以下に本発明について詳述する。
 scFvディスプレイファージライブラリーは、 以下のようにして作製することができる。複 数の健常者から採取した末梢血Bリンパ球よ� �、RT-PCR法にて免疫グロブリン重(H)鎖、軽(L)� �cDNAを合成する。次に各種プライマーを組み� ��わせて、H鎖可変領域(VH)とL鎖可変領域(VL)を 増幅させ、両者をlinker DNAで結合させること� ��より、健常者リンパ球由来のVHとVLのランダ ムな組み合わせによるscFv遺伝子のライブラ� �ーが作製される。このscFv遺伝子をファージ� ��ドベクター(例、pCANTAB5E)に組込み、約10 ⁸ ~10 ¹¹ クローンからなる健常者由来scFvディスプレ� �ファージライブラリーを構築することがで� �る。

 抗原であるα9インテグリンの調製は、以下� ��ようにして行うことができる。
 α9インテグリン(以下、単に「α9」ともいう )は膜蛋白質であるため、α9遺伝子をクロー� �ングして培養細胞に遺伝子導入を行い、人� �的に培養細胞表面に発現させることができ� �。遺伝子クローニングの鋳型としては、cDNA� �library等を用いるとよい。細胞表面に発現さ� ��るためには、通常N末端部分にシグナル配列 が存在する必要があるので、α9が本来有する シグナル配列を利用してもよいし、成熟型α9 をコードする遺伝子領域を他のシグナル配列 と連結させてもよい。作製する抗体について は、種特異性等を評価し、抗体の用途や可能 性を見極めることが必要であるため、遺伝子 の取得はヒトα9とマウスα9の両方について行 うのが望ましい。

 以上のようにして取得した、シグナル配� ��を含むα9の遺伝子を、例えばpcDNA3.1(-)ベク� �ー(Invitrogen)などの発現ベクターにクローニ� �グする。ここで、インテグリンファミリー� �α鎖の内、α9と最も相同性が高いと言われて いるのはα4である。このことから望ましくは 、α9のコントロールとして用いるために、α4 インテグリンについても同様の操作を行い、 発現ベクターにクローニングするとよい。

 構築した発現ベクターを、CHO細胞やSW480� �胞等の培養細胞に、Lipofectamine 2000(Invitrogen)� ��を用いたトランスフェクションにより導入� ��る。発現ベクターのマーカー(ネオマイシン 等)を利用して発現細胞のみを選択し、得ら� �た細胞を以降のスクリーニングや評価に使� �することができる。発現細胞については、� �界希釈法等によりクローニングを行い、均� �の細胞集団にすることによって、より安定� �に高発現量を示す細胞を得るとよい。

 以下に抗体作製について述べる。抗α9イ� ��テグリン抗体を作製して、α9のターゲット� ��リデーションを行うことを目的とする場合� ��は、まずマウスα9をターゲットとして機能� ��害活性を有するモノクローナル抗体を取得� ��、マウスの病態モデル系を用いて抗体の薬� ��の有無を評価するとよい。

 まずは、scFvディスプレイファージライブ ラリーからの特異クローン分離について述べ る。例えば次のような手順で行うことが出来 る。上記のライブラリーを、CHO細胞と反応さ せてサブトラクションを行った後、マウスα9 発現CHO細胞に結合させて回収、濃縮し、抗α9  scFvディスプレイファージクローンをスクリ ーニングする。抗原としては、細胞そのもの ではなく、膜画分を調製して用いたり、或い は膜画分から抗原を精製して用いたりするこ ともできる。

 このようにして得られたクローンのscFvを 調製し、α9発現細胞との反応性を確認する。 scFvの発現方法としては、例えば大腸菌で発� �させることができる。大腸菌の場合、常用� �れる有用なプロモーター、抗体分泌のため� �シグナル配列等、発現させるscFvを機能的に� ��合させて発現させることが出来る。例えば� ��ロモーターとしては、lacZプロモーター、ara Bプロモーター等を挙げることができる。scFv� ��分泌のためのシグナル配列としては、大腸� ��のペリプラズムに発現させる場合、pelBシグ ナル配列(J. BacterioR1987, 169: 4379-4383)を用い� �とよい。培養上清中に分泌させるにはM13フ� �ージのg3蛋白のシグナル配列を用いることも できる。

