技术领域

本发明涉及一种 HIV杀微生物剂， 以及经阴道或直肠给药来预防 HIV 感染的方法。

背景技术

1.艾滋病的流行趋势

自 1981年发现首例艾滋病感染者以来， 艾滋病因其传播快、 病死率高 和无法治愈， 成为全球性的健康难题。 虽然鸡尾酒疗法的推广大大地降低 了艾滋病的发病率和死亡率，但其危害性依然 不可小视。截至 2009年，全 球已有 3000万人因艾滋病引起的相关疾病死亡，现存� �的人免疫缺陷病毒 ( HIV )感染者和艾滋病人超过 3340万， 而且每天有约 7000人被发现新 感染了 HIV病毒 ( www»ti腿 Ms'org ) 在我国， 截至 2011年 10月底， 全 国累计报告 HIV感染者和病人 43.4万例， 其中病人 16.6万例； 死亡 8.8 万例。

全球大约 70 % -80 %的 HIV感染者是通过性接触感染上的（ Downs AM 等， 1996， 艾滋病与人逆转录病毒学杂志 （J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol) ll(4):388-95 ) 。 发生一次无保护性交， 在男性同性恋中 传染 HIV的概率约为 0.5%-3%； 而在异性性接触中， 男传女的概率是 0.1%-0.2%, 女传男的概率是 0.03%-0.1% ( Wiley JA等， 1989， 医学统 计 (Stat Med) 8:93-102 ) 。 2009年中国卫生部公布的最新数据显示， 性传 播已经成为我国艾滋病传播的主要途径， 其中， 同性性行为所引起的艾滋 病传播已经占到传播总数的 32%， 异性性行为导致的艾滋病传播达到

40%, 超 itiL液传播和母婴传播， 成为最主要的传播途径。 2008年中国 61 个城市的同性恋群体调查显示，现平均有 4.8%的同性恋者患有艾滋病，其 中最高的一个城市高达 18%。 资料显示， 2009年我国有 70万（55-85万） 的 HIV感染者中， 男性同性恋者约为 7.7万人， 占总评估人数的 11% (侯 建星等， 2010， 上海预防医学杂志 22(2): 83-85 ) 。

男同性恋者之间艾滋病传染的几率高于异性性 行为。该人群主要的性行 为之一是肛交。 与异性性行为相比， 直肠弹性不及阴道， 而且直肠比较脆 弱， 直肠黏膜较薄， 更容易破损。 在直肠破损时， 精液里含有的大量 HIV 就很容易进入人体。 此外， 男性同性恋者经常交换性伙伴， 安全套使用率 低， 更增加了 HIV感染的机会。

2.人免疫缺陷病毒（HIV )的生命周期

HIV的繁殖周期包括以下重要步驟。 首先， 病毒外包膜的糖蛋白 _g pl20 与淋巴细胞表面的 CD4分子发生特异性的结合，吸附于细胞膜上。 在一组 趋化因子受体的协助下， 病毒包膜与宿主细胞膜融合（Berger, E.A.等， 1999， 免疫学年度综述 (Amm Rev Immunol) 17:657-700 ) 。 融合后， 包装 在核衣壳里的 HIV毒粒进入细胞， 脱去衣壳， 棵露出病毒核酸。 病毒逆转 录酶催化由 HIV单股 RNA转录成单股 DNA，再在细胞聚合酶的催化下成 为双股 DNA。 HIV的双股 DNA可以以自由形式存在于胞浆中， 也可在病 毒整合酶的催化下，以双股 DNA前病毒的形式整合于宿主染色体 DNA内， 从而形成 HIV的潜伏感染（ Roe, T.等， 1997， 病毒学杂志 (J Virol) 71(2):1334-40 ) 。 前病毒在宿主染色体中是稳定的， 不会被切除。 前病毒 能随染色体的复制而遗传。 在 HIV的 mRNA翻译出大的聚蛋白后， 病毒 蛋白酶切断并加工聚蛋白，形成成熟的病毒结 构蛋白（Xian _g ， Y等， 1997， 病毒学杂志 (J Virol) 71(3):2083-91 ) 。 最后， HIV核酸和这些结构蛋白结 合， 装配出新的病毒颗粒， 并以出芽的方式释放到细胞外（ Kiss-Lazozlo 等， 1996， 微生物学趋势 (Trends Microbiol) 4(12):480-5 ) 。

