Die Entwicklung effektiver Verfahren zur Generierung umfangreicher Bibliotheken von enantioselektiven Katalysatoren durch Methoden der kombinatorischen Chemie [Übersicht : a) M. T. Reetz, Angew. Chem. 2001, 113, 292-320 ; Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 284-310 ; b) B. Jandeleit, D. J. Schäfer, T. S. Powers, H. W. Turner, W. H. Weinberg, Angew. Chem. 1999, 111, 2648- 2689 ; Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 2494-2532 ; c) K. Burgess, H. -J. Lim, A.

M. Porte, G. A. Sulikowski, Angew. Chem. 1996, 108, 192-194 ; Angew. Chem.

Int. Ed. Engl. 1996, 35, 220-222 ; d) B. M. Cole, K. D. Shimizu, C. A. Krueger, J.

P. A. Harrity, M. L. Snapper, A. H. Hoveyda, Angew. Chem. 1996, 108, 1776- 1779 ; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1668-1671] sowie zur Herstellung von Bibliotheken von enantioselektiven Biokatalysatoren durch gerichtete Evolution [a) M. T. Reetz, A. Zonta, K. Schimossek, K. Liebeton, K. -E. Jaeger, Angew. Chem. 1997, 109, 2961-2963 ; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997,36, 2830-2832 ; b) M. T. Reetz, K. -E. Jaeger, Chem.-Eur. J. 2000, 6, 407-412] ist Gegenstand aktueller Forschung. Entscheidend für den Erfolg dieser neuen Technologien ist die Verfügbarkeit von effizienten Methoden zum raschen Durchsuchen der enantioselektiven Katalysatoren oder Biokatalysatoren aus den jeweiligen Katalysatorbibliotheken. Im Gegensatz zu Screening-Methoden für die kombinatorische Wirkstoffchemie [a) F. Balkenhohl, C. Bussche-Hünnefeld, A.

Lansky, C. Zechel, Angew. Chem. 1996, 108, 2436-2488 ; Angew. Chem. Int. Ed.

Engl. 1996, 35, 2288-2337 ; b) J. S. Früchtel, G. Jung, Angew. Chem. 1996, 108, 19-46 ; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 17-42 ; c) Chem. Rev. 1997,97 (2), 347-510 (Ausgabe zur kombinatorischen Chemie) ; d) G. Jung, Combinatorial Chemistry : Synthesis, Analysis, Screening, Wiley-VCH, Weinheim, 1999] fehlt es an effizienten Verfahren zum Hoch-Durchsatz-Screening von enantioselektiven Katalysatoren, Biokatalysatoren oder optisch aktiven Agenzien. Die klassische Bestimmung von Enantiomerenüberschüssen (engl. : enantiomeric excess, ee) per Gas-oder Flüssigkeitschromatographie an stationären chiralen Phasen liefert zwar eine hohe Genauigkeit, nachteilig ist jedoch ein begrenzter Probendurchsatz pro Zeiteinheit. Ähnliches gilt für die herkömmliche NMR-spektroskopische Bestimmung des ee-Wertes einer Enantiomerenmischung, bei der die Probe (z. B. ein chiraler Alkohol) zunächst im Labor mit einem enantiomerenreinen Derivatisierungsmittel (z. B. a-Methoxy-a-trifluormethyl-phenylessigsäure- chlorid,"Mosher's Säurechlorid") oder Shiftreagenz (z. B. 1- (9-Anthryl)-2, 2,2- trifluorethanol) umgesetzt wird, gefolgt von NMR-spektroskopischer Analyse des Diastereomerengemisches. Auch die Arbeitsweise eines solchen Verfahrens ist sehr zeitaufwendig.

Zur Lösung dieser Art von Analysenproblemen wurden kürzlich erste Assays entwickelt. So wurde z. B. im Rahmen einer Untersuchung zur gerichteten Evolution von enantioselektiven Lipasen ein Testverfahren entwickelt, womit der Verlauf enantioselektiver Hydrolysen von chiralen Carbonsäureestern verfolgt werden kann [W09905288A, Studiengesellschaft Kohle ; M. T. Reetz, A. Zonta, K. Schimossek, K. Liebeton, K. -E. Jaeger, Angew. Chem. 1997, 109, 2961-2963 ; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 2830-2832]. Mittels eines Photometer- Assays ist die Verfolgung von enantioselektiven Hydrolysen von Lipase- Varianten in Mikrotiterplatten möglich. Nachteilig ist, dass keine exakten ee- Werte zugänglich sind und dieses Verfahren auf die Stoffklasse der chiralen Carbonsäuren beschränkt ist. Ähnliche Einschränkungen gelten für ein verwandtes Testverfahren [L. E. Janes, R. J. Kazlauskas, J. Org. Chem. 1997, 62, 45460-45461]. Des weiteren gilt diese Einschränkung für Verfahren, die auf Farbänderung von pH-Indikatoren während einer Esterhydrolyse beruhen [L. E.

