Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Wirkstoff-Trägerprotein- Lösungen sowie die Wirkstoff-Trägerprotein-Lösungen selbst. Die erfindungsgemäße Wirkstoff-Trägerprotein-Lösungen können insbesondere zur Injektion von an sich wasserunlöslichen Wirkstoffen unter Verwendung von Trägerproteinen, beispielsweise von humanem Serumalbumin als Lösungsvermittler eingesetzt werden. Bei vielen Wirkstoffen treten aufgrund ihrer oftmals geringen Wasserlöslichkeit Schwierigkeiten bei der intravenösen Verabreichung auf. Oftmals werden Hilfsstoffe zur Formulierung benötigt, wie beispielsweise polyoxyethyliertes Castoröl (Cremophor) oder organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Methylenchlorid oder Chloroform, die bei der Verabreichung an einen Patienten toxische Nebenwirkungen hervorrufen können.

Weiterhin sind im Stand der Technik Formulierungen beschrieben, in denen Wirkstoffe zur Verabreichung an Proteine gebunden sind. DE 196 36 889 A1 beschreibt Transferrin- und AlbuminkKonjugate zytostatischer Verbindungen. Dazu werden thioliertes Transferrin und/oder Albumin durch Maleinimidverbindungen derivatisierten zytostatischen Verbindungen kovalent gekoppelt. WO 00/71079 A2 beschreibt proteinstabilisierte pharmakologisch aktive Mittel. Dabei werden im Wesentlichen wasserunlösliche Wirkstoffe in Form von suspendierten, mit Protein beschichteten Partikeln bereitgestellt. DE 198 47 362 A1 beschreibt makromolekulare Wirkstoffkonjugate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Es erfolgt eine kovalente Kopplung unter Verwendung eines bifunktionellen Säurechlorids. K. Santhi et al, (Drug Development and Industrial Pharmacy, Vol. 28, No. 9 (2002) 1171-1179) beschreibt Nanopartikel aus Rinderserumalbumin umfassend 5-Fluorouracil. Dabei warden Albuminnanopartikel, die durch Quervernetzung von Albumin unter Verwendung einer Glutaraldehyd- Ethanol-Lösung erhalten werden mit 5-Fluorouracil umgesetzt.

Z. Song et al. (Drug Design, Development and Therapy, 2016:10, 2643- 2649) beschreibt mit Curcumin beladene Serumaibumin-Nanopartikel. Die Nanopartikel werden durch Einbringen von humanem Serumalbumin und Curcumin in mit Chloroform gesättigtem Wasser gebildet.

S. Yan et al. (Procedia Engineering 102 (2015) 590-601) beschreibt mit JD27 beladene HSA-Nanopartikel. Zur Herstellung wird eine wässrige HSA-Lösung mit Natronlauge auf pH 9 eingestellt, der Wirkstoff JD27 zugegeben und Nanopartikel durch Zugabe von Glutaraldehyd gebildet.

Bei den in den oben genannten Dokumenten beschriebenen Vorgehensweisen erfolgt bei der Kopplung eine Denaturierung der Proteine, beispielsweise durch kovalente Kopplung mit dem Wirkstoff oder durch die Bildung von Proteinpartikeln. Es besteht aber die Gefahr, dass solche denaturierte Proteine immunogen wirken.

Eine Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem allgemein Wirkstoffe, insbesondere schlecht oder nicht wasserlösliche Wirkstoffe, in eine zur Injektion geeignete Formulierung gebracht werden. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer Wirkstoff-Trägerprotein-Lösung umfassend die Schritte: i) Bereitstellen einer wässrigen Trägerprotein-Lösung,

ii) Auflösen eines Wirkstoffes in einem Alkohol, wobei der Alkohol einen Siedepunkt < 100°C aufweist, oder/und in Acetonitril,

iii) Zugeben der Wirkstoff-Alkohol-Lösung oder/und Wirkstoff- Acetonitril- Lösung zu der wässrigen Trägerprotein-Lösung,

iv) Lyophilisieren der in Schritt iii) erhaltenen Lösung und

v) Resuspendieren des Lyophilisats, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung oder ähnlichem.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass unter Verwendung eines Trägerproteins, insbesondere von Serumalbumin, noch mehr bevorzugt von humanem Serumalbumin als Lösungsvermittler, Wirkstoffe, insbesondere wasserunlösliche Wirkstoffe, in eine zur Injektion geeignete Formulierung gebracht werden können.