3. HIV感染的防治 从 HIV的复制周期可以看出： HIV复制的关键阶段是 1)病毒吸附并通 过融合进入细胞； 2)逆转录与整合； 3)蛋白翻译与加工； 4)病毒的装配和释 放。 目前已有 32种治疗艾滋病的药物上市，针对上述不同的� ��键阶段， 包 括逆转录酶抑制剂、 蛋白酶抑制剂、 进入抑制剂以及整合酶抑制剂。 这些 药物对艾滋病疫情的控制起了巨大的作用， 但艾滋病仍无法治愈， 一旦感 染， 将终生服药。 全球每年都需要为此投入巨资。 此外艾滋病药物的毒副 作用较大， 严重影响了患者的生活质量。 因此， 艾滋病防治的关键在于预 防。

虽然近些年， 许多科学家致力于艾滋病疫苗的研制， 但由于 HIV复杂 的变异性， 尚没有一个疫苗被证明是有效的。 在短期不可能找出有效的、 适用于人类的艾滋病疫苗。严峻的形势迫使人 们寻找其它能防治 HIV的新 的手段和方法。 在这样的情况下， 用于阴道和直肠的杀微生物剂成为有希 望预防艾滋病，特别是保护女性和男同性恋人 群免于 HIV感染的另一重要 策略。

4.杀微生物剂

杀微生物剂是人们对这一类局部预防药物习惯 性的称呼。其实很多杀微 生物剂并不都具有杀死微生物的作用。 以抗 HIV的杀微生物剂为例，针对 HIV入侵粘膜、 感染细胞、 复制等不同的阶段和环节， 杀微生物剂也分为 了几类： 有些可以破坏 HIV的包膜， 有些用来阻断 HIV _g pl20和宿主细 胞 CD4或 CCR5的结合， 有些抑制 gp41的膜融合作用， 有些抑制逆转录 酶的活性，而有些则只是起到维持阴道酸性环 境，保护正常菌群的作用（表 1 ) 。 截至 2008年底， 全球共开展了 118项抗 HIV的杀微生物剂的研究， 其中 73项处于临床前研究阶段， 45项已经进入了临床试验阶段 (李亮助 等， 2010， 中国艾滋病性病 16(1):84-87 ) 。

表 1 抗 HIV杀微生物剂分类与作用机制 种类 作用机制 示例 非特异性破坏细胞和微生物的包膜，

Nonoxinol-9 (N-9); C31G(Savvy); 表面活性剂 有广谱杀微生物和宿主细胞毒性的双

Sodium lauryl sulfate

重作用。 阴道环境 Carbopol 974P (BufferGel);

维持阴道的酸性环境。

维持剂 Acidform (Amphora) 其负电荷与 HIV包膜蛋白作用，阻止其 PRO2000; Carrageenan 阴离子 (PC-515); Cellulose sulfate (CS);

吸附 CD4细胞； 具有一定的广谱抗微

聚合物 Cellulose acetate phthalate;

生物活性。 Dendrimers; SPL 7013 逆转录醉 抑制 HIV逆转录酶活性，会产生一定的 Tenofovir (TFV); TMC120;

抑制剂 耐药性； 无广谱抗微生物活性。 UC781

CCR5 可以结合 CCR5, 阻断 HIV和宿主细胞

进 拮抗 的作用；特异性抗 HIV;无广讲抗微生 PSC-RANTES; CMPD167 入 剂 物活性。

抑

制 膜融 结合 gpl20, 阻止 HIV与宿主细胞的融

Cyanovirin-N (CV-N);

剂 合抑 合；特异性抗 HIV;无广讲抗微生物活

BMS-378806

制剂 性。

第一个进入 III期临床试验的 HIV杀微生物剂是已经作为杀精子剂上市 销售多年的 N-9, 遗憾的是临床研究结果显示， N-9并没有象预期的那样 阻断或降低 HIV感染，反而在一定程度上增加了 HIV感染的机率（Hillier SL等， 2005， 艾滋病与人逆转录病毒学杂志 （J Acquir Immune Defic Syndr) 39(l):l-8 ) 。 至今世界上还没有任何一个 HIV杀微生物剂上市。

