【技术领域】

本发明涉及微生物动物细胞领域， 尤其涉及一种人肝癌细胞系及其应用。

【背景技术】

肝脏具有多种重要的生理功能， 主要包括： 合成和分泌大量的血清蛋白， 如白蛋白和脂 蛋白； 合成和转运与蛋白结合的脂质； 解毒功能； 合成分泌胆汁； 合成糖来调节血糖； 分解 氨基酸合成尿素； 激活维生素； 合成和分解糖原； 合成谷胱甘肽和金属硫蛋白等。

随着生物技术的进步， 利用基因重组和细胞融合的方法可以生产很多 有用的生物制品， 但相比之下， 动物细胞培养技术比以前显得更加重要。 考虑到肝脏具有比其他器官更多的生 理功能， 包括其显著的合成和分泌胞浆蛋白的功能， 且拥有更强的合成白蛋白、 脂蛋白、 运 输脂质、 尿素、 糖原、 谷胱甘肽的能力和更强的代谢能力， 这使得使研究者更有兴趣利用肝 脏细胞培养生产上述产品。 基于此， 为了研究肝脏功能并生产相关的生物制品， 需要培养肝 细胞。 然而， 目前的细胞培养技术并不能在肝细胞的培养时 期生产出血浆蛋白等生物制品， 正常肝细胞离体后活力极速下降， 这导致相关产品的获得变得十分困难。

肝脏也是成人体内少数可以再生的器官， 但是在培养皿中培养的肝细胞传代次数有限， 不能反复培养。

已有的一些肝细胞系由于是非人源的或与人肝 细胞相差较大而不能广泛应用。 目前已有 一些来源于实验动物的肝细胞系， 比如来源于大鼠 （Tsao et. al., Exp. Cell Res., 1984, 154:38-52； Enat et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1984， 87: 1411-1415), 利用无血清培养基建立 的来源于成年大鼠肝脏的大鼠上皮细胞 （Chessebeuf and Padieu, In Vitro, 1984, 20:780-795; Enat et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81 :1411-1415 )。 大鼠肝细胞中还可转入 SV40 DNA (Woodworth et al., Cancer Res., 1987, 46: 4018-4026; Ledley et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA,

1987, 84: 5335-5339), 但是由于和人的肝细胞代谢不同， 这种细胞不能用于研究人体内药物 代谢和肝癌生成。

此外， 人肝细胞无性繁殖也已有相关报道 （Kaighn and Prince, Proc. Nat. Acad. Sci., 1971, 68:2396-2400), 长期培养的人胎肝也已经建立 （ Salas-Prato, M. et al., In Vitro Cell Dev. Biol.,

1988, 24:230-238; Sells, M. A. et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 1985, 21 :216-220),但是由于胎肝和 成年肝在代谢方面的差异， 使得胎肝在肿瘤生成和毒理研究方面的应用受 到局限， 成年肝更 易用于肿瘤生成和毒理研究。 为了寻找替代肝细胞的研究模型， 研究者建立了来源于肝癌、 且与正常肝细胞有相同功 能（比如分泌白蛋白功能）的细胞系。 目前已建立有多种肝癌细胞系（e.g., Knowles et al., U.S. Pat. No. 4,393,133, issued Jul. 12, 1983; Knowles B. B. et al., Science, 1980, 209:497-499; Monjardino J. and Crawford E.， Virology, 1979, 96:652-655; Park J. G et al., Int. J. Cancer, 1995, 62:276-282; Zhong et al., PNAS, 2005, 102(26):9294-9299; Fuand Cheng, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000, 44(12):3402-3407), 比如肝癌细胞系 HepG2 (U.S. Pat. No. 4393133 )。 进一步利用 HepG2的研究也己有相关报道 （Kelly et al., In Vitro Cell, and Dev. Biol., 1989, 25:217-222; U.S. Pat. No. 5,290,684;and Darlington et al., In Vitro Cell, and Dev. Biol., 1987, 2-3:349-354 )。 另外， Nakabayashi 建立了肝癌细胞系 Huh7 ( Cancer Research, 1982, 42:3858-3863 综观现有的出版文献， 已有的肝癌细胞系包括但不限于： HLF (Okayama University, medical school: 1975), HLE, c-1 (Okayama University, medical school: 1975), HuH-6 clone 5 (Okayama University, medical school: 1976), HuH-7(Okayama University, medical school: 1979)， C-HC-4 (Hokkaido University, school of medicine: 1979), HCC-M (Keio University, school of medicine: 1980), JHH-1 (The Tokyo Jikei University School of Medicine: 1980)， JHH-2 (The Tokyo Jikei University School of Medicine: 1982), JHH-4 (The Tokyo Jikei University School of Medicine: 1983), KIM-1 (Kurume University, school of medicine: 1983), JHH-5 (The Tokyo Jikei University School of Medicine: 1984), JHH-6 (The Tokyo Jikei University School of Medicine: 1984), OHR (Showa University, school of medicine: 1985), KMCH-1 (Kurume University, school of medicine: 1985), KMG-A (Kurume University, school of medicine: 1985), JHH-7 (The Tokyo Jikei University School of Medicine: 1986), JHC-1 (The Tokyo JikeiUniversity School of Medicine: 1986)， KYN-1 (Kurume University, school of medicine: 1986), KY -2 (Kurume University, school of medicine: 1987), HCC-T (Keio University, school of medicine: 1986), HPT-NT D3 (Kyushu University, faculty of medicine: 1986), Hep-tabata (Mie University, Faculty of Medicine: 1986), HuCC-Tl (Toyama Medicine and Pharmaceutical University, faculty of medicine: 1987), HuH-28 (Okayama University, medical school: 1987). 上述相关数据可参见 人类细胞 Vol. Ι, Νο. Ι, ρ. 106-126, 1988。

