 2， 3, 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物， 优选的所述 PCR引物如表 2所示。 13. 权利要求 11所述的标签引物用于 PCR测序方法的用途。 |
本发明涉及核酸测序技术领域， 特别是 PCR测序技术领域。 另外，本发明还涉及 DN A分子标签技术和 DNA不完全打断策略。 本发明的方法特别适用于第二代测序技术。 本发明的方法涉及 DNA序列的分型方法， 特别是 HLA基因高分辨率分型方法。 背景技术
人类白细胞抗原， 即 HLA(human leukocyte antigen, HLA)， 是迄今为止发现的多态性最高的基因系统之一 ， 它是调控人体特 异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主 要基因系统， 与同 种异体器官移植的排斥反应密切相关。 研究发现， 移植时， 供受 双方的 HLA相关基因匹配程度越高， 分辨率越高， 移植物的存 活时间越长。
HLA-SBT ( Sequence Based Typing, 基于 DNA序列的分型 方法）是当前 HLA高分辨率分型的主要方法。 该方法通过 PCR 扩增相应 HLA 的基因区域， 对扩增产物测序， 测序结果经过专 业的分型软件分型， 最终得到样本的 HLA基因型别信息。 其具 有直观、 高分辨且能检测新的等位基因的特点。
当前的 HLA-SBT方法主要是基乎 Sanger测序法，该测序方 法不能直接得到样本中单体型 （父本或者母本单独的序列信息） 的序列信息， 而只能得到二倍体型序列信息， 这给 HLA分型结 果带来了不确定性 （Ambiguity ) ，为了得到确定的分型结果， 需 要加测 GSSP (组特异性测序引物， Group Sepecific Sequencing Primer ) 或者通过克隆测序来解决上述问题 基于 Sanger测序法的测序通量小， 以 ABI公司的 3730.测序 仪一天 4000 个测序反应的饱和通量为例， 单份样本的 HLA-A/B/DRB1三个位点的 SBT分型大概需要 17个测序反应， 一台 3730测序仪整天不停运转也只能产出约 240份样本的数据 量。
目前 HLA-SBT主要通过专业分型软件来分型， 导入测序峰 图质量的好坏对分型软件的峰图识别能力影响 很大， 当软件识别 错误时， 需要分型人员能及时发现错误， 改正错误。 同时， 为了 避免人为错误， 同一批次样本的分型工作往往要由两人以上独 立 完成， 核对无误后， 才能确认结果。 如果能够实现软件分型的自 动化那将大大减少错误的发生率， 并且降低人力成本。
基于 Sanger测序法的 HLA-SBT实验步骤包括： PCR扩增、 PCR产物电泳、 PCR产物纯化、 测序反应、 测序反应产物纯化、 测序仪测序、 测序结果分型以及后继的加测 GSSP等， 整个实验 流程复杂， 且实验过程中， 不同 PCR产物不能混合在一起操作， 大大地加大了实验工作量。
HLA-SBT 整个实验流程复杂、 通量低和成本高等缺点使其 很难应用于大规模 HLA高分辨分型项目。
发明内容
Illumina GA测序 （ Illumina 公司的 Genome Analyzer测序 仪， 简称 Illumina GA )是利用边合成边测序的原理进行 DNA序 列分析， 可以检测单体型， 其最终产出的数据是一系列的碱基序 列， 可直接用于与 HLA数据库中的参考序列直接比对， 不存在 传统分型软件峰图误判的问题， 有利于软件分型的自动化。
Illumina GA的测序通量大，目前一个实验流程下来可以 生 50G ( 500亿）碱基的数据， 平均每天产生 50亿碱基的数据。 高的数 据通量可以在测序序列数确定的情况下， 使得每条序列获得高的 测序深度， 确保测序结果的可靠性。
目前还未有将 Illumina GA应用于 HLA分型领域的研究， 本 发明首次将 Illumina GA测序应用于 HLA分型领域， 结合 DNA 分子标签技术、 DNA不完全打断及 PCR-FREE建库的 PCR测序 技术， 实现 HLA 的低成本， 高通量、 高准确率、 高分辨率的分 型。
基于 DNA分子标签技术， 实现了对多样本 PCR产物的分别 标记， 使 Illumina 测序文库构建实验环节可把多个样本混合 ( pooling ) 成一个文岸同时处理， 大大简化了实验操作， 最终， 每个样本的检测结果可以通过其独特的标签（ index )序列找回。
DNA不完全打断技术使 Illumina GA实际可测通的 PCR产 物长度超过测序仪的测序最大长度， 在当前 Illumina GA测序最 大长度 200bp的情况下，实际可测通的 PCR产物长度达到 200bp 以上。
