Wenn anorganische Phosphatquellen im Medium verbraucht sind, produzieren viele Mikroorganismen alkalische Phosphatasen (APasen), um organisch gebundenes Phosphat zu mobilisieren. WO-A-94/12636 beschreibt ein durch Phosphatlimitation induzierbares Expressionssystem für das Gram-negative Bakterium Escherichia coli. Dieses System basiert auf einer mutierten Variante des Phosphat-Bindeproteins PstS sowie dem Promotor der Alkalischen Phosphatase von E. coli, phoA.

Das Gram-positive Bakterium Bacillus subtilis synthetisiert bei Phosphatlimitation mindestens zwei APasen, PhoA und PhoB (Hulett et al., 1994). Die Synthese beider APasen wird durch das Zwei-Komponenten- System PhoP-PhoR reguliert (Liu and Hulett, 1997 ; Liu et al., 1998a, b ; Qui and Hulett, 1998a, b). Eine dritte APase, das Genprodukt von phoD, hat hauptsächlich Phosphodiesterase (APDase)-Aktivität (Eder et al., 1996).

Das Gram-positive Bakterium B. subtilis ist ein anerkannter industrieller Wirt. Dennoch fehlen für diesen Mikroorganismus geeignete, leicht regulierbare, starke Expressionssysteme. Es besteht daher ein großes Bedürfnis, solche Expressionssysteme bereitzustellen. Ein durch Phosphatlimitation induzierbares Expressionssystem in B. subtilis wurde bislang noch nicht beschrieben.

Die vorliegende Erfindung ist ein starkes, durch die Phosphatkonzentration im Medium reguliertes Expressionssystem, welches vorzugsweise auf einer Expressionskontrollsequenz eines durch Phosphatlimitation induzierbaren Bacillus-Gens basiert. Das System ermöglicht eine phosphatregulierte Überexpression von heterologen Genen in Gram-positiven Bakterien, insbesondere in Vertretern der Gattung Bacillus. Im Vergleich zu E. coli ist B. subtilis ein ausgewiesener Mikroorganismus der zur Sekretion von Fremdproteinen in das extrazelluläre Medium befähigt ist. Weiterhin ist B. subtilis ein GRAS-Organismus (GRAS = Generally Regarded As Safe), der keine Endotoxine bildet und damit besonders für die Überproduktion von pharmazeutischen sowie Nahrungsmittel-Enzymen geeignet ist.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein System zur phosphatregulierten Genexpression in Gram-positiven Organismen, insbesondere Bacillus umfassend (a) eine Genexpressionseinheit enthaltend eine erste Expressionskontrollsequenz mit einem phosphatregulierbaren Promotor, einer ribosomalen Bindungsstelle und gegebenenfalls eine für ein Signalpeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz, (b) eine Regulationseinheit enthaltend ein PhoP-PhoR- Phosphatregulationssystem von Bacillus in operativer Verknüpfung mit einer zweiten Expressionskontrollsequenz.

Der Promotor und gegebenenfalls die ribosomale Bindungsstelle der ersten Expressionssequenz stammen vorzugsweise von durch Phosphatlimiation regulierbaren Genen aus Bacillus z. B. von den Genen pstS, phoD, phoB oder glpQ von B. subtilis. Alternativ können auch funktionelle Varianten der B. subtilis Expressionskontrollsequenzen verwendet werden, die sich durch Substitution, Insertion oder/und Deletion einzelner Nukleotide oder Nukleotidabschnitte von den natürlichen Sequenzen unterscheiden.

Bevorzugte Beispiele solcher funktionellen Varianten sind Expressionskontrollsequenzen umfassend die in Fig. 6B gezeigten

Sequenzen, bei denen es sich um insbesondere hinsichtlich der ribosomalen Bindestelle optimierte Expressionskontrollsequenzen handelt.

Zusätzlich kann die erste Expressionskontrollsequenz stromabwärts der ribosomalen Bindungsstelle eine für ein Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz in operativer Verknüpfung mit Promotor und ribosomaler Bindungsstelle enthalten. Diese Signalpeptidsequenz ermöglicht die Expression von rekombinanten heterologen Proteinen, die von der Wirtszelle in das extrazelluläre Kulturmedium sekretiert werden.