Janes, A. C. Löwendahl, R. J. Kazlauskas, Chem.-Eur. J. 1998, 4, 2324-2331].

Ein Verfahren zur Verwendung von DNA-Microarrays zur Bestimmung von Enantiomerenüberschüssen ermöglicht zwar einen hohen Probendurchsatz, das Assay beinhaltet aber vier Stufen und ist somit umständlich, darüber hinaus ist das Verfahren nicht allgemein anwendbar [G. A. Korbel, G. Lalic, M. D. Shair, J. Am.

Chem. Soc. 2001, 123, 361-362]. Die kürzlich vorgestellte Verwendung von gekoppelten Enzymreaktionen zur Ermittlung von Enantiomerenüberschüssen (EMDee) hat einen zu hohen Fehlerbereich von +/-10 % ee und ist nur eingeschränkt anwendbar [P. Abato, C. T. Seto, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9206-9207]. Ein alternativer Ansatz zur Identifizierung chiraler Katalysatoren beruht auf der massenspektrometrischen Untersuchung von isotopenmarkierten pseudo-enantiomeren bzw. pseudo-prochiralen Substraten [WO 00/58504, Studiengesellschaft Kohle ; M. T. Reetz, M. H. Becker, H. W. Klein, D. Stöckigt, Angew. Chem. 1999, 111, 1872-1875 ; Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1758- 1761]. Die Methode ist allerdings auf die Verwendung von prochiralen Substraten mit enantiotopen Gruppen oder auf kinetische Racematspaltungen beschränkt.

Kürzlich wurde ein auf paralleler Kapillarelektrophorese beruhendes Screening- System für enantioselektive Katalysatoren vorgestellt [PCT/EP 01/09833, Studiengesellschaft Kohle ; M. T. Reetz, K. M. Kühling, A. Deege, H. Hinrichs, D. Belder, Angew. Chem. 2000, 112, 4049-4052 ; Angew. Chem. Int. Ed. 2000,39, 3891-3893]. Damit konnten erstmals bis zu 40000 ee-Bestimmungen pro Tag durchgeführt werden. Allerdings wurde die Methode bisher nur auf die Analyse chiraler Amine angewandt. Ein weiteres ee-Screeningsystem beruht auf enzymatische Immunoassays [F. Taran, C. Gauchet, B. Mohar, S. Meunier, A.

Valleix, P. Y. Renard, C. Créminon, J. Grassi, A. Wagner, C. Miokowski, Angew.

Chem. 2002, 114, 132-135 ; Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 124-127]. Nachteilig ist jedoch die Tatsache, dass in einem aufwendigen Verfahren Antikörper gegen die Enantiomere gezüchtet werden müssen.

Beschreibung der Erfindung Wir stellten fest, dass sich die oben beschriebenen Einschränkungen bzw.

Nachteile vermeiden lassen, wenn im Verfahren zur Hochdurchsatz-Bestimmung der Enantioselektivität von Reaktionen, die von chiralen Katalysatoren, Biokatalysatoren oder chiralen Agenzien bewirkt werden, in einem automatisierten Messvorgang die NMR-Spektroskopie als Detektionssystem verwendet wird. In einer ersten Ausführungsform der Erfindung werden isotopenmarkierte Substrate eingesetzt, die NMR-spektroskopisch detektierbar sind. Neben der Verfolgung kinetischer Racematspaltungen sowie stereoselektiver Reaktionen von Verbindungen mit enantiotopen Gruppen können mit der vorliegenden Erfindung auch solche enantioselektiven Stoffumwandlungen bequem verfolgt werden, bei denen eine prochirale Verbindung ohne enantiotope Gruppen in ein chirales Produkt übergeht. Durch Quantifizierung der NMR- Signale der isotopenmarkierten Substrate kann der Enantiomerenüberschuss (ee- Wert) bestimmt werden. In der zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die chiralen Produkte und/oder Edukte der zu untersuchenden Reaktionen mit enantiomerenreinen Agenzien zur Derivatisierung versetzt und die NMR-Signale der resultierenden Diastereomeren zur ee-Bestimmung quantitativ ausgewertet.

Des weiteren kann die ee-Bestimmung auch durch die Verwendung chiraler Lösemittel oder chiraler Shiftreagenzien erfolgen. In beiden Ausführungsformen der Erfindung ist ein Durchsatz von 1000 und mehr Proben pro Tag möglich.

Beschreibung der Figuren Figur 1 : a) Asymmetrische Transformationen von pseudo-enantiomeren (a und b), pseudo-meso (c) und pseudo-prochiralen (d) Verbindungen. FG stellt die funktio- nelle Gruppe dar, FG'bzw. FG"symbolisieren die durch die Umsetzung gebilde- ten funktionellen Gruppen ; die Isotopenmarkierung ist durch einen Stern (*) gekennzeichnet.