"接头 （adapter ) " 或 "文库接头 ( library adapter ) " 标 签技术是指通过对多个测序文库添加不同文库 接头 （不同文库接 头的组成序列不同， 序列不同的部分称为接头标签 （ adapter index )， 构建标签测序文库， 从而可实现多个不同标签测序文库 混合测序， 且最终各个标签测序文库的测序结果可相互区 分的一 种文库标签技术。
基于 DNA分子标签技术和 DNA不完全打断策略的 PCR测 序方法的使用可在减少引物标签数目的情况下 ， 大大提高可唯一 标记的样本数目 （图 1 ) 。
结合文库接头标签技术的 PCR-FREE的文库构建方法，是指 将文库接头直接连接至测序文库中的 DNA片段两端，文库接头的 导入过程因为没有 PCR的参与， 因此称作 PCR-Free文库构建。 其中接入方法可以采用 DNA连接酶进行连接。 其整个文库构建 过程中无 PCR的参与， 避免了在高序列相似度的 PCR产物混合 ( poolin ) 文库的构建过程中， 由 PCR 引入错误而导致最后结 果的不准确性。
本发明， 采用基于 DNA分子标签技术、 DNA不完全打断及 PCR-FREE建库的 PCR测序技术， 通过对待分析样本分组， 再 对每组样本通过双向引物标签标记的引物， 对 HLA基因目的片 段扩增 （PCR产物的最大长度取决于测序仪可结合的最 大 DNA 长度， 当前 Illumina GA适用的最大 DNA长度为 700bp， 此长度 为原始 DNA长度， 没有包括文库接头序列长度） ， 所得 PCR产 物等量混合， 经 DNA不完全打断处理， 构建 PCR-Free标签测序 文库。 把各样本组得到的不同标签测序文库等摩尔混 合， 选择性 回收片段长度大于测序仪最大测序长度以上的 所有 DNA片段，随 后用 Illumina GA 测序仪测序。 通过对测序结果中接头标签 ( adapter index )、 引物标签以及 PCR引物的序列信息筛选， 可 获得每个样本的 DNA 序列信息， 所得 DNA 序列经过组装与 IMGT HLA专业数据库中对应数据库的比对，最终可得 到样本的 HLA基因型别。
在本发明的一个方面中， 提供了一组引物标签 （ primer index ) , 其包括表 1所示 95对引物标签中的至少 10对， 或至少 20对， 或至少 30对， 或至少 40对， 或至少 50对， 至少 60对， 或至少 70对， 或至少 80对， 或至少 90对， 或 9 对 （或者所述 一组引物标签由表 1所示 95对引物标签中的 10 - 95对（例如 10 - 95对， 20 - 95对， 30 - 95对， 40 - 95对， 50 - 95对， 60 - 95对， 70 - 95对， 80 - 95对， 90 - 95对， 或 95对）组成） ， 并 且
所述一组引物标签优选地至少包括表 1所示 95对引物标签中 的 PI-1至 PI-10, 或 PI-11至 PI-20, 或 PI-21至 PI-30, 或 PI-31 至 PI-40,或 PI-41至 PI-50,或 PI-51至 PI-60,或 PI-61至 PI-70, 或 PI-71至 PI-80, 或 PI-81至 PI-90, 或 PI-91至 PI-95, 或者它 们任何两个或者多个的组合。
根据本发明另一方面，还提供了所述的引物标 签用于 PCR测 序方法的用途， 其中特别是， 每一对引物标签与用于扩增待测目 的序列的 PCR引物对组合成一对标签引物， 正反 PCR引物的 5， 端分别具有 （或者任选通过连接序列连接）正向引物标签 和反向 引物标签。
在本发明的一个具体实施方式中，所述 PCR引物是用于扩增 HLA的特定基因的 PCR引物， 优选是用于扩增 HLA-A/B 2, 3, 4号外显子和 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物， 优选的所述 PCR引物如表 2所示。
本发明另一方面中， 提供了上文所述一组引物标签与用于扩 增待测目的序列的 PCR引物对组合成的一组标签引物，其中每一 对引物标签与 PCR引物对组合成一对标签引物， 正反 PCR引物 的 5，端分别具有 （或者任选通过连接序列连接）正向引物标签 和 反向引物标签。
在本发明的一个具体实施方式中， 上文所述标签引物中的 PCR引物是用于扩增 HLA的特定基因的 PCR引物，优选是用于 扩增 HLA-A/B 2, 3, 4号外显子和 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR 引物， 优选的所述 PCR引物如表 2所示。