已有大量的研究利用生物反应器培养肝细胞来 制造人工肝。 人工技术己在肾脏、 心脏和 肺移植方面取得进展。 利用人造肝和其他技术长期保留肝功能已有报 道 （例如， Anand A. C , Indian J. Gastroenterol., 2003, 22 Suppl 2:S69- 74; Ueda et al., ASAIO J, 2003, 49(4):401-6; Tilles et al., J.Hepatobiliary Pancreat. Surg., 2002, 9(6): 686-96; Metab. Brain Dis., 2005, 20(4):327-35; and Park and Lee, J. Biosci Bioeng., 2005， 99(4):311-9)。 肝辅助设备也有过相关报道 （例如， Lu et al., Tissue Eng., 2005, 11 (11-12): 1667-77; Pless and Sauer, Transplant Proc, 2005, 37(9):3893-5; Millis and Losanof , Nat. Clin. Pract. Gastroenterol Hepatol., 2005, 2(9):398-405; and George I, J. Assoc. Physicians India, 2004, 52:719-22 这些肝辅助设备在移植手术中经常用到。 例如， 人 造肝和肝辅助设备能让爆发性肝衰竭病人在手 术前保持清醒和镇定； 能让病人在移植手术后 稳定， 特别是在对再灌注没有反应的情况下， 也可在某些情况下代替肝移植。 为了更好地利 用生物人造肝和肝辅助器， 需要发明轻便小巧的生物反应器。 因此要求所培养细胞在反应器 内产生急需和足够的肝特异蛋白。人正常肝细 胞的缺乏使肝癌细胞在此应用上具有很大潜力 。 研究者已经成功地利用 HepG2细胞在这种装置中生产抗凋亡蛋白 Bcl-2 (Terada S.， J. Biosci. Bioeng., 2003, 95(2): 146-51 )。

肝癌是一种常见的肿瘤， 多数肝癌是由肝炎病毒引起的， 如乙肝病毒（HBV)、丙肝病毒

(HCV); 目前尚无有效的疗法。 HCV感染是一种主要的人类感染疾病， 尚无有效疫苗进行 防治。 已有部分证据证明了细胞免疫清除肝炎病毒的 重要性， 但是病人体内抗体介导的抗病 毒反应机制尚不明确。 多数病人体内的抗体可以中和病毒抗原， 但是血清中中和抗体的含量 和强度未知， 缺乏支持病毒感染的细胞或动物模型限制了对 中和抗体的研究。

尽管已有一些来源于人肝癌的细胞系， 但这些己有的细胞系多数是低分化的且肝细胞 功 能不健全。 据我们所了解的情况， 目前尚无一株可以支持 HBV和 HCV感染的细胞系， 这也 限制了抗病毒药物的研发和应用。 尽管有部分的研究小组利用人原代肝细胞检测 到了少量 HCV复制，但是还没有能支持野生型 HCV大量复制的细胞系（Tagawa M. et al., J. Gastroenterol Hepatol, 1995, 10:523-527; Ito T. et al., J. Gen. Virol., 1996, 77 (Pt. 5): 1043-1054; Ito T. et al., Hepatology, 2001， 34:566-572)。 2005年， 几个研究小组成功地在细胞系中呈现了 2a型 HCV JFH1的生理周期 （Heller T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102:2579-2583; Wakita T. et al., Nat. Med., 2005, 11 (7) :791-796; Zhong J. et al., PNAs, 2005, 102(26) :9294-9; Lindenbach B. D. et al., Science 2005, 309(5734):623-6)„