发明内容

本发明公开了一种 HIV杀微生物剂， 该杀微生物剂含有有效量的膜融 合抑制剂西夫韦肽。本发明所述的 HIV杀微生物剂还含有另外一种预防或 治疗艾滋病的药物——逆转录酶抑制剂。 在一个实施方案中， 杀微生物剂 中的所含的逆转录酶抑制剂为替语福韦 （tenofovir, TFV )„

本发明还涉及预防 HIV-1感染的方法， 所述方法包括通过哺乳动物粘 膜给予有效量的权利要求 1中所述的 HIV杀微生物剂。可以通过制备不同 剂型通过阴道或直肠给予本发明所述的杀微生 物剂。

膜融合抑制剂是一类可以干扰病毒包膜与宿主 细胞膜融合的化合物，阻 止病毒遗传物质进入到宿主细胞， 因而无法复制。 西夫韦肽（Sifuvirtide, SFT )是一种由 36个 ^酸残基组成的膜融合抑制剂，通过与 HIV gp41 C 末端肽（ C肽）竟争结合 N末端肽（ N肽）， 抑制天然的 HIV gp41 C肽与 N肽形成 6螺旋束， 从而阻止 HlV it^宿主细胞。 如已经上市的 T20及 处在临床阶段的西夫韦肽。 西夫韦肽的序列已在中国专利

ZL200780021805.2中公开：

CH ₃ CO-SWETWEREIENYTRQIYRILEESQEQQDRNERDLLE-NH ₂ (SEQ ID ΝΟ:1)„ 临床试验结果显示， 连续 2周皮下注射 20 mg西夫韦肽， 可以使病毒载量<10,000 copies/ml的患者体内的病毒载量降低 1.2 log拷贝

/毫升（ wwwJ'usoge om )。至今未见膜融合抑制剂西夫韦肽作为杀微� �物 剂的报道。 逆转录酶抑制剂是通过抑制 HIV DNA的合成来抑制病毒复制，分为核 苷类和非核苷类逆转录酶抑制剂。 替诺福韦属于核苷类逆转录酶抑制剂， 已经批准用于治疗 HIV-1感染。 连续 21天， 每天一次口服 300 mg替诺福 韦， 血浆平均病毒载量下降大于 1.5 log拷贝 /亳升（Louie M等， 2003， 艾 滋病 (AIDS) 17 (8):1151-6 )。 科学家正在研究将 1%的替诺福韦凝胶作为阴 道用杀微生物剂，试验结果显示使用替诺福韦 凝胶的 HIV-1的感染率可以 降低 39% ( Abdool K'Q.等， 2010， 科学 (Science) 329:1168-1174 ) 。 另外 一个试验结果显示， 男性同性恋服用替诺福韦和恩曲他滨可以将感 染率降 低 44% ( Grant RM等， 2010， 新英格兰医学杂志 (N Engl J Med)

363:2587-2599 ) 。 在本发明中， "有效量，，是指给予动物或人体后， 能阻止或抑制 HIV复 制， 达到预防 HIV感染的药物的用量，本领域技术人员能够理 解该剂量取 决于很多因素， 如年龄、 性别、 身高、 体重以及身体状态等。 一般在体内 的血药浓度需达到药物体外试验的半数有效浓 度 ( IC ₅₀ )o

本发明所述 HIV杀微生物剂可以通过粘膜给予哺乳动物（包 括人类）， 以预防 HIV感染。 可以应用到人体内表面， 如阴道或直肠。 进行性交前或 在亲密接触前将本发明的杀微生物剂涂抹在腔 道内、 皮肤或粘膜上， 如生 殖器、 阴道、 外阴、 宫颈、 直肠、 口、 手、 下腹或大腿上部， 尤其是阴道、 外阴、 宫颈和肛门直肠黏膜。

本发明所述杀微生物剂可以制成快速释放的剂 型或緩控释剂型。

本发明所述杀微生物剂可以制成凝胶剂、胶冻 剂、乳膏剂、糊剂、霜剂、 乳剂、 分散剂、 软骨剂、 膜剂、 贴剂、 海绵剂、 泡沫剂、 气雾剂、 散剂、 栓剂、 片剂、 针剂、 水剂、 ¾A剂或阴道环、 宫颈帽等剂型。