在本发明的另一个具体实施方式中， 所述的标签引物用于 PCR测序方法。 本发明另一方面中， 提供了一种 HLA分型的方法， 其包括：
1 )提供 n 个样品， n为大于等于 1的整数， 所述样品优选地来 自哺乳动物， 更优选是人， 特别是人的血样；
2 )将待分析的 n个样品分成 m个小组， m为整数且 n > m > l ;
3 )扩增： 对于每一个样品， 使用一对标签引物， 在存在来自 该样品的模板时， 在适于扩增目的核酸的条件下进行 PCR扩增， 其中， 每一对标签引物由包含引物标签的正向标签引 物和反向标 签引物 （均可以是简并引物）构成， 其中正向标签引物和反向标 签引物所包含的引物标签可以相同或者不同； 不同样品所用标签 引物对中的引物标签彼此不同；
4 ) 混合： 将各样品的 PCR扩增产物混合在一起， 获得 PCR 产物文库；
5 )打断： 将所得的 PCR产物文库进行不完全打断；
6 )建库： 结合文库接头标签技术， 将打断后的 PCR产物文库 构建 PCR-Free测序文库， 回收位于所用测序仪最大读长长度到所 用测序仪适用的最长 DNA长度范围之间的所有 DNA条带， 可以对 文库添加不同的文库接头 （adapter ) 以区分不同的 PCR-Free测 序文库；
7 ) 测序： 将回收的 DNA混合物利用二代测序技术， 优选的 是 Pair-End技术（例如 Illumina GA、 Illumina Hiseq 2000 )进行 测序， 获得打断后的 DNA的序列；
8 )拼接： 基于各个文库不同的文库接头序列和每个样品 独特 的引物标签将获得的测序结果与样品一一对应 ，利用比对程序（例 如 Blast，BWA程序） ^各个测序序列定位到 PCR产物的相应 DNA 参考序列上，通过序列重叠和连锁关系，从打 断后的 DNA的序列 拼接出完整的目的核酸。 在本发明的一个具体实施方式中， 在上文所述的方法中， 所 述结合文库接头标签技术， 将打断后的 PCR 产物文库构建 PCR-Free测序文库是指使用 m种文库接头给 4 ) 中得到的 m个 PCR产物文库加上接头， 其中每一个 PCR产物文库使用一种不 同的文库接头， 从而构建 m个接头标签测序文库； 将 m个接头 标签测序文库等摩尔混合在一起构建混合接头 标签测序丈库。 其 中连接文库接头的方法是指不通过 PCR程序直接采用 DNA连接 酶进行连接。
在本发明的一个具体实施方式中， 在上文所述的方法中， 每 一对引物标签与 PCR引物对组合成一对标签引物， 正反 PCR引 物的 5，端分别具有 （或者任选通过连接序列连接）正向引物标签 和反向引物标签。
在本发明的一个具体实施方式中， 在上文所述的方法中， 所 述 PCR引物是用于扩增 HLA的特定基因的 PCR引物， 优选是 用于扩增 HLA-A/B 2， 3, 4号外显子和 HLA-DRB1 2号外显子 的 PCR引物， 优选的所述 PCR引物如表 2所示。
在本发明的一个具体实施方式中， 在上文所述的方法中， 所 述引物标签针对 PCR引物进行设计， 优选针对用于扩增 HLA的 特定基因的 PCR引物进行设计， 更优选针对用于扩增 HLA-A\B 2， 3， 4号外显子和 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物， 特别 是如表 2所示的 PCR引物进行设计，所述引物标签特别是包括表 1所示 95对引物标签中的至少 10对， 或至少 20对， 或至少 30 对， 或至少 40对， 或至少 50对， 至少 60对， 或至少 70对， 或 至少 80对， 或至少 90对， 或 95对（或者所述一组引物标签由表 1所示 95对引物标签中的 10 - 95对 （例如 10 - 95对， 20 - 95 对， 30 - 95对， 40 - 95对， 50 - 95对， 60 - 95对， 70 - 95对， 80 - 95对， 90 - 95对， 或 95对）组成） ， 并且
所述一组引物标签优选地至少包括表 1所示 95对引物标签中 的 PI-1至 PI-10, 或 PI-11至 PI-20, 或 PI-21至 PI-30, 或 PI-31 至 PI-40,或 PI-41至 PI-50,或 PI-51至 PI-60,或 PI-61至 PI-70, 或 PI-71至 PI-80, 或 PI-81至 PI-90, 或 PI-91至 PI-95, 或者它 们任何两个或者多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中， 在上文所述的方法中， 所 述 DNA打断包括化学打断方法和物理打断方法， 其中所述化学 方法包括酶切方法， 所述物理打断方法包括超声波打断方法或机 械打断方法。 所述 DNA打断后， 纯化回收 450-750bp长度的片 段。 所述纯化回收纯化回收方法包括但不限于电泳 割胶回收， 也可 以是磁珠回收。