Figur 2 : Derivatisierung von Enantiomerengemischen mit chiralen Hilfsreagen- zien für die Quantifizierung mittels NMR-Analyse.

Figur 3 : Experimenteller Aufbau eines Hochdurchsatz-Screening-Systems auf Enantioselektivität mittels NMR mit isotopen-markierten Substraten.

Figur 4 : Experimenteller Aufbau eines Hochdurchsatz-Screening-Systems auf Enantioselektivität mittels NMR und chiralen Hilfsreagenzien bzw. chiralen Agenzien oder Lösungsmittel.

Figur 5 : Kinetische Racematspaltung von 1-Phenylethylacetat : Vergleich der ee-Bestimmung zwischen chiraler GC und Hoch-Durchsatz-NMR.

Figur 6 : Methylsignal des Diacetats im'H-NMR-Spektrum mit natürlichen Satelliten bei einer Messfrequenz von 300 MHz.

Figur 7 : Methylsignal des Diacetats im'H-NMR-Spektrum mit 69 % 13C- Markierung (_ 38 % ee) bei einer Messfrequenz von 300 MHz.

Figur 8 : Diastereomere Aufspaltung im'H-NMR-Spektrum der CH-Gruppe des Esters von racemischen Phenylethanol mit MTPA bei einer Messfrequenz von 300 MHz.

Im Vergleich zu bestehenden Verfahren bietet die vorliegende Erfindung folgende Vorteile : 1) Bestimmung der ee-Werte mit einem Fehler von maximal 5 % von asymmetrisch verlaufenden Stoffumwandlungen, wobei keine Einschränkung hinsichtlich der Stoffklasse oder des Reaktionstyps gemacht wird.

2) Bestimmung des Umsatzes der untersuchten Reaktionen.

3) Das Durchmustern von Reaktionen im Hoch-Durchsatz-Verfahren, wobei mindestens 1000 Bestimmungen pro Tag möglich sind.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Detektionssysteme sind Kernresonanzspektrometer, insbesondere solche mit Durchflusszelle, für den Hoch-Durchsatz-Betrieb [a) Übersicht : M. J. Shapiro, J. S. Gounarides, Prog.

Nucl. Magn. Reson. Spec. 1999, 35, 153-200 ; b) C. L. Gavaghan, J. K. Nicholson, S. C. Connor, I. D. Wilson, B. Wright, E. Holmes, Anal. Biochem. 2001, 291, 245-252 ; c) E. Macnamara, T. Hou, G. Fisher, S. Williams, D. Raftery, Anal.

Chim. Acta 1999, 387, 9-16] mit einer automatisierten Probenaufgabe (Verwendung von einem oder mehreren Probenaufgabe-bzw. Pipettierrobotern), wobei eine oder mehrere Messzellen pro Spektrometer oder mehrere Spektrometer parallel eingesetzt werden, um den gewünschten hohen Durchsatz zu erreichen.

Geeignete Kerne hierfür sind'H,'9F, 31p und 13C, wobei sich die Methode auf weitere Kernarten (z. B. IlB, l5N, 29Si) erweitern lässt.

Das Verfahren kann zum Auffinden oder Optimieren von chiralen Katalysatoren, Biokatalysatoren oder chiralen Agenzien für asymmetrisch verlaufende Reaktionen verwendet werden. Hierzu zählen : a) chirale Katalysatoren, chirale Agenzien oder Biokatalysatoren wie Enzyme, Antikörper, Ribozyme oder Phagen für die kinetische Racematspaltung von Verbindungen wie Alkohole, Carbonsäuren, Carbonsäureestern, Aminen, Amiden, Olefinen, Alkinen, Phosphinen, Phosphoniten, Phosphiten, Phosphaten, Halogeniden, Oxiranen, Thiolen, Sulfiden, Sulfonen, Sulfoxiden, Sulfonamiden sowie deren Derivate und Kombinationen ; b) chirale Katalysatoren, chirale Agenzien oder Biokatalysatoren für die stereoselektive Umsetzung von prochiralen Verbindungen, mit oder ohne enantiotope Gruppen, wobei die Substrate zu den Substanzklassen der Carbonsäuren, Carbonsäureester, Alkohole, Amine, Amide, Olefine, Alkine, Phosphine, Phosphonite, Phosphite, Phosphate, Halogenide, Oxirane, Thiole, Sulfide, Sulfone, Sulfoxide oder Sulfonamide (oder deren Derivate und Kombinationen) gehören.

Die erste Ausführungsform der Erfindung basiert auf der Verwendung von isotopenmarkierten Substraten in Form von pseudo-enantiomeren oder pseudo- prochiralen Verbindungen (Figur 1), wobei insbesondere 13C-markierte Substrate eingesetzt werden. Die zweite Ausführungsform macht von der Verwendung chiraler Hilfsreagenzien Gebrauch (Figur 2).

