技术领域

[0001] 本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种均相检测方法。

背景技术

[0002] 目前， 生物大分子测定技术有胶乳增强免疫比浊技术 （LETIA） 、 化学发光免 疫分析技术 （CLIA） 。 LETIA通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆� ��体， 在抗原存在的条件下， 偶联微球的单克隆抗体与抗原在短时间内迅速 结合聚集 在一起， 从而改变反应溶液的吸光度； 反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度 在一定范围内具有线性关系， 从而可用来反映被测抗原的浓度。 CLIA是用化学 发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法， 该方法具有很高的灵敏度和良好 的线性范围。

[0003] 化学小分子的测定技术有克隆酶供体免疫测试 （cloned enzyme donor

immunoassay, CEDIA） 、 酶放大免疫测试 （EMIT） 、 荧光偏振免疫测试 （FPI A） 。 CEDIA是利用重组 DNA技术制备（3 -半糖苷酶的两个片段： 大片段称为酶受 体 （enzyme acceptor, EA） ， 小片段称为酶供体 （enzyme donor, ED） ， 两个 片段本身均不具酶活性， 但在合适的条件下结合在一起就具有酶活性， 利用这 两相片段的特性建立的均相酶免疫测定称为克 隆酶供体免疫测定。 ED标记的半 抗原与抗体结合后由于空间位阻， 不再能与 EA结合。 当样品中含有待测半抗原 时， 会与 ED标记的半抗原竞争结合抗体， 使被抑制的 ED恢复自由状态， 能够与 EA互补， 酶活性恢复。 CEDIA主要用于药物和小分子物质的测定， 也有专利将 蛋白分子的特定表位连接到 ED片段上， 从而实现了对生物大分子的检测， 但目 前 CEDIA技术都是使用竞争法进行测试， 待测物浓度与酶活力大小成正比。 EMI T的基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原� � 保留半抗原和酶的活性。 当酶标 半抗原与抗体结合后， 所标的酶与抗体密切接触， 使酶的活性中心受到影响而 活性被抑制， 当样品中含有待测半抗原时， 会与酶标半抗原竞争结合抗体， 使 被抑制的酶活性恢复。 EMIT技术使用竞争法进行测试， 待测物浓度与酶活力大 \¥0 2019/104529 卩（：17 \2017/113570

2 小成正比。 ？?1八的试剂为荧光素标记的小分子待测物和� ��药物的抗体， 模式为 均相竞争法。 荧光偏振免疫测试的原理如下， 荧光物质经单一平面的偏振光蓝 光 （波长 485!1111） 照射后， 可吸收光能跃入激发态； 在恢复至基态时， 释放能量 并发出单一平面的偏振変光 （波长 52511111） 。 偏振変光的强度与変光物质受激发 时分子转动的速度成反比。 大分子物质旋转慢， 发出的偏振荧光强； 小分子物 质旋转快， 其偏振荧光弱。 将待测小分子连接到荧光分子上， 同时在检测环境 中添加针对待测小分子的抗体， 当检测环境中含有待测小分子时， 该待测小分 子会与标记了荧光分子的待测小分子竞争结合 抗体， 使部分标记了荧光分子的 待测物释放出来， 检测环境中的偏振光强度下降。 该方法为竞争法测试， 待测 物浓度与偏振光强度呈反比， 利用这一现象建立了荧光偏振免疫测定用于小 分 子物质特别是药物的测定。

[0004] 上述方法中， 1^11八技术最高可以只能实现 0.111¾ 的分析灵敏度， 但对于一 些灵敏度要求更高的分析就无能为力了。 （: 方法是一种非均相的测试， 测试 过程中涉及到清洗分离步骤， 测试速度较慢， 测试成本很高， 且非均相反应导 致测试的重复性较差， 而且以上方法由于需要使用抗体， 还会存在类风湿因子 （1^） 、 人抗动物免疫球蛋白 等干扰， 均可能严重影响测试结果的 准确性。 最适合用来测试小分子物质， 检测大分子时非常受限， 且同等情况下， 竞争法灵敏度较非竞争法低。 因此， 现有技术有待改进。

技术问题

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足， 提供一种均相检测方法， 旨在解 决现有检测方法灵敏度和重复性较差、 成本高， 以致使其应用受限的技术问题

