【명세서】

【발명의 명칭】

하이브리드 바이오 잉크와 그 제조 방법， 및 이를 이용한 인공 조직 제조 방 법

【기술분야】 본 발명은， 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한 제 1 바이오 잉크와 알지 네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제 2 바이오 잉크를 혼합하여, 생체 적합성이 우수하여 세포의 생존， 증식 및 분화에 유리하고, 물리적 강도가 우수하여 이온 가 교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 하이브리드 바이오 잉크와 그 제조 방법, 및 이를 이용하여 바이오 30 프린팅 공정을 통해 인공 조직을 제조하는 방법 에 관한 것이다.

［과제고유번히 1711064779 ［부처명］ 과학기술정보통신부 ［연구관리전문기관］ 한국연구재단 ［연구사업명］ 세포재생기술개발사업

［연구과제명］ 미세 혈관 내재형 간 조직 모사체 프린팅 기술 개발 ［주관기관］ 울산과학기술원

［연구기관］ 2017.04.01. - 2021. 12.31.

［과제고유번히 201걔1쇼284010353 ［부처명］ 이공분야기초연구사업

1 대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 1»（：1/10公018/012996

［연구관리전문기관］ 과학기술정보통신부

［연구사업명］ 중견연구자지원사업

［연구과제명］ 30바이오프린팅을 이용한 이질성 간암모델제작

［주관기관］ 한국산업기술대학교

［연구기간］ 2017.03.01 ~ 2019.02.29

【배경기술】

바이오 30프린팅 기술은， 바이오 프린터, 바이오 잉크, 세포, 성장인자등 을 기반으로 사용자가 원하는 형상을 조형 및 적층하여 특정 형상을 제작할 수 있 는기술을 말한다.

이러한 바이오 30 프린팅 기술을 이용하여 오가노이드（0 8!101（1） , 장기유사 칩（0 311-011-3 -（ ）， 동물 실험대체를 위한 조직 및 장기 유사체 등과 같이 질병 의 치유에 도움을줄수 있는 여러 연구들이 활발히 이루어지고 있다.

특히, 바이오 잉크는, 내재되는 세포들이 생존, 증식 및 분화가 가능하고， 인간의 조직처럼 오랜 시간 동안 특정 형상이나 구조가 유지되어야 하므로， 콜라 겐， 피브린겔， 마트리겔， 알지네이트， 젤라틴 등이 포함된 재료가 활용되기도 한 다.

하지만 다양한 세포들을 인체의 조직처럼 분화시키기 위해서는 다양한성장 인자가 요구되며, 이에 동물의 특정 조직을 탈세포화 및 액상화하고, 세포를 다시 배양시켜 원래의 조직과유사한형태로복원하는 배양 기술이 연구되고 있다.

그러나 앞서 언급된 기존의 바이오 잉크는， 특정 세포의 생존， 증식 및 분화 에 유리하지만, 물리적 강도가 약하기 때문에 장기간의 배양 과정 중에서 쉽게 수

2 대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 （그1/10公018/012996 축되거나분해될 수 있으며, 오랜 시간동안특정 형상혹은 구조를 유지하기 어려 운문제점을 갖고 있다.

［선행기술문헌］

미국등록특허 제 9442105호

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

본 발명은， 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한제 1 바이오 잉크와 알지 네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제 2 바이오 잉크를 혼합하여， 생체 적합성이 우수하여 세포의 생존， 증식 및 분화에 유리하고， 물리적 강도가우수하여 이온가 교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 하이브리드 바이오 잉크와 그 제조 방법, 및 이러한 하이브리드 바이오 잉크를 사용한 바이오 30 프린팅 공정을 통해 인공조직을 제조하는 방법을 제공하기 위한것이다.

【기술적 해결방법】

상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태는, 하이브 리드 바이오 잉크에 관한 것으로서， 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한 저 11 바이오 잉크; 및 알지네이트 및/또는 피브리노겐을 포함하는 제 2 바이오 잉크;를 포함하며 , 제 1 바이오 잉크와 제 2 바이오 잉크가 1.5 - 9 : 1의 부피비（V八 0로 혼 합되는 것이 바람직하다.

상기 조직은， 돼지로부터 유래된 조직을포함하며, 상기 제 1 바이

1 ~ 3， 약 15 25 ^° 0의 온도에서 펩 액상화（ （1116£3（：11011）될 수 있다.