目前， 唯一能支持 HCV感染的动物模型是黑猩猩 （Lanford R. E. et al., Virology, 2002, 293: 1-9).这种动物模型的优点是呈现了病毒的真实� ��理周期，尽管与感染人的病理表现不同 (Alter M. J. et al., N. Eng. J. Med., 1999， 341 :556-562; Bassett S. E. et al., J. Virol., 1998, 72:2589-2599), 但这种模型针对病毒感染后宿主的免疫反应提 供了大量解释。 利用此种模型 的最大限制是大猩猩来源少， 且价格昂贵。 树駒是接近灵长类的一种小动物， 很容易适应实 验室环境。 有研究表明树齣也能感染多种人类病毒， 包括肝炎病毒 （die Z. C. et al.， Virology, 1998, 244:513-520)。

表达 HCV核心蛋白的转基因鼠已被用来研究肝脏病理 和肿瘤生成 （Lemon S. M. et al., Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc., 2000, 111: 146-156)。 多数转基因动物没有显示对肝细胞的毒 性， 有一种模型显示出淋巴细胞炎症和肝细胞坏死 （Zhao X. et al., J. Clin. Invest, 2002, 109:221-232),另外两种模型显示出脂肪变性和肝� �（Moriya K. et al., J.Gen. Virol, 1997, 78 (Pt. 7): 1527-1531; Moriya K. et al., Nat. Med., 1998, 4:1065-1067)。 利用 HBV转基因小鼠模型极大 地开阔了对 HBV 引起的免疫疾病发生机理的研究 （Chisari F. V. et al., Science, 1985, 230:1157-1160; Chisari F. V. et al., Hepatology, 1995, 22: 1316-1325 )。转基因小鼠在 HCV免疫学 方面尚未被广泛应用， 对病毒蛋白的免疫耐受成为利用小鼠动物模型 研究的一个问题。

以上现有的研究结果表明， 获得具有肝癌类似功能的肝癌细胞系和动物模 型是极为有利 的。这些细胞系的潜在应用包括但不局限于： 筛选和评价抗肿瘤药物；在细胞系中培养 HBV、 HCV, 模拟病毒的自然感染方式； 筛选和评价抗病毒药物； 研究肝细胞的代谢动能。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不 足， 提供一种高分化、 可在体外培养、 具 有肝脏的功能特性、 可被肝炎病毒感染的人肝癌细胞系 HLCZ01, 还相应提供该人肝癌细胞系 HLCZ01在细胞模型、 动物模型、 制备筛选抗病毒和抗肿瘤药物等方面的应用。

为解决上述技术问题， 本发明提出的技术方案为一种人肝癌细胞系 HLCZ01 , 所述人肝癌 细胞系 HLCZ01 为保藏于中国典型培养物保藏中心 （简称 CCTCC)、 且保藏号为 CCTCC N0: C201309 的人肝癌细胞系。 该人肝癌细胞系 HLCZ01 的保藏单位为中国典型培养物保藏中心 CCTCC, 保藏单位的地址位于中国武汉大学， 保藏日期为 2013年 1月 17日， 该人肝癌细胞系 HLCZ01被命名为人肝癌细胞系 HLCZ01。