在本发明的一个具体实施方式中， 在上文所述的方法中， 所 述 DNA打断后， 在构建 PCR-Free标签文库的过程中， 对不同组 样品的 DNA用不同的文库接头连接， 从而在其后的分型步骤中， 基于每个样品所用的引物标签和接头标签， 将获得的测序结果与 样本 对应。
利用比对程序把各个样本测序序列定位到其 PCR产物已知相应的 DNA 参考序列 （Reference Sequence )上， 通过序列重叠和连锁 关系， 从打断后的 DNA的序列拼接出完整的 PCR产物序列。
本发明另一方面中， 提供了一种 HLA分型方法， 包括： 使 用上文所述的测序方法对来自患者的样品 （特别是血样） 进行测 序和拼接， 以及将拼接好的序列与 HLA数据库 （如 IMGT HLA 专业数据库）中 HLA相关序列数据比对， 序列比对结果 100 %匹 配的即为对应样本的 HLA-DRB1基因型别。
发明的有益效果 本发明提供了基于 illumina GA测序技术的 HLA基因高分辨 率分型方法， 从而实现单体型测序、 软件分型自动化， 提高 HLA 基因分型的通量， 降低成本。
附图说明
图 1:为引物标签和接头标签（adaptor index )标记后的 PCR 产物示意图。 实验时， 通过 PCR在每个样本的 PCR产物两端同 时引入引物标签；把多个带有不同引物标签的 PCR产物混合在一 起， 用于构建测序文库。 测序文库构建过程中， 当需要构建多个 测序文库时， 可通过添加带有不同接头标签的文库接头， 来标记 各个测序文库。 文库构建完毕后， 带有不同接头标签标记的多个 测序文库可以混合在一起同时用 Illumina GA测序 （不同接头标 签标记的测序文库之间的引物标签可以相同） 。测序结果出来后， 通过对测序结果中接头标签和引物标签序列信 息的歸选， 可获得 每个样本的 DNA序列信息。
图 2: 为 1号样本 HLA-A/B/DRB1相应外显子 PCR产物电泳 结果， 从电泳图上看， PCR产物为一系列片段大小 300bp-500bp 的单一条带，其中泳道 M是分子量标记物（ DL 2000,Takara公司）， 泳道 1-7为 1号样本的 HLA-A/B/DRB1各外显子 （ A2、 A3、 A4、 B2、 B3、 B4、 DRBl-2 ) PCR扩增产物， 阴性对照 ( N )无扩增条 带。 其它样品的结果与此类似。
图 3: 为 HLA-Mix打断后 DNA电泳情况 (割胶前后）， 割胶 区域为 450-750bp区域。 其中泳道 M是分子量标记物（NEB-50bp DNA Ladder ) ， 泳道 1是割胶前 HLA-Mix的电泳情况， 泳道 2 是割胶后 HLA-Mix的胶图。
图 4: 1号样本一致性（consensus )序列构建程序截图， 示例 说明了根据引物标签和 DNA片段之间的重叠关系拼接出 PCR产物 的完整序列。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述， 但是 本领域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不 应视为限定本发明的范围。
在本发明的实施例中，釆用基于引物标签、 DNA不完全打断、 文库标签及 PCR-FREE建库的 PCR测序方法， 对 950个样本的 HLA-A/B 2, 3, 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子 （PCR产 物长度大小处于 290bp-500bp之间）的基因分型， 证明该发明能够 实现低成本、 高通量、 高准确率和高分辨率的 HLA基因分型。