问题的解决方案

技术解决方案

[0006] 为实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下：

[0007] 本发明提供一种均相检测方法， 该均相检测方法包括如下步骤：

[0008] 提供适配体和酶， 所述适配体可特异性识别待测物， 将所述适配体连接到所述 \¥0 2019/104529 卩（：17 \2017/113570

3 酶上， 得适配体 -酶复合物；

[0009] 配置不同浓度的待测物标准溶液， 将所述适配体-酶复合物和所述酶作用的底 物加入到所述待测物标准溶液中进行酶促反应 ， 测得酶促反应信号， 获取酶促 反应信号与待测物含量的方程；

[0010] 将所述适配体-酶复合物和所述底物加入到含� �所述待测物的样品溶液中进行 酶促反应， 测得酶促反应信号， 根据所述方程计算所述样品溶液中的待测物含 量。

发明的有益效果

有益效果

[0011] 本发明提供的均相检测方法， 是一种全新的均相非竞争法， 该方法利用可特异 性识别待测物的适配体对酶进行标记， 先根据待测物标准溶液中酶促反应的酶 促反应信号， 推导出酶促反应信号与待测物含量之间关系的 方程， 然后根据该 方程， 检测样品溶液中酶促反应的酶促反应信号， 就可以计算出样品溶液中的 待测物含量； 由于该酶促反应信号与待测物含量成一定比例 ， 所以根据样品溶 液中的酶促反应信号可以快速计算出待测物含 量。 因此， 本发明与现有技术相 比， 具有灵敏度高、 重复性好、 抗干扰能力强、 检测速度快和成本低的特点， 可检测各种生物分子， 应用非常广泛。

对附图的简要说明

附图说明

[0012] 图 1为本发明实施例 1中的（:-反应蛋白检测的原理图；

[0013] 图 2为本发明实施例 2中的（:-反应蛋白检测的原理图。

发明实施例

本发明的实施方式

[0014] 为了使本发明要解决的技术问题、 技术方案及有益效果更加清楚明白， 以下结 合附图和实施例， 对本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具 体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。

[0015] 本发明实施例提供了一种均相检测方法， 该均相检测方法包括如下步骤： \¥0 2019/104529 卩（：17 \2017/113570

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[0016] 801： 提供适配体和酶， 所述适配体可特异性识别待测物， 将所述适配体连接 到所述酶上， 得适配体 -酶复合物；

[0017] 802： 配置不同浓度的待测物标准溶液， 将所述适配体-酶复合物和所述酶作用 的底物加入到所述待测物标准溶液中进行酶促 反应， 测得酶促反应信号， 获取 酶促反应信号与待测物含量的方程；

[0018] 803： 将所述适配体-酶复合物和所述底物加入到含� �所述待测物的样品溶液中 进行酶促反应， 测得酶促反应信号， 根据所述方程计算所述样品溶液中的待测 物含量。

[0019] 本发明实施例提供的上述均相检测方法， 是一种全新的均相非竞争法， 该方法 利用可特异性识别待测物的适配体对酶进行标 记， 先根据待测物标准溶液中酶 促反应的酶促反应信号， 推导出酶促反应信号与待测物含量之间关系的 方程 （ 在具体实施例中， 可以是线性方程或非线性方程） ， 然后根据该方程， 检测样 品溶液中酶促反应的酶促反应信号， 就可以计算出样品溶液中的待测物含量； 由于该酶促反应信号与待测物含量成一定比例 ， 所以根据样品溶液中的酶促反 应信号可以快速计算出待测物含量。

[0020] 因适配体分子量较低， 将一段特异性的适配体连接到酶或具有互补活 性的酶片 段 （酶供体或酶受体） 上， 适配体本身不影响酶的活性或酶片段的互补活 性， 与酶连接后也不会影响酶的活性或酶片段的互 补活性， 但当样本溶液中含有待 测物时， 待测物与适配体直接特异性结合， 由于空间位阻效应， 酶的活性或酶 片段的互补活性丧失， 待测物浓度越高酶活力越低， 待测物浓度与酶活力成反 比， 因此检测到酶促反应信号 （与酶活力对应） 后可以快速计算出样品溶液中 的待测物浓度。 该均相检测方法具有灵敏度高、 重复性好、 抗干扰能力强、 检 测速度快和成本低的特点， 可检测各种生物分子， 应用非常广泛。

[0021] 具体地， 本发明实施例的上述均相检测方法中， 该酶是具有催化活性的酶， 即 该酶是全酶， 也可以是具有互补活性的酶供体和酶受体 （酶供体和酶受体组成 一个具有催化活性的全酶） ； 另外， 该酶可以是天然酶或人工酶， 人工酶是可 以通过基因工程的方法对以上全酶或酶片段进 行改造， 以改变其活力、 特异性 ， 来对本检测方法的灵敏度、 线性范围、 检测特异性、 稳定性等性能进行优化 \¥0 2019/104529 卩（：17 \2017/113570