上述的人肝癌细胞系 HLCZ01中， 其染色体条数优选为 54〜63。

上述的人肝癌细胞系 HLCZ01中， 所述人肝癌细胞系 HLCZ01经过染色体 G带核型分析后 表明其存在染色体异性化现象， 且细胞核型中出现有一条标记染色体。

上述的人肝癌细胞系 HLCZ01不仅含有肝细胞特异基因 ALB和 AAT， 而且可表达肝细胞特 异蛋白 ALB和 T。 上述的人肝癌细胞系 HLCZ01 , —方面它属于高分化的人肝癌细胞系； 另 一方面， 该人肝癌细胞系 HLCZ01可被肝炎病毒感染， 所述肝炎病毒特别是指乙肝病毒（HBV) 和 /或丙肝病毒 （HCV)， 包括丙肝病毒 2a型和乙肝病毒各型在内均可感染。 HBV和 HCV可在 本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01中大量复制。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上 述的人肝癌细胞系 HLCZ01作为支持肝炎病 毒感染的细胞模型的应用，所述肝炎病毒包括 乙肝病毒和 /或丙肝病毒（特别是包括丙肝病毒 2a型和乙肝病毒各型在内均可感染）。 本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01支持 HBV和 HCV的完整 生活周期； 通过在细胞模型中培养 HBV和 HCV， 可模拟病毒的自然感染方式。 作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上 述的人肝癌细胞系 HLCZ01作为建立支持病 毒感染的动物模型的应用。所述病毒优选包括 乙肝病毒和 /或丙肝病毒。具体的， 本发明的人 肝癌细胞系 HLCZ01可用于非人类的动物模型， 将人肝癌细胞系 HLCZ01植入或转入动物体内 (比如小鼠体内）， 可用于建立支持病毒感染的动物（例如小鼠） 模型。 利用本发明人肝癌细 胞系 HLCZ01建立的动物模型有利于进行肝脏病理学和 肝炎病毒学研究。如前所述， 由于人肝 癌细胞系 HLCZ01支持 HBV和 HCV的完整生活周期， 因此， 人肝癌细胞系 HLCZ01中可以重现 HBV和 HCV的关键病理过程， 使得含有该人肝癌细胞系 HLCZ01的动物模型可用于研究人体对 HBV和 HCV的抗病毒反应。

作为一个总的技术构思，正是基于本发明的人 肝癌细胞系 HLCZ01可以作为支持肝炎病毒 感染的细胞模型或作为建立支持病毒感染的动 物模型进行应用， 这便有利于临床筛选抑制或 干预 HBV和 HCV的药物 (包括病毒疫苗及其他辅助试剂），因此，本� �明的人肝癌细胞系 HLCZ01 还可在制备、筛选或评价抗肝炎病毒药物中进 行应用，所述肝炎病毒包括乙肝病毒和 /或丙肝 病毒。

作为一个总的技术构思，本发明上述的人肝癌 细胞系 HLCZ01可在培养基中体外培养，进 而可被用于预测化合物对细胞的致癌和致畸研 究； 通过化学致癌研究可进一步用于制备、 筛 选或评价抗肿瘤药物。

作为一个总的技术构思， 本发明上述的人肝癌细胞系 HLCZ01 具有肝脏的重要功能和特 性， 可将氨转化为尿素； 而将氨代谢为尿素的功能使其成为制造人造肝 或肝辅助设备的有利 工具， 以用于临床或科研。 因此， 本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01还可在人造肝的制备中进行 应用。

除上述基本的应用方式外，本发明上述的人肝 癌细胞系 HLCZ01还可用于研究肝细胞代谢 (例如评价化合物在肝脏中的代谢激活作用） 及其他代谢功能研究、 肝细胞中肝炎病毒生存 复制研究、 人类寄生虫研究等； 还可在在细胞中转入外源基因研究其功能； 由于本发明的人 肝癌细胞系 HLCZ01可以表达细胞色素 P450、 CyPlAU CyPlBl和 CyP2C9蛋白， 因此， 该人肝 癌细胞系 HLCZ01还可应用于需要进行大量同源细胞实验的 场合， 例如药物代谢研究，

与现有技术相比， 本发明的优点在于： 本发明筛选、 得到了一种具有开创性意义的人肝 癌细胞系 HLCZ01 , 该人肝癌细胞系 HLCZ01不仅属于高分化的人肝癌细胞系， 而且可在培养 基中体外培养；其具有肝脏的重要功能和特性 ，可将氨转化为尿素，可以表达细胞色素 P450、 CyPlA CyPlBl和 CyP2C9蛋白， 更重要的是其可被肝炎病毒感染， HBV和 HCV可在其中大量 复制； 由于本发明人肝癌细胞系 HLCZ01 所具有的特殊性能， 使得本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01可广泛应用于抗病毒、 抗肿瘤药物的制备、 研发、 筛选和评价， 可用于制备生物人造 肝等各种临床治疗用生物制品，本发明的筛选 培养的人肝癌细胞系 HLCZ01比其他动物肝细胞 更有利于研究人肝脏代谢功能和疾病发展过程 。

一种人肝癌细胞系 HLCZ01 , 其保藏单位为中国典型培养物保藏中心（简称 CCTCC)， 地址 为中国武汉大学， 保藏号为 CCTCC NO: C201309, 保藏日期为 2013年 1月 17日。