In einem ersten Schritt wird erfindungsgemäß eine wässrige Trägerprotein- Lösung bereitgestellt. Als Trägerprotein wird vorzugsweise Serumalbumin verwendet, insbesondere humanes Serumalbumin. Weiterhin besonders bevorzugt wird als Trägerprotein rekombinantes humanes Serumalbumin (rHSA) eingesetzt. Besonders bevorzugt wird als Trägerprotein ein Liganden- freies humanes Serumalbumin (liganden-freies HSA) eingesetzt. In einem Liganden-freien humanen Serumalbumin sind die hydrophoben Bindungsstellen nicht besetzt und stehen so zur nicht-kovalenten Bindung mit hydrophoben Wirkstoffen zur Verfügung. Kommerziell erhältliches humanes Serumalbumin aus Humanblut ist oftmals mit Octanoat versetzt, damit hydrophobe Bindungsstellen sicher besetzt sind. Das erfindungsgemäß besonders bevorzugt eingesetzte Liganden-freie HSA ist aber gerade frei von solchen Stoffen wie Octanoat oder Fettsäuren, die die hydrophoben Bindestellen des HSA blockieren. Vorzugsweise wird erfindungsgemäß beim Bereitsstellen der wässrigen Trägerprotein-Lösung ein Schritt durchgeführt, bei dem eventuell vorhandene Liganden, wie beispielsweise Octanoat oder andere Fettsäuren entfernt werden. Vorzugsweise werden solche Liganden, insbesondere Octanoat und andere Fettsäuren durch Filtration über Aktivkohle aus dem HSA Präparat entfernt.

Für Veterinäranwendungen können aber auch tierische Serumalbumine, beispielsweise bovines Serumalbumin eingesetzt werden.

Das Trägerprotein wird erfindungsgemäß in Wasser gelöst, um eine wässrige Trägerprotein-Lösung zu bilden. Diese wässrige Trägerprotein-Lösung enthält vorzugsweise keine weiteren Substanzen neben dem Trägerprotein und dem Wasser und insbesondere keine weiteren Lösungsmittel. Die wässrige Trägerprotein-Lösung besteht somit vorzugsweise aus Trägerprotein und Wasser. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält die wässrige Trägerprotein-Lösung, insbesondere HSA-Lösung 1 bis 20% w/v Trägerprotein auf Wasser, mehr bevorzugt 2 bis 10% w/v und noch mehr bevorzugt 4 bis 6% w/v.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, insbesondere zur Herstellung von Curcumin-Trägerprotein-Lösungen, wird die in Schritt i) bereitgestellte wässrige Trägerprotein-Lösung auf einen pH-Wert von 5,5 bis 6,5 eingestellt, z.B. mittels eines Citrat-Puffers.