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[0022] 当所述酶为全酶时， 将所述适配体连接到所述全酶上， 得到步骤301中的所述 适配体 -酶复合物， 然后进行酶促反应。 当然， 当所述酶是具有互补活性的酶供 体和酶受体时， 适配体可单独连接在酶供体或酶受体上， 后续再进行均相检测 ， 以上三种情况都可以取得本发明的效果， 都在本发明的保护范围内。 具体地 ， 适配体单独连接在酶供体或酶受体上的两种情 况如下：

[0023] 一种均相检测方法， 包括如下步骤：

[0024] 8011： 提供适配体和酶， 所述适配体可特异性识别待测物， 所述酶包括具有互 补活性的酶供体和酶受体， 将所述适配体连接到所述酶供体上， 得适配体 -酶供 体复合物；

[0025] 8012： 配置不同浓度的待测物标准溶液， 将所述适配体-酶供体复合物、 所述 酶受体和所述酶作用的底物加入到所述待测物 标准溶液中进行酶促反应， 测得 酶促反应信号， 获取酶促反应信号与待测物含量的方程；

[0026] 8013： 将所述适配体-酶供体复合物、 所述酶受体和所述底物加入到含有所述 待测物的样品溶液中进行酶促反应， 测得酶促反应信号， 根据所述方程计算所 述样品溶液中的待测物含量。

[0027] 一种均相检测方法， 包括如下步骤：

[0028] 8021： 提供适配体和酶， 所述适配体可特异性识别待测物， 所述酶包括具有互 补活性的酶供体和酶受体， 将所述适配体连接到所述酶受体上， 得适配体 -酶受 体复合物；

[0029] 8022： 配置不同浓度的待测物标准溶液， 将所述适配体-酶受体复合物、 所述 酶供体和所述酶作用的底物加入到所述待测物 标准溶液中进行酶促反应， 测得 酶促反应信号， 获取酶促反应信号与待测物含量的方程；

[0030] 8023： 将所述适配体-酶受体复合物、 所述酶供体和所述底物加入到含有所述 待测物的样品溶液中进行酶促反应， 测得酶促反应信号， 根据所述方程计算所 述样品溶液中的待测物含量。

[0031] 具体地， 在步骤 3011中， 所述适配体连接到所述酶供体上时， 步骤 3012或3013 中的适配体-酶供体复合物和酶受体在反应液� �结合， 就形成了301中的适配体- \¥0 2019/104529 卩（：17 \2017/113570

6 酶复合物。 同理， 在步骤 3021中， 所述适配体连接到所述酶受体上时， 步骤 02 2或3023中的适配体-酶受体复合物和酶供体在反 应液中结合， 就形成了 301中的 适配体 -酶复合物。

[0032] 进一步地， 在上述均相检测方法中， 所述适配体包括核酸适配体、 多肽适配体 和肽核酸适配体中的至少一种。 优选地， 适配体分子量一般小于 本发明 实施例中， 优选适配体分子量小于 该范围内适配体性能最佳。 在一具体 实施例中， 适配体为多肽适配体， 其氨基酸序列如

NO:l所示： EWACNDRGFNCQLQR。 更进一步优选地， 上述适配体为修饰的适 配体， 修饰方式包括环化修饰 （如形成分子内二硫键） 、 甲基化修饰和磷酸化 修饰中的至少一种。 将适配体进行修饰， 可以进一步以提高适配体的稳定性、 亲和力或特异性。 当然， 如果是待测物的拮抗小分子或其衍生物， 也具有适配 体的相同功能， 也属于本发明实施例中的适配体范围内。

[0033] 进一步地， 在上述均相检测方法中， 所述待测物包括蛋白质、 脂质体、 激素、 核酸、 病毒、 细菌、 真菌、 细胞和组织中的至少一种； 即本方面实施例的均相 检测方法可检测各种生物大分子、 细胞体或组织， 优选地， 待测物的分子量一 般大于 101^03, 分子量越大， 检测灵敏度越高， 进一步优选待测物为分子量大于 的物质， 其检测灵敏度更佳。