Wird an einem herkömmlichen Racemat die eine enantiomere Form isotopenmarkiert, so nennt man solche Verbindungen pseudo-Enantiomere [vgl.

M. T. Reetz, M. H. Becker, H. -W. Klein, D. Stöckigt, Angew. Chem. 1999, 111, 1872-1875 ; Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1758-1761]. Markiert man eine enantiotope Gruppe eines prochiralen Substrats mit Isotopen, so nennt man die Verbindung pseudo-prochiral, so z. B. pseudo-meso. Die Markierungen können auf verschiedene Weise eingeführt werden (vgl. Fälle a und b in Figur 1). Bei kinetischen Racematspaltungen von beliebigen chiralen Verbindungen werden Substrate 1 und 2 oder 1 und 7, die sich in der absoluten Konfiguration und in der Isotopenmarkierung in der funktionellen Gruppe FG bzw. im Rest R2 unterscheiden, in enantiomerenreiner Form hergestellt und im Verhältnis 1 : 1 gemischt, so dass ein Racemat simuliert wird (Figur la bzw. b). Nach einer enantioselektiven Umsetzung, bei der die chemische Reaktion an der funktionellen Gruppe stattfindet (im Idealfall einer kinetischen Racematspaltung bis zu einem Umsatz von 50 %), entstehen echte Enantiomere 3 und 4 neben nicht markierten und markierten achiralen Nebenprodukten 5 bzw. 6, oder es entstehen die pseudo-Enantiomere 3 und 8. Wird die Desymmetrisierung von prochiralen Verbindungen durchgeführt (Figur lc oder d), so entstehen ebenfalls pseudo- Enantiomere.

Integration der entsprechenden'H-NMR-Signale von I3C-markierten Substraten und/oder Produkten sowie von spiegelbildlichen nicht-markierten Substraten und/oder Produkten erlaubt die quantitative Ermittlung der Enantioselektivität (ee- Wert) sowie des Umsatzes. Dies ist besonders einfach durchzuführen, wenn die 13C-Markierung an"isolierten"Methylgruppen erfolgt ist, und zwar deshalb, weil dann das'H-NMR-Signal als Dublett auftritt, während die nicht-markierte Methylgruppe im Enantiomer als Singulett erscheint. Somit sind im Falle von kinetischen Racematspaltungen auch die Selektivitätsfaktoren (S-oder E-Werte) zugänglich [H. B. Kagan, J. C. Fiaud, Top. Stereochem. Vol. 18, Wiley, New York, 1988,249-330].

In der zweiten Ausführungsform der Erfindung wird auf eine Isotopenmarkierung verzichtet. Vielmehr werden die Enantiomerengemische asymmetrisch verlaufender Reaktionen mit enantiomerenreinen chiralen Derivatisierungs- agenzien, NMR Shift-Agenzien oder Solventien unter Bildung von diastereomeren Verbindungen oder Komplexen umgesetzt, die dann im Hoch- Durchsatz NMR-spektroskopisch untersucht werden (Figur 4).

In dieser zweiten Ausführungsform der Erfindung (Figur 2) können als chirale Hilfsreagenzien Verbindungen wie z. B. Mandelsäure, Mandelsäurechlorid, O- Methylmandelsäure (MPA), O-Methylmandelsäurechlorid, Atrolactinsäure, Atrolactinsäurechlorid, a-Methoxy-a-trifluormethyl-phenylessigsäure (MTPA, Mosher's Säure), a-Methoxy-a-trifluormethyl-phenylessigsäurechlorid (MTPACI, Mosher's Säurechlorid), 2- (9-Anthryl)-2-hydroxyacetat (AHA), 9- Anthryl-2-methoxyacetat (9-AMA), a-Pentafluoro-phenylpropionamid, 2-Fluoro- phenylessigsäure (AFPA) oder Cinchona-Alkaloidderivate in enantiomerenreiner Form verwendet werden. Diese Beispiele dienen zur Illustration und schränken die Erfindung nicht ein [a) Übersichten über diese und andere Derivativierungsagenzien : S. K. Latypov, N. F. Galiullina, A. V. Aganov, V. E.

Kataev, R. Riguera, Tetrahedron 2001,57, 2231-2236 ; b) J. A. Dale, D. L. Dull, H. S. Mosher, J. Org. Chem. 1969, 34, 2543-2549 ; c) J. A. Dale, H. S. Mosher, J.

Am. Chem. Soc. 1973,95, 512-519]. Chirale NMR Shift-Agenzien wie z. B.

Eu (dcm) 3, wobei dcm = dicampholylmethanato, oder 1- (9-Anthryl)-2, 2,2- trifluorethanol sowie chirale Solventien (E. L. Eliel, S. H. Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, Wiley, New York, 1994) können ebenfalls zur Bildung von diastereomeren Verbindungen oder Komplexen eingesetzt werden.