 細胞内外に発現されたscFvは、宿主から分 離し均一にまで精製することができる。例え ば、pCANTAB5Eの系で発現されるscFvは、そのC末� ��にEtag配列が付加されているので、抗Etag抗� �を用いたアフィニティークロマトグラフィ� �を用いて、容易に短時間で精製することが� �きる。その他、通常のタンパク質で使用さ� �ている分離、精製方法を組み合わせて精製� �ることも可能である。例えば、限外濾過、� �析、ゲル濾過/イオン交換/疎水クロマト等の カラムクロマトグラフィーを組み合わせれば 抗体を分離・精製することができる。精製し た標品については、HPLCゲルろ過分析等で分� �形態を分析することができる。

 得られた抗体や抗体フラグメントのα9イン� ��グリンに対する結合活性を測定する方法と� ��ては、ELISAやFACS等の方法がある。例えばELIS Aを用いる場合、α9インテグリン発現細胞を� �接またはcapture抗体を介して固相化した96穴� �レートに目的の抗体や抗体フラグメントを� �む試料、例えば大腸菌の培養上清や精製抗� �を加える。次に西洋わさびペルオキシダー� �(HRP)、アルカリフォスファターゼ(AP)等の酵� �、フルオレセインイソシアネート、ローダ� �ン等の蛍光物質、 ³² P、 ¹²⁵ I等の放射性物質、化学発光物質などで標識� �た抗Etag抗体等の二次抗体を添加して反応さ� ��、洗浄した後、必要に応じて検出試薬(例え ばHRP標識の場合、発色基質TMBなど)を加えて� �吸光度、蛍光強度、放射活性、発光量等を� �定することで、抗原結合活性を評価するこ� �が出来る。

 また単離したクローンのscFv遺伝子のVH及� ��VLのDNA塩基配列については、ジデオキシ法� �により決定でき、得られたDNA塩基配列情報� �らアミノ酸配列を推定できる。

 更に、分離クローンがα9に対する機能阻� ��活性を有しているか否かを評価する方法と� ��ては、例えばα9依存性の細胞接着を指標と� ��た以下の方法がある。α9のリガンドの一つ� ��あるN末OPN(オステオポンチンがトロンビン� �より切断された後のN末端側フラグメント)の RAA改変体(他のインテグリンとの反応を抑え� �ためにRGD配列をRAAに改変したもの)をプレー� ��に固定化し、ブロッキングを行う。各種抗� ��を添加した後、α9発現細胞を添加し、37℃� �1時間インキュベートする。細胞をCrystal viol etとメタノールを用いて固定・染色して、洗� ��後、接着した細胞中の色素をTriton X-100で抽 出し、波長595nmにおける吸光度を測定する。� ��れにより抑制作用が確認されれば、当該抗� ��はα9に対する機能阻害活性を有しているも� ��と判断される。

 ここで、scFvは一価の抗体フラグメントで あるが、IgG型またはscFv-Fc型の二価の抗体に� �ることで、Avidityの効果により親和性や阻害� ��果が大きく向上する場合のあることが知ら� ��ている。また、IgG型またはscFv-Fc型のように 分子量の比較的大きな分子形態の方が、scFv� �のような分子量の比較的小さな分子形態よ� �も、体内安定性に優れており、半減期が長� �こともよく知られたことである。

 よって、例えば分離クローンについて以� ��のようにscFv-Fc型に分子形態を変換させ、評 価を行うとよい。分離クローンのscFv遺伝子� �域をPCR増幅し、マウスまたはヒトFc融合蛋白 質発現ベクターに挿入することにより、scFv-F cの発現ベクターを構築する。このようなマ� �スまたはヒトFc融合蛋白質発現ベクターの例 としては、例えば、pFUSE-mIgG1-FcまたはpFUSE-hIgG 1-Fc(InvivoGen社)が使用可能である。当該ベクタ ーにおいては、細胞外への分泌発現を促すリ ーダー配列とscFv遺伝子、及びマウスまたは� �トFc遺伝子領域が連結されており、その発現 は各種プロモーターにより制御される。

 構築したscFv-Fc発現ベクターは、Lipofectamin e 2000(Invitrogen)等を用いることにより、CHO細� �等の培養細胞に遺伝子導入される。発現ベ� �ターのマーカー(ネオマイシン等)を含む選択 培地で拡張培養を行い、培養上清を回収して 、Protein Aカラムクロマトグラフィー等によ� �精製を行うことができる。得られたscFv-Fc精� ��標品は、scFvと同様に、HPLCゲルろ過やELISA、 FACS、或いはα9依存性細胞接着阻害試験等に� �り分析するとよい。ELISAにおいては、HRP標識 抗マウスIgG抗体等で、FACSにおいてはFITC標識� ��マウスIgG抗体等で検出を行うことができる� ��コントロール抗体としてヒトα9に対するマ� ��スモノクローナル抗体Y9A2(CHEMICON)を用いる� �よい。