[0034] 进一步地， 在上述均相检测方法中， 所述酶包括葡萄糖 -6 -磷酸脱氢酶、 （3 -半乳 糖苷酶、 过氧化物酶、 荧光素酶、 碱性磷酸酶和荧光蛋白 （如绿色荧光蛋白和 红色荧光蛋白等） 中的至少一种， 但不限于以上几种。 所述酶作用的底物为显 色底物、 发光底物和荧光底物中的任意一种， 具体可以根据不同灵敏度、 线性 范围等要求从中选择合适的底物。 而酶促反应信号可为比色信号、 发光信号和 荧光信号中的任意一种。 在本发明实施例中， 优选（3 -半乳糖苷酶和葡萄糖 -6 -磷 酸脱氢酶， 对应的底物分别为邻硝基苯（3 -半乳吡喃糖苷和葡萄糖 -6 -磷酸， 同 时， 将（3 -半乳糖苷酶分为 片段和 片段， 片段和适配体融合表达， 葡萄糖 -6 -磷酸脱氢酶作为全酶与适配体连接。

[0035] 进一步地， 在上述均相检测方法中， 所述酶连接所述适配体的方式为化学偶联 、 亲和吸附 （如生物素-亲和素连接） 和基因融合表达中的任意一种。 适配体、 \¥0 2019/104529 卩（：17 \2017/113570

7 酶或酶的片段可以通过化学合成或基因表达获 得， 优选基因融合表达方式将酶 连接适配体， 更进一步优选地， 所述酶可通过连接肽与所述适配体相连， 即可 以在适配体与全酶或酶片段之间添加一段连接 肽进行连接， 该连接肽可以使适 配体与全酶或酶片段保持其独立的生物学属性 。 在本发明一实施例中， 融合蛋白即为将（3 -半乳糖苷酶的£0片段与识别（: -反应蛋白的适配体融合表达， 两者中间增加一段连接肽 （序列为： 。

[0036] 进一步地， 在上述均相检测方法中， 所述酶连接有一种或多种所述适配体。 即 所述酶可以连接针对同一待测物的一株或多株 所述适配体， 实现对一种待测物 的检测， 采用一株或多株针对同一待测物的适配体标记 的方法， 在防止假阴性 时具有明显的技术优势； 当然， 也可以选择针对不同待测物的适配体对不同的 酶或酶片段进行标记， 实现多重待测物的同步检测。 以上方法都在本发明保护 范围内， 都受本发明保护。

[0037] 进一步地， 在上述均相检测方法中， 在进行所述酶促反应的过程中， 还加入了 化学物质， 该化学物质包括但不限于表面活性剂、 环糊精、 牛血清白蛋白 （：83八 ） 、 酪蛋白、 氨基酸、 螯合剂、 核苷酸、 亲水高分子、 还原剂、 氧化剂、 防腐 齐 ^ 缓冲盐、 多糖、 醇和金属离子中的至少一种。 上述物质的加入， 或可改变 适配体标记的酶片段的互补活性， 或改变适配体标记的酶与待测物之间的亲和 性， 以减少待测物类似物导致的干扰， 或改善所制备试剂的稳定性、 抗干扰能 力等性质。

[0038] 进一步地， 在上述均相检测方法中， 所述均相检测包括管式检测、 板式检测、 微流控检测和层析检测中的任意一种。 同时， 根据该均相检测方法中使用的试 齐 1 可以制备成液体、 干粉或者两者组合的形式的试剂盒。

[0039] 另外， 本发明实施例可以将酶的两个片段 （酶供体片段和酶受体片段） 分别替 换成两个不同的、 可发生荧光共振能量转移的荧光基团 （供体荧光基团和受体 荧光基团） ， 也能起到前述检测方法相同的技术效果。

[0040] 具体地， 该替代的均相检测方法， 包括如下步骤：

[0041] £01： 提供适配体、 可发生荧光共振能量转移的供体荧光基团和受 体荧光基团

， 所述适配体可特异性识别待测物； \¥0 2019/104529 卩（：17 \2017/113570

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[0042] £02： 配置不同浓度的待测物标准溶液， 将所述供体荧光基团和所述受体荧光 基团均连接所述适配体后， 加入到所述待测物标准溶液中， 测得所述供体荧光 基团的荧光强度， 获取荧光强度与待测物含量的方程；

[0043] £03： 将连接有所述适配体的供体荧光基团和连接有 所述适配体的受体荧光基 团加入到含有所述待测物的样品溶液中， 测得所述供体荧光基团的荧光强度， 根据所述方程计算所述样品溶液中的待测物含 量。