3

대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 1»（：1^1{2018/012996 구체적으로 상기 제 1 바이오 잉크 또는 제 2 바이오 잉크는, 배아유래 섬유 아세포， 배아줄기세포에서 유래된 간세포, 인간유래 줄기세포 중에서 선택된 1종 이상을포함할수 있으며， 각각 1.5 ~ 4.0 %(wt八 0의 농도인 것이 바람직하다. 한편, 본 발명의 다른 실시형태는， 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법에 관한 것으로， 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계; 탈세포된 조직의 세포외기질 을 액상화시켜 제 1 바이오 잉크를 제조하는 단계; 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제 2 바이오 잉크를 준비하는 단계; 및 상기 제 1 바이오 잉크와 제 2 바이 오 잉크를 1.5〜 9 : 1의 부피비 ( 로혼합하는단계;를포함할수 있다.

이때, 상기 조직은돼지로부터 유래된 간 (l iver) 조직을포함할수 있고, 상 기 탈세포 단계는， 계면활성제 및 고장용액이 포함된 탈세포 용액을 이용하여 상기 조직의 세포를제거할수 있다.

구체적으로 상기 고장용액은 NaCl , KC1 , CaCh, MgCh, BaCh및 NaHCOs을 포 함하는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 0.03 내지 1.0 M의 용액인 것이 바람직하고, 상기 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100) , Tween 80, SDS(sodium dodecyl sul fate) , 소듐 데옥시콜레이트 및 트리톤 X-200(Tri ton X- 200)를포함하는군에서 선택되는 어느하나 이상인 것이 바람직하다.

또한 상기 체 1 바이오 잉크를 제조하는 단계는， 상기 탈세포된 조직의 세포 외기질이 pH 1 ~ 3， 약 15〜 25 ^° C의 온도에서 펠신 (pepsin)에 의해 액상화될 수 있 고, 이때 제 1 바이오 잉 a 및 제 2 바이오 잉크는, 각각 1.5 - 4.0 %(wt八 r)의 농도 인 것이 바람직하다.

한편， 본 발명의 또 다른 실시형태는， 인공 조직 제조 방법에 관한 것으로,

4 대체용지 (규칙제 26조) 2019/245110 1»（：1/10公018/012996 상기 하이브리드 바이오 잉크를 사용하여 인공 조직을 프린팅하는 단계; 및 무기염 을사용하며 상기 인공 조직을 겔화 (gelat ion) 및 가교 (cross-1 inking)시키는 고형 화 (sol idi f icat ion) 단계;를포함할수 있다.

이때 상기 무기염은， 칼슘， 망간, 바륨， 코발트, 아연, 구리를 포함하는 군 에서 선택되는 어느하나 이상인 것이 바람직하다.

또한, 상기 고형화단계는, 열에 의해 콜라겐을 겔화 (gelat ion) 시킨 후， 무 기염이 포함된 용액을 사용하여 알지네이트 또는 피브리노겐을 가교 kross- 1 inking)시킬 수 있다.

【발명의 효과】

본 발명은, 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한제 1 바이오 잉크와알지 네이트 또는 피브리노겐을포함하는 제 2 바이오 잉크를 혼합함으로써, 생체 적합성 이 우수하여 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하고， 물리적 강도가우수하여 이온 가교후에도세포에 의해 형상이 변화되지 않는효과를 갖는다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따라 인공 조직을 제조할 때 소요되는 가교 시간이 짧아지며， 본 발명에 따라 제조된 인공 조직의 경우, 세포가 부착 가능한 3차원적 인 부착 공간을 포함하는 동시에 세포가 부착할 수 없는 공극을 포함하여 세포 간 의 응집이 가능하고, 이에 따라 세포의 생존， 증식 및 분화에 유리한 효과를 갖는 다.

【도면의 간단한설명】

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제 1 바이오잉크의 온도 변화에 따른 점 성을측정한 결과를 경시적으로 나타낸그래프이다. 대체용지 (규칙제 26조) 2019/245110 ^1/1012018/012996 도 2 및 도 3은본 발명의 일 실시예에 따른하이브리드 바이오 잉크의 함량 변화에 따른 점성을측정한결과를 경시적으로나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이브리드 바이오 잉크의 형상 변화를 나타낸 도면이다.