Um den erwünschten hohen Durchsatz in den beiden Ausführungsformen der Erfindung zu ermöglichen, ist eine Automatisierung verbunden mit einer Miniaturisierung erforderlich. Ein möglicher Geräteaufbau für die beiden Ausführungsformen ist in Figur 3 bzw. Figur 4 skizziert.

Bibliotheken von chiralen Katalysatoren, Biokatalysatoren oder Agenzien können so im Hoch-Durchsatz mithilfe von kommerziell erhältlichen Mikrotiterplatten und Robotern (Probenmanagern) durchsucht werden. Nach erfolgter Reaktion werden die Proben NMR-spektroskopisch untersucht. Bei entsprechender Aus- stattung des NMR-Spektrometers können auch moderne Pulsverfahren unter Anwendung von gepulsten Feldgradienten sowie von geformten HF-Pulsen ("shaped pulses") zur ee-Bestimmung herangezogen werden. Mit dieser Kombination von kommerziell erhältlichen Geräten und Apparateteilen ist es möglich, mindestens 1000 ee-Bestimmungen pro Tag mit einer Genauigkeit von +/-5 % durchzuführen.

Das Assay für das High-Throughput-Screening einer asymmetrischen Reaktion mittels NMR gestaltet sich so, dass im Falle einer kinetischen Racematspaltung zunächst ein pseudo-Racemat aus enantiomerenreinem Isotopen-markiertem und nichtmarkiertem Substrat hergestellt wird. Anschließend wird die Racemat- spaltung, z. B. in 96-well Mikrotiterplatten, unter Zusatz des Katalysators durchgeführt. Schließlich werden die Proben mittels eines Pipettier-und Proben- aufgaberoboters in die Durchflusszelle des NMR-Gerätes eingebracht (Figur 3).

Beim Einsatz von chiralen Derivatisierungsreagenzien ändert sich der Ablauf dahingehend, dass nach erfolgter katalytischer Reaktion zunächst das Reagenz durch den Pipettierroboter zur Reaktionsmischung zugegeben wird. Erst danach wird die Probe in die Durchflusszelle gebracht (Figur 4). In beiden Fällen können die erhaltenen Datensätze mit einer geeigneten Software, z. B. AMIXÜ der Firma Bruker, automatisch ausgewertet werden.

Beispiel 1. Kinetische Racematspaltung von 1-Phenylethylacetat Die kinetische Racematspaltung von 1-Phenylethylacetat durch Hydrolyse, katalysiert durch z. B. Enzyme wie Lipasen (Wildtyp oder Varianten), wird nach Figur 3 im Rahmen eines Hoch-Durchsatz-Assays verfolgt, d. h. es werden Enantioselektivität sowie Umsatz bestimmt.

Synthese von (R)-1-Phenylethylacetat : In einem 50 ml Einhalskolben mit Hahn werden unter Argon 4 ml Pyridin (abs.) und 1,0 g (8,2 mmol) (R)-1-Phenylethanol in 30 ml Dichlormethan (abs. ) gelöst und auf 0 °C gekühlt. Anschließend werden 0,97 g (12,3 mmol) Acetylchlorid zugetropft, wobei ein weißer Niederschlag auftritt. Dann wird über Nacht bei RT gerührt und die rote Lösung unter Kühlung mit einem Eisbad mit Wasser gequencht. Die organische Phase wird abgetrennt, je einmal mit IM Salzsäure und ges. Natriumchlorid-Lösung extrahiert und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer abgetrennt und das Rohprodukt über Kieselgel mit Dichlormethan gesäult. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum und kurzem Trocknen im Hochvakuum erhält man 1,24 g (92 %) des gewünschten Produkts als klare Flüssigkeit. Analytik : lH-NMR (300 MHz, CDC13) : 8 = 1,53 (d, 3JH, H = 6,6 Hz, 3H) ; 2,06 (s, 3H) ; 5,88 (q, 3JH, H = 6,6 Hz, 1H) ; 7,24-7, 37 (m, 5H) ; l3C-NMR (75,5 MHz, CDC13) : 8 = 21,3 ; 22,2 ; 72,3 ; 126,1 ; 127,9 ; 128,5 ; 141,7 ; 170,3 ; MS (EI, 70 eV) m/z = 164 (M+) ; 122 ; 104 ; 77 ; EA : % C 72,9 (ber. 73,3) ; % H 7,4 (ber. 7,3).