Das Signalpeptid und die dafür kodierende Nukleotidsequenz sind vorzugsweise von den Genen pstS, phoD, phoB oder glpQ von B. subtilis abgeleitet und umfassen vorzugsweise eine der in Fig. 6A gezeigten Sequenzen. Die in Figur 6A dargestellten Signalsequenzen von gipQ, pstS, phoB und phoD sind vor allem für eine Sekretion von Fremdgenen unter Phosphathungerbedingungen geeignet (s. auch Figur 1). Weiterhin können diese Signalsequenzen auch mit Fremdgenen fusioniert werden, die unter anderen Kultivierungsbedingungen in Bacillus überexprimiert werden, z. B. in der exponentiellen Wachstumsphase oder bei Glukoselimitation und dadurch eine Sekretion dieser Fremdproteine unter diesen Bedingungen ermögjichen. Das Startcodon der Signalsequenz von phoB kann dabei von TTG zu ATG verändert werden.

Die Genexpressionseinheit kann weiterhin eine Klonierungsstelle in operativer Verknüpfung mit der ersten Expressionskontrollsequenz enthalten, um eine Einklonierung eines gewünschten Zielgens, das für ein heterologes zu exprimierendes Polypeptid kodiert, zu ermöglichen.

Vorzugsweise ist die Klonierungsstelle, die eine oder mehrere Restriktionsschnittstellen umfassen kann, so angeordnet, daß sie eine operative Verknüpfung eines einklonierten Zielgens mit der Expressionskontrollsequenz und insbesondere auch der Signalpeptid- kodierenden Sequenz ermöglicht. In einer anderen Ausführungsform der

Erfindung kann die Genexpressionseinheit bereits ein Strukturgen, das für ein heterologes zu exprimierendes Polypeptid kodiert, in operativer Verknüpfung mit der Expressionskontrollsequenz enthalten.

Die Regulationseinheit des erfindungsgemäßen Expressionssystems enthält ein PhoP-PhoR-Phosphatregulationssystem von Bacillus, insbesondere von B. subtilis, z. B. die Gene phoP (Accession Nr. X67676) und phoR (Accession Nr. M23549).

Das erfindungsgemäße Genexpressionssystem kann auf einem oder zwei Vektoren oder auch auch auf dem Chromosom einer Wirtszelle lokalisiert sein. Die Vektoren sind vorzugsweise Gram-positive prokaryontische Vektoren, d. h. Vektoren, die zur Propagierung in einer Gram-positiven prokaryontischen Wirtszelle, insbesondere in einer B. subtilis Wirtszelle fähig sind. Beispiele für derartige Vektoren sind Plasmidvektoren, Bakteriophagen, Cosmide etc. Besonders bevorzugt sind die Vektoren Derivate des Plasmids pAMß1 aus Enterococcus faecalis (Bruand et al.

EMBO J. 10 (1991) ; 2171-2177 ; Swinfield et al., Plasmid 26 (1991), 209- 221). Weiterhin weisen die Vektoren vorzugsweise einen für die jeweilige Wirtszelle geeigneten Replikationsursprung sowie vorzugsweise ein Antibiotikumresistenzgen auf, um eine Selektion zu ermöglichen. Zur Optimierung der phosphatregulierten Genexpression ist die Klonierung der Regulatorgene phoP und phoR in operativer Verknüpfung mit einer zweiten Expressionskontrollsequenz auf demselben oder einem zweiten Vektor bevorzugt. Alternativ kann die Genexpressionseinheit auf einem extrachromosomalen Vektor lokalisiert oder in das Chromosom der Wirtszelle integriert sein, während die Regulationseinheit in das Chromosom der Wirtszelle, z. B. durch homologe Rekombination integriert ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Gram-positive Zelle, die in erfindungsgemäßes Expressionssystem enthält. Vorzugsweise ist die Zelle

eine B. subtilis Zelle. Besonders bevorzugt ist die Wirtszelle eine sporulationsdefiziente Bacillus Zelle, insbesondere eine Bacillus spoOA- Mutante, wie sie bei Jensen et al. (J. Bacteriol, 175 (1993), 3749-3756) beschrieben ist, oder eine Bacillus spolIA-Mutante.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem und die erfindungsgemäße Zelle können in einem Verfahren zur gentechnischen Herstellung von Polypeptiden in Gram-positiven prokaryontischen Zellen verwendet werden.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur gentechnischen Herstellung von Polypeptiden in einer prokaryontischen Zelle, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein phosphatregulierbares Expressionssystem wie zuvor beschrieben verwendet. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren die Schritte (i) Bereitstellen einer Zelle, die ein erfindungsgemäßes Expressionssystem enthält, (ii) Kultivieren der Zelle aus (i) in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen, die zu einer Expression des gewünschten Polypeptids führen und (iii) Isolieren des Polypeptids aus der Zelle oder vorzugsweise aus dem Medium.