 次に、抗体のエピトープ解析について述べ� ��。
 機能阻害活性を有する抗体クローンのエピ� ��ープを同定できれば、α9の中和エピトープ� ��明らかにすることができる。エピトープの� ��析は、例えば以下のようにして行うことが� ��きる。α9のアミノ酸置換体を構築して、当� ��抗体との反応性を解析する。アミノ酸置換� ��より、抗体との反応性に変化が認められれ� ��、置換した部位が抗体のエピトープである� ��能性が強く示唆される。アミノ酸置換の方� ��としては、例えば、ヒトα9とマウスα9の配� ��を入れ替える、α9とα4の配列を入れ替える� ��或いはα9の配列をAlaに置換する等の方法が� ��る。

 インテグリンファミリーのα鎖に共通す� �特徴として、細胞外領域N末端部分に位置す� ��βプロペラドメインが、リガンドとの相互� �用部位であると言われている(Science, 296, 151 -155, 2002)ことから、この領域内に中和エピト ープが存在する可能性は高いと思われる。よ って、βプロペラドメインを解析の対象とし� ��もよい。

 また、α4のリガンド結合部位及び中和エ� ��トープを解析した文献(Proc. Natl. Acad. Sci.  USA, 94, 7198-7203, 1997)で、βプロペラドメイン 内のR1からR5と呼ばれるリピート部分(ループ� ��域に対応)の内、R2とR4がリガンド結合に重� �であり、またR2、R3a及びR3cが中和エピトープ になりうるとの結果が示されている。これら のことから、ループ領域が中和エピトープに なっている可能性は高いと思われる。よって 、βプロペラドメイン中のループ領域に対象� ��絞って解析を行ってもよい。

 更に、それまでの解析結果より、当該抗� ��の種特異性に関する知見が得られていれば� ��それを利用することも可能である。例えば� ��ヒトα9及びマウスα9に対する反応性の強さ� ��違いが認められていれば、エピトープ領域� ��アミノ酸配列がヒトとマウスとでは多少異� ��っている可能性が考えられる。ヒトα9とマ� ��スα9とは高い相同性を有していることから� ��解析の対象とする部位の候補の内、ヒトα9� ��マウスα9とでアミノ酸配列が異なっている� ��位を選択すれば、更に候補部位が絞られ、� ��率的に解析を行うことが可能となる。

 また、ヒトα9改変体の発現を確認するた� ��のマーカーとしてEGFP等の蛍光蛋白質を用い るとよい。例えば、α9のC末端(細胞質領域)に EGFPを融合させたα9-EGFP融合体を構築すれば、 蛍光によりα9の発現を確認でき、その発現量 に応じた抗体の反応性を評価することができ るため、より定量的な評価が可能となる。

 そのようなα9或いはα9-EGFP融合体のアミ� �酸置換体をsite-directed mutagenesis法等により構 築する。それらを発現ベクターにクローニン グし、CHO細胞等の培養細胞にそれぞれ導入す る。一過性発現または安定発現させた細胞集 団について、野生型または改変型α9(或いはα 9-EGFP)の発現と、それらの当該抗体との反応� �をELISA或いはFACS等を用いて評価することが� �きる。例えばα9-EGFPをベースとして各種アミ ノ酸置換体を構築し、抗体との反応性をFACS� �より解析した場合、横軸にα9-EGFPの発現、縦 軸に抗体との反応性を示せば、発現量あたり の抗体との反応性を議論することが可能とな る。

 このようにして解析した結果、α9のアミ� ��酸置換により、当該抗体との反応性に変化� ��認められれば、置換した部位が当該抗体の� ��ピトープ(或いはエピトープの一部)である� �推察される。

 次に、抗体の薬効評価について述べる。
 α9については炎症への関与が強く示唆され� ��いることから、マウス病態モデル系として� ��、代表的な関節炎モデルであるマウスコラ� ��ゲン抗体誘導関節炎等を用いるとよい。例� ��ば以下のような手順で、各抗体クローンの� ��ウスコラーゲン抗体誘導関節炎に対する薬� ��を評価することができる。