Synthese von (S)-1-Phenylethyl-2-13C-acetat : In einem 50 ml Einhalskolben mit Hahn werden unter Argon 4 ml Pyridin (abs.) und 1,0 g (8,2 mmol) (S)-1-Phenylethanol in 30 ml Dichlormethan (abs. ) gelöst und auf 0°C gekühlt. Anschließend werden 0,97 g (12,3 mmol) 2- 13 C-Acetylchlorid zugetropft, wobei ein weißer Niederschlag auftritt. Dann wird über Nacht bei RT gerührt und die rote Lösung unter Kühlung mit einem Eisbad mit Wasser gequencht. Die organische Phase wird abgetrennt, je 1 mal mit 1M Salzsäure und ges. Natriumchlorid-Lösung extrahiert und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer abgetrennt und das Rohprodukt über Kieselgel mit Dichlormethan gesäult. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum und kurzem Trocknen im Hochvakuum erhält man 1,24 g (92 %) des gewünschten Produkts als klare Flüssigkeit. Analytik :'H-NMR (300 MHz, CDCl3) : 8 = 1,53 (d, 3JH, H = 6,6 Hz, 3H) ; 2,06 (d,'Jc, H = 129,4 Hz, 3H) ; 5, 88 (q, 3JH, H = 6,6 Hz, 1H) ; 7,24-7, 37 (m, 5H) ; 13C-NMR (75,5 MHz, CDCl3) : 8 = 21,3 ; 22,2 ; 72,3 ; 126,1 ; 127,9 ; 128,5 ; 141,7 ; 170,7 ; MS (EI, 70 eV) : m/z = 165 (M+) ; 122 ; 104 ; 77 ; 44 ; EA : % C 72,6 (ber. 73,3) ; % H 7,5 (ber. 7,3).

In Vorversuchen wurden die pseudo-Enantiomere in verschiedenen Verhältnissen gemischt. Die dabei resultierenden Mischungen wurden zunächst per Gaschroma- tographie an chiraler stationärer Phase untersucht, um die pseudo-ee-Werte zu ermitteln. Die gleichen Proben wurden dann NMR-spektroskopisch untersucht.

Der Vergleich der zwei Datensätze zeigt Übereinstimmung im Rahmen von +/-2 % (Tabelle 1) und eine hohe Korrelation (R = 0,9998 in Figur 5).

Tabelle 1 : Mischungen von 35 µl auf 700 Fl CDC13. ee (%) ee (%) Eintrag per GC per 1H-NMR 1 100 (S) 98,2 (S) 2 88, 5 (S) 87,4 (S) 3 71, 2 (S) 69,6 (S) 4 39, 2 (S) 37,8 (S) 5 13, 4 (S) 13,6 (S) 6 0, 4 (S) 1,6 (S) 7 13, 6 (R) 14,2 (R) 8 42, 8 (R) 44,0 (R) 9 69, 6 (R) 70,6 (R) 10 87, 8 (R) 87,2 (R) 11 100 (R) 98,0 (R) Zum Erreichen eines möglichst hohen Probendurchflusses kann die Messmethode auf eine Zykluszeit von ungefähr einer Minute reduziert werden. Die Genauigkeit der Analyse wird dadurch nicht beeinträchtigt, die Rückmischung mit der vorherigen Probe bleibt kleiner 1 %. Typische Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2 : Mischungen von 1,3 bis 1,7 mg auf 1 ml CDC13 im Hoch-Durchsatz- NMR-Verfahren (ca. 1 min pro Zyklus). ee (%) ee (%) Eintrag per GC per H-NMR 1 39, 2 (S) 38, 5 (S) 2 39, 2 (S) 38,2 (S) 3 39, 2 (S) 38,3 (S) 4 13, 6 (R) 12,7 (R) 5 13, 6 (R) 12,2 (R) 6 13, 6 (R) 12,8 (R) 7 42, 8 (R) 41,9 (R) 8 42, 8 (R) 41, 1 (R) 9 42, 8 (R) 41,8 (R) Die Verhältnisse der Methylsignale im'H-NMR-Spektrum (Figur 6 und 7) wurden unter Verwendung der AMIXt-Software der Firma Bruker automatisch ausgewertet.

Beispiel 2. Kinetische Racematspaltung von 2-Phenylpropionsäuremethylester.

Synthese von (R)-2-Phenylpropionsäuremethylester : In einem 25 ml Einhalskolben mit Hahn werden 600 mg (4,0 mmol) (R)-2- Phenylpropionsäure und 912 mg (6,0 mmol) Cäsiumfluorid in 12 ml Dimethylformamid (abs. ) aufgenommen und mit einem Kryostaten auf 13 1 °C gekühlt. Dann werden 1,93 g (13,6 mmol) Methyliodid zugegeben und 46 h bei dieser Temperatur gerührt. Anschließend wird etwas Ethylacetat zugesetzt und zusammen mit dem Überschuß Methyliodid im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Ethylacetat aufgenommen, 1 mal mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung extrahiert und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer wird das Rohprodukt über Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat 8 : 2 gesäult. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum und kurzem Trocknen im Hochvakuum werden 454 mg (69 %) des Produkts als klare Flüssigkeit erhalten. Analytik :'H-NMR (300 MHz, CDC13) : 8 = 1,50 (d, 3JH, H = 7,2 Hz, 3H) ; 3,65 (s, 3H) ; 3,72 (q, 3JHH = 7,2 Hz, 1H) ; 7,23-7, 35 (m, 5H) ; 3C-NMR (75,5 MHz, CDC13) : 8 = 18,6 ; 45,4 ; 52,0 ; 127,1 ; 127,5 ; 128,6 ; 140,6 ; 175,0 ; MS (EI, 70 eV) : m/z =164 (M+) ; 105 ; 77 ; 51 ; EA : % C = 73,2 (ber. 73,3) ; % H 7,5 (ber. 7,3).