【附图说明】

图 1为本发明实施例中通过 RT-PCR检测三种细胞中基因 ALB和 T的对比检测结果，其 是在凝胶成像仪下拍摄到的电泳图。

图 2为本发明实施例中通过 Western Blot检测三种细胞中 ALB和 AAT蛋白表达的对比检 测结果。

图 ₃ 为本发明应用实施例 1中人肝癌细胞系感染 HCV后病毒拷贝量随培养时间的变化曲 线。

图 4为本发明应用实施例 1中人肝癌细胞系感染 HCV后免疫荧光的检测结果， 其中， 左 图表示以抗丙肝病毒 NS5A的抗体检测病毒感染细胞内的病毒；中图� �示以 DAPI衬染细胞核； 右图表示将左图与中图合并后的图像。

图 5为本发明应用实施例 2中 HLCZ01细胞被来源于 HepaG2. 2. 15细胞内的 HBV感染后 PCR定量检测结果。

图 6为本发明应用实施例 3中两种人肝癌细胞系感染 HCV后病毒拷贝量随培养时间的变 化曲线。

图 7为本发明应用实施例 3中人肝癌细胞系感染 HBV和 HCV后免疫荧光的检测结果， 其 中四张图片从左至右依次为： 以针对丙肝病毒的 NS5A抗体检测细胞内丙肝病毒； 以乙肝病毒 核心蛋白抗体检测细胞内乙肝病毒； 以 DAPI衬染细胞核； 左侧三张图片合并得到的图片， 其 中个别细胞可以被两种病毒同时感染。

图 8为本发明应用实施例 1中以 HLCZ01细胞制备人源化小鼠被丙肝病毒感染后， 小鼠血 清中病毒含量随感染时间的变化曲线。

图 9为本发明应用实施例 2中 HLCZ01细胞内乙肝病毒含量随干扰素用量和处理 时间的变 化关系图。

图 10为本发明应用实施例 1中 HLCZ01细胞内丙肝病毒含量随干扰素用量和处理 时间的 变化关系图。

图 11为本发明应用实施例 4中流式检测 HLCZ01细胞对 TRAIL的敏感性结果。

图 12为本发明具体实施方式中对人肝癌细胞系 HLCZ01染色体核型分析后的染色体分布 频率图。 图 13为本发明具体实施方式中人肝癌细胞系 HLCZ01 ( 2n=54) 的染色体核型分析图片结 果。

图 14为本发明具体实施方式中人肝癌细胞系 HLCZ01 ( 2n=59) 的染色体核型分析图片结 果。

图 15为本发明具体实施方式中人肝癌细胞系 HLCZ01 ( 2n=63) 的染色体核型分析图片结 果。

【具体实施方式】

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本 发明作进一步描述， 但并不因此而限制本 发明的保护范围。

下述实施例中， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的实验材料或生物制 剂， 如无特殊说明， 均为可从市场上购得的常规试剂。 以下实施例中的定量实验， 均设置三 次重复实验， 结果取平均值。

实施例中所用的主要实验材料与试剂：

( 1 ) 细胞培养： 人肝癌细胞系 HLCZ01 (己保藏）、 Huh7. 5细胞 （Huh7. 5细胞从美国洛 克菲勒大学 Charles Rice教授实验室馈赠得到）， HCVcc (JFH1病毒上清， HCV材料从日本传 染病国立中心 Takaji Wakita教授实验室馈赠得到）， 100mm细胞培养板（Costar公司）， 60mm 细胞培养板 （Costar公司）， 六孔细胞培养板 （Costar公司）， DMEM培养基 （Invitrogen公 司）、青霉素和链霉素（ Invitrogen公司：)、谷氨酰胺（ Invitrogen公司）、羊血清（ Invitrogen 公司）、 胰蛋白酶（Invitrogen公司）、 非必需氨基酸（ Invitrogen公司）、 1 X PBS (Hyclone 公司）；

( 2)细胞总 RNA提取： TRIZ0L ( Invitrogen公司）、 异丙醇（上海生工）、 无水乙醇（上 海生工）、 DEPC (上海生工）；

( 3 ) Reverse Transcription PCR 禾卩 Real Time PCR : Invitrogen RT-PCR 试剂盒 ( Invitrogen公司）、 SYBR Premix Ex Taq (Taraka公司）、 200 μ L PCR八联管 （Eppendorf 公司）；