 抗コラーゲン抗体カクテルをマウスに投� ��して、3日後にLPSを投与することにより、関 節炎の発症を誘導する。LPS投与の当日と3日� �に、当該クローンのscFv-Fcを500、170、56μg/head で腹腔内投与する。経時的にマウス全肢の腫 脹の程度を観察・スコア化し、各群の平均値 の推移をグラフ化する。その結果として、scF v-Fcの濃度依存的な関節炎抑制効果が認めら� �れば、当該クローンは関節炎に対する薬効� �有しているものと判断される。

 或いは、もう一つの代表的な関節炎モデ� ��であるマウスコラーゲン誘導関節炎に対す� ��抑制効果を評価するとよい。コラーゲン抗� ��誘導関節炎では急性期の炎症反応が惹起さ� ��るのに対し、コラーゲン誘導関節炎では免� ��反応を介した慢性的な炎症応答が引き起こ� ��れることが知られている。例えば以下のよ� ��な手順で、当該クローンのマウスコラーゲ� ��誘導関節炎に対する薬効を評価することが� ��きる。

 ウシII型コラーゲンを3週間隔で2回マウス に投与することにより、関節炎の発症を誘導 する。2回目の投与の4日後、6日後、8日後、10 日後及び12日後に当該クローンのscFv-Fcを500、 170、56μg/headで腹腔内投与する。経時的にマ� �ス全肢の腫脹の程度を観察・スコア化し、sc Fv-Fcの濃度依存的な関節炎抑制効果が認めら� ��るかどうかを評価する。

 また、関節リウマチは関節破壊を伴う慢� ��の炎症性疾患であり、関節破壊は患者の自� ��度を奪いQOLの大きな低下をもたらす。現在� ��でに使用されている関節リウマチ治療剤に� ��、抗炎症作用は有するものの、関節破壊を� ��果的に抑制するものは存在せず、今後は、� ��い抗炎症作用と共に、関節破壊抑制作用を� ��せ持つ関節リウマチ治療剤の開発が望まれ� ��いる。従って、例えば、以下のように当該� ��ローンの破骨細胞分化に対する抑制効果を� ��価してもよい。

 上記の関節炎誘導マウスから骨髄細胞を� ��取し、当該クローンのscFv-Fcと共にRANKL及びM -CSFを含んだαMEM培地で培養を行った後、破骨 細胞(TRAP陽性細胞)数を計数し、破骨細胞への 分化に対する抑制効果を評価する。また、別 の方法としては、関節炎の誘導と同時に当該 scFv-Fcを投与し、翌日に該マウスから骨髄細� �を採取してRANKL及びM-CSFを含んだαMEM培地で� �養し、破骨細胞数を計数して評価する。

 次に、抗体の親和性向上について述べる。
 抗体の可変領域について、アミノ酸置換等� ��改変を行うことにより、親和性や特異性が� ��上或いは変化した例は数多く報告されてい� ��。得られた抗体が十分な親和性や特異性を� ��していない場合、当該抗体についても、例� ��ば以下のようにして親和性や特異性を向上� ��せることは可能と思われる。

 改変の方法としては、当該分野で公知の� ��々の方法が存在し、例えば、部位を特定し� ��Ala等の特定のアミノ酸に置換する方法(例え ば、Current Protocols in Molecular Biology edit. 198 7, 5: Section 8, 1-8)やランダムアミノ酸を導� �する方法(いずれもsite-directed mutagenesis法に� �り行うことができる)、更には部位を特定せ� ��に抗体の可変領域にランダムにアミノ酸置� ��を導入する方法(random mutagenesis法により行� �ことができる)(例えば、PCR methods and Applicat ions, 1992, 2: 28-33)等がある。

 多くの場合、抗体可変領域の内、抗原認� ��に最も大きく寄与しているのはVHのCDR3領域� ��あることから、本領域を改変の対象部位と� ��てもよい。

 また、scFv改変体ディスプレイファージラ イブラリーを作製し、元のクローンよりも親 和性または特異性が向上した改変体をスクリ ーニングすることもできる。

 取得した改変体クローンについては、元� ��クローンと同様に、例えばscFvやscFv-Fcの分� �形態で標品を調製し、反応性や機能阻害活� �、更には薬効について評価するとよい。そ� �結果、元のクローンより優れた性状とヒトα 9への反応性、そして薬効が確認されれば、α 9が病態形成に寄与する疾患に対する予防ま� �は治療薬となりうる可能性が大いに期待さ� �ることとなる。