In einem weiteren Schritt wird erfindungsgemäß eine Wirkstofflösung bereitgestellt. Erfindungsgemäß wird dabei als Lösungsmittel ein Alkohol mit einem Siedepunkt von < 100°C eingesetzt oder/und Acetonitrii (Siedepunkt: 82°C). Bevorzugte Alkohole zur Bereitstellung der Wirkstofflösung sind Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol, sec-Butanol und tert-Butanol, bevorzugt Methanol, Ethanol, n-Propanol und iso-Propanol, noch mehr bevorzugt Methanol, Ethanol und iso- Propanol und am meisten bevorzugt Ethanol. Durch die Verwendung eines oder mehrerer Alkohole und/oder Acetonitril kann erfindungsgemäß die Zugabe von anderen organischen Lösungsmitteln, beispielsweise von halogenierten Lösungsmitteln, Ketonen, Estern oder Ethern vermieden werden. Insbesondere ist erfindungsgemäß die Verwendung von halogenierten und insbesondere chlorierten Lösungsmitteln, wie etwa Methylenchlorid oder Chloroform nicht erforderlich. Auch die Verwendung von anderen Lösungsmitteln, wie etwa polyoxyethyliertem Castoröl ist erfindungsgemäß nicht erforderlich. Bevorzugt wird deshalb erfindungsgemäß als einziges Lösungsmittel ein oder mehrere Alkohole mit einem Siedepunkt von < 100°C und/oder Acetonitril eingesetzt und noch mehr bevorzugt wird als alleiniges Lösungsmittel eine Zusammensetzung, bestehend aus Methanol, Ethanol, iso-Propanol und/oder Acetonitril als Lösungsmittel verwendet. Durch die Verwendung eines Alkohols mit einem Siedepunkt < 100°C und/oder Acetonitril wird im nachfolgenden Lyophilisierungsschritt sichergestellt, dass der Alkohol oder das Acetonitril zusammen mit dem Wasser beim Trocknungsschritt vollständig aus dem Wirkstoff-Trägerproteinprodukt entfernt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich auf alle Wirkstoffe, die in eine zur Injektion geeignete Formulierung gebracht werden sollen, anwendbar. Besonders vorteilhaft wird es auf schlecht wasserlösliche oder wasserunlösliche Wirkstoffe angewandt, also auf Wirkstoffe, die eine geringe oder keine Löslichkeit in Wasser aufweisen, insbesondere auf Wirkstoffe, die eine Löslichkeit von weniger als 10 mg/ml, noch mehr bevorzugt weniger als 5 mg/ml und noch mehr bevorzugt weniger als 1 mg/ml in Wasser bei 25°C aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Wirkstoff ein Zytostatikum eingesetzt. Besonders vorteilhafte Ergebnisse wurden erfindungsgemäß bei Einsatz von Curcumin, Amsacrin, Imatinib, Glivec, Mitoxantron, Artemisinin oder Elipticin erhalten. Am meisten bevorzugt wird erfindungsgemäß als Wirkstoff Curcumin, Amsacrin, Mitoxantron oder Artemisinin eingesetzt.

Möglich, aber nicht bevorzugt, ist auch der Einsatz von Doxorubicin.

Weiterhin bevorzugt wird als Wirkstoff ein Farbstoff, insbesondere ein Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt. Besonders geeignet sind Farbstoffe für die photodynamische Therapie, wie z.B. meso-Tetrahydrophenylchlorin (mTHPC). Zur photodynamischen Therapie wird zunächst mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein mTHPC-HSA oder ein anderes geeignetes Farbstoff-Trägerprotein-Konjugat hergestellt. Dieses wird dann dem Patienten i.v. verabreicht und reichert sich aufgrund des Trägerproteins, insbesondere HSA, im Zielgewebe an. Zielgewebe ist insbesondere Tumorgewebe, wie z.B. Plattenepithelkarzinom-Gewebe. Anschließend kann eine Fotoaktivierung des Farbstoff-Trägerprotein-Konjugats, insbesondere mTHPC-HSA durchgeführt werden, beispielsweise durch Bestrahlung mit einem Laser mit definierter Wellenlänge (z.B. 652 nm). Durch die Fotoaktivierung werden im Zielgewebe, insbesondere Tumorgewebe reaktive Spezies gebildet, die das Tumorgewebe zerstören.

Im nächsten Schritt wird erfindungsgemäß die Wirkstoff-Alkohol-Lösung der wässrigen Trägerprotein-Lösung, insbesondere der wässrigen HSA-Lösung (vorzugsweise 5% w/v) zugegeben. Die Zugabe kann beispielsweise durch langsames Eintropfen unter Rühren erfolgen.

