| REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente mi invención, lo que considero como una novedad y por io tanto reclamo de mi exclusiva propiedad las siguientes reivindicaciones: 1. Un proceso para la producción de compuestos bacterianos (cepas) altamente productores de sideróforos caracterizado porque comprende las siguientes etapas: A. PREPARACION DE MUESTRAS. Se toman 25 muestras de suelo de la zona de la rizósfera de una parcela para el cultivo de maíz; se mezcla en el interior de contenedores flexibles. Se pesan 10 g de la mezcla de suelo y se realizaron al menos una dilución con una relación 1 :10 (1x10'1 a 1x107) en solución salina fisiológica (NaCI 0.85%). Se transfirieren alícuotas de 100 μΙ_ de las diluciones a cajas de Petri con medio Pikovskaya y CAS para la selección directa de productores de sideróforos; también se utilizan los medios de gelosa nutritiva, arginina glicerol, B de King, para la selección de grupos microbianos específicos. Los medios de cultivo inoculados se incuban entre los 25 y 47 °C por 18 a 64 h; B. REACTIVACION DE CEPAS. Se seleccionan cepas de los medios Pikovskaya y CAS que generaron un halo color naranja, indicador de la producción de sideróforos. Se reactivan las cepas en medio solido CAS para corroborar la producción de sideróforos, se ajustan suspensiones bacterianas en 5 ml_ de solución salina fisiológica al tubo 0.5 en la escala de McFarland. Se transfieren 1 ml_ de la suspensión bacteriana y se inocularon 100 ml_ de medio ácido succínico, compuesto por: K2HPO4 6.0 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, MgSO4 0.2 g/L, (NH4)2SO41.0 g/L y ácido succínico 4.0 g/L, pH 7.0; Se incuban a 28 °C en un agitador orbital, a 120 rpm por 24-30 h. Para obtener los sideróforos, 10 mL del medio inoculado se centrifugan a 4696 g por 10 min; C. AISLAMIENTO Y SEPARACION DE CEPAS. Se seleccionan aislamientos de los otros medios con morfología macroscópica y microscópica diferentes, se purifican las cepas en el mismo medio de donde se aislaron. Los aislamientos puros se resiembran en medios de cultivo con substratos como Gelosa gelatina, Gelosa Leche, Gelosa almidón, Gelosa Baird- Parker, Caldo nitrato, Gelosa Acetato de Fowller, Gelosa Azul Victoria, Gelosa quitina coloidal, Gelosa con lignina, entre otros, y se evalúan las capacidades metabólicas de los aislamientos; y D. CRIOPRESERVACIÓN DE CEPAS. Las cepas caracterizadas se conservan largo plazo en criopreservación. Se prepara un inoculo a partir de cultivo en fase de crecimiento logarítmica tardía y previa a la fase estacionaria (18 a 48 h) de las cepas caracterizadas, se ajusta el inoculo en SSF a la turbidez 7 del nefelómetro de McFarland (2.1x10· UFC/mL). Se coloca el criotubo con 0.5 mL de leche descremada al 20% estéril en un baño de hielo y se transfirieren 0.5 mL dei inoculo ajustado al tubo 7 del nefelómetro, se rotulan y se equilibró el crioprotector por 30 min en un baño de hielo, después se colocan los tubos en un congelador a -20 °C durante 24 h, se almacenan los tubos en un ultracongelador a -80 °C. 2. Una cepa denominada Pseudomonas spp. CM-CNRG 186, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno; 3. Una cepa denominada Serratia spp. CM-CNRG 199, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno; 4. Una cepa denominada Pseudomonas spp. CM-CNRG 181, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno; 5. Una cepa denominada Pseudomonas spp. CM-CNRG 200, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno; 6. Una cepa denominada Pseudomonas palleroniana CM-CNRG 172, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno; 7. Una cepa denominada Pseudomonas extremorientalis CM-CNRG 144, caracterizada porque fue obtenida a través del proceso de preparación de la reivindicación uno; 8. Una cepa denominada Serratia grímesii CM-CNRG 197, caracterizada porque fue obtenida a través dei proceso de preparación de la reivindicación uno; 9. El compuesto de biomasa bacteriana donde los microorganismos fueron aislados, seleccionados, conservados