( 4) 细胞总蛋白提取： RIPA裂解液 （Thermo公司）、 蛋白酶抑制剂 （Merck公司）、 蛋 白浓度测定试剂 （Bio-Rad公司）；

( 5) Western Blot: PVDF膜 （Bio- Rad公司）、 抗 ALB抗体 （SANTA CRUZ)、 抗 MT抗体 ( SANTA CRUZ).抗 HCV NS5A抗体（美国佛罗里达大学馈赠），二抗 goat anti-mouse IgG (HRP) ( Invitrogen公司：)、 Western Blot化学发光底物（Thermo公司：)、 Western Blot曝光机（Keda 公司）； (6)免疫荧光：载玻片和盖玻片（SPI Supplies公司）、免疫组化笔（ZLI-9305, PAP Pen), I X PBS (Hyclone公司）、 羊血清 （Invitrogen公司）、 抗 HCV NS5A抗体 （自制）、 二抗 goat ant i -mouse IgG (FITC) ( Invitrogen 公司）、 DAP I ( Invitrogen 公司）。

实施例：

本实施例获得了一种本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01 , 该人肝癌细胞系 HLCZ01 已保藏于 中国典型培养物保藏中心， 且保藏号为 CCTCC NO: C201309, 保藏单位的地址位于中国武汉 大学，保藏日期为 2013年 1月 17日，该人肝癌细胞系 HLCZ01被命名为人肝癌细胞系 HLCZ01。

HLCZ01细胞系的建立与培养方法

1.取一男性肝癌患者手术切除的新鲜手术标本� �� PBS洗一次，将组织块用手术刀切成 1mm ³ 的小块铺于已用胶原蛋白处理过的培养皿 （100毫米） 内， 加入 8ml新鲜培养基， 同时加入 表皮生长因子， 终浓度为 lOng/ml;

2.培养 2天后换新鲜培养基， 以后每 3天换新鲜培养基；

3.观察培养皿中长出细胞克隆后， PBS洗一次细胞， 将 0. 25%胰酶滴于细胞克隆上， 置培 养箱中约 lmin后取出， 用移液枪吸取新鲜培养基将消化后的克隆冲起 吸出， 转移到 12孔板 中继续培养；

4.带细胞在 12孔板中长满后转移至六孔板中， 长满后再扩大至 10cm培养皿中；

5.将 1 X 10 ⁷ 个细胞接种到 NOD- SCID鼠皮下， 约 45天后长出明显肿块， 取出肿块后继续 按照人肝癌组织培养方法培养而得到 HLCZ01细胞。

通过 RT-PCR检测本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01中含有肝细胞特异基因 ALB和 T， 具体过程如下：

将人肝癌细胞系 Huh7、本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01和中国仓鼠卵巢细胞系 CH0 (从美 国 ATCC购买） 平铺于六孔细胞培养板中 （30万 /孔）， 每种细胞各铺占两孔； 培养 24h后， 三种细胞各取一孔， 用 TRIZOL提取细胞总 RNA， 然后取 1 μ g总 RNA逆转录成 cDNA， 以 1 μ L cDNA为模板进行 PCR， 扩增 ALB和 T基因， 扩增后的结果如图 1所示。 由图 1可见， 人肝 癌细胞系 Huh7和人肝癌细胞系 HLCZ01中均能扩增出肝细胞特异基因 ALB和 AAT, 而非肝癌 细胞系 CH0中不能扩出这两种基因。

通过 Western Blot证实本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01中可表达肝细胞特异蛋白 ALB 和 T， 具体过程如下：

取上述六孔细胞培养板中剩余三孔的三种细胞 ， 用 RIPA Buffer裂解细胞， 将细胞裂解 液置于冰上 15min， 然后以 13000rpm离心 15min (4°C )， 取上清转入新 EP管中； Lowry法测 蛋白浓度， 分别取 50 p _g 蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE), 然后将聚丙烯酰胺凝 胶上的蛋白转移到 PVDF膜上， 最后用 Anti- ALB、 Anti-AAT—抗和带 HRP标记的二抗来检测 各蛋白样品中 ALB和 T的表达，结果如图 2所示，由图 2可见，人肝癌细胞系 Huh7和 HLCZ01 细胞中均有 ALB和 T蛋白表达， 而非肝癌细胞系 CH0中不表达这两种蛋白。

由以上实验可以证实，本发明筛选获得的人肝 癌细胞系 HLCZ01不仅含有肝细胞特异基因 ALB和 T， 而且可表达肝细胞特异蛋白 ALB和 AAT。

我们对上述本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01进行了染色体核型分析，该染色体核型分 析参 考美国 ATCC动物细胞系染色体核型分析方法。 送检细胞常规传代， 分别对 P2、 P4、 P7世代 的细胞 （1000个中期分裂细胞）进行染色体制片， 普通核型染色体计数， 计算染色体分布频 率； G带染色观察、 CCD成像并用 VideoTest-Karyo 3. 1软件进行核型分析。

