背景技术 盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危 害之一，盐渍土 壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主， 成为影响植物生长、导致粮食和 经济作物减产的主要因素。 世界上盐碱土的面积约有 4亿公顷， 占 灌溉农田的 1 /3。 盐碱地在中国分布广泛， 现有盐碱地面积约 0. 4 亿公顷。 随着我国人口增加，耕地减少， 盐碱地资源的开发利用有 着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干 旱能力的提高和适宜 在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的 植物种或品系的选 育，则是利用盐碱地经济、 有效的措施。 对绝大多数农作物来说， 大多数植物对盐碱、 干旱的耐受性差， 只能生长在氯化钠含量为 0. 3 %以下的土壤上， 土壤中过量的 Na+会对植物体的正常的生长代 谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高 作物产量就成为全世 界农业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其 耐盐机制涉及从 植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个 水平。各国的科学家 也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展 ，特别在利用高等模 式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面 ，使该领域的研究有 了突破性的进展 ( Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53:1247-1273; Zhang ZL. 2011. Arabidopsis Floral Initiator SKB1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23: 396-411 )。高 等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化 参数的变化，从而将 胞外的信号变为胞内信号，通过系列的信号传 导最后将胁迫信号传 递至细胞核内，激活转录因子，而激活转录因 子再作用于功能基因， 启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆 性。尽管研究者已从 不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分 复杂，植物抗盐中的 许多重要问题仍有待探索。 例如， 植物抗盐的关键因子仍未找到； 植物耐盐的分子机制并不十分清楚。

发明内容 本发明人发现了一种新的 HKT1 Na/K转运蛋白， 并将其成功 地用于培育耐盐性提高的转基因植物。

在第一方面中， 本发明提供了一种 HKT1 Na/K转运蛋白 GhHKTl , 其特征在于具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。

在第二方面中， 本发明提供了一种编码权利要求 1所述的转 运蛋白 GhHKTl 的核苷酸序列。 在一个优选实施方案中， 所述 核苷酸序列为 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。

在第三方面中， 本发明提供了一种重组表达载体， 其特征在 于在所述载体的多克隆位点中插入第二方面所 述的核苷酸序列。

在第四方面中， 本发明提供了一种重组表达载体 rd29A-GhHKTl-2300 , 其特征在 于 以 双元表达载体 pCAMBIA2300为骨架载体， 在其多克隆位点中插入第二方面所 述的核苷酸序列， 以 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以诱导型启动子 rd29A及 Tnos作为所述的核苷酸 序列的启动子和终止子。 在一个优选实施方案中， 所述多克隆位 点为 Pstl和 Sacl。

在第五方面中， 本发明提供了一种含有第二方面所述的核苷 酸序列或者第三或第四方面所述的重组表达载 体的转基因细胞 系。

在第六方面中， 本发明提供了一种含有第二方面所述的核苷 酸序列或者第三或第四方面所述的重组表达载 体的宿主菌。在一 个优选实施方案中， 所述宿主菌为农杆菌。 在一个更优选地实施 方案中， 所述农杆菌为农杆菌 LBA4404。

在第七方面中， 本发明提供了一种调控植物耐盐性的方法， 是将第二方面所述的核苷酸序列或者第三或第 四方面所述的重 组表达载体导入植物组织或细胞， 并在其中表达。

在第八方面中， 本发明提供了一种生产转基因植物的方法， 其特征在于用第二方面所述的核苷酸序列或者 用第三或第四方 面所述的重组表达载体转化所述转基因植物并 在其中表达。在一 优选的实施方案中，所述转化是将第二方面所 述的核苷酸序列整 合到所述转基因植物的染色体上。 在一个更优选的实施方案中， 所述整合是通过以下方式进行的： 用第三或第四方面所述的重组 表达载体转化农杆菌，再以经转化的农杆菌转 染植物并在其中表 达。 在一个更优选的实施方案中， 所述植物为烟草。 在一个更优 选的实施方案中， 所述烟草为普通烟草。

在第九方面中， 本发明提供了第二方面所述的核苷酸序列或 者第三或第四方面所述的重组表达载体用于制 备转基因植物的 用途。 在一个优选实施方案中， 所述植物为烟草。 在一个更优选 实施方案中， 所述烟草为普通烟草。