y depositados de conformidad con las reivindicaciones dos, tres, cuatro, cinco, seis y siete caracterizado porque se obtiene de un proceso que comprende el aislamiento tos morfotipos bacterianos compatibles en medios de cultivo selectivos, medio B de King, Arginina glicerol, medio Czapeck, gelosa nutritiva, a una temperatura de 35 °C a 37 °C durante 18 a 48 horas en condiciones aeróbicas y de obscuridad; 10. El compuesto de biomasa bacteriana de la reivindicación nueve caracterizado porque el proceso de aislamiento los morfotipos bacterianos compatibles en medios de cultivo selectivos, medio B de King, Arginina glicerol, medio Czapeck, gelosa nutritiva, a una temperatura de 35 °C a 37 °C durante 18 a 48 horas en condiciones aeróbicas y de obscuridad, es el de la reivindicación uno. 11. Un procedimiento para la selección de los morfotipos bacterianos compatibles con los género Pseudomonas y Serratia, se fundamenta en lo establecido en el manual de taxonomía sistemática de Bergey para las características de morfología colonial y microscópica, además de la siembra de las cepas en medios de cultivo selectivos de la reivindicación 1 para la obtención de cultivos axénico; 12. Los compuestos de las reivindicaciones diez y once realizado en medios de cultivos formulados en laboratorio caracterizado porque evidencia la capacidad de producción de sideróforos y compuestos con actividad antimicrobiana y su fijación de nitrógeno atmosférico: 13. El uso de los compuestos de la reivindicación doce caracterizados porque tienen actividad como agente inhibidor de fitopatógenos en cultivos preferentemente con importancia agrícola. |
SIDERÓFOROS, SU PROCESO DE OBTENCIÓN Y SU USO COMO
AGENTE INHIBIDOR DE FITOPATÓGENOS
OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un cultivo mixto de cepas bacterianas con capacidad antagónica para hongos patógenos de cultivos con importancia agrícola y productoras de sideróforos; El objeto de esta invención es un cultivo mixto bacteriano aislado de la rizósfera de maiz que consistente en una suspensión de células de los microorganismos. El procedimiento de aislamiento y obtención de la mezcla microbiana forman el objeto de la presente invención y por tanto se considera que es una invención del área biotecnológica.
ANTECEDENTES
El uso de microorganismos rizosféricos como una alternativa biotecnológica en el control de microorganismos patógenos se práctica mediante la inoculación de semillas. Klopper en la década de los 70s, utilizo el término PGPR (plant growth promoting rizobacteria) para referirse a las rizobacterias capaces de provocar un efecto benéfico en las plantas. La capacidad para colonizar las raices es una condición indispensable para que una bacteria sea considerada como una verdadera PGPR, siendo por tanto esa capacidad un primer paso y un rasgo crucial para la selección de los inoculos microbianos a ser usados como biofertilizantes, biopesticidas, fitosimuladores o biorremediadores (Peña y Reyes, 2007). La producción de sideróforos se ha asociado con diversas bacterias de vida libre (Loredo-Osti y cois., 2004). En teoría en respuesta a la limitación de hierro de las condiciones encontradas en la superficie aérea de las plantas o en la rizósfera, los microbios producen sideróforos in situ (Loper y Buyer, 1991). Varios factores ambientales pueden modular la síntesis de sideróforos, incluyendo el pH, los niveles de hierro y sus formas químicas, la presencia de otros elementos traza y una adecuada fuente de carbono, nitrógeno y fósforo (Compant y cois., 2005). Este es uno de los principales factores limitantes de nutrientes esenciales para la vida microbiana, dado que en la naturaleza del hierro no está fácilmente disponible en la forma preferida, ios microorganismos producen pequeñas moléculas quelantes llamados sideróforos para su adquisición. Los sideróforos también juegan un papel critico en la expresión de la virulencia y el desarrollo de biopelículas por diferentes microorganismos (Saha y cois. , 2013) .