Besonders günstige Ergebnisse werden erhalten, wenn das Molverhältnis von Trägerprotein zu Wirkstoff größer als 1 :10, insbesondere größer als 1 :5 beträgt. Das Molverhältnis von Trägerprotein zu Wirkstoff beträgt insbesondere 10:1 bis 1 :10, vorzugsweise 10:1 bis 1 :3, insbesondere 5:1 bis 1 :2, bevorzugt 1:1 bis 1 :5 und noch mehr bevorzugt 1 :2 bis 1 :4. Bei einer solchen Vorgehensweise liegen verhältnismäßig wenige Wirkstoffmoleküle pro Trägerproteinmolekül vor und das Trägerprotein bleibt in seiner natürlichen, nicht denaturierten Form. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt das Molverhältnis von Trägerprotein zu Wirkstoff 10:1 bis 1 :3, bevorzugt 5:1 bis 1 :3, mehr bevorzugt 5:1 bis 1 :2, insbesondere 2:1 bis 1 :2, bevorzugt 1 ,5:1 bis 1 :1 ,5 und noch mehr bevorzugt 1 ,2:1 bis 1 :1 ,2. Es wurde festgestellt, dass bei einem äquimolaren Verhältnis von Trägerprotein zu Wirkstoff besonders gute Ergebnisse erhalten werden und das Trägerprotein in natürlicher, nicht denaturierter Form vorliegt. Insbesondere werden bei einem solchen Verhältnis über lange Zeit lagerstabile Lösungen erhalten.

Erfindungsgemäß bevorzugt liegt das Trägerprotein, insbesondere Albumin in der erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoff-Trägerprotein-Lösung, insbesondere in einer erfindungsgemäß hergestellten wässrigen Wirkstoff- Trägerprotein-Lösung und in dem darin enthaltenen Wirkstoff-Trägerprotein- Komplex in nativer Form vor. Weiterhin bevorzugt liegt das Trägerprotein vereinzelt vor, also als Monomer mit daran gekoppeltem Wirkstoff und nicht als Polymer und nicht als Trägerproteinpartikel.

Weiterhin bevorzugt weist die erfindungsgemäß hergestellte Wirkstoff- Trägerprotein-Lösung Wirkstoff-Trägerprotein-Komplexe auf, in denen das Trägerprotein und der Wirkstoff nicht-kovalent aneinander gebunden sind. Bevorzugt sind das Trägerprotein und der Wirkstoff durch hydrophobe Wechselwirkungen aneinander gebunden. Insbesondere durch die Kombination von geringer Beladung des Trägerproteins mit Wirkstoff, also durch ein Molverhältnis von Trägerprotein zu Wirkstoff von 10:1 bis 1 :3, bevorzugt 5:1 bis 1 :2 und insbesondere 5:1 bis 1 :1 ,5 und durch die nicht-kovalente Bindung der gering oder nichtwasserlöslichen Wirkstoffe an das Trägerprotein wird erreicht, dass das Trägerprotein in der erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoff-Trägerprotein- Lösung in nativer Form vorliegt. Dies ist wichtig, da denaturiertes Albumin, wie es bei hohen Beladungen mit Wirkstoff gebildet wird, immunogen wirkt.

Die Zugabe der Wirkstoff-Alkohol-Lösung und/oder der Wirkstoff-Acetonitril- Lösung zur wässrigen Trägerprotein-Lösung erfolgt vorzugsweise derart, dass der Anteil des organischen Lösungsmittels in der gebildeten Lösung < 20% v/v, vorzugsweise < 15% v/v ist. Weiterhin beträgt der pH-Wert der Wirkstoff-Trägerprotein-Lösung vorzugsweise einen Wert im Bereich von pH 5,5 bis pH 8, vorzugsweise pH 5,9 bis pH 7,5 oder wird auf einen solchen Wert eingestellt. Auf jeden Fall muss ein pH-Wert von 4,9 vermieden werden, da dies dem isoelektrischen Punkt des Albumins entspricht und dabei das Protein koaguliert.

In einem weiteren Schritt wird dann die aus der Wirkstoff-Alkohol-Lösung bzw. Wirkstoff-Acetonitril-Lösung und der wässrigen Trägerprotein-Lösung gebildete Zusammensetzung lyophilisiert. Vorzugsweise erfolgt die Lyophilisierung durch Einfrieren bei -80°C und Gefriertrocknen. In diesem Verfahrensschritt wird ein gefriergetrocknetes Pulver, enthaltend das Trägerprotein und den Wirkstoff, gebildet. Vorzugsweise wird bei der Lyophilisierung der Alkohol und/oder das Acetonitnl und das Wasser vollständig entfernt.