 本発明者らは、上記の方法により抗α9イ� ��テグリンscFvの取得を試みた結果、α9インテ グリンに対して特異的な反応性を有するscFv� �ローンMA9-413を取得することに成功した。scFv からscFv-Fcの形に分子形態を変換させて評価� �た結果、本クローンは、ヒトα9及びマウスα 9の両方に対する反応性と、両方に対する機� �阻害活性を有するという、これまでに報告� �れたものとは全く異なる性状であることが� �認された。

 さらに本発明者らは、クローンMA9-413につ いてエピトープ解析を行ない、ヒトα9インテ グリンの104番目のArgから122番目のAspまでの領 域(配列番号36:Swiss-Prot AC:Q13797に記載のヒトα 9インテグリン アミノ酸配列のN末端を1とし� ��番号付けを行った)が主として構成するエピ トープ、及び当該マウスα9インテグリンの105 番目のArgから123番目のAspまでの領域(配列番� �37:GenBank ACCESSION:AJ344342に記載のマウスα9イ� �テグリン アミノ酸配列のN末端を1として番� ��付けを行った)が主として構成するエピトー プを認識することを明らかにした。この領域 はこれまでに他のインテグリンファミリーの 研究でその機能や役割についての報告がなさ れていないループ領域であり、本発明者らは ここをL1領域と命名した。

 この様な特性を有する抗体及び抗体フラ� ��メントが有する薬効を調べた結果、マウス� ��節炎モデルにおいて炎症や関節腫脹を有意� ��抑制するという効果が確認された。

 すなわち、本発明のヒト抗α9インテグリ� ��抗体及び抗体フラグメントは、α9インテグ� ��ンのL1領域が形成するエピトープを認識し� �マウスα9インテグリンとヒトα9インテグリ� �の両方に反応性を有するという、これまで� �報告例のない性質を有するものである。こ� �ような性質を有する本発明の抗体及び抗体� �ラグメントは、α9インテグリンが関与する� �種疾患に対する新規な診断、予防または治� �薬として産業利用が可能であることが期待� �れる。

 また、本発明のヒト抗α9インテグリン抗� ��及び抗体フラグメントは、マウスα9インテ� ��リンとヒトα9インテグリンの両方に反応性� ��有するので、上述したように、同一抗体で� ��マウスを用いた薬理試験のデータを取得し� ��更にヒトを対象とした臨床試験を実施して� ��抗体医薬の開発を進めることが可能であり� ��この点は産業上非常に大きなメリットであ� ��と言える。

 また本発明は、L1領域という新たな中和� �ピトープを見出したことにより、α9インテ� �リンひいてはインテグリンファミリー全般� �関する研究或いは産業への応用に対して、� �たな可能性を提供するものである。

 更に、本発明者らは、上記クローンMA9-413 に対する分子改変を行い、ヒトα9インテグリ ンに対する反応性が大きく向上した複数のク ローンMA9-418、HA9-107、HA9-143及びHA9-212を得る� �とに成功した。これらのクローンは、MA9-413� ��り更に有効な薬剤となりうるものと期待さ� ��る。

 本発明者らによって取得された、上記性� ��を有するscFvクローンのVH鎖及びVL鎖のアミ� �酸配列及びそれをコードする塩基配列は、� �記の通りである。

(1)クローンMA9-413
 クローンMA9-413のVH鎖のアミノ酸配列を配列� ��号1に示した。当該VH鎖のCDR1~3のアミノ酸配� ��を配列番号2~4に示した。すなわち、配列番� ��1に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31番� �~35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号2)、50� �目~66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号3)、9 9番目~115番目のアミノ酸配列がCDR3(配列番号4) に対応している。また、当該VH鎖をコードす� ��遺伝子の塩基配列を配列番号5に示した。
 また、クローンMA9-413のVL鎖のアミノ酸配列� ��配列番号6に示した。当該VL鎖のCDR1~3のアミ� ��酸配列を配列番号7~9に示した。すなわち、� ��列番号6に示すVL鎖のアミノ酸配列において� ��23番目~35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号 7)、51番目~57番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番 号8)、90番目~96番目のアミノ酸配列がCDR3(配列 番号9)に対応している。また、当該VL鎖をコ� �ドする遺伝子の塩基配列を配列番号10に示し た。