En el estado de la técnica, encontramos métodos que divulgan procesos de obtención de sideróforos cuya mezcla comprende sacarosa, CAS, MM9, Agar, Pipes, Casamino, etc. , entre otras sustancias que consisten en disolver 60.5 de CAS en agua y mexclar con 10 mi de una solución A (1 Mm de cloruro férrico, 10 Mm hcL). Bajo agitación agregar lentamente 72.9 mg HDTMA disuelto en 40 mi de agua. Autoclavar la solución azul resultante. Por otro lado autoclavar una mezcla de 750 mi de agua, 100 mi de sales MM9 (X10), 15 g de agar, 30.24 g de Pipes (6.8). Luego enfriar agregar 30 mi de solución Casamina Acids al 10% y la fuente de carbono elegida como soluciones estériles. Agregar a la solución azul obtenida anteriormente, por las paredes con suficiente agitación para lograr la mezcla pero no formar espuma.
Otro método conocido para la producción de sideróforos consiste en modificar un medio CAS liquido con Casamina Acids 0.3%, sucrosa 0.2%, tiamina-HCI 0.0002% y succinato 0.2%, w/v que se usa para producir sideróforos en tres tiempos, primero son detectados con el medio liquido y en Agar son modificados en pequeñas muestras hasta obtener una mezcla azul oscuro, posteriormente se disuelve en una solución especifica y los sideróforos son evaluados en tabaco; posteriormente se realiza una doble destilación y deionización para preparar en al menos tres días;
Los procesos anteriormente descritos y divulgados, difieren en grado significativo con el de la presente invención, porque particularmente solo preparan la producción de los sideróforos en un nivel genérico, sin caracterizarlos, ni deducir la potencia de la actividad que tienen los productos obtenidos.
OBTENCION DE LA MEZCLA MICROBIANA
A. PREPARACION DE MUESTRAS. Se realizó la toma de 25 muestras de suelo de la zona de la rizósfera de una parcela para el cultivo de maíz; se mezclaron las 25 muestras en el interior de contenedores flexibles. Se pesaron 10 g de la mezcla de suelo y se realizaron al menos una dilución con una relación 1:10 (1x10 1 a 1x1 Qr 7 ) en solución salina fisiológica (NaCI 0.85%). Se transfirieron alícuotas de 100 pL de las diluciones a cajas de Petri con medio Pikovskaya y CAS para la selección directa de productores de sideróforos; también se utilizaron los medios de gelosa nutritiva, arginina giicerol, B de King, para la selección de grupos microbianos específicos. Los medios de cultivo inoculados se incubaron entre los 25 y 47 °C por 18 a 64 h;
B. REACTIVACION DE CEPAS. Se seleccionaron cepas de los medios Pikovskaya y CAS que generaron un halo color naranja, indicador de la producción de sideróforos. Se reactivaron las cepas en medio solido CAS para corroborar la producción de sideróforos, se ajustaron suspensiones bacterianas en 5 mL de solución salina fisiológica al tubo 0.5 en la escala de McFarland. Se transfirió 1 mL de la suspensión bacteriana y se inocularon 100 mL de medio ácido succínico, compuesto por: K2HPO4 6.0 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, MgS04 0.2 g/L, (NH4>2S04 1.0 g/L y ácido succínico 4.0 g/L, pH 7.0; Se incubará a 28 °C en un agitador orbital, a 120 rpm por 24-30 h. Para obtener los sideróforos, 10 mL del medio inoculado se centrifugarán a 4696 g por 10 min; el sobrenadante se someterá a los análisis que se mencionan a continuación (Bholay y col., 2012). C. AISLAMIENTO Y SEPARACION DE CEPAS. Se seleccionaron aislamientos de los otros medios con morfología macroscópica y microscópica diferentes, se purificaron las cepas en el mismo medio de donde se aislaron. Los aislamientos puros se resembraron en medios de cultivo con diferentes substratos para la evaluación de diferentes capacidades metabólicas de los aislamientos (Tabla 1).