Die Kultivierung der Zelle in Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise auf solche Weise durchgeführt, daß bis zum Erreichen einer vorbestimmten Zelldichte die Expression des für das gewünschte Polypeptid kodierenden Gens weitgehend reprimiert ist, d. h. unter Bedingungen, bei denen eine Phosphatkonzentration im Medium vorliegt, bei der die erste Expressionskontrollsequenz reprimiert ist. Die Phosphatkonzentration beträgt vorzugsweise 10 bis 100 mM, besonders s bevorzugt 10 bis 30 mM. Nach Erreichen einer bestimmten Zelldichte wird durch Phosphatlimitation, z. B. durch Medienwechsel oder Abfangen des im

Medium vorhandenen Phosphats, z. B. durch Komplexbildung, die Expression des gewünschten Polypeptids induziert. Vorzugsweise wird die Phosphatlimitation, z. B. in einer Fed-Batch-Fermentation, durch Fütterung einer phosphatfreien oder-armen Nährlösung während der Fermentation oder/und durch Vorlage einer begrenzten Phosphatkonzentration im Kulturmedium bestimmt.

Die Erfindung wird weiterhin durch folgende Figuren und Beispiele erläutert.

Es zeigen : Figur 1 : Eine zweidimensionale Auftrennung der extrazellulären Proteine von Bacillus subtilis vor (A) und (B) 2 h nach Eintritt der stationären Phase durch Phosphatlimitation Figur 2 : Die APase-Aktivität von B. subtilis im Medium im Verlauf einer phosphatlimitierten Batch-Kultur.

Figur 3 : Eine Northernanalyse der glpQ mRNA vor und 0. 5, 1, 1. 5, 2 sowie 2. 5 h nach Eintritt der stationären Phase ausgelöst durch Phosphatlimitation.

Figur 4 (A) : Die Identifizierung des Promotors von glpQ durch Primerextension. (B) Die Sequenz der abgeleitete g/pQ-Promotorregion.

Figur 5 : Die Stärke der Promotoren und der Translationssignale der phosphatregulierten Proteine PstS, PhoD, PhoB und GlpQ wurde mit Hilfe translationaler/acZ-Fusionen in B. subtilis analysiert.

Figur 6 : (A) Mit Hilfe von Computerprogrammen wurden die potentiellen Signal peptid-Sequenzen von GlpQ, PstS, PhoD und PhoB ermittelt.

(B) Optimierte phoD-und pstS-Sequenzen.

Figur 7 : Einen Vergleich der Stärke der Expression des Modellproteins ß- Galactosidase (LacZ) durch die optimierte pstS-Sequenz (vergl. Figur 6B) mit einer Wildtyp-/acZ Fusion.

Figur 8 : Die Expression der ß-Galactosidase mit dem erfindungsgemäßen Expressionssystem während einer zweistufigen Fed-Batch Fermentation.

Beispiele 1. Phosphatregulierte Genexpression in B. subtilis Durch zweidimensionale Proteingelelektrophorese und anschtießende Identifizierung der Proteinspots mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie konnte die Synthese von Proteinen, die durch Phosphathunger reguliert werden, in B. subtilis genauer analysiert werden (Figur 1).

Durch diese Technik konnte eine starke Expression von verschiedenen Proteinen in der stationären Phase, ausgelöst durch Phosphatlimitation, vor allem im extrazellulären Medium beobachtet werden. Dies schließt die APasen PhoB, die APase/APDase PhoD, eine Glyrerophosphoryldiesterase (GtpQ) sowie das Phosphatbindeprotein PstS ein. GlpQ wurde als neues Mitglied des PhoPR-Regulons identifiziert. Alle phosphatregulierten Proteine werden in der exponentiellen Wachstumsphase, wenn Phosphat ausreichend im Medium vorhanden ist, nicht oder nur in sehr geringen Mengen synthetisiert. 30 Minuten nach Eintritt der stationären Phase, ausgelöst durch den Verbrauch von Phosphat im Medium, wird die Synthese dieser Proteine drastisch verstärkt. Die APase-Aktivität im Medium wird um den Faktor 200 erhöht (Figur 2).