[0044] 荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团 中， 如果一个荧光基团 （供体 !!〇!·） 的发射光谱与另一个基荧光共振能量转移团 （受体 的吸收光谱 有一定的重叠， 当这两个荧光基团间的距离合适时 （一般小于 100人） ， 就可观 察到荧光能量由供体向受体转移的现象， 即以前一种基团的激发波长激发时， 可观察到后一个基团发射的荧光。 在供体荧光基团和受体荧光基团上， 分别标 记一种或多种适配体， 当加入待测物时， 两个荧光基团上的适配体与待测物形 成夹心结构， 并使两个荧光基团距离拉近， 发生荧光共振能量转移， 根据该荧 光共振能量转移信号检测荧光基团发射的荧光 强度， 该荧光强度与待测物浓度 呈方程关系， 因此， 可以快速计算出待测物浓度。

[0045] 进一步地， 在该均相检测方法中， 所述供体荧光基团和所述受体荧光基团为配 对的荧光蛋白、 配对的有机染料和配对的半导体量子点中的任 意一种。 现在市 场上已经有很多商品化的荧光染料， 可作为本均相检测方法中配对的两个荧光 基团， 包括但不限于荧光蛋白 （如青色荧光蛋白与黄色荧光蛋白的配对， ） 、 有机染料 （如， 公司的 系列染料） 、 半导体量子点等。

[0046] 该依据荧光共振能量转移信号的均相检测方法 中， 与前述依据酶促反应信号的 方法相比， 在适配体选择上是一样的， 适配体可以包括核酸适配体、 多肽适配 体和肽核酸适配体中的至少一种， 也可进行修饰。 待测物的选择也可以是一样 的， 包括蛋白质、 脂质体、 激素、 核酸、 病毒、 细菌、 真菌、 细胞和组织中的 至少一种。 供体荧光基团和受体荧光基团连接适配体的方 式也可以是化学偶联 、 亲和吸附 （如生物素-亲和素连接） 和基因融合表达中的任意一种， 当然如果 是半导体量子点， 则是化学偶联或亲和吸附。 总之， 除了不需要添加酶底物， 其他步骤的选择都可以一样。 [0047] 本发明先后进行过多次试验， 现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一 步 详细描述， 下面结合具体实施例进行详细说明。

[0048] 实施例 1 :

[0049] 一种 C-反应蛋白检测方法， 使用的试剂和步骤如下：

[0050] 实验材料： 磷酸钠 （购自国药） 、 EDTA （乙二胺四乙酸， 购自国药） 、 ONP G （邻硝基苯（3-D-半乳卩比喃糖 I， 购自 sigma） 、 吐温 -20 （购自国药） 、 防腐剂 p roclin-300 （购自 sigma） 、 C-反应蛋白 （购自南京立顶） 、 ED-CA融合蛋白 （本 公司构建表达， 序列为 SEQ ID NO:2） 、 EA酶片段 （本公司构建表达， 在野生 型（3-半乳糖苷酶基础上敲除了 11-41位氨基酸序列） 。

[0051] 试剂 1的配制： 200mM的磷酸钠， 调整 pH到 7.3， 加入 5mM的 EDTA、 0.1%的 pr oclin-300、 1%的 BSA、 0.05uM的 ED-CA融合蛋白。

[0052] 试剂 2的配制： 200mM的磷酸钠， 调整 pH到 7.3， 加入 5mM的 EDTA、 0.1%的 pr oclin-300、 1%的 BSA、 0.05uM的 EA酶片段、 0.2g/L的 ONPG。

[0053] C-反应蛋白标准液： 酉己制 lmg/L、 10mg/L、 100mg/L、 1000mg/L四个浓度梯度 的标准液。

[0054] 其中， ED-CA融合蛋白为将（3-半乳糖苷酶的 ED片段与识别 C-反应蛋白的适配体

（SEQ ID NO: l： EWACNDRGFNCQLQR） 融合表达 （ED-CA） ， 两者中间增 加一段连接肽 （序列为： GGGGS） ， SEQ ID NO:2的序列如下

[0055] ITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQ

LRSLNG GGGGSEWACNDRGFNCOLOR。

[0056] 检测步骤： 在反应容器中， 先加入 2ul的 C-反应蛋白标准液， 再加入 lOOul的试 剂 1， 37°C孵育 5分钟， 加入 lOOul的试剂 2， 37°C下进行酶促反应， 检测 415nm波 长下吸光度的变化， 吸光度变化速度 （反应度） 与 C-反应蛋白的浓度呈反比， 以 C-反应蛋白标准液的浓度与反应度建立标准曲� �� （即存在关系方程） 。 测试 待测样本溶液的反应度， 根据标准曲线可计算出样品溶液中的 C-反应蛋白浓度