可以根据常规技术来制备本发明中的杀微生物 剂，将作为有效成分的有 效量的膜融合抑制剂和其他治疗艾滋病的药物 与药学可接受的辅料混合， 然后按照常规的制剂工艺进行操作。 本发明的杀微生物剂可以制成凝胶剂， 该凝胶剂中包含： 活性成分、凝 胶化合物、 緩冲剂、 稀释剂、 优选水、 润湿剂和防腐剂等辅料。 上述凝胶 化合物包括： 多糖和壳聚糖， 所述多糖包括纤维素衍生物、 糖胺聚糖、 树 胶、 淀粉； 羧基乙烯及衍生物、 乙烯及聚合物、 聚乙二醇、 聚丙烯酸、 聚 甲基丙烯酸、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙烯醇； 聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺 聚合物、 陶土、 聚氧乙烯 -聚氧丙烯共聚物或聚环氧乙烷共聚物； 蛋白质、 胶态二氧化硅、肥皂、硅氧烷等。凝胶剂可以 制备成容易分散的固体剂型， 如散剂、 片剂等。 所述固体剂型可以在需要是时通过于水性液体 或阴道内 液体作用而转变成所需的凝胶浓度。 本发明的杀微生物剂还可以制成栓剂， 包括活性成分、基质、 吸收促进 剂和 /或抗氧剂。 首先熔化基质， 通过搅拌均匀分散活性成分， 可添加吸收 促进剂、 抗氧剂， 然后将熔化均匀的混合物倒入模具中， 使其冷却成型。 上述基质可为半合成脂肪酸甘油酯、可可脂、 乌桕酯、硬酯、 SUPPOCIRE 系列、 泊洛沙姆、 硬脂酸聚烃氧 (40)酯、 明胶、 聚乙二醇以及本领域常用 的其他材料。 上述吸收促进剂可为氮铜、 二甲亚砜、 水片中的任意一种； 所述抗氧剂可为焦亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、 硫代硫酸钠中的任意一种。 本发明的杀微生物剂还可以通过将活性成分与 羟丙基甲基纤维素

( "HPMC，，）、 "PHARMABURST，，、 "CARBOPOL 947P"聚合物和

"CARBOPHIL"混合， 制备具有粘膜粘附性的能够立即^:的片剂。

本发明的杀微生物剂还可以可以通过将活性成 分掺入到水可分散膜剂 (类似于广泛使用的 "breath control" ) 中。 本发明的杀微生物剂也可以通过将活性成分掺 入到再局部施用后会转 化成凝胶的水可分散海绵剂中（ Neurath等， 2003， BMC传染病杂志 (BMC Infectious Disease) 3:27； 美国专利 6572875和 6596297 )。 本发明的杀微生物剂也可以含有其他活性成分 ，如杀精子剂、抗微生物 药物、 防腐剂或其他抗病毒药物。 也可以含有添加剂， 如防腐剂、 调味剂 和香料。 这些添加剂可以以任何需要的浓度存在， 浓度将决定于所需的性 能、 所要释放的药物、 功效、 添加量以及溶解时间等。

附图说明

可从说明书、附图以^斤附的权利要求中详实� �解本发明的上述特点以及 发明本身。 附图供理解本发明原理提供， 因此^ ]·附图进行测量或强调。

图 1 西夫韦肽凝胶细胞水平抗 HIV-1假病毒活性。 （a)西夫韦肽

( SFT )体外的抗 HIV-1 C亚型假病毒的活性比替诺福韦 （TFV )更高。

(b)SFT溶于 PBS或 0.0015% HEC胶中，抑制 HIV-1假病毒活性比较。左 上为 CRF07_BC， 右上为 CRF01_AE， 左下为 B型， 右下为 C型。 图中 数据为三次试验数据的平均值士 SD。 用 Student's t-test检验两组数据是否 有显著性差异（ 7<0.05 )。