Die Menge der durch Phosphathunger regulierten Proteine im extrazellulären Medium entspricht 1 h nach Eintritt der stationären Phase ca. 60-70 % des extrazellulären Gesamtproteins (Figur 1). Dabei sind vor

allem die Proteine PhoB, PhoD, GlpQ und PstS hervorzuheben. Das Phosphatbindeprotein PstS ist unter diesen Bedingungen außerdem in großen Mengen im Cytoplasma zu finden (Eymann et al. 1996). Für pstS wurde eine 5000-fache Induktion des Promotors nach Phosphatlimitation beschrieben (Qi et al. 1998). Der Promotor wurde durch Primerextension identifiziert.

Außerdem konnte eine starke Expression von glpQ mittels Northernanalysen beobachtet werden (Figur 3). GlpQ wird hauptsächlich monocistronisch nach Phosphatlimitation transkribiert. Der Promotor wurde durch Primerextension identifiziert (Figur 4).

2. Bereitstellung von Expressionskontrollsequenzen für die phosphatregulierte Expression heterologer Proteine Die Stärke der Promotoren und der Translationssignale der phosphat- regulierten Proteine PstS, PhoD, PhoB und Gips wurde mit Hilfe translationaler/acZ-Fusionen in B. subtilis analysiert (Figur 5).

Mit Hilfe von Computerprogrammen wurden die potentiellen Signalpeptid- Sequenzen dieser Proteine ermittelt (Figur 6A). Weiterhin konnten optimierte Sequenzen der Transkriptions-und Translationssignale bestimmt werden (Figur 6B).

3. Bereitstellung von Wirtszellen für die phosphatregulierte Genexpression Als Ausgangsquelle kann ein sporulationsdefizienter spoOA Bacillus-Stamm (Jensen et al. (1993), supra) oder ein sporulationsdefizienter spollA Stamm verwendet werden. Eine Kopie der Gene phoP und phoR kann nach der Amplifikation mit Hilfe der PCR-Technik in das Amylasegen von Bacillus subtilis auf einem Escherichia co/i Plasmid integriert, das nur zur Replikation

in E. coli aber nicht in Bacillus befähigt ist, integriert werden. Nach Linearisierung und Transformation dieses Plasmids in Bacillus, kann die phoP-phoR-Sequenz durch die flankierenden Amylasegensequenzen über zwei Crossingover in das chromosomale Amylasegen von B. subtilis integriert werden.

4. Phosphatregulierte Expression heterologer Proteine Die Stärke der Expression des Modellproteins ß-Galaktosidase (LacZ) mit den optimierten phoD-und pstS-Sequenzen wurde mit den Wildtyp lacZ- Fusionen verglichen.

Zur Konstruktion der/acZ-Fusionen wurden die jeweiligen Promotorsequenzen mit Hilfe der unten angegebenen Primer amplifiziert, mit EcoRl und BamHl geschnitten und in den Translationsfusionvektor pAC7 eingebaut (Ref. : Weinrauch Y, Msadek T, Kunst F, Dubnau D 1991.

Sequence and properties of comQ, a new competence regulator gene of Bacillus subtilis. J Bacteriol 173 (18) : 5685-93). Nach Linearisierung der Vektoren mit Scal und einer Transformation in Bacillus wurden die entsprechenden/acZ-Fusionen in den amyE-Ort des Bacillus-Chromosoms einrekombiniert.