(2)クローンMA9-418
 クローンMA9-418のVH鎖のアミノ酸配列を配列� ��号12に示した。当該VH鎖のCDR1~3のアミノ酸配 列を配列番号13~15に示した。すなわち、配列� ��号12に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31� ��目~35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号13)� �50番目~66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号1 4)、99番目~115番目のアミノ酸配列がCDR3(配列� �号15)に対応している。また、当該VH鎖をコー ドする遺伝子の塩基配列を配列番号16に示し� ��。
 また、クローンMA9-418のVL鎖のアミノ酸配列� ��、クローンMA9-413のVL鎖と同一である(配列番 号6)。

(3)クローンHA9-107
 クローンMA9-107のVH鎖のアミノ酸配列を配列� ��号18に示した。当該VH鎖のCDR1~3のアミノ酸配 列を配列番号19~21に示した。すなわち、配列� ��号18に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31� ��目~35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号19)� �50番目~66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号2 0)、99番目~115番目のアミノ酸配列がCDR3(配列� �号21)に対応している。また、当該VH鎖をコー ドする遺伝子の塩基配列を配列番号22に示し� ��。
 また、クローンMA9-107のVL鎖のアミノ酸配列� ��、クローンMA9-413のVL鎖と同一である(配列番 号6)。

(4)クローンHA9-143
 クローンHA9-143のVH鎖のアミノ酸配列を配列� ��号24に示した。当該VH鎖のCDR1~3のアミノ酸配 列を配列番号25~27に示した。すなわち、配列� ��号24に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31� ��目~35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号25)� �50番目~66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号2 6)、99番目~115番目のアミノ酸配列がCDR3(配列� �号27)に対応している。また、当該VH鎖をコー ドする遺伝子の塩基配列を配列番号28に示し� ��。
 また、クローンHA9-143のVL鎖のアミノ酸配列� ��、クローンMA9-413のVL鎖と同一である(配列番 号6)。

(5)クローンHA9-212
 クローンHA9-212のVH鎖のアミノ酸配列を配列� ��号30に示した。当該VH鎖のCDR1~3のアミノ酸配 列を配列番号31~33に示した。すなわち、配列� ��号30に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31� ��目~35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号31)� �50番目~66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号3 2)、99番目~115番目のアミノ酸配列がCDR3(配列� �号33)に対応している。また、当該VH鎖をコー ドする遺伝子の塩基配列を配列番号34に示し� ��。
 また、クローンHA9-212のVL鎖のアミノ酸配列� ��、クローンMA9-413のVL鎖と同一である(配列番 号6)。

 好ましい実施形態においては、本発明の� ��ト抗α9インテグリン抗体または抗体フラグ� ��ントは、配列番号2、配列番号3、配列番号4; 配列番号13、配列番号14、配列番号15;配列番� �19、配列番号20、配列番号21;配列番号25、配� �番号26、配列番号27;または配列番号31、配列� ��号32、配列番号33に各々示されるアミノ酸配 列からなる重鎖相補性決定領域(CDR1、CDR2、CDR 3)、及び配列番号7、配列番号8、配列番号9に� ��々示されるアミノ酸配列からなる軽鎖相補� ��決定領域(CDR1、CDR2、CDR3)を有する。より好� �しい実施形態においては、該ヒト抗α9イン� �グリン抗体または抗体フラグメントは、配� �番号31、配列番号32、配列番号33に各々示さ� �るアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領� �(CDR1、CDR2、CDR3)を有する。

 さらに好ましい実施形態においては、本� ��明のヒト抗α9インテグリン抗体または抗体� ��ラグメントは、配列番号1、配列番号12、配� ��番号18、配列番号24、配列番号30のいずれか� ��示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領� ��(VH)、及び配列番号6に示されるアミノ酸配� �からなる軽鎖可変領域(VL)を有する。最も好� ��しい実施形態においては、該ヒト抗α9イン� ��グリン抗体または抗体フラグメントは、配� ��番号30に示されるアミノ酸配列からなる重� �可変領域(VH)を有する。