Synthese von (S)-2-Phenylpropionsäure-'3C-methylester : In einem 25 ml Einhalskolben mit Hahn werden 600 mg (4,0 mmol) (S)-2- Phenylpropionsäure und 912 mg (6,0 mmol) Cäsiumfluorid in 12 ml Dimethylformamid (abs. ) aufgenommen und mit einem Kryostaten auf 13 1 °C gekühlt. Dann werden 1,93 g (13,6 mmol) 13C-Methyliodid zugegeben und 46 h bei dieser Temperatur gerührt. Anschließend wird etwas Ethylacetat zugesetzt und zusammen mit dem Überschuß Methyliodid im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Ethylacetat aufgenommen, 1 mal mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung extrahiert und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer wird das Rohprodukt über Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat 8 : 2 gesäult. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum und kurzem Trocknen im Hochvakuum werden 454 mg (69 %) des Produkts als klare Flüssigkeit erhalten. Analytik :'H-NMR (300 MHz, CDC13) ; 8 = 1,50 (d, JH, H = 7,2 Hz, 3H) ; 3,65 (d,'Jc, H = 146,9 Hz, 3H) ; 3,71 (q, 3JH, H = 7,1 Hz, 3H) ; 7,22-7, 35 (m, 5H) ; 3C-NMR (75,5 MHz, CDC13) : 8 = 18,6 ; 45, 4 ; 52,0 ; 127,1 ; 127,5 ; 128,6 ; 140,6 ; 175,0 ; MS (EI, 70 eV) : m/z = 165 (M+) ; 105 ; 77 ; 51 ; EA : % C 72,8 (ber. 73,3) ; % H 7,4 (ber. 7,3). Die entsprechenden Ester wurden zur Evaluierung des Screening-Systems in verschiedenen Verhältnissen gemischt und sowohl per GC als auch per Hoch- Durchsatz-NMR bestimmt, die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Der Fehler liegt in allen Fällen bei < 2 % ee.

Tabelle 3 : Mischungen von 10 Ill auf 700 Al CDCl3. Eintrag ee (%) per GC ee (%) per'H-NMR 1 100 (S) 98,2 (S) 2 82, 6 (S) 82,8 (S) 3 76, 4 (S) 77,0 (S) 4 58, 0 (S) 58,8 (S) 5 29, 8 (S) 30,4 (S) 6 0 0, 6 (R) 7 31, 0 (R) 29,0 (R) 8 5 8, 4 (R) 57,2 (R) 9 74, 6 (R) 74,0 (R) 10 81, 2 (R) 81,4 (R) 11 loo (R) 98,2 (R) Die Verhältnisse der Methyl-Signale (Figur 6 und 7) im'H-NMR-Spektrum wurden unter Verwendung der AMIX°-Software der Firma Bruker automatisch ausgewertet.

Beispiel 3. Enantioselektive Hydrolyse von meso-1, 4-Diacetoxy-2-cyclopenten Dieses Beispiel bezieht sich auf die Reaktion einer pseudo-prochiralen Verbindung, die enantiotope Gruppen trägt (hier Acetoxygruppen).

Synthese von (1S, 4R)-cis-1- (2-13C-Acetoxy)-4-acetoxy-2-cyclopenten : In einem 250-ml-Stickstoffkolben werden unter Luft-und Feuchtigkeitsausschluss 5,00 g (35,2 mmol) (1S, 4R)-cis-4-Acetoxy-2-cyclopenten-1-ol, 4,27 mL (4,18 g/ 6,95 mmol) Pyridin und 100 ml Dichlormethan vorgelegt und auf 0'C gekühlt.

Unter Rühren wird innerhalb von 10 min 3,00 mL (3, 44 g, 42,2 mmol/2-C- Acetylchlorid zugetropft. Innerhalb von 12 h wird auf Raumtemperatur erwärmt und sukzessive mit je zweimal 50ml 1 M Salzsäurelösung, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert.

Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, vom Trockenmittel durch Filtration getrennt und am Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit.