原理： 将待分析的样本均分成 10组，对每组样本通过 PCR反 应在 HLA-A/B 2, 3，4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR 产物两端引入引物标签， 使其特异的标记 PCR产物的样本信息。 将各组内样品的 HLA-A/B/DRB1三个位点的 PCR扩增产物等体 积混合在一起， 获得 PCR产物文库； 所得 PCR产物文库经过超 声不完全打断后， 构建不同的 PCR-Free标签测序文库 （其中每 一个 PCR产物文库使用一种不同的接头， 从而构建 10个标签测 序文库）； 将 10个标签测序文库等摩尔混合在一起构建混合 签 测序文库， 混合标签测序文库经 2%低熔点琼脂糖电泳， 割胶纯 化回收位于 450-750p 长度范围之间的所有 DNA 条带。 回收的 DNA经 Illumina GA PE-100测序。 通过文库标签和引物标签序 列可以找到所有所测样本的序列信息， 再通过已知 DNA 片段的 参考序列信息和 DNA 片段序列之间的重叠和连锁关系组装出整 个 PCR产物的序列， 再通过与 HLA-A/B/DRB1相应外显子的标 准数据库的比对结果可组装出原 PCR 产物的全序列，实现 HLA-A/B/DRB1的基因分型。 实施例 1
样本提取
使用 KingFisher 自动提取仪（请提供供货商信息） （美国 Therm (^公司）从 950份已知 HLA-SBT分型结果的血样（中国造 血干细胞捐献者资料库（以下称 "中华骨髓库" ）） 中提取 DNA。 主要步骤如下： 取出 6个 Kingfisher自动提取仪配套的深孔板及 1个浅孔板， 根据说明书分别加入一定量配套的试剂并作好 标记， 将所有已加好试剂的孔板按要求置于相应的位 置， 选定程序 "Bioeasy— 200ul Blood DNA_KF.msz" 程序， 按下 "star" 执行 该程序进行核酸提取。 程序结束后收集 plate Elution中的 lOOul 左右的洗脱产物即为提取的 DNA， 准备做下一步 PCR中的模板 用。 实施例 2
PCR扩增
把样本提取步骤中所得的 950份 DNA依次编号 1-950， 均分 成 10组，每组 95份 DNA，分别标记为 HLA-1、 HLA-2、 HLA-3、 HLA-4、 HLA-5、 HLA-6、 HLA-7、 HLA-8、 HLA-9、 HLA-10. 对每组样本分别以 95 套带有双向引物标签 （表 1 ) 用于扩增 HLA-A/B 2, 3, 4号外显子和 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引 物 （表 2 ) 来分别扩增 95份 DNA样本。 PCR反应在 96孔板中 进行， 共 7 板， 编号分别为 HLA-X-P-A2、 HLA-X-P-A3、 HLA-X-P-A4、 HLA-X-P-B2, HLA-X-P-B3、 HLA-X-P-B4 以及 HLA-X-P-DRB1-2 ( "X"表示样本组号信息 1/2/3/4/5/6/7/8/9/10, "A2/3/4，B2/3/4，DRBl-2"表示扩增的位点） ， 每板内设置一个不 添加模板的阴性对照， 阴性对照所用引物为 PI-1 (表 1 ) 标记的 引物。 实验的同时， 记录下每个样本对应的样本组号信息和引物 标签信息。
引物标签的相关信息
-ει-
SC8l00/0l0ZN3/13d CSIOOO/ZTOZ OAV
PI-95 CGACGTAGAGTC CAGTAGCACTAC Hll 95 95+95*n 表 2， 未添加引物标签前用于扩增 HLA-A/B/DRB1相应外显 子的 PCR引物
D2-F1, D2-F2, D2-F3, D2-F4, D2-F5, D2-F6, D2-F7为扩增 HLA-DRBl 2号外显子的正向引物， D2-R为扩增 HLA-DRB1 2号 外显子的反向引物。
HLA-A/B/DRB1 的 PCR程序如下：
96 2min
95 " 30s ->60 30s ^72 20s (32cycles)
15 ∞
HLA-A/B的 PCR反应体系如下
PI nf -D2-F7 ( 2pmol/ ul ) l.Oul
PI„ r -D2-R ( 2pmoI/ ul ) l.Oul
Promega Taq ( 5U/uI ) 0.2ul
DNA (约 20 ng/ul ) 5.0ul
ddH 2 0 4.8ul
Total 25.0ul
其中 PI nr A/B/D2-F 1/2/3/4/5/6/7 表示引物 5，末端带有第 n号正向引 物标签序列（表 1 )的 HLA-A/B/DRB1的 F引物， PI nr A/B/D2-R 2/3/4 表示引物 5，末端带有第 n号反向引物标签序列的 HLA-A/B/DRB1 的 R引物（此处 n < 95 ) ， 其它依次类推。 且每个样本对应特定的 一套 PCR引物 （ PI n 「A/B/D2-F 1/2/3/4/5/6/7 ， PI n 「A/B/D2-R 2/3/4 ) 。