[0057] 本实施例的原理见图 1 : 由于在 ED片段上增加的适配体氨基酸很少， 不影响 ED -CA和 EA互补形成有活力的酶， 当检测环境中含有 C-反应蛋白时， C-反应蛋白 与 ED-CA结合， 由于 C-反应蛋白分子量约为 l lOkd， 两者结合的空间位阻， 阻碍 了: ED-CA与 EA片段的结合， 导致两者无法形成有活力的酶， C-反应蛋白浓度越 高无活力的酶越多， 酶促反应的信号值越低， 根据酶促反应的信号值可以计算 出 C-反应蛋白的浓度。

[0058] 实施例 2:

[0059] 一种 C-反应蛋白检测方法， 使用的试剂和步骤如下：

[0060] 实验材料： TRIS （三羟甲基氨基甲烷， 购自阿拉丁） 、 EDTA （购自国药） 、 葡萄糖 -6 -磷酸脱氢酶 （购自罗氏） 、 葡萄糖 -6 -磷酸 （购自罗氏） 、 氧化型辅酶 I I （购自罗氏） 、 防腐剂 proclin-300 （购自 sigma） 、 MES （2 -吗啉乙磺酸， 购自 si gma） C-反应蛋白 （购自南足立顶） 、 EDC （1-（3二甲氨基丙基）-3 -乙基碳二 亚胺盐酸盐， 购自 sigma） 。

[0061] 适配体标记葡萄糖 -6 -磷酸脱氢酶 （G6PD-CA） _: 配制 5g/L的 MES缓冲液， 调 整 PH到 6.5， 加入 50mg/L的葡萄糖 -6 -磷酸脱氢酶和 2mg/L的 C-反应蛋白适配体 （ SEQ ID NO: l： EWACNDRGFNCQLQR） 搅拌均匀后加入 100mg的 1-（3 -二甲氨 基丙基）-3 -乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDC） ， 25°C下反应 1小时， 加入 10g/L的 BSA 终止反应， 使用 20kd的透析袋过夜透析， 去掉未反应的 C-反应蛋白适配体。

[0062] 试剂 1的配制： 200mM的 TRIS缓冲液， 调整 pH到 8.0， 加入 10%上述标记好的 G 6PD-CA、 0.1 %的 proclin-300、 1 %的 BSA。

[0063] 试剂 2的配制： 纯水中加入 2g/L的葡萄糖 -6 -磷酸、 4g/L的氧化型辅酶 II、 0.1%的 proclin-300。

[0064] C-反应蛋白标准液： 酉己制 lmg/L、 10mg/L、 100mg/L、 1000mg/L四个浓度梯度 的标准液。

[0065] 检测步骤： 反应容器中， 先加入 2ul的 C-反应蛋白标准液， 再加入 200ul的试剂 1 ， 37°C孵育 5分钟， 加入 50ul的试剂 2， 37°C下进行反应， 检测 340nm波长下吸光 度的变化， 吸光度变化速度 （反应度） 与 C-反应蛋白的浓度呈反比， 以 C-反应 蛋白标准液的浓度与反应度建立标准曲线 （即存在关系方程） 。 测试待测样本 溶液的反应度， 根据标准曲线可以计算出样品溶液中的 C-反应蛋白浓度。

[0066] 本实施例的原理见图 2: 将识别 C-反应蛋白的适配体通过偶联剂， 如 1-（3 -二甲 \¥0 2019/104529 卩（：17 \2017/113570

11 氨基丙基）-3 -乙基碳二亚胺盐酸盐 （£0（：） ， 按照一定比例， 偶联到葡萄糖 -6 -磷 酸脱氢酶上， 形成酶-适配体复合物 ， 由于适配体很小， 对酶的催 化活性影响很小。 当检测环境中含有（:-反应蛋白时， （: -反应蛋白与 合， 由于（:-反应蛋白分子量约为 覆盖了酶的催化中心， 导致酶活力降低 ， （:-反应蛋白浓度越高， 酶活力越低， 酶促反应的信号值越低， 根据酶促反应 的信号值可以计算出（: -反应蛋白的浓度。

[0067] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的 精神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保 护范围之内。