D. CRIOPRESERVACIÓN DE CEPAS. Las cepas caracterizadas se conservaron a largo plazo en criopreservación. Se preparó un inoculo a partir de cultivo en fase de crecimiento logarítmica tardía y previa a la fase estacionaria (18 a 48 h) de las cepas caracterizadas, se ajustó el inoculo en SSF a la turbidez 7 del nefelómetro de McFarland (2.1x10» UFC/mL). Se colocó el criotubo con 0.5 mL de leche descremada al 20% estéril en un baño de hielo y se transfirieron 0.5 mL del inoculo ajustado al tubo 7 del nefelómetro, se rotularon y se equilibró el crioprotector por 30 min en un baño de hielo, después se colocaron los tubos en un congelador a -20 °C durante 24 h, se almacenaron los tubos en un ultracongelador a -80 °C.
Las cepas fueron identificadas con el análisis de la secuencia de un fragmento de DNA del gen 16S rDNA con el uso de iniciadores universales para la identificación de procaríontes 27f (5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3') y 1492r (5 * -GGTTACCTTGTTACGACTT- 3'), la asignación de identidad se realizó con el análisis de las secuencias en la plataforma BLAST y se corroboró por medio de una reconstrucción filogenética in silico.
NOVEDAD Y DEPOSITO DE CEPAS.
Se logró la asignación de identidad de siete cepas, 4 cepas fueron clasificadas a nivel de género debido a que no se agruparon con alguna de las especies descritas del género bacteriano correspondiente lo que permite en el poder clasificarlas como nueva especie del género; las cepas fueron depositadas en la Colección de Microorganismos del Centro Nacional de Recursos Genéticos (CM-CNRG) del INIFAP (Tepatitlán de Morelos, Jalisco, México), con las siguientes claves: Pseudomonas spp. CM-CNRG 186, Serratia spp. CM-CNRG 199, Pseudomonas spp. CM-CNRG 181, y Pseudomonas spp. CM-CNRG 200. 3 cepas fueron clasificadas taxonómicamente a nivel de género y especie y fueron depositadas en la CM-CNRG con las siguientes claves: Pseudomonas pal!eroniana CM-CNRG 172, Pseudomonas extremorientalis CM-CNRG 144, y Serratia gnmesii CM- CNRG 197. Se determinó la capacidad de crecimiento de las cepas en el medio CAS como mezclas, primero las 4 cepas con nivel a género como mezcla A y las 3 cepas identificadas como mezcla B.
DETERMINACIÓN DE PORCENTAJE DE UNIDADES DE SIDERÓFOROS
Para estimar el porcentaje de unidades de sideróforos producidos se utilizó el método CAS en solución. Este es un método colorimétrico consiste en mezclar 0.5 ml_ de sobrenadante con 0.5 mL del medio CAS, la absorbencia se determinó a una longitud de onda de 630 nm, se usó como blanco la mezcla de 0.5 mL del medio sin inoculo de bacterias y 0.5 mL del medio CAS y se determinó la absorbencia a 630 nm (Jakare y Chavan, 2014). Para obtener el porcentaje de unidades de sideróforos se utilizó la formula siguiente:
%US= (Ar-As)/Arx100 Dónde: Ar = Absorbencia de referencia a 630 nm; As = absorbencia de la muestra a 630 nm; US = unidades de sideróforos. Esta estimación es independiente del tipo de sideróforo presente (Aparna y Hevesh, 2012).
CARACTERIZACIÓN DE SIDERÓFOROS Pere le detección de sideróforos tipo catecolato se utilizó el método de Amow, que se bese en le capacidad de combinación del catecol con ácido nitroso y se genere un compuesto de color amarillo. Se realizó una mezcla de 1 mL del sobrenadante del cultivo con 1 mL de HCI 0.5 M y 1 mL del reactivo nitrito-molibdato; a la mezcla se adicionó 1 mL de NaOH 1 M. Le presencie de catecolatos se determinó por la formación de un compuesto de color color amarillo al adicioner el reactivo nitrito-molibdato y un cambió a color rojo al adicioner el NeOH; se midió la absorbencia a una longitud de onda de 500 nm; como blanco se utilizó el medio sin inocular más los otros reactivos (Gorkan y Pal, 2010).