Das gefriergetrocknete Pulver kann als solches gelagert und transportiert werden. Vorzugsweise wird das gefriergetrocknete Pulver erst kurz vor der Anwendung resuspendiert, beispielsweise in einem pharmazeutisch akzeptablen Medium. Bevorzugt erfolgt das Resuspendieren in physiologischer Kochsalzlösung. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Kit umfassend ein Lyophilisat erhältlich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie ein pharmazeutisch annehmbares Medium, wie beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung.

Erfindungsgemäß wurde insbesondere festgestellt, dass bei Resuspendieren des hergestellten Lyophilisat eine klare Lösung erhalten wird und nicht eine Suspension. Es wird angenommen, dass unter Verwendung von Trägerprotein, insbesondere von Serumalbumin und bevorzugt von humanem Serumalbumin und am meisten bevorzugt von Liganden-freiem HSA als Lösungsvermittler nicht kovalent gebundene Wirkstoff- Trägerproteinkomplexe gebildet werden, in denen das Trägerprotein in nicht denaturierter Form und somit weiterhin in löslicher Form vorliegt. Die im Stand der Technik bei Verwendung von organischen Lösungsmitteln, wie etwa halogenierten organischen Lösungsmitteln beobachtete Coagulierung, beziehungsweise Nanopartikelbildung tritt erfindungsgemäß nicht auf. Deshalb können tatsächlich klare Lösungen und nicht, wie im Stand der Technik oftmals beschrieben, lediglich Suspensionen erhalten werden. Erfindungsgemäß können somit schlecht oder nicht wasserlösliche Wirkstoffe in einer physiologischen wasserlöslichen Form durch nicht-kovalente Kopplung an natives und insbesondere Liganden-freies HSA als Lösungsvermittler zu Verfügung gestellt werden. Insbesondere sind die erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoff-Trägerprotein-Lösungen zur parenteralen Applikation geeignet. Durch die nicht-kovalente Bindung der Wirkstoffe an das Trägerprotein und insbesondere Albumin bleibt das Trägerprotein in nativer löslicher Form. Albumin hat zudem die Eigenschaft sich in Entzündungen und Tumoren anzureichern und führt zudem zu einer deutlich verlängerten Zirkulationszeit des gekoppelten Wirkstoffes.

Von besonderem Vorteil ist die relativ einfache erfindungsgemäße Herstellungsweise, die insbesondere eine reproduzierbare und sichere Herstellung von Trägerprotein-Konjugaten und insbesondere Albumin- Konjugaten mit schlecht oder nicht wasserlöslichen Wirkstoffen ermöglicht. Insbesondere enthalten die erfindungsgemäßen Wirkstoff-Trägerprotein- Lösungen keine Partikel mit einem Durchmesser von > 200 nm, insbesondere mit einem Durchmesser > 100 nm, noch mehr bevorzugt mit einem Durchmesser > 50 nm. Die Abwesenheit von Nanopartikeln in den erfindungsgemäß erhältlichen klaren Lösungen kann beispielsweise durch Ultrafiltration überprüft werden. Soweit gewünscht kann die erfindungsgemäße Wirkstoff-Trägerprotein-Lösung vor der Anwendung noch einer Sterilfiltration unterzogen werden.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoff-Trägerprotein-Lösungen sind insbesondere für parenterale Anwendungen und am meisten bevorzugt für eine i.v.-Applikation geeignet.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Beispiele weiter erläutert. Beispiel 1

Curcumin nicht kovalent an HSA gebunden

66000mg/3x369 = WOO g/X daraus folgt X- 17mg Curcumin auf 1g HSA Herstellung

1 g HSA wird in 20 ml Wasser (z.B. Ampuwa, also Wasser zur Injektion) gelöst. 17 mg Curcumin werden in 4 ml Ethanol absolut gelöst. Die Ethanol- Lösung wird unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen gelassen. Diese Lösung wird bei -80°C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophillisat wird mit physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Zur Kontrolle, dass tatsächlich keine Nanopartikel vorliegen, wird ein Aliquot (2 ml) mit Centricon-Ultrafiltration untersucht. Anschließend erfolgt eine Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung.