 本発明で開示されるVH鎖及び/またはVL鎖は� �ファージ抗体法を用いてscFvの形で得られた� ��のであり、その評価もscFv或いはscFv-Fcの分� �形態で行ったが、原則として、本発明のヒ� �抗α9インテグリン抗体または抗体フラグメ� �トは、それらの分子形態に限定されること� �ない。例えば、完全抗体としては、開示し� �VH鎖及び/またはVL鎖をヒト免疫グロブリンの 定常領域と連結した完全分子型、また、抗体 フラグメントとしては、scFv及びscFv-Fcのほか� ��ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部と組� ��合わせたFab、Fab'またはF(ab') ₂ 、さらにscFvをヒト免疫グロブリンのL鎖の定� ��領域と結合させた一本鎖抗体(scAb)などの他� ��抗体フラグメントも、本発明に含まれる。

 本発明はまた、上記の本発明の抗ヒトα9� ��ンテグリン抗体またはその抗体フラグメン� ��のほか、該抗体または抗体フラグメントに� ��のペプチドやタンパク質と融合させた融合� ��体や、ポリエチレングリコールなどの高分� ��修飾剤を結合させた修飾抗体をも包含する� ��

 H鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させ たscFvを調製する場合、ペプチドリンカーと� �ては、例えばアミノ酸10~25残基からなる任意 の一本鎖ペプチドが用いられる。

 このようにして得られた本発明のヒト抗� �9インテグリン抗体または抗体フラグメント� ��当該抗体または抗体フラグメントを他のペ� ��チドまたはタンパク質と融合させた融合抗� ��、または当該抗体または抗体フラグメント� ��修飾剤が結合されてなる修飾抗体(以下、「 ヒト抗α9インテグリン抗体等」と称する)は� �必要によりさらに精製された後、常法に従� �て製剤化され、関節リウマチ等の自己免疫� �患、アレルギー、移植片拒絶反応等の免疫� �患、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患、癌等のα 9インテグリンが病態形成に関与する疾患の� �防および/または治療に用いることができる� ��

 本発明のヒト抗α9インテグリン抗体等は� ��好ましくは、関節リウマチの予防・治療剤� ��して用いることができる。これらの治療剤� ��剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の� ��経口剤とすることができ、静脈内投与、皮� ��投与等により投与することが好ましい(自己 免疫疾患治療剤とする場合もこれに準じれば よい)。また、製剤化にあたっては、薬学的� �許容される範囲で、これら剤型に応じた担� �や添加剤を使用することができる。

 上記製剤化に当たってのヒト抗α9インテ� ��リン抗体等の添加量は、患者の症状の程度� ��年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の� ��合力価等により異なるが、例えば、0.1mg/kg� �いし100mg/kg程度を用いればよい。

 本発明はまた、本発明の抗体又はそのフ� ��グメントをコードする遺伝子、及びそれを� ��む発現ベクターを提供する。本発明の発現� ��クターは、原核細胞および/または真核細胞 の各種の宿主細胞中で本発明の抗体又はその フラグメントをコードする遺伝子を発現し、 これらポリペプチドを産生できるものであれ ば特に制限されない。例えば、プラスミドベ クター、ウイルスベクター(例えば、アデノ� �イルス、レトロウイルス)等を挙げることが� ��きる。

 本発明の発現ベクターは、本発明の抗体� ��はそのフラグメントをコードする遺伝子、� ��び当該遺伝子に機能可能に連結されたプロ� ��ーターを含み得る。細菌中で本発明のポリ� ��プチドを発現させるためのプロモーターと� ��ては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例� ��ば、Trpプロモーター、lacプロモーター、recA プロモーター、λPLプロモーター、lppプロモ� �ター、tacプロモーターなどが挙げられる。� �母中で本発明の抗体又はそのフラグメント� �発現させるためのプロモーターとしては、� �えば、PH05プロモーター、PGKプロモーター、G APプロモーター、ADHプロモーターが挙げられ� ��宿主がバチルス属菌の場合は、SL01プロモー ター、SP02プロモーター、penPプロモーターな� ��が挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞� ��の真核細胞である場合、CAGプロモーター(Niw a H. et al., Gene, 108, 193-200, 1991)、SV40由来� �プロモーター、レトロウイルスのプロモー� �ー、ヒートショックプロモーターなどが挙� �られる。

 宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用い� ��場合、本発明の発現ベクターは、開始コド� ��、終止コドン、ターミネーター領域および� ��製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主� ��して酵母、動物細胞または昆虫細胞を用い� ��場合、本発明の発現ベクターは、開始コド� ��、終止コドンを含み得る。また、この場合� ��エンハンサー配列、本発明のポリペプチド� ��コードする遺伝子の5’側および3’側の非� �訳領域、スプライシング接合部、ポリアデ� �レーション部位、または複製可能単位など� �含んでいてもよい。また、目的に応じて通� �用いられる選択マーカー(例えば、テトラサ� ��クリン、アンピシリン、カナマイシン)を含 んでいてもよい。