在第十方面中， 本发明提供了一种转基因植物或其种子， 其 特征在于其中含有并表达第二方面所述的核苷 酸序列。在一个优 选实施方案中，所述核苷酸序列是整合在所述 转基因植物的染色 体上。 在一个优选实施方案中， 所述转基因植物为烟草。 在一个 更优选实施方案中， 所述烟草为普通烟草。

附图说明 图 1示出了植物重组表达载体 rd29A-GhHKTl-2300构建流程 图。

图 2示出了植物重组表达载体 rd29A-GhHKTl-2300的结构。 图 3示出了转基因烟草的耐盐性测试结果， 其中左图为转基因 植株（ X5-2 ), 右图为非转基因烟草。 具体实施方式 下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步 说明。

实施例 实施例 1 盐胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试 剂盒所示的方法通过抑制消减杂交方法构建消 减文库。在实验过程 中以经 NaCl处理 6h的棉花幼苗的根的 mRNA作为样品（ tester ), 以未处理的棉花幼苗的根的 mRNA作为对照 （driver )。

( 1 )供试材料：

翼棉 14 (国家棉花中期库， 获取单位中国棉花研究所， 统一 编号： ZM-30270 )播种到灭过菌的蛭石上，在 25 °C、光暗周期 16h/8h 条件下培养， 每周浇 1/2MS培养基（9.39 mM K 0 ₃ , 0.625 mM KH2P0 ₄ , 10.3 mM NH4NO3, 0.75 mM MgS0 ₄ , 1.5 mM CaCl ₂ , 50 μΜ KI, 100 μΜ H ₃ B0 ₃ , 100 μΜ MnS0 ₄ , 30 μΜ ZnS0 ₄ , 1 μΜ Na ₂ Mo0 ₄ , 0.1 μΜ CoCl ₂ , 100 μΜ Na ₂ EDTA, 100 μΜ FeS0 ₄ )― 次。 当苗株长高达 25-30 cm时用于实验。

( 2 )材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4株。 第一组为对照组， 在 25°C、 光照下培养，放置到 1/2MS液体培养基中。第二组为处理组， 25°C、 光照下培养，放置到添加有终浓度为 200 mM NaCl的 1/2MS液体 培养基中， 处理 6小时， 处理完毕后及时剪取两组幼苗的根， 用液 氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。

( 3 )总 RNA提取： 分别取对照和 NaCl处理的棉花根 0.5g, 用植物 RNA提取试 剂盒（invitrogen )提取棉花总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分 光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD260/OD280比值为 1.8-2.0, 表明总 RNA纯度较高， 用 1.0%的 琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S 条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒 (purification of polyA+ mRNA from total RNA) 分离 mRNA。

( 4 )抑制消减杂交：

为了增加获得表达序列标签（ Expressed sequence tag, EST ) (unigene)的有效性， 避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译 区。 本实验室用 R _sa l, Haelll分别对 链 cDNA (按照消减试剂 盒中记载的方案， 由 mRNA逆转录获得）进行消化， 做两组抑制 消减， 其他步骤及方法按 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制消减杂交，最后 合并两 组获得的正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物。

( 5 ) cDNA消减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

将合并的正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物

( QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen )与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒)载体连接，依照 pGEM-T Easy试剂盒 的程序， 具体步骤如下： 用 200 l PCR管依次加入下列成分： 纯 化 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μΐ, Τ4连接酶緩冲液 5 μΐ, pGEM-T Easy载体 1 μΐ, Τ4 DNA连接酶 1 μΐ ,于 4°C连接过夜。 取 10 连接反应产物，加入到 100 μΐ,感受态大肠杆菌 JMI09(购 自 TAKARA)中，冰浴 30 min、热休克 60 s、冰浴 2 min，另加 250 L LB培养液（ 1% Tryptone购自 OXOID, 0.5% Yeast Extract购自 OXOID, 1% NaCl购自国药）置 37°C摇床中， 以 225 r/min振荡 培养 30 min,取 200 μΐ,菌液种植于含 50 g/mL氨苄青霉素的 LB

(同上）/X-gal/IPTG( X-gal/IPTG购自 TAKARA )培养板上， 37 "C 培育 18 h。计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数，随 机挑取 300个白色菌落 (编号： Gh-S001至 Gh-S300)。 将 300个白 色克隆挑于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96孔 细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于- 80°C保存备用。 以巢式 PCR 引物 Primer 1 ( Clontech ) 和 Primer 2R ( Clontech ) 进行菌液 PCR扩增，得到 211个阳性克 隆，对所有阳性克隆在送英潍捷基（上海） 贸易有限公司测序