图 2 西夫韦肽凝胶体外的安全性评价。 （a)MTT法测定西夫韦肽的 细胞毒性。 所用细胞系为 Caco-2直肠上皮细胞（左）和巨噬细胞系 RAW264.7(右）。西夫韦肽（ SFT )分别溶解在磷酸緩冲液（ PBS )和 0.015% 的 HEC凝胶中， 浓度分别为 3 nM, 30 nM and 300 nM。 （b)将上述 SFT溶 液和凝胶与细胞温浴 12小时，用流式微球分析（ Cytometric 221 Bead Array. CBA )方法测定巨噬细胞系 RAW264.7所产生的 IL-6(左）和 TNF-oi(右）。 图中数据为三次试验数据的平均值士 SD。 用 Student's t-test检验 PBS空白 组和杀微生物剂候选化合物组或阳性对照脂多 糖（LPS )组的数据是否有 显著性差异（ * 7<0.05 )。

图 3 施用西夫韦肽凝胶和其他杀微生物剂候选化合 物后的小鼠阴道 组织病理学检查。 将甲醛固定的阴道离体组织 ¾A ^蜡， 横切成片。 切片 用苏木精伊红染色， 对上皮细胞破碎和炎症应答进行盲评。 图中所示分别 为施用过 (a)1.5 % HEC凝胶（安慰剂组）， (b)0.03 mM SFT凝胶， (c)0.3 mM SFT ^ , (d) 3 mM SFT ^ , (e)l% TFV凝股， （f)3% carragee腿凝 胶， （g)6 % CS凝胶， （h)l% N-9凝胶的生殖 且织的切片。 采用苏木精伊 红染色， 放大倍数为 χΐοο。

图 4 施用过西夫韦肽凝胶和其他杀微生物剂候选化 合物后生殖道阴 道灌洗液中的炎性细胞因子检测。 定量分析所用试剂盒为小鼠

Thl/Th2/Thl7细胞因子 CBA kit ( BD Biosciences )， 用 FACSAria流式细 胞仪 ( BD Biosciences )分析。 所测定的炎性细胞因子包括 (a)白介素 IL-6, (b)肿瘤坏死因子 TNF-a， （c)干扰素 IFN-γ, (d)白介素 IL-10和 (e)白介素 IL-17A。 图中的 X轴表示杀微生物剂候选化合物， Y轴表示相应的炎性细 胞因子的含量。 数据为每组 5只大鼠的平均值士 SD。 用 Student's t-test检 验安慰剂组和用药组是否有显著性差异（ * 7<0.05 )。 具体实施方式

理想的杀微生物剂是在有效杀微生物剂的浓度 下， 要阻止 HIV进入宿 主细胞或直接杀死 HIV， 但又不能杀死身体本身存在的有益菌， 还不能对 粘膜或表皮细胞有刺激作用， 不会激发机体的免疫反应， 否则反而会加快 艾滋病毒感染。另一方面，理想的杀微生物剂 还应该足以耐受变化的温度， 并在变化的 ρΗ值范围内发挥作用。本发明的 HIV杀微生物剂可以通过如 下的实施例来证明其安全和有效。

实施例 1 -西夫韦肽凝胶细胞水平抗 HIV-1假病毒活性试验

西夫韦肽溶于无菌 PBS溶液（ ρΗ=7.4 ) 中， 或溶于 0.0015%的羟乙基 纤维素（ hydroxyethyl cellulose, HEC )凝股中。 四种 HIV-1 Env-假病毒是 在 293T细胞中通过不同亚型的 HIV env表达质粒分别与 HIV-1骨架质粒 pNL4-3Aenv (包括除 Env以外的所有 HIV-1基因组）的共转染生产的， 其中四种不同亚型的 HIV env表达质粒分别是编码 HIV-1 SVPB16 ( B亚 型）， SVPC12 ( C亚型）， 32-72 ( CRF07_BC )和 SH188.6 ( CRF01_AE ) 病毒株包膜蛋白的。 收集假病毒， 滴定后在 -80°C储存。

具体方法如下， 在 96孔板上按每孔约 lxlO ⁴ 个 TZM-bl细胞铺板， 并在 含有 10%牛胎蛋白和青霉素-链霉素的 DMEM( Dulbecco's Modified Eagle Medium )培养基中于 37°C^f 下培养一天。 将假病毒（每孔 100 TCID ₅₀ ) 和 SFT或 TFV的 PBS溶液或 0.0015%的 HEC凝胶溶液混合， 配置成所需浓 度， 然后将混合¾ 入孔中， 37°C， 5% C0 ₂ ^下培养 48小时。 用