PCR反应在 Bio-Rad公司的 PTC-200 PCR仪上运行。 PCR完 成后， 取 2ul PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。 图 2显示 了 1号样本 HLA-A/B/DRB1相应外显子 PCR产物电泳结果， DNA 分子标记为 DL 2000 ( Takara公司）， 胶图上有一系列片段大小为 300bp-500bp单一条带， 表明 1号样本的 HLA-A/B/DRB1各外显 子 （A2、 A3、 A4、 B2、 B3、 B4、 DRB1-2 ) PCR扩增成功， 阴性 对照 （N )无扩增条带。 其它样品的结果与此类似 实施例 3
PCR产物混合和纯化
对第 "X "组 ("X" 为 1/2/3/4/5/6/7/8/9/10)样本， 从 96 孔板 HLA-X-P-A2剩余的 PCR产物中 （阴性对照除外）各取 20 ul混 合在一个 3ml的 EP管中， 标记为 HLA-X-A2-Mix, 对第 "X"组 样本的其它 6 个 96 孔板进行同样的操作， 分别标记为 HLA-X-A3-Mix 、 HLA-X-A4-Mix 、 HLA-X-B2-Mix 、 HLA-X-B3-Mix、 HLA-X-B4-Mix和 HLA-X-D2-Mix， 震荡混匀， 从 HLA-X-A2-Mix 、 HLA-X-A3-Mix 、 HLA-X-A4-Mix 、 HLA-X-B2-Mix 、 HLA-X-B3-Mix 、 HLA-X-B4-Mix 和 HLA-X-D2-Mix中各取 200ul混合在一个 3ml的 EP管中， 标记 为 HLA-X-Mix。 从中各取 500ul DNA 混合物经 Qiagen DNA Purification kit过柱纯化（具体纯化步驟详见说明书） ， 纯化所 得的 200ul DNA, 经 Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific公 司）测定的 DNA浓度分别为：
实施例 4
Illumina GA测序文库构建
l.DNA打断
从纯化后的 HLA-X-Mix中各取总量 5ug的 DNA 用带 AFA 纤维扣盖的 Covaris 微管在 Covaris S2(Covaris公司）上打断。 打 断条件如下：
频率扫描 ( frequency sweepin )
2. 打断后纯化
将 HLA-X-Mix 的所有打断产物用 QIAquick PCR Purification Kit( QIAGEN公司）回收纯化，分别溶于 37.5ul 的 EB ( QIAGEN Elution Buffer ) 中；
3. 末端修复反应
对打断后纯化的 HLA-X-Mix进行 DNA末端修复反应， 体系 如下 （试剂均购自 Enzymatics公司） ：
DNA 37.5 L
H 2 0 37.5μί 多核苷酸激酶緩冲液（ 10x Polynucleotide Kinase Buffer( B904 ) ) 10
dNTP混合物 （每种 10mM ) ( Solution Set ( lOmM each ) ) 4
T4 DNA聚合酶 （ T4 DNA Polymerase ) 5μL
Kleno 片段 ( Klenow Fragment ) ΙμΙ
T 多聚核苷酸激酶（ T4 Polynucleotide Kinase ) 5μL·
总体积 ( Total volume ) 100 μL·
反应条件为： 恒温混匀器 （ Thermomixer, Eppendorf公司）
20 温浴 30 min。
反应产物经 QIAquick PCR Purification Kit回收纯化， 溶于 34 μΐ的 EB ( QIAGEN Elution Buffer ) 中。
4. 3' 末端加 A反应
上一步回收 DNA的 3， 末端加 A反应， 体系如下 （试剂均 购自 Enzymatics公司 ) ：
上一步所得 DNA 32
10x 蓝色緩沖液（ 10x blue buffer ) 5
dATP(lmM , GE公司） 10
Klenow (3'-5' exo-) 3 μΐ^ 总体积 ( Total volume ) 50
反应条件为： 恒温混匀器 （ Thermomixer , Eppendorf 公 司）37t)温浴 30 min。
反应产物经 MiniElute PCR Purification Kit( QIAGEN公司） 回收纯化， 溶于 13 μΐ的 ΕΒ溶液（ QIAGEN Elution Buffer )中。
5. 连接 Illumina GA PCR-Free文库接头 （adapter ) 术语 "PCR-Free文库接头 （adapter ) " 是指经设计的一段 碱基， 其主要作用是辅助固定 DNA分子在测序芯片上以及提供 通用测序引物的结合位点， PCR-Free文库接头可以通过 DNA连 接酶将其直接连接至测序文库中的 DNA片段两端，接头的导入过 程因为没有 PCR的参与， 因此称作 PCR-Free文库接头。