本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01 中， 染色体核型分析结果显示染色体条数为 54〜63， 其分布频率如图 12所示。

本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01中， 人肝癌细胞系 HLCZ01经过染色体 G带核型分析后 表明其存在染色体异性化现象， 且细胞核型中出现有一条标记染色体。 我们以其中最典型的 三组染色体 （2n=54、 2n=59、 2n=63三组染色体） 核型分析为例， 其分析结果如图 13〜图 15 所示， 由图 13〜图 15可以看出， 细胞核型均出现有一条标记染色体。

应用实施例 1： HLCZ01被肝炎病毒 HCV感染。

1. 将本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01和现有的 Huh7. 5铺设于六孔细胞培养板中 （20 万 /孔）， 24h后将培养基换成只含有 2% FBS的培养基， 以 M0I=0. 2的 JFH1病毒感染细胞； 24h后换新鲜的完全培养基， 将细胞分别培养 1天、 2天、 3天和 6天， 对应时间点用 TRIZ0L 提取两种细胞的总 RNA， 然后取 1 μ g总 RNA逆转录成 cDNA， 以 1 μ L cDNA为模板进行定量 PCR, 检测两种细胞中的 HCV RNA水平， 结果如图 3所示。

2. 另取感染 3天后的上述部分人肝癌细胞系铺于 60mm培养皿中的盖玻片上， 继续培养 3天。 1 XPBS冲洗细胞两次后， 用冰丙酮将上述的两种人肝癌细胞系固定 8min。 1 X PBS清洗 固定后长有前述人肝癌细胞系的盖玻片 3次， 每次 5min， 羊血清室温下封闭 30min， 然后加 Anti- NS5A—抗孵育 lh， 1 XPBS洗 3次后加 FITC标记的二抗孵育 lh， 1 XPBS洗 3次后 DAPI 封片， 最后在荧光显微镜下观察， 结果如图 4所示， 图 4可进一步证明， 本发明的人肝癌细 胞系 HLCZ01细胞中可检测出病毒蛋白 NS5A。

由上可见， HCV感染 HLCZ01细胞后， 通过荧光定量 PCR检测细胞中 HCV RNA水平， 以及 免疫荧光检测细胞中病毒蛋白表达，进一步证 实本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01可被肝炎病毒 HCV (JFH1 ) 感染。 基于此， 本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01可作为支持肝炎病毒 HCV感染的 细胞模型进行应用， 也可作为建立支持 HCV病毒感染的动物模型进行应用， 还可用于制备、 筛选或评价抗 HCV肝炎病毒药物。

以本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01作为支持肝炎病毒（上述丙肝病毒）感染 的细胞模型 进行应用的情形如图 3和图 4所示。

以本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01 作为建立支持上述丙肝病毒感染的动物模型的 应用 情形如图 8所示，图 8为本实施例中以人肝癌细胞系 HLCZ01制备人源化小鼠被丙肝病毒感染 后， 小鼠血清中丙肝病毒含量随感染时间的变化曲 线。

本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01还可用于制备、筛选或评价抗丙型肝炎病 毒药物。根据 我们的实验发现， 上述丙肝病毒感染该人肝癌细胞系 HLCZ01后， 目前用于治疗丙肝的药物一 一 α -干扰素可以降低丙肝病毒感染该人肝癌细胞� � HLCZ01 内的病毒含量 （参见图 10)， 图 10即显示了 HLCZ01细胞内丙肝病毒含量随干扰素用量和处理 时间的变化关系， 由此可见， 本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01可用于制备、 筛选或评价抗丙型肝炎病毒药物。

应用实施例 2: HLCZ01被肝炎病毒 HBV感染。

将本实施例中的人肝癌细胞系 HLCZ01铺于 60mm培养皿中， 24h后将培养基 （DMEM培养 基） 换为 HepaG2. 2. 15细胞上清与完全培养基 （按 1： 1的体积比） 混合， 继续培养 5天。 5 天后细胞传代， 换为正常培养基培养， 每 3天传代时取部分细胞提取总细胞 DNA。 取第 46天 所提 DNA作为模板进行定量 PCR， 检测人肝癌细胞系 HLCZ01细胞中的 HBV含量， 结果如图 5 所示， 由图 5可见， 人肝癌细胞系 HLCZ01细胞中可被检测出 HBV。