Bright-Glo ( Promega )酶解细胞，然后使用 Victor 3发光计 ( PerkinElmer ) 测量相对发光值， 计算 IC ₅ 。值。

如图 1所示， TFV的 PBS溶液和 SFT的 PBS溶液对 C亚型 HIV-1C 亚型假病毒的半数有效浓度 IC ₅ 。分别为 5.2 μΜ和 25.6 nM, SFT的活性是 TFV的 200倍以上（图 la )。 SFT的 PBS溶:^含有四种不同亚型 Env 基因 （ CRF07_BC， CRF01_AE, HIV-1亚型 B和 C亚型）的 HIV-1假病 毒的 IC ₅₀ 值分别为 13.3， 30.9, 5.9和 25.6 nM， 而 SFT的 0.0015%HEC 凝胶的对应的 IC ₅ o值分别为 9.8， 22.2， 3.4和 12.4 nM (图 lb )。 这些数据 表明 HEC在凝胶中可 增强 SFT的抗 HIV-1活性作用。 实施例 2 -西夫韦肽凝胶体外安全性评价

利用细胞模型进行体外安全性评价。 制备三个不同浓度的 SFT ( 3 nM, 30 nM和 300 nM )的 0.015%HEC凝股和 PBS溶液。 用 MTT比色法检 测上述样品对 Caco-2直肠上皮细胞或巨噬细胞 RAW264.7生存能力的影 响。

按照 Denizot and Lang的方法操作， 简单来说， 5xl0 ⁴ ml ^-1 的细胞接种 于含有不同浓度 ( 3 nM, 30 nM和 300 nM )的 SFT的 0.015%HEC

SFT的 PBS溶液中的 96孔板中， 37°C，增湿 5% C0 ₂ 条件下培养 12小时 后， 收集 50 μΐ细胞， 储存在 -80°C， 待进一步测定细胞因子含量。 剩余样 本继续培养 48小时后， 将 10 μΐ MTT ( 5 mg/ml )加入培养板中， 37。C培 养 4小时。 然后， 移除培养基， 将甲臜（formazan )溶解于酸化的异丙醇 ( 0.4 N HC1 ) 中。 通过测定 490 nm处的光密度 ( optical density, OD )来 推算存活细胞的数目。 细胞生存率％ = (用药组 OD/空白组 OD)xl00。 试 验重复 3次。

结果如图 2a所示， 用 SFT凝胶或 PBS溶液处理 48小时后， 两种细胞 均保持约 100%的活力，这表明 SFT在 HEC凝胶和 SFT的 PBS溶液中都 不会造成显著的细胞死亡。

为了检测 SFT凝胶潜在的促炎症作用， 用 SFT凝胶和 SFT的 PBS溶 液分别刺激 RAW264.7细胞 12小时， 用流式微球分析 ( Cytometric 221 Bead Array,CBA )检测细胞培养上清液中的炎性细胞因子——� �瘤坏死因 子 TNF-α和白介素 IL-6。 与 PBS对照组相比， SFT凝胶和 SFT的 PBS 溶液均不会额外上调 TNF-α和 IL-6的表达， 而阳性对照脂多糖（ LPS ) 则显著刺激了 TNF-α和 IL-6的分泌。这些结果表明 SFT的凝胶制剂和 SFT 的 PBS溶^ J"免疫细胞没有促炎作用 （图 2b )。 实施例 3 -西夫韦肽在小鼠体内的安全性试验

将 6-8周的无病原体的 BALB/c雌性小鼠随机分为 8组， 每组 5只， 并 分别阴道内给予 40 μΐ ρΗ 4.5的含有 1.5% HEC凝胶 (安慰剂对照）、分别 含三种浓度 SFT ( 0.03 mM、 0.3 mM、 3 mM )的 1.5% HEC股、 1% TFV、 3% carrageenan, 6% CS、 1% N-9凝胶。 连续阴道给药 3天， 每 12小时 给药一次。 最后一次给药后 12小时， 用 200 μΐ无菌生理盐水冲洗宫颈阴 道并收集濯洗液， 然后用蛋白酶抑制剂 （ Complete Protease Inhibitor Cocktail, Roche )处理濯洗液， 4°C， 200xg离心 10分钟， 收集上清并在 -80°C储存， 为测定细胞因子备用。 处死小鼠后， 收集阴道组织， 为下一 步分离单核细胞或组织学检查备用。