加 A后的产物分别连接不同的 Illumina GA PCR-Free index
反应条件为： 恒温混匀器 （ Thermomixer , Eppendorf 公 司） 20 温浴 15 min。
样本组与文库接头的对应关系如下
反应产物经 Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)纯化 后溶于 50ul去离子水， 经荧光定量 PCR ( QPCR )检测到 DNA 摩尔浓度结果如下：
6. 割胶回收
将 HLA-1-Mix、 HLA-2-Mix、 HLA-3-Mix , HLA-4-Mix、 HLA-5-Mix, HLA-6-Mix、 HLA-7-Mix、 HLA-8-Mix, HLA-9-Mix 和 HLA-10-Mix 等摩尔混合 （终浓度 72.13nM/ul ) ， 标记为 HLA-Mix-10, 取 30 L HLA-Mix-10用 2%低熔点琼脂糖胶进行回 收。电泳条件为 100V, 100min。 DNA marker为 NEB公司的 50bp DNA marker 0 割胶回收 450-750bp长度范围的 DNA片段（附图 3 ) 。 胶回收产物经 QIAquick PCR Purification Kit ( QIAGEN 公司）回收纯化， 纯化后体积为 32ul， 经荧光定量 PCR ( QPCR ) 检测到 DNA浓度结果为 9.96nM。 实施例 5
Illumina GA测序
根据 QPCR 检测结果， 取 lOpmol DNA 用 Illumina GA PE-100程序测序， 具体操作流程详见 Illumina GA操作说明书 ( Illumina GA Π x ) 。 实施例 6
结果分析
Illumina GA产出的测序结果是一系列 DNA序列，通过查找 测序结果中的接头标签序列、 正反引物标签序列和引物序列， 建 立各个引物标签对应样本 HLA-A/B/DRBl 各外显子 PCR产物测 序结果的数据库。通过 BWA(Burrows-Wheeler Aligner)把各外显 子的测序结果定位在相应外显子的参考序列上 （参考序列来源： http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ ) 同时， 构建各个数据库的一致性
( consensus )序列， 再对数据库中 DNA序列进行筛选和测序错 误校正。 校正后的 DNA 序列通过序列重叠 （overlap ) 和连锁
( Pair-End连锁） 关系可组装成 HLA-A/B/DRBl 各外显子相应 的序列。 所得 DNA 序列利用与 IMGT HLA 专业数据库中
HLA-A/B/DRBl 相应各外显子的序列数据库比对，序列比对结 果
100%匹配的即为对应样本的 HLA-A/B/DRBl基因型别。 可参考 图 4示例说明的 1号样品的 HLA-A位点的 2号外显子一致性序 列构建程序的截图。 所有 950个样本， 得到的分型结果与原已知 分型结果完全相符， 其中 1-32号样本的具体结果如下：
样本编号 原 HLA-A/B/DRBl型别
1 A*02:03 A*ll:01 38:02 "48:01 DRB1' "14:54 DRB1 *15:01
2 A*01:01 A*30:01 ^08:01 k 13:02 DRB1' ^03:01 DRB1 *07:01
3 A*01:01 A*02:01 B v 45:11 fe 47:01 DRB1' fe 13:02 DRB1 * 15:01
4 A*24:08 A*26:01 k 40:01 B J k 51:01 DRB1' "04:04 DRB1 *09:01
5 A*01:01 A*24:02 B j fc 54:01 B j 5:02 DRB1' "=04:05 DRB1 *09:01
6 A*01:01 A*03:02 B J 15:11 k 37:01 DRB1' 0:01 DRB1 *14:54
7 A*ll:01 A*30:01 43:02 B 45:18 DRB1' ^04:04 DRB1 *07:01
8 A*01:01 A*02:01 B v ^5:03 B v k 81:01 DRB1' 1:01 DRB1 *15:01
9 A*02:06 A*31:01 k 27:07 B J k 40:02 DRB1' "03:01 DRB1 *13:02