도 5 및 도 6은본 발명의 일 실시예에 따른하이브리드 바이오 잉크의 함량 변화에 따른 압축강도를측정한결과를 경시적으로나타낸그래프이다.

도 7은본 발명의 일 실시예에 따른 인공조직에서 배양된 세포를 나타낸도 면이다.

도 8은본 발명의 일 실시예에 따른 인공조직에서 배양된 세포 생존율을측 정한결과를 경시적으로 나타낸그래프이다.

도 9는본 발명의 일 실시예에 따른 인공조직에서 배양된 세포 증식률을측 정한결과를 경시적으로나타낸그래프이다.

도 10은본발명의 일 실시예에 따른 인공조직의 공극을나타낸 도면이다. 【발명의 실시를 위한형태】

이하 본 발형의 바람직한 실시 예를 통해 상세히 설명하기에 앞서， 본 명세 서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석 되어야함을 밝혀둔다.

본 명세서 ¾체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 ''포함"한다고 할 때, 이 는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포 ¾ ^· 할수 있는 것을 의미한다.

6 대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 ^1/100018/012996 이하에서는 본 발명의 하이브리드 바이오 잉크와 그 제조 방법， 및 이를 이 용한 인공조직 제조방법에 관하여 보다상세히 설명하고자한다.

먼저, 하이브리드 바이오 잉크는, 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한 제 1 바이오 잉크; 및 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제 2 바이오 잉크;를 포함하며， 제 1 바이오 잉크와제 2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1 의 부피비（ 로혼 합할수 있다.

탈세포된 조직은조직의 세포외기질을 제외한나머지 세포성분을 제거한조 직을 의미한다. 이때 사용되는 조직은, 인간， 돼지， 소， 토끼, 개， 염소， 양, 닭, 말 등의 포유동물로부터 유래된 조직（예를 들어, 간조직， 심장조직, 근육조직 등） 일 수 있으나， 본 발명에 사용되는조직은 간세포의 생존， 증식 및 분화에 유리하 도록돼지로부터 유래된 간（:】 !·）조직을포함하는것이 가장바람직하다.

구체적으로, 제 1 바이오 잉크는, 탈세포된 조직의 세포외기질이 1 ~ 3, 약 15 ~ 25°（：의 온도에서 펩신 6?3比）에 의해 액상화되어， 바이오 프린팅 소재로 쓰이기 위한 적절한 점도（예를 들어, 100 내지 1000 ?3 ）를 갖는 것이 바람직하 다, 여기서 펩신은 1）11 및 온도 조건에 따라 반응성이 다른 특성을 가지고 있으며, 이로 인해 온도가 미만인 경우에는， 펠신 ? !!）의 활성도가 감소하여 원활 한 소화（（1 63 010가 이루어질 수 없고, 251：를 초과하는 경우에는 펩신 6?3比） 의 활성이 지나치게 증가되어， 점도가 낮아져서 바이오 잉크로 사용하기에 부적합 하다.

상술한바와 같은 제 1바이오 잉크는 적절한 점도로 액상화되어 바이오 프린 팅 적성이 우수하며, 탈세포된 조직의 세포외기질을 포함하여 생체 적합성이 뛰어

7 대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 ^1/1012018/012996 나고, 세포 외 기질 성분인 다양한 단백질과 당단백질 및 글리코사미노글리 등을 활용하여 특정 세포의 생존， 증식 및 분화에 유 리하다.

저 12 바이오 잉크는， 알지네이트, 피브리노겐， 카르복실메틸 셀룰로오스， 헤 파란황산， 히알루론산， 콜라겐, 덱스트란 등과 같은 천연 고분자물질을포함할수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 알지네이트 또는 피브리노 겐 등의 하이드로겔을포함할수 있다.

상기 알지네이트 또는 피브리노겐을 비롯한하이드로겔은수분 함량이 높고， 생체 적합성이 뛰어나며， 무기염에 의해 이온 결합하여 가교되기에 기계적 물성이 우수하고, 이에 따라 가교 후에도 세포에 의한 형상의 변화가 없어 바이오 잉크로 사용하기에 적합하다. 또한, 세포가부착할수 없는 공극을 제공하여 세포 간에 응 집하도록유도해준다.