La detección de sideróforos tipo hidroxamato se obtuvo con el método de Atkin, que es un método colorímétrico y se fundamenta en la combinación de 0.5 mL de sobrenadante con 2.5 mL de reactivo de Atkin (0.1771 g de Fe(CI04)3, 1.43 mL de ácido perclórico aforado en 100 mL de ddhbO), se incuba a temperatura de la habitación por 5 minutos; un resultado positivo por la presencia de hidroxamatos se indica por la adquisición de un color naranja o rojo. Se determinó la absorbencia a una longitud de onda a 480 nm; el medio sin inocular más los reactivos antes mencionados se utilizaron como blanco (Angel y col., 2013).
El ensayo de Vogel (Dave y Dube, 2000) detectó la presencia de sideróforos del tipo carboxilato; se mezclaron 3 gotas de hidróxido de sodio 2 N y se adicionó una gota de fenolftaleína, se adicionaron de 2 a10 gotas de agua hasta que la mezcla desarrolló un color rosa, se adicionó ei sobrenadante de cada una de las cepas y se consideró un resultado positivo si el color rosa desapareció. Se hizo una curva de calibración con desferramina B y ácido 2,3-hidrobenzoico para la cuantificación de sideróforos de tipo catecolato e hidroxamato respectivamente. EVALUACIÓN in vitro DE LA ACTIVIDAD ANTAGÓNICA DE SIDERÓFOROS a Fusaríum
La actividad antifúngica de los sideróforos se evaluó al colocar un disco de medio con micelio del hongo sobre una caja de Petri con medio agar papa dextrosa al que previamente se inocularon 0.2 mL de sobrenadante que contiene los sideróforos y se homogeneizo con una varilla de vidrio acodad estéril; se incubó la caja a 32 °C por 6 dias y se registró el crecimiento del hongo, se usó como control una caja con medio sin el extendido del sobrenadante. Se obtuvo el porcentaje de inhibición de Fusaríum por los sideróforos con base a la siguiente formula:
Dónde: Pl es el porcentaje de inhibición de crecimiento de Fusarium, C es el área de crecimiento del hongo en la placa control y Fs es el área de crecimiento del hongo con el sobrenadante (Syed y Vidhale, 2012). OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO PARA LA PRODUCCIÓN DE SIDERÓFOROS
Para optimizar la producción de sideróforos se hicieron pruebas con las variables: pH (4 a 8), concentración de agente quelante (PIPES 0.5% al 3%), temperatura (20 °C a 42 °C) y fuente de carbono (glucosa, sacarosa y ácido succínico del 0.5% al 6%) (Tailor y Joshi, 2012). GENERACIÓN DE LAS MEZCLAS MICROBIANAS
Se generó la biomasa de las cepas en medio solido CAS y se hicieron suspensiones bacterianas en volúmenes que van desde 5 mL a 1000 mL de SSF con la transferencia de biomasa hasta ajusfar a una turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala del Nefelómetro de McFarland. Se hicieron mezclas con las suspensiones ajustadas de las cepas: Pseudomonas spp. CM-CNRG 186, Serratia spp. CM-CNRG 199, Pseudomonas spp. CM-CNRG 181, y Pseudomonas spp. CM-CNRG 200; en volúmenes finales iguales de cada suspensión hasta volúmenes de 1000 mL. Se realizó otra mezcla con las cepas: Pseudomonas palleroniana CM-CNRG 172, Pseudomonas extremoríentalis CM-CNRG 144, y Serratia grimesii CM-CNRG 197; en volúmenes finales iguales de cada suspensión hasta volúmenes de 1000 mL. Las De las mezclas se tomaron volúmenes iguales para generar una mezcla microbiana con las cepas de los géneros Pseudomonas y Serratia productoras de sideróforos y con capacidad antagónica al género Fusarium. REFERENCIAS
Syed, S. A., Vidhale N. 2012. Antagonistic Activlty of Siderophore Producing Pseudomonas Aeruginosa against Aspergillus Spp. and Candida Albicans. Research journal of pharmaceutical, biological and chemica! sciences. 3, 719-726.
Nagoba, B., Vedpathak D., 2011. Medical applications of sidefophores. Eur. J. Gen. Med. 8, 229-235.