10 A*01:01 A*66:01 B J fc 37:01 fc 49:01 ORBV ^10:01 DRB1 fc 13:02
11 A*01:01 A*03:01 35:01 52:01 DRB1' k 01:01 DRB1 "15:02
12 A*ll:01 A*ll:01 B j 15:01 B J 45:05 DRB1*04:06 DRB1 45:01
13 A*01:01 A*ll:02 k 07:02 B J 45:02 DRB1' "09:01 DRB1' fc 15:01
14 A*01:01 A*02:01 k 52:01 B J k 67:01 ORBV "15:02 DRB1' *16:02
15 A*01:01 A*02:05 fc 15:17 B*50:01 ORBV fe 07:01 DRBl: fc 15:01
16 A*01:01 A*ll:01 k 37:01 B v k 40:02 ORBV 0:01 DRB1*12:02
17 A*24:07 A*32:01 B v k 35:05 k 40:01 ORBV ^03:01 DRB1 04:05
18 A*ll:01 A*24:02 B v k 13:01 B J k 35:01 ORBV 46:02 DRB1 fc 16:02
19 A*ll:01 A*ll:01 B J k 40:02 B v ^55:12 ORBV k 04:05 DRB1' "15:01
20 A*02:ll A*24:02 B*40:01 fe 40:06 DRB1' 1:01 DRB1*15:01 -it- εο:8θ*ιβπα 10: 0, I0:9 F a I0=T0*V 9Ζ
90 : Z.O, f a το : τε*ν ιο:π*ν SZ
ΙΟ:ΔΟ, f a ιο:οε*ν Ζ
ΙΟ:ΟΙ*ΙΗΉα εο:ΗΜβπα 10=9^*9 I0 : I0*V £Ζ iona¾a so: o. I0:6 V T0 : I0*V ζζ ιο:π* a 10: 0, IS, 90:Z0*V I0:I0*V ιζ io:s iaHa WIT. 90：0^*9 I0:0 π:ζο*ν οζ io:s 簡 a zx=ss*a f a ιο:π*ν 61 zo:9 ie«a Z0:9I, ιο:ει. Z0'PZ*Y ιο:ττ*ν 8Τ ιο:εο; L\ ana 10: Ϊ0:Ι0 91
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I 'LQ ia¾a xana SO: ( I0:I0*V zz
SC8T00/0l0iN3/X3d CSTOOO/ZTOi OAV 27 A*01:01 A*02:01 B' 5:18 fe 37:01 DRB1*04:01 DRB1*15:01
28 A*01:01 A*24:02 B' 7:01 B j k 46:01 DRB1*09:01 DRB1*10:01
29 A*26:01 A*66:01 B*40:40 B*41:02 DRB1*12:01 DRB1*15:01
30 A*02:01 A*29:02 fe 13:02 B J ^45:01 DRB1*03:01 DRB1*12:02
31 A*01:01 A*ll:03 45:01 B J k 57:01 DRB1*07:01 DRB1*15:01
32 A*ll:01 A*26:01 35:03 B" '38:01 DRB1*11:03 DRB1*14:04
HLA-DRB1 • 型 别 中 的 DRB1*1201 不 排 除
DRB1*1206/1210/1217的可能性， DRB1*1454不排除 DRB1*1401 的可能性， 因为上述等位基因在 2号外显子的序列完全相同。 同 理对于 HLA-A/B位点中 2、 3、 4号外显子序列完全相同的结果 取常见型。
釆用本发明的技术路线， 对 950份已知 HLA-SBT分型结果的 样本进行 HLA-A/B/DRB1位点的基因分型， 结果发现： 采用本发 明的技术路线所得的分型结果与原结果完全一 致。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述， 本领域技 术人员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进 行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发 明的全部范围由所附权利要求及其^:何等同物 出。 参考文献
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