Beispiel 2

Curcumin nicht kovalent an HSA gebunden

66000mg/369mg = 1000mg/X daraus folgt : X = 5,6mg Curcumin auf 1g HSA. Herstellung

1g HSA wird in 30ml Ampuwa und 0,5 ml Citratpuffer pH 6,0 (z.B. Fa. Sigma Best. Nr. C9999) gelöst; 5,6mg Curcumin wurden in 3 ml Ethanol abs. unter Erwärmung auf 50°C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Curcumin/Ethanol-Lösung unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen gelassen. Anschließend wird diese Lösung bei -80° C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophillisat wird mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Kontrolle eines Aliquotes (2 ml) des Ansatzes mittels Centrion-Ultrafiltration oder GPC-HPLC Anschließend Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung.

Beispiel 3

Anwendungsbeispiel: Doxorubicin

Doxorublcin (FG 579g/mol)

66000mg 3x579 - lOOOmg/Xdaraus folgt: x=27mg Doxorubicin auf 1g HSA.

Herstellung Doxorubicin-HSA

1 g HSA wird in 20 ml Wasser (z.B. Ampuwa; d.h. Wasser zur Injektion) gelöst. 27 mg Doxorubicin werden in 4 ml Ethanol absolut gelöst. Die Ethanol-Lösung wird unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen gelassen. Diese Lösung wird bei -80°C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophillisat wird mit physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Zur Kontrolle wird ein Aliquot (2 ml) mit Centricon-Ultrafiltration untersucht. Anschließend erfolgt eine Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung. Beispiel 4

Anwendungsbeispiel: Amsacrin-HSA nicht kovalent gebunden

. Amsacrin (FG 393 g/mol)

Diese Beispiel-Substanz hat sine Proteinbindung größer 98% und ist in Ethanol Iäslich.66000mg/3x393 = lOOOmgfX daraus folgt : X = 18mg Amsacrine auf 1g HSA Herstellung

1 g HSA wird in 20 ml Wasser (z.B. Ampuwa, d.h. Wasser zur Injektion) gelöst. 18 mg Amsacrin werden in 4 ml Ethanol absolut gelöst. Die Ethanol- Lösung wird unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen gelassen. Diese Lösung wird bei -80 °C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophillisat wird mit physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Zur Kontrolle wird ein Aliquot (2 ml) mit Centricon-Ultrafiltration untersucht. Anschließend erfolgt eine Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung. Beispiel 5: Amsacrin nicht kovalent an HSA gebunden

I Amsacrin (FG 393 g/mol)

66000mg/393mg = 1000mg/X daraus folgt : X = 6,0mg Amsacrin auf 1g HSA. Herstellung

1g HSA wird in 30ml Ampuwa und 0,5 ml Citratpuffer pH 6,0 gelöst; 6,0mg Amsacrin werden in 3ml Ethanol absolut unter Erwärmung auf 50°C gelöst.

Die Ethanol-Lösung wird unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen gelassen. Diese Lösung wird bei -80° C eingefroren und gefriergetrocknet.

Das Lyophillisat wird mit physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert.

Kontrolle eines Aliquotes (2ml) des Ansatzes mittels Centricon-Ultrafiltration oder GPC-HPLC. Anschließend Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung.

Beispiel 6

Elipticin

Berechnung des Ansatzes:

66000 mg / 3x246 mg = 1000 mg/ X mg ;

X = 1 1 ,2 mg Elipticin auf 1g HSA (Humanes Serumalbumin) Herstellung:

1 g HSA in 50 ml Ampuwa lösen; 1 1 ,2 mg Mitoxantron in 10 ml Ethanol absolut lösen. Die Ethanol-Lösung unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen lassen. Diese Lösung wird bei -80 °C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wird mit physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Zur Kontrolle wird ein Aliquot (2 ml) mit Centricon- Ultrafiltration untersucht. Anschließend erfolgt eine Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung.

Beispiel 7

6

Elipticin

Berechnung des Ansatzes: 66000mg / 246mg = 1000mg/ X mg ;

X = 3,7mg Elipticin auf 1g HSA (Humanes Serumalbumin)

Herstellung:

1g HSA in 50ml Ampuwa lösen; 3,7mg Elipticin in 10ml Ethanol absolut unter Erwärmung auf 50°C lösen. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird die

Ethanol-Lösung unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen gelassen.