 本発明はまた、本発明の遺伝子が導入さ� ��た形質転換体を提供する。このような形質� ��換体は、例えば、本発明の発現ベクターで� ��主細胞を形質転換することにより作製でき� ��。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞� ��しては、前記の発現ベクターに適合し、形� ��転換されうるものであれば特に限定されず� ��本発明の技術分野において通常使用される� ��然細胞あるいは人工的に樹立された細胞な� ��種々の細胞(例えば、細菌(エシェリキア属� �、バチルス属菌)、酵母(サッカロマイセス属 、ピキア属など)、動物細胞または昆虫細胞(� ��えば、Sf9)など)が例示される。形質転換は� �自体公知の方法により行われ得る。

 本発明はまた、本発明の遺伝子を宿主細� ��に発現させること、即ち、このような形質� ��換体を用いることを含む、本発明の抗体又� ��そのフラグメントの生産方法を提供する。

 本発明の抗体又はそのフラグメントの生� ��において、形質転換体は、栄養培地中で培� ��され得る。栄養培地は、形質転換体の生育� ��必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒� ��源を含んでいることが好ましい。炭素源と� ��ては、例えばグルコース、デキストラン、� ��溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源� ��しくは有機窒素源としては、例えばアンモ� ��ウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンス� ��ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エ� ��ス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示� ��れる。また所望により他の栄養素(例えば、 無機塩(例えば塩化カルシウム、リン酸二水� �ナトリウム、塩化マグネシウム)、ビタミン� ��、抗生物質(例えばテトラサイクリン、ネオ マイシン、アンピシリン、カナマイシン等)� �ど)を含んでいてもよい。

 形質転換体の培養は自体公知の方法によ� ��行われる。培養条件、例えば温度、培地のp Hおよび培養時間は、適宜選択される。例え� �、宿主が動物細胞の場合、培地としては、� �5~20%の胎児牛血清を含むMEM培地(Science,Vol.122,p .501,1952)、DMEM培地(Virology,Vol.8,p.396,1959)、RPMI164 0培地(J.Am.Med.Assoc.,Vol.199,p.519,1967)、199培地(proc .Soc.Exp.Biol.Med.,Vol.73,p.1,1950)等を用いることが� ��きる。培地のpHは約6~8であるのが好ましく� �培養は通常約30~40℃で約15~72時間行なわれ、� ��要により通気や撹拌を行うこともできる。� ��主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を� ��むGrace’s培地(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,p.8404,19 85)等が挙げられ、そのpHは約5~8であるのが好� ��しい。培養は通常約20~40℃で15~100時間行な� �れ、必要により通気や撹拌を行うこともで� �る。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌で� �る場合、例えば上記栄養源を含有する液体� �地が適当である。好ましくは、pHが5~8である 培地である。宿主がE.coliの場合、好ましい培 地としてLB培地、M9培地(Millerら、Exp.Mol.Genet、 Cold Spring Harbor Laboratory,p.431,1972)等が例示さ� ��る。かかる場合、培養は、必要により通気� ��撹拌しながら、通常14~43℃、約3~24時間行う� ��とができる。宿主がBacillus属菌の場合、必� �により通気、撹拌をしながら、通常30~40℃、 約16~96時間行うことができる。宿主が酵母で� ��る場合、培地として、例えばBurkholder最小培 地(Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.77,p.4505,1980)が挙 げられ、pHは5~8であることが望ましい。培養� ��通常約20~35℃で約14~144時間行なわれ、必要� �より通気や撹拌を行うこともできる。

 本発明の抗体又はそのフラグメントは、� ��述のような形質転換体を培養し、該形質転� ��体から回収、好ましくは単離、精製するこ� ��ができる。単離、精製方法としては、例え� ��塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方� ��、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫� ��ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳 動など分子量の差を利用する方法、イオン交 換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタ イトクロマトグラフィーなどの荷電を利用す る方法、アフィニティークロマトグラフィー などの特異的親和性を利用する方法、逆相高 速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差 を利用する方法、等電点電気泳動などの等電 点の差を利用する方法などが挙げられる。

 以下、本願発明を実施例に基づき詳細に� ��明するが、本願発明は何らこれらに限定さ� ��るものではない。