본 발명은 상기 제 1 바이오 잉크와 제 2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 ： 1의 부피 비（ 로 혼합함으로써, 생체 적합성이 뛰어나고, 물리적 강도가 우수하여， 이온 가교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 하이브리드 바이오 잉크를 제공할 수 있다.

또한， 본 발명은 상기 제 1 바이오 잉크와 제 2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 ： 1의 부피비（V八 0로 혼·#함으호써, 제 1 바이오 잉크가 세포가부착할수 있는 3차원적인 부착 공간을 제공함과 동시에, 제 2 바이오 잉크가 세포가 부착할 수 없는 공극을 제공하여 세포 간의 응집을유도해주는하이브리드 바이오 잉크를 제공할수 있다. 반면, 제 1 바이오 잉크와 제 2 바이오 잉크의 혼합 비율이 앞서 언급된 범위

8 대체용지（규칙제 26조） 0 2019/245110 1»（：1/10公018/012996 를 벗어나게 되어 제 1 바이오 잉크가 높은 함량을 갖는 경우， 물리적 강도가 약하 고， 가교시간이 길게 되며, 이에 따라 세포에 의해 쉽게 수축 및 분화될 수 있고, 제 2 바이오 잉크가 높은 함량을 갖는 경우 세포 친화도가 낮아 세포의 생존, 증식 및 분화가제한되게 된다.

일 예로, 저 U 바이오 잉크 또는 제 2 바이오 잉크는 배아 유래 섬유아세포, 배아줄기세포에서 유래된 간세포， 인간유래 줄기세포 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함할수 있으나， 이에 제한된 것은아니다.

또한， 제 1 바이오 잉크 및 제 2 바이오 잉크는 각각 1.5 - 4.0 %（wt八 0의 농 도인 것이 바람직하며， 가장바람직하게는 3%（wt八）의 농도일 수 있다.

한편， 본 발명의 다른 실시 형태는, 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법에 관한 것으로서， 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계; 탈세포된 조직의 세포외기 질을 액상화시켜 제 1 바이오 잉크를 제조하는 단계; 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제 2 바이오 잉크를 준비하는 단계; 및 상기 제 1 바이오 잉크와 제 2 바이 오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1 의 부피비（v八 r）로혼합하는단계;를포함할수 있다.

탈세포 단계에 사용되는조직은, 앞서 전술한바와같이 인간, 돼지, 소, 토 끼, 개, 염소, 양， 닭， 말 등의 포유동물로부터 유래된 조직（예를 들어, 간조직, 심장조직, 근육조직 등）일 수 있으나, 본 발명에 사용되는 조직은 간 세포의 생존， 증식 및 분화에 유리하도록 돼지로부터 유래된 간（l i _ver ） 조직을 포함하는 것이 가 장바람직하다.

일 예로， 돼지로부터 유래된 간（l iver） 조직을 증류수와 함께 상온에서 2시 간 내외로 교반시켜 ^· 세척한 다음， 탈세포 용액을 이용하여 간조직과 함께 교반하

9 대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 1»（그1^1{2018/012996 여 조직의 세포성분을 제거할수 있다.

이때 탈세포 용액에 포함된 계면활성제는 SDS(sodium dodecyl sulfate) , 소 둠 데옥시콜레이트， 트리톤 X-200(Triton X-200) 등의 이온성 계면활성제 또는 트 리톤(Triton X-100) , Tween 80 등의 비이온 계면활성제 모두 가능하나， 트리 톤(Triton X-W0)를 사용하는 것이 바람직하며， 이에 따라 세포 외 기질의 다양한 단백질과 당단백질 ¾ 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan, GAG) 등의 손상을 최소화시킬 수 있고, 세포에 포함되어 있는 DNA를파괴시킬 수 있다,

그리고 탈세포 용액에 포함된 고장용액은 탈세포효율을증가시킬 수 있도록 상기 계면활성제와 함께 사용되며, 일반적인 식염수 농도의 3배 이상의 고장용액을 이용할 수 있고, 조직의 세포 외 기질의 잔존량을 높이기 위해 NaCl, KC1 , CaCh, MgCls, BaCh및 NaHCOs을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 0.03내지 1.0 M의 용액을사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 탈세포 단계를통해 얻어진 탈세포된 조직은, 세포에 포함되어 있 는 DNA를 파괴시킴으로써 조직 내 포함된 DNA함량이 현저하게 낮아져 체내에 인입 시 면역거부 반응을 현저히 저하시킬 수 있을 뿐만 아니라, 세포외기질 성분인 다 양한 단백질과 당단백질 및 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan, GAG) 등을 활 용할수 있어 특정 세포의 생존， 증식 및 분화에 유리하다.