Das Rohprodukt wird auf Kieselgel aufgetragen und chromatographisch mit Hexan/Ethylacetat 5 : 1 gereinigt. Die Produktfraktionen werden vereinigt und am Rotationsverdampfer vom Lösemittel befreit. Nach Trocknen im Ölpumpen- vakuum verbleibt eine klare Flüssigkeit (6,38 g, 97 %). Analytik :'H-NMR (CDCl3, 300 MHz) : d= 1,71-1, 78 (m, 2H) ; 2,07 (s, 3H) ; 2,07 (d,'Jc, H = 130 Hz, 3H) ; 2,83-2, 93 (m, 2H) ; 5,55 (dd, 3JHH= 3,8 Hz, 2JHH= 7. 5 Hz, 2H) ; 6,10 (s, 2H) ; 13C-NMR (CDCI3, 75 MHz) : = 21,5 ; 37,5 ; 76,9 ; 135,0 ; 171,1 ; MS (EI, 70 eV) : nez = 183 [M+] ; 82 ; 54 ; 46 ; 43 ; EA : C : 57,8 % (ber. 57,7 %) ; H : 6,5 % (ber.

6, 5 %).

Die entsprechenden Monoacetate wurden zur Evaluierung des Screening-Systems in verschiedenen Verhältnissen gemischt und sowohl per GC als auch per Hoch- Durchsatz-NMR bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 4 : Mischungen von 1 mg auf 1 mL CDCl3 ee (%) ee (%) Eintrag per GC per'H-NMR 1 100 (S) 99,5 (S) 2 82, 4 (S) 82,6 (S) 3 63, 0 (S) 63,8 (S) 4 43, 0 (S) 44,3 (S) 5 6, 4 (S) 9,2 (S) 6 2, 6 (S) 3,6 (S) 7 19, 6 (R) 17,3 (R) 8 41, 6 (R) 38,3 (R) 9 64, 4 (R) 63,9 (R) 10 82, 2 (R) 81,8 (R) 11 99, 9 (R) 97,5 (R) Die Verhältnisse der Methylsignale im'H-NMR-Spektrum (Figur 6 und 7) wurden unter Verwendung der AMIXt-Software der Firma Bruker automatisch ausgewertet.

Beispiel 4. Kinetische Racematspaltung von 2-Butanol Zunächst wurde der Alkohol mit Mosher's Säurechlorid derivatisiert, um die entsprechenden diastereomeren Ester herzustellen. Die Proben wurden danach in einem Hoch-Durchsatz-NMR-Gerät getestet und die ee-Werte durch automatische Integration der CH2-Signale der Diastereomere im'H-NMR-Spektrum berechnet.

Zur Kontrolle wurde die Enantiomerenreinheit der gleichen Proben gaschromatographisch bestimmt. Die mittels Hoch-Durchsatz-NMR und GC bestimmten ee-Werte sind in Tabelle 5 gegenübergestellt.

Tabelle 5 : Mischungen von 1 mg auf 1mL CDC13 ee (%) ee (%) Eintrag per GC per'H-NMR 1 100 (S) 100 (S) 2 68, 4 (S) 70,9 (S) 3 47, 6 (S) 52,7 (S) 4 36 (S) 34,2 (S) 5 19 (S) 17,6 (S) 6 2, 2 (R) 3,4 (R) 7 10, 4 (R) 12,3 (R) 8 35 (R) 40,5 (R) 9 49, 8 (R) 56 (R) 10 66, 4 (R) 66,2 (R) 11 100 (R) 100 (R) Die Verhältnisse der CH2-Signale der Diastereomere wurden unter Verwendung der AMIXt-Software der Firma Bruker automatisch ausgewertet.

Beispiel 5. Kinetische Racematspaltung von 1-Phenylethanol Zunächst wurde der Alkohol analog zu Beispiel 4 mit Mosher's Säurechlorid derivatisiert, um die entsprechenden diastereomeren Ester herzustellen. Die Proben wurden danach in einem Hoch-Durchsatz-NMR-Gerät getestet und die ee- Werte durch automatische Integration der CH-Signale der Diastereomere im lH- NMR-Spektrum berechnet. Zur Kontrolle wurde die Enantiomerenreinheit der gleichen Proben gaschromatographisch bestimmt. Die mittels Hoch-Durchsatz- NMR-Gerät und GC bestimmten ee-Werte sind in Tabelle 6 gegenübergestellt.

Tabelle 6 : Mischungen von 1 mg in 1 mL CDC13 ee (%) ee (%) Eintrag per GC per'H-NMR 1 100 (S) 100 (S) 2 82, 7 (S) 86, 0 (S) 3 65, 0 (S) 66,7 (S) 4 47, 7 (S) 55,0 (S) 5 35, 4 (S) 38,7 (S) 6 11, 4 (S) 16,3 (S) 7 6, 6 (R) 3, 5 (R) 8 25, 2 (R) 21,9 (R) 9 49, 6 (R) 45,9 (R) 10 74, 8 (R) 75, 4 (R) 11 100 (R) 100 (R) Die Verhältnisse der CH-Signale der Diastereomere (Figur 8) wurden unter Verwendung der AMIX°-Software der Firma Bruker automatisch ausgewertet.