Die folgenden Primer wurden für die Konstruktion der lacZ-Fusionen mit den Phosphathunger-induzierbaren Promotoren verwendet. pstS Forward GGGGAATTCTAAAAAAAACGCTCACATGATG pstS Revers CGGGATCCATTTCCTAAATTCCCCCTTCG pst-mut Forward GGGGAATTCTAAAAAAAACGCTCACATGATG pstS-mut Revers CGGGATCCATTTCCTAAATTCCTCCTTTGTA

phot Forward GGGGAATTCGAGTCATTCTGCGAAATGGC phoD Revers GGGGGATCCATTCAAGATCCCCTCTCTC phoD-mut Forward GGGGAATTCGAGTCATTCTGCGAAATGGC phoD-mut Revers GGGGGATCCATTCAAGATCCTCCTTTTCCTCATTG phoB-mut Forward GGGGAATTCAGATTTCAGTCCGCCTATCC phoB-mut Revers GGGGGATCCATTGGATAACCTCCTAAA Die verschiedenen/acZ-Fusionen wurden in Phosphat-limitierten BLM- Medium mit 0, 1 mM Phosphat getestet. Die höchste ß- Galactosidaseaktivität zeigte die Fusion mit dem pstS-Promotor und den optimierten Transiationssignalen (Figur 5, 7). Die Bestimmung der ß- Galaktosidaseaktivität erfolgte nach Kenney and Moran (Kenney, T. J. and Moran, C. P., Jr (1987) Organization and regulation of an operon that encodes a sporulation-essential sigma factor in Bacillus subtilis J. Bacteriol.

169, 3329-3339). Die Aktivität wurde als Miller Units per optischer Dichte dargestellt.

Die Expression der optimierten pst-/acZ-Fusion wurde in einer Fed-Batch Fermentation getestet. (Figur 8). Der Fermentationsprozeß, mit dem in dieser Erfindung beschriebenen phosphatregulierten Expressionssystemen wird zweistufig durchgeführt. Die erste Phase, die sogenannte Wachtumsphase, wird als Fed-Batch Fermentation durchgeführt. In dieser Phase ist im Kulturmedium oder/und in der Fütterungslösung ausreichend Phosphat enthalten. Das Grundmedium enthält vorzugsweise die folgende Zusammensetzung :

Endkonzentration g/i Glukose 5 Tris 50 mM 6, 057 (NH4) 2S04 15 mM 2 MgSO4 # 7 H2O 8 mM 2 KCI 27 mM 2 Natriumcitrat x 2 H20 7 mM 2, 1 Glutaminsäure 9 mM 0, 825 Der pH-Wert der Salzlösung wird auf 7. 5 eingestellt (mit HCI). Nach dem Autoklavieren werden folgende Salze dazugeben : Stammlösung g/ml Endkonz. ml/100m1 CaC'2 1M 7, 35 g/50ml 2mM 0, 2 FeSO4 0, 5 mM 6, 95g/50m1 1, uM 0, 2 MnSO4 25 mM 0, 275g/50ml 19, uM 0, 04 KH2PO4 0, 2 M 1, 35g/50ml 0, 4 mM 0, 2 Nach dem Verbrauch der zu Beginn der Fermentation vorgelegten Glukose (5 g/l), identifiziert durch den Anstieg des pO2-Levels wurde kontinuierlich Glukoselösung zugefüttert. Die Fütterungslösung enthielt (in g/kg Lösung) : Glukose 200, Tris 6, (NH4) 2SO4 2. 0, Glutaminsäure 0. 9, KCI 0. 5, Na-Citrat x 2H2O 1. 0, und Spurenelementelösung 10 mL kg-'. Zusätzlich wurde 2. 75 m/l Lösung MgSO4 (1 M) zweimal während der Fed-Batch Kultivierung separat zugegeben, um ein Ausfallen von Salz in der Fütterungslösung zu verhindern.

In dem in Figur 8 gezeigten Fermentationsprozeß wurde 20 mM Phosphat in das Medium gegeben. Dadurch wurde eine optische Dichte (OD500nm) von etwa 100 erreicht bis das Phosphat verbraucht war, und der pstS-Promotor induziert wurde. Die maximale ß-Galactosidaseaktivität war in der

Fermentation nach etwa 5 h nach Phosphatlimitation zu beobachten (Fig. 8).

In der zweiten Phase, der Produktionsphase, ist entweder im Kulturmedium das Phosphat verbraucht oder es wird nun eine Fütterungslösung zugegeben, die kein Phosphat mehr enthält. Durch den damit ausgelösten Phosphathunger wird eine Induktion des Expressionssystems über das Zweikomponentensystem PhoP-PhoR erreicht. In bestimmten Zeitabständen ist eine limitiert Zugabe von Phosphat, insbesondere von organischen Phosphatverbindungen, möglich, um die durch Phosphathunger ausgelöste Überproduktion der entsprechenden Polypeptide zu optimieren.

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