한편, 제 1 바이오 잉크를 제조하는 단계는, 탈세포 단계를통해 얻어진 탈세 포된 조직의 세포외기질을 특정 온도와 pH조건 하에서 액상화시켜 적절한 점도를 가진 제 1바이오 잉크를 제조하게 된다.

구체적으로, 상기 제 1 바이오 잉크를 제조하는 단계는 탈세포된 조직의 세포

10 대체용지 (규칙제26조) 2019/245110 1»（그1^1{2018/012996 외기질이 1 ~ 3， 약 15 ~ 25 의 온도에서 액상화되어, 바 이오 프린팅 소재로 쓰이기 위한 적절한 점도（예를 들어, 100 내지 1000 ? 3）를 갖는 것이 바람직하다. 여기서 펩신은如 및 온도조건에 따라 반응성이 다른 특성 을 가지고 있으며, 이로 인해 온도가 15 ^° 0 미만인 경우에는 활성 도가 감소하여 원활한 소화（ 은63 011）가 이루어질 수 없고, 25껀를 초과하는 경우 에는 활성이 지나치게 증가되어， 점도가 낮아져서 바이오 잉크로 사용하기에 부적합하다.

제 2 바이오 잉크를준비하는 단계는， 알지네이트, 피브리노겐, 카르복실메틸 셀룰로오스, 헤파란황산, 히알루론산, 콜라겐， 덱스트란등과 같은 천연 고분자물 질을 포함하는 제 2 바이오 잉크를 준비할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 알지네이트 또는 피브리노겐을 비롯한 하이드로겔을 포함할 수 있다.

상기 제 2 바이오 잉크는 천연 고분자 물질을 증류수에 투입한 후 상온에서 교반하여 준비될 수 있다.

이후상기 제 1바이오 잉크와제 2바이오 잉크를 1.5 - 9 : 1의 부피비（V八 0 로 혼합함으로써 생체 적합성이 뛰어나고, 물리적 강도가 우수하여, 이온 가교 후 에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 하이브리드 바이오 잉크를 제조할 수 있 다.

또한, 제 1 바이오 잉크가 세포가 부착할 수 있는 3차원적인 부착 공간을 제 공함과 동시에， 제 2 바이오 잉크가 세포가 부착할 수 없는 공극을 제공하여 세포 간의 응집을유도해주는하이브리드 바이오 잉크를 제조할수 있다.

11 대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 1»（그1^112018/012996 반면, 제 1 바이오 잉크와 제 2 바이오 잉크의 혼합 비율이 앞서 언급된 범위 를 벗어나게 되어 제 1 바이오 잉크가 높은 함량을 갖는 경우 물리적 강도가 약하 고, 가교시간이 길게 되며， 세포에 의해 쉽게 수축 및 분화될 수 있고， 제 2 바이오 잉크가 높은 함량을 갖는 경우 세포 친화도가 낮아 세포의 생존, 증식 및 분화가 제한되게 된다.

구체적으로， 제 1 바이오 잉크 및 제 2 바이오 잉크는, 각각 1.5 - 4.0 %（ / V）의 농도인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 3¾（桃八^의 농도일 수 있 다. 이때 상기 제 1 바이오 잉크는 다양한단백질 성분이 포함되어 있어 열에 취약 하며, 이상의 온도에서 변형되거나 응집， 섬유화 반응이 진행되어 제형이 변 성될 수 있으므로， 미만의 온도 범위가유지되도록 적절히 온도를 제어하면서 혼합하는 것이 바람직하며， 적절한 점성을가질 수 있도록교반속도를제어하면서 혼합하는 것이 적절하다.

본 발명의 또 다른실시 형태로, 앞서 언급한제조방법으로 제조된 하이브리 드 바이오 잉크를사용한 인공 조직 제조 방법을 들 수 있는데, 본 발명에 따른 인 공 조직 제조 방법은， 하이브리드 바이오 잉크를사용하여 인공 조직을 프린팅하는 단계; 및 무기염을 사용하여 인공 조직을 겔화（용61 011） 및 가교（ 033-1 1］ 1 ） 시키는고형화（301 比 比11） 단계;를포함한다.