Diese Lösung wird bei -80° C eingefroren und gefriergetrocknet. Das

Lyophillisat mit 20ml physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert.

Anschließend Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung. Kontrolle eines Aliquotes (2ml) des Ansatzes mittels Centricon-Ultrafiltration oder GPC-

HPLC. Beispiel 8

Mitoxantron

Formelgewicht = 444.48092

Berechnung des Ansatzes:

66000 mg / 3x444,5 mg = 1000 mg / X mg; man erhält für X = 20,2 mg Mitoxantron auf 1g HSA (Humanes Serumalbumin)

Herstellung:

1 g HSA in 50 ml Ampuwa lösen; 20,2 mg Mitoxantron in 10 ml Methanol lösen. Die Methanol Lösung unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen lassen. Diese Lösung wird bei -80 °C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wird mit physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Zur Kontriolle wird ein Aliquot (2 ml) mit Centricon- Ultrafiltration untersucht. Anschließend erfolgt eine Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung.

Beispiel 9

Anwendungsbeispiel mTHPC-HSA

meso-tetrahydroxyphenylchlorin:

Formelgewicht = 676.79704

Berechnung des Ansatzes:

66000 mg / 3x676,8 mg = 1000 mg / X mg; man erhält für X = 30,7 mg mTHPC auf 1g HSA (Humanes Serumalbumin) Herstellung:

1 g HSA in 50 ml Ampuwa lösen; 30,7 mg mTHPC in 10ml Ethanol lösen. Die Ethanol Lösung unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen lassen. Diese Lösung wird bei -80 °C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wird mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Zur Kontrolle wird ein Aliquot (2 ml) mit Centricon-Ultrafiltration untersucht. Anschließend erfolgt eine Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung. meso-tetrahydroxyphenylch lorin = mTHPC = FoscanR

Beispiel 10 mTHPC / HSA Berechnung des Ansatzes:

66000mg / 676,8mg = 1000mg / X; man erhält für X = 10,2mg

mTHPC auf 1g HSA

Herstellung mTHPC-HSA :

1g HSA in 40ml Ampuwa lösen; 10,2mg mTHPC in 4ml Ethanol absolut, lösen. Die Ethanol-Lösung unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen lassen. Diese Lösung bei -80° C einfrieren und gefriertrocknen. Das Lyophilisat mit physiologischer Kochsalzlösung wieder auflösen. Anschließend Sterilfiltration der Lösung und Kontrolle des Ansatzes mittels GPC-HPLC. Beispiel 11

Mitoxantron

Molekularformel = C H N O

22 28 4 β

Molekulargewicht = 4 4 48092

Berechnung des Ansatzes:

66000mg / 444,5mg = 1000mg / X mg; man erhält für X = 7,0 mg Mitoxantron auf lg HSA

Herstellung:

1g HSA in 30ml Ampuwa und 0,5 ml Citratpuffer pH 6,0 lösen; 7,0mg Mitoxantron in 3ml Ethanol absolut unter Erwärmung auf 50°C lösen. Die Ethanol Lösung nach Abkühlung auf Raumtemperatur unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen lassen. Diese Lösung wird bei -80° C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophillisat mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Kontrolle eines Aliquotes (2ml) des Ansatzes mittels Centrion-Ultrafiltration oder GPC-HPLC. Anschließend Sterilfiltration der Lösung zur Anwendung. Beispiel 12

Artemisinin

O

Molekular Gewicht 283 g/Mol

Berechnung des Ansatzes:

66000mg/283mg = 1000mg/X mg ; X = 5,0mg Artemisinin auf 1g HSA

Herstellung:

1g HSA in 50ml Ampuwa lösen; 5mg Artemisinin in 5 ml Ethanol absolut lösen. Die Ethanol-Lösung unter Rühren langsam in die HSA-Lösung tropfen lassen. Diese Lösung wird bei -80° C eingefroren und gefriergetrocknet. Das Lyophillisat mit 20ml physiologischer Kochsalzlösung wieder auflösen. Anschließend Sterilfiltration der Lösung und Kontrolle des Ansatzes mittels GPC-HPLC ( Detektion bei 350nm )