( 6 )差异克隆的 cDNA测序分析：

将上述 211个差异克隆的 DNA测序结果去除载体和不明确序 列及多余的 cDNA后， 共得到 153个 EST(unigene)。 经 BlastN发 现其中 87条在 GenBank 中有同源序列， 29条功能未知或者为假 定蛋白， 另有 37条未获得同源匹配，推测可能是处于 3，、 5，末端非 翻译区的较短序列。 实施例 2棉花离子通道蛋白 GhHKTl的克隆

克隆子 Gh-S075序列为 SEQ ID No: 3, 序列分析表明该序列 的编码的氨基酸序列属于离子通道蛋白， 本文将克隆子 Gh-S075 编码的全长基因命名为 GhHKTl。

GhHKTl全长基因的克隆

根据已经获得的 GhHKTl基因片段， 设计两条特异性引物， 作为 3，RACE的 5，端特异性引物。

GhHKTl GSP1: SEQ ID NO: 4:

CTGGAAGGAGATGGGTTATAGTC

GhHKTl GSP2: SEQ ID NO: 5:

GGGTTGACATTAGTTCAGTTTAT

实验步骤按试剂盒说明书操作 ( 3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司 )

用 SEQ ID NO: 4与 3，端引物 AUAP(试剂盒自带），以 mRNA 逆转录的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。 具体步骤如下： Ex Taq 购自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ lOxEx Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μΐ mRNA反转录的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq. 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP各 2.0 μΐ, 以及 35 μΐ的双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 "C 变性 30 s, 58 °C 退火 30 s, 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 所得的 PCR产物用双馏水稀释 100倍后取 2.0 μΐ作为模板， 用 8£00) 0: 5与3，端引物 1^?进行第二轮？€11扩增， 具体 步骤如下： 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM 的 dNTP, 2.0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ 的引物 SEQ ID NO: 5和 AUAP各 2.0 μΐ, 以及 35 μΐ的双蒸水。

PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 "C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。第二次 PCR 产物 3 μΐ连接于 pGEM-T Easy Vector,转化到大肠杆菌 JM109(具 体方法同上)， 随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉 素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% , -80 °C保存备用。 SEQ ID NO: 5与 3，端引物 AUAP进行菌 液 PCR扩增，得到 6个阳性克隆，送英潍捷基（上海） 贸易有限 公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 3，端。

根据已经获得的 GhHKTl基因片段， 设计三条特异性引物， 作为 5，RACE的 3，端特异性引物。

GhHKTl GSP3: SEQ ID NO: 6:

CCTGCTGATT CATTTTGACT TCC

GhHKTl GSP4: SEQ ID NO: 7:

AAGGAGGGAG ATACATCATA ACA

GhHKTlGSP5: SEQ ID NO: 8:

GATCAACTAC CGATTCACCA GC

实验步骤按试剂盒说明书操作（5， RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司 )。

用 SEQ ID NO: 7与 5，通用引物 AAP(试剂盒自带），以 mRNA 逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6 )为模板进行第一轮 PCR扩增， 具体步骤如下： Ex Taq 购自 TAKARA, 50 l PCR反 应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μΐ mRNA 反转录的 cDNA, 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2.0 μ1, 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 "C 变性 30 s, 55°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min, 33个 循环后， 72 °C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 100倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 8与 3，端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如 下： 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 l Ex Taq、 ΙΟ μΜ的引物 SEQ ID NO: 8和 AUAP各 2.0 μΐ,以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 "C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 第二次 PCR产物 3 μΐ连 接于 pGEM-T Easy Vector,转化到 JM109(具体方法同上)，随机挑 取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基 中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% , -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 8与 3，端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系 及反应条件同上），得到 3个阳性克隆，送英潍捷基（上海）贸易有 限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 5，端。

所得的 5，RACE产物克隆测序后， 与 3，RACE产物测序结果 拼接。获得 GhHKTl全长 cDNA序列。根据 GhHKTl全长 cDNA 序列设计一对引物如下：

GhHKTIF: SEQ ID NO: 9:

ATG AGT AAC ACT ATT ATC TGT TTC G

GhHKTIR: SEQ ID NO: 10:

TTAGGAGAGT TTCCAAGCTT TACC

通过 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10来克隆 GhHKTl全长。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的 cDNA 为模板进行 PCR反应。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR. 10 μΜ的 引物 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10各 2.0 μΐ,以及 30 μΐ的双蒸 水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 "C 变性 30 s, 58°C退 火 30 s, 72 °C 延伸 2min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2.5倍的无水乙醇， -20°C 放置 10分钟， 离心， 去上清， 晾干， 用 21 μΐ双蒸水溶解。 加入 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 0.5 μΐ 5 mM的 dATP , 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Taq„反 应条件： 70°C反应 30分钟。 将得到约 1600 bp的 DNA片段回收 ( Omega 回收试剂盒）， 连接至 pGEM T-easy 载体上，转化 JM109(方法同上）， 随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄 青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20% , -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 9与 SEQ ID NO: 10进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆，送至 英潍捷基 (上海） 贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO: 2。 实施例 3 GhHKTl基因植物表达载体构建

选择植物 元表达载体 pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生 物技术有限责任公司）作为植物表达载体， 用 Pnos 启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物 中的表达。 选择诱导型启动子 rd29A及 Tnos作为 GhHKTl基因 的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12以植物表达载体 PBI121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩� � Pnos, 采 用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ PBI121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR. 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μΐ, 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 56°C退火 30 s, 72 °C 延伸 30 s, 33个循环后， 72 °C 延伸 10 min。通过 EcoRI、 Bglll酶切连接到 pCAMBIA2300 (promega, T4 连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 11 ：

GCAC GAATTC ATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO: 12:

ATCC AGATCT AGATCCGGTGCAGATTATTTG SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14以 PBI121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ PBI121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR. 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14各 2.0 μΐ, 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 30 s, 33个循环 后， 72°C 延伸 10 min。 通过 Sacl、 EcoRI 酶切连接到 pCAMBIA2300-l(promega T4连接醇盒)获得 pCAMBIA2300-2 SEQ ID NO: 13:

AAGGL^ GCJCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO: 14:

TCAGAA JrCCCAGTGAATT CCCGATCTAG TA

SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16以拟南芥（哥伦比亚型 ， 购自 www.arabidopsis.org ) DNA (参考 Zeng J" et L. 2002， Preparation of total DNA from"recalcit rant plant taxa", Acta Bot. Sin., 44(6): 694-697 中的方法提取拟南芥 DNA )为模板， 扩增拟 南芥 rd29A启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。

50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ拟南芥 DNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR.10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16各 2.0 μΐ, 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条 件： 94°C预变性 5 min, 94 "C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延 伸 30 s, 33个循环后， 72 °C 延伸 10 min。 通过 HindIII、 Pstl酶 切连接到（连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3

SEQ ID NO: 15:

ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA SEQ ID NO: 16:

TGAC GTCC AAAGATT TTTTTCTTTC CAATAG SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18扩增 GhHKTl (模板是实 施例 2所获得 GhHKTl ), 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 1.0 μΐ GhHKTl-pGEM, 1.0 μΐ PrimeSTAR. 10 μΜ的引 物 SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18各 2.0 μΐ, 以及 31 μΐ的双蒸 水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 "C 变性 30 s, 58°C退 火 30 s, 72 °C 延伸 2min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。 通过 Pstl、 Sad酶切连接到 （连接方法同上） pCAMBIA2300-3, 获得 植物表达载体 rd29A- GhHKTl-2300。

SEQ ID NO: 17:

TGACTO GATG AGT AAC ACT ATT ATC TGT TTC G SEQ ID NO: 18:

AAGGL^ GCJCTTAGGAGAGT TTCCAAGCTT TACC。 实施例 4 rd29A- GhHKTl-2300表达载体转化农杆菌 农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab,Inc )感受态制 备：提前 1-2天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ _§ /ιη1利福平和 50 μ _§ /ιη1 链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。挑取 单菌落接种于 5 ml含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB液 体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16 h)至 OD600值为 0.4, 形成种子菌液。取 5 ml活化后的菌液（ 1:20的比例）接种于 100 ml 同样浓度抗生素的 LB 液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2.5 h 至 冰浴菌液 lO min, 每隔 3 min摇匀一次， 令细菌均匀 进入休眠状态。 于 4°C下 4000 离心 10 min, 弃上清液； 加入一 定量预冷 10%甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 离心 10 min, 收集沉 淀； 用 10%甘油重复洗 3-4次； 加入适量冰浴预冷的 10%甘油重 新悬浮细菌沉淀， 以 40 μΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞， 往 40 μΐ的感受态细胞 中加入 1 μΐ的质粒， 混匀后冰浴约 10 min。将感受态和 DNA的混 合物用枪转移到预冷的电击杯中，轻敲使悬浮 液到达底部，注意不 要有气泡。 将电击杯（购自 bio-rad )放到电击室的滑道上， 推动 滑道将电击杯放至电击室基座电极处。 使用 0.1cm 的电击杯的时 候， MicroPulser (购自 bio-rad )的程序设置为 "Agr", 电击一次 。 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 LB培养基。 快速而轻柔的用 枪将细胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 28°C , 225 rpm 培养 1 h。 取 100 ~ 200 μΐ的菌液涂布与相应的抗性筛选培养基平 板上（LB固体培养基， 含 50 g/ml利福平、 50 g/ml链霉素、 50 g/ml卡那霉素）， 28°C培养。 实施例 5 利用农杆菌介导的转染法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子（国家烟草中期库， 获取单位： 中 国农科院烟草所， 库编号 I5A00660 ) 30 s, 用灭菌双蒸水洗两次。 再用 0.1%升求浸泡 8 min, 用灭菌 ¾1蒸水洗两次， 完成表面灭菌。 将表面灭菌的烟草种子置于 MS ( 18.78 mM K 0 ₃ , 1.25 mM KH ₂ P0 ₄ , 20.6 mM NH4NO3, 1.5 mM MgS0 ₄ , 3.0 mM CaCl ₂ , 50 μΜ KI, 100 μΜ H ₃ B0 ₃ , 100 μΜ MnS0 ₄ , 30 μΜ ZnS0 ₄ , 1 μΜ Na ₂ Mo0 ₄ , 0.1 μΜ CoCl ₂ , 100 μΜ Na ₂ EDTA, 100 μΜ FeS0 ₄ , 7.4 g/L琼脂， 蔗糖 30 _g /L )上于无菌条件下发芽， 制备无菌苗。 取无 菌苗叶片剪成 5 mmx5 mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表 达载体 rd29A-GhHKTl-2300的农杆菌浸染叶盘 10 min, 吸干菌 液， 在黑暗条件下共培养 2天（MS培养基）。 将叶片转到分化培 养基 ( MS+1 mg/L细胞分裂素（BA ) +0.1 mg/L萘乙酸 ( NAA ) +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素）上， 光照条件下培养 45 天左右， 待芽长大后切下转移到生根培养基 ( MS+50 mg/L卡那霉 素 +500 m _g /L头孢霉素） 中培养 30天左右， 待根系发达后将小苗 转入仅加有 500 mg/L头孢霉素的 MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法），用 SEQ ID NO: 9:和 SEQ ID NO: 10( 50 μΐ PCR 反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μΐ DNA, 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10各 2.0 μΐ, 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s, 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72 °C 延伸 10 min ) , PCR 鉴定， 保存阳性植株进行编号 实施例 6过表达 GhHKTl转基因烟草 T1的耐盐模拟实验及 功能鉴定

灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。选取 T0代转基因烟草种子 (即实施例 5中所获得的转基因植株的种子 ΤοΚΙ-ΤοΚδ ) 、 对照烟 草种子分别播种在蛭石上， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循 环， 每 5天浇一次 1/2MS。 培养 25天之后， 摘取最下端一片叶子， 提取基因组 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法）， 用 SEQ ID NO: 9: 和 SEQ ID NO: 10 ( PCR条件同上）做 PCR鉴定， 剔除阴 性植株（对照烟草也同样摘取一片叶子）。挑 取大小一致的转基因 烟草、对照烟草做耐盐实验， 浇灌 lOO mM NaCl, 其中转基因烟草 分为五组（5个不同转化事件），每组 10一株；对照组含 10一株。 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环， 14天后观察结果： T1代转基因 植株的耐盐性鉴定表明，对照植株不能正常生 长，生长明显受到抑 制，而转基因植株生长明显高于对照植株，显 现出明显的耐盐性（参 见图 3及表 1 ) 。

表 1 表达 GhHKTl的转基因烟草表现出良好的耐盐性。耐盐 鉴定处理： 浇灌 lOO mM NaCl, 14天后， 称量不同转化事件植株 重量（表 1 ) , 数值为平均值士标准偏差。