인공 조직을프린팅하는 단계는， 혼합된 하이브리드 바이오 잉크를사용하여 3차원 적인 구조인 인공 조직을 프린팅하는 바이오 30프린팅 단계을 의미한다. 인 공 조직은 예컨대 , 오가노이드（0^81101（1）， 장기유사 칩（0^811-011-011-3 - 11）） , 간 조직， 심장 조직， 뼈 조직 등일 수 있으며, 30프린팅 장치를 사용하여 수행될 수

12 대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 1»（그1^1{2018/012996 있다.

다음으로 프린팅된 인공 조직을 무기염을 사용하여 겔화 (gelat ion) 및 가 교 (cross-1 inking)시키는 고형화 (sol idi f icat ion) 단계를 진행한다. 이때 무기염 은, 칼슘, 망간， 바륨， 코발트， 아연, 구리를포함하는 군에서 선택되는 어느하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 칼슘을 사용하여 인공조직이 가교 결합을 형성하도록할수 있다.

구체적으로, 상기 고형화 단계는, 열에 의해 콜라겐을 겔화 (gelat ion) 시킨 후, 무기염이 포함된 용액을 사용하여 알지네이트 또는 피브리노겐을 가교 (cross- l inking)시킴으로써, 프린팅 된 인공 조직이 세포에 의해 형상이 변화되지 않도록 단단한 구조물로 완성될 수 있도록 해준다. 이때 세포는 인공 조직의 종류에 따라 다양하게 변경 가능하며 , 세포배양장치를 사용하여 인공 조직에 세포를 배양할 수 있다.

상기 고형화 단계는, 무기염이 포함된 용액을 사용하여 알지네이트 또는 피 브리노겐을 가교 (cross-1 inking)시킨 후, 열에 의해 콜라겐을 겔화 (gelat ion) 시킬 수도 있으나, 앞서 언급된 바와 같이 열에 의해 콜라겐을 겔화 (gelation) 시킨 후， 무기염이 포함된 용액을 사용하여 알지네이트 또는 피브리노겐을 가교 (cross- bilking) 시키는 것이 가장바람직하다.

상기 인공 조직은, 제 1 바이오 잉크로 인해 세포가부착할 수 있는 3차원적 인 부착 공간을 포함하는 동시에, 제 2 바이오 잉크로 인해 세포가 부착할 수 없는 공극을 포함하는 것이 바람직하며, 이에 따라 다수의 세포 간의 응집을 유도하여 세포의 생존， 증식 및 분화를활발하게 해준다.

13 대체용지 (규칙제 26조) 2019/245110 1»〔"^0技018/012996 본 발명에 따라 제조된 하이브리드 바이오 잉크는, 탈세포된 조직의 세포외 기질을 액상화한 제 1 바이오 잉크와 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제 2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1 의 부피비（ 로 혼합함으로써， 생체 적합성이 우수하 여 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하고， 물리적 강도가 우수하여 이온 가교 후 에도세포에 의해 형상이 변화되지 않는다.

뿐만 아니라， 본 발명에 따라 인공 조직을 제조할 때 소요되는 가교 시간이 짧아지며, 본 발명에 따라 제조된 인공 조직의 경우， 세포가 부착 가능한 3차원적 인 부착 공간을 포함하는 동시에 세포가부착할 수 없는 공극을 포함하여 세포 간 의 응집이 가능하고, 이에 따라 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리한 효과를 갖는 다.

구체적으로， 본 발명의 효과를극대화하기 위해 제 1 바이오 잉크와제 2바이 오 잉크를 4 : 1 의 부피비（V八 0로혼합하는 것이 가장바람직하다.

아하에서는， 본 발명의 실시예를살펴본다. 그러나본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상 의 지식을 가진 자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여 러 가지 변형된 형태를실시할수 있다.