Kannahi, M., Senbagam, N. 2014. Studies on siderophore production by microbial isolates obtained from rhizosphere soil and its antibacterial activity. J. Chem. Pharm. Res. 6, 1142-1145
Seyesayamdost, M. R., Cleto, S., Carr, G., Vlamakis H., Vieira, M. J. 2012. Mixing and matching clusters: structure and biosynthesis of serratiochelin from serratia sp. V4. J. Am. Chem. Soc. 134, 13550-13553.
Aguado, G., Moreno, B., Jiménez, B. García, E., Preciado. R. E., 2012. Impacto de los sideróforos y fitosideróforos en la asimilación de hierro por las plantas: una síntesis. Rev. Fitotecnia Mexicana. 35, 9 - 21.
Saharan, B. S., Nehra. V. 2011. Plant growth promoting rhizobacteria: A critical review. Life Sciences and Medicine Research. 2011: LSMR-21.
García, M., Cardoso. E. F., Lechner, B. E., Gauthier, G. M., Lidner, H., Meló A., Haas, H. 2014. Hydroxamate production as a high affinity iron acquisition mechanism in Paracoccidiodes Spp. PLOS ONE. 9(8): e105805. do¡:10.1371/journal.pone.0105805
Ahmed, E., Holmstróm, S. J. M. 2014. Siderophores in environmental research: roles and applications. Microbial Biotechnology. 7, 196-208. Yétérian, E. 2010. Bases moléculaires de la maturation et de la sécrétion de la pyiverdine chez Pseudomonas aeruginosa. (Tesis doctoral). Universidad de Estrasburgo. Francia. Disponible en: http://scd-theses.u- strasbg.fr/1921/0lAYETERIAN_Emilie_2010r.pdf. Accesado el 23/06/2015.
Bhattacharya, A. 2010. Siderophore mediated metal uptake by pseudomonas fluorescens and its comparison to iron (iii) cheiation. Cey. J. Sci. (Bio. Sci.). 39, 147-155.
Syed, S. A., Vidhale N. 2013. Bacterial siderophore and their a ppl ¡catión: A review. Int. J. Curr. Microbiol. App.Sci. 2, 303-312.
Tailor, A. J , Joshi, B. H. 2012. Characterization and optimization of siderophore production from Pseudomonas fluorescens strain isolated from sugarcane rhizosphere. Journal of environmental research and development. 6, 688-694.
Bholay, A. D., Jadhav, P. U„ Borkataria, B. V., Mayuri, V. D. 2012. Fluorescent pseudomonads as plant growth promoting rhizobacteria and their siderophoregenesis Journal of pharmacy and biological sciences. 3, 27- 32.
Jakare, A. M., Chavan, M. D. 2014. Enhanced plant growth by siderophore producing Enterobacter spp. mz-12. Bionano Frontier. 7, 49-52.
Aparna, J. T., Bhavesh H. J. 2012. Characterization and optimization of siderophores production from Pseudomonas fluorescens strain isolated from sugarcane rhizosphere. Journal of environmental research and development. 6, 688-794.
Gorkan, K., Pal, R.B. 2010. Siderophores and pathogenecity of microogamisms. J. Biosci. Tech. 1, 127-134.
Angel, M. R., Reena, A., Aysha, O. S., Valli, S., Nirmala, P., Vinothkumar, P., 2013. Isolation of siderophore producing bacteria from rhizophere soil and their antagonistic activity against selected fungal plants pathogens. lnt.J.Curr.Microbiol.App.Sci. 2, 59-65. Dave, B. P., Dube, H. C, 2000. Chemical characterization of fungal siderophores. Indian journal of experimental biology. 38, 56-62.
Sayyed, R. Z., Patel, P. R. 2011. Biocontrol potencial of siderophore producing heavy metal resistant Aicaligenes sp. and Psudomonas aeruginosa RZS3 vis-á-vis organophosphorus fungicide. Indian J. Microbiol. 51, 266-272.
Dehner, C, Awaya, J., Maurice, P M DuBois, J. 2010. Roles of siderophores, oxalate, and ascorbate in movilization of iron from hematite by aerobio bacterium Pseudomonas mendocina. Applied and environmental microbiology. 76, 2041-2048.