由上可见， HBV感染 HLCZ01细胞后， 通过荧光定量 PCR检测细胞中 HBV的含量水平， 进 一步证实本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01可被肝炎病毒 HBV (来源于 paG2. 2. 15细胞内的乙 肝病毒）感染。基于此， 本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01可作为支持肝炎病毒 HBV感染的细胞 模型进行应用， 也可作为建立支持 HBV病毒感染的动物模型进行应用， 还可用于制备、 筛选 或评价抗 HBV肝炎病毒药物。

以本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01作为支持肝炎病毒（上述乙肝病毒）感染 的细胞模型 进行应用的情形如图 5所示。

本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01还可用于制备、筛选或评价抗乙型肝炎病 毒药物。根据 我们的实验发现， 上述乙肝病毒感染该人肝癌细胞系 HLCZ01后， 目前用于治疗乙肝的药物一 一 α -干扰素可以降低乙肝病毒感染该人肝癌细胞� � HLCZ01内的病毒含量 （参见图 9)， 图 9 即显示了 HLCZ01细胞内乙肝病毒含量随干扰素用量和处理 时间的变化关系， 由此可见，本发 明的人肝癌细胞系 HLCZ01可用于制备、 筛选或评价抗乙型肝炎病毒药物。

应用实施例 3: HLCZ01同时被肝炎病毒 HBV和 HCV感染。

1. 取 HBV (应用实施例 2中的 HBV) 感染 53天后的 HLCZ01细胞铺于六孔细胞培养板中 ( 20万 /孔）， 同时取未被 HBV感染的 HLCZ01细胞铺于六孔细胞培养板中 （20万 /孔）， 24h 后将完全培养基换成只含有 2% FBS的培养基，以 M0I=0. 2的 JFH1病毒感染前述的两种 HLCZ01 细胞 （HBV感染和未被 HBV感染的两种细胞）。 24h后换新鲜的完全培养基， 将细胞分别培养 1天、 2天、 3天和 6天， 对应时间点用 TRIZ0L提取细胞总 RNA, 然后取 lug总 RNA逆转录成 cDNA, 以 luL cDNA为模板进行定量 PCR， 检测细胞中 HCV RNA水平， 结果如图 6所示， 由图 6可见， HCV在两种 HLCZ01细胞中的含量均随感染时间延长而增加， 但被 HBV感染过的 HLCZ01 细胞中 HCV含量低于未被感染过的 HLCZ01细胞。

2. 取被 HBV感染过的 HLCZ01细胞， 再以上述方法感染 HCV 6天， 丙酮固定细胞， 分别 用针对 HBV核心蛋白抗原和 HCV NS5A蛋白的抗体检测细胞中的肝炎病毒， 结果如图 7所示， 由图 7可见， HLCZ01细胞中能检测出 HBV和 HCV两种病毒蛋白， 且能在同一个 HLCZ01细胞 中检测到两种病毒蛋白。

由上可见， HBV和 HCV同时感染 HLCZ01细胞后，通过荧光定量 PCR检测细胞中 HBV和 HCV RNA水平，以及免疫荧光检测细胞中病毒蛋白表 达，进一步证实本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01 可同时被肝炎病毒 HBV (来源于 HepaG2. 2. 15细胞内的乙肝病毒）和 HCV ( JFH1 )感染。 基于 此，本发明的人肝癌细胞系 HLCZ01可作为支持肝炎病毒 HBV和 HCV同时感染的细胞模型进行 应用， 也可作为建立支持 HBV和 HCV病毒同时感染的动物模型进行应用， 还可用于制备、 筛 选或评价同时抗 HBV和 HCV肝炎病毒药物 （参见图 6〜图 10)。

应用实施例 4: HLCZ01在制备、 筛选或评价抗肿瘤药物中的应用。

图 11给出了目前用于临床试验 II期的药物 TRAIL可诱使该 HLCZ01细胞发生死亡的实验 数据， 由此可以看出， 本实施例的人肝癌细胞系 HLCZ01还可用于制备、筛选或评价抗肿瘤药 物。

综合以上应用实施例的检测结果，这有力证明 本发明建立的细胞系 HLCZ01为一株人肝癌 细胞系， 该人肝癌细胞系 HLCZ01能被 HBV和 /或 HCV (同时感染）， 但 HBV并不局限于实施例 2中的来源于 HepaG2. 2. 15细胞中的 HBV， HCV也并不局限于来源于 2a型 HCV 的 JFH1感染。 本发明人肝癌细胞系 HLCZ01的建立将给 HBV、 HCV等肝炎病毒学方面、 肝癌肿瘤学方面及其 他方面的研究提供有力的工具， 拥有广阔的应用价值和应用前景。 1/1

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