小鼠生殖道组织进行病理组织学检查粘膜组织 完整性。 结果显示 HEC 安慰剂凝股、 1% TFV ^^和 3% carrageenan 且小鼠的生殖道组织 无损伤及炎症反应 （图 3a，e，f)， 与此相似， 三个 SFT凝胶组也没有观察 到明显的上皮损伤或炎症反应（图 3b，c，d )。 相比之下， 6% CS凝胶处理 组表现轻微炎症反应（图 3g )。 1% N-9凝 i且显示出上皮细胞的破坏和严 重的炎症反应 （图 3h )。

生殖道濯洗中炎性细胞因子检测结果显示， 与 HEC安慰剂凝胶对照组 相比， 1%TFV和 3% carrageenan胶等作为临床上已被证明安全的杀微� �� 物剂候选药物，没有引起上述五种细胞因子的 额外分泌；与此相似， 0.3 mM 和 0.03 mM SFT凝胶组也没有额外上调细胞因子的产生； 3mM的 SFT凝 胶组仅上调了 TNF-α的分泌。然而， 1% N-9凝胶显著上调 TNF-a和 IL-6 的产生， 6% CS凝胶增加了 TNF-a、 IL-6、 IL-10和 IFN-γ的分泌（图 4 )。 实施例 4 -西夫韦肽与替诺福韦抗病毒活的协同作用

根据不同浓度的药物抑制假病毒感染的实验结 果，计算出各种药物相对 于特定亚型假病毒的 IC ₉ 。， 再将第一种药物的浓度设定为计算出的 IC ₉₀ ， 第二种则围绕其 IC ₉ 。上下浮动， 再计算出第二种药物新的 IC ₉ 。， 根据已有 的 IC ₉ 。计算出这两种药物之间的协同系数（CI )， 当 CI值小于 1时， 说明 它们之间具有协同作用， CI值越小， 则协同作用效果越明显。 表 1显示， 西夫韦肽（SFT )和替诺福韦（TFV )联用会产生协同作用， 针对不同亚型的 HIV协同系数 CI分别为 0.029和 0.055。 并且， 相对于单 独使用， 两种药物所需浓度都大为降低。 西夫韦肽与替诺福韦之间的协同作用

实施例 5 -西夫韦肽与替诺福韦联合用药时在猕猴体内� �保护作用 将 20只猕猴分成四组，每组 4只，分别直肠给予 2.2% HEC、 1 mM SFT 凝股、 35 mM TFV ^^和0·3 mM SFT联合12 mM TFV的复合凝股， 给 药周期为 0、 9、 16、 23和 30天， 每次给药 30分钟后使用人猴嵌合病毒 SHIV-1157i进行直肠攻毒， 并在每次给药攻毒前抽静脉血检测血浆中的病 毒载量， 检测猴子感染情况， 通过未被感染猕猴数量计算保护率。 从表 2可以看出， 连续 4次给药并攻毒， HEC安慰剂对照组和 TFV 组动物全部感染， 西夫韦肽单药组保护率为 25%， 而 SFT+TFV联用组保 护率一直维持在 _75% 。 表 2 西夫韦肽联用替诺福韦对猕猴直肠攻毒的保护 率

30 0 0 25 75 实施例 6 -西夫韦肽凝胶的稳定性评价

采用了加速稳定性试验来检测 80 nM SFT( SFT对 HIV-1 C亚型的 IC ₉₀ 值）在 PBS或 1.5%HEC凝胶制剂中的稳定性，试验品在不同温� �下（ 4°C， 室温， 30°C和 40°C )保存 8周。 每周提取样品检测其对 HIV-1 C亚型的 抗病毒活性。 如表 3, 4所示， 不同温度下保存的 SFT凝胶和 PBS溶液的 抗病毒活性在长达 8周的时间内保持不变。

表 3 西夫韦肽 HEC凝胶的稳定性