[제조예 1]

제 1 바이오 입크의 제조

돼지의 간을 1ä 크기로 잘라 여러 개의 절편을 준비한 후, 상기 절편들을 증류수에 투입한 후 교반기를 이용하여 상온에서 2시간 동안 세척하였다. 이후 상

14 대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 1»（그1^1{2018/012996 기 절편들을 0.5% 트리톤 X-100(Tr i ton X-100) , 0.5M의 NaCl 용액을 포함한 탈세포 용액을 사용하여 10 ^° C에서 8시간 동안 탈세포 시켰다. 이때， 상기 탈세포 용액은 매 3시간 마다 바꿔주었다. 다음으로 탈세포된 절편들을 증류수로 교반하여 상온에 서 2시간 동안 세척한후, P.B.S.에 0.1%과초산 (Peracet ic acid)이 포함된 소독액 으로 상온에서 1시간 동안교반하여 탈세포된 절편들을 소독하였다. 마지막으로 증 류수로교반하여 상온에서 1시간동안세척하여 탈세포된 조직을제조하였다.

제조된 탈세포된 조직과 펩신 (P印 sin)을용기에 넣은후, 온도가 201：, 沈 ^° C 로 일정하게 유지되는 챔버 내부로 투입하여 액상화 시켜 제 1 바이오 잉크를 제조 하였다.

제 2바이오 잉크의 제조

알지네이트* 증류수에 투입하고 상온에서 12시간동안 교반하여 제 2 바이오 잉크를 제조하였다.

하이브리드 바이오 입크의 제조

25 °C 챔버에서 제조된 제 1 바이오 잉크와제 2바이오 잉크를 하기 표 1과 같 은 부피 비율 (v八，)로 혼합한 후, 페이스트 믹서 (paste mixer)를 사용하여 15분간 혼합하여 하이브리드 바이오 잉크를제조하였다.

【표 II

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대체용지 (규칙제 26조) 2019/245110 1»（그1^1{2018/012996

［제조예 到

이공조직 제조

상기 제조예 1에 의해 제조된 하이브리드 바이오 잉크를 3D 프린팅 장치를 이용하여 육면체 형상의 3차원 구조물로 프린팅 한 뒤, 열을 가하여 하이브리드 바 이오 잉크를 겔화 (gelat ion)시켰다. 이후， 20(M 농도의 염화칼슘 용액과 함께 30 분동안교반하여 가교시켜 인공조직을 제조하였다.

［실험예 1］ 제 1바이오 잉크의 점성 측정 실험

상기 제조예 1에서 제조된 제 1 바이오 잉크의 온도 변화에 따른 점도를 확인 하기 위하여, 브룩필드점도계 (Brookfield RVDV-3, Brookf ield, US)를 이용하여 농 바이오 잉크의 점도를측정하였다. 도 1의 결과를 살펴보면, 25 ^° C 챔버에서 제조된 3%농도의 제 1 바이오 잉크 의 경우가장높은 점도를나타내는 것으로 확인되었다.

또한, 동일한 농도의 경우 25 °C 챔버에서 제조된 제 1 바이오 잉크는， 20 °C

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대체용지 (규칙제 26조) \¥0 2019/245110 챔버에서 제조된 제 1 바이오 잉크보다모두 높은 값을 나타내는 것으로 보아, 25 °C 의 챔버에서 우수한 점도특성을나타내는 것으로 여겨진다.

[실험예 2] 하이브리드 바이오 잉크의 점성 측정 실험

상기 제조예 1에서 제조된 하이브리드 바이오 잉크의 함량 변화에 따른 점도 를 확인하기 위하여, 4°C 에서 브룩필드점도계 (Brookfield RVDV-3, Brookf ield, US)를 이용하여 비교예 1 내지 4 및 실시예 1 내지 4의 점도를 측정하였으며， 그 결과는도 2및 도 3과 같다.

도 2의 결과를 살펴보면， 제 1 바이오 잉크만포함된 비교예 1의 경우제 1 바 이오 잉크와 제 2 바이오 잉크가 혼합된 실시예 1 내지 4보다 현저히 낮은 점도를 나타내는 것을확인할수 있었다.

하지만， 도 2 및 도 3에 도시된 바와같이 제 1바이오 잉크와제 2바이오 잉 크가 혼합된 실시예 1 내지 실시예 4와 비교예 2 내지 4의 경우 제 1 바이오 잉크 대비， 제 2 바이오 잉크의 함량이 높아질수록 점도가높아지는 것을 확인할 수 있었 다.

[실험예 3] 하이브리드바이오 잉크의 형상변화실험

상기 제조예 2에 의해 제조된 비교예 1 내지 4및 실시예 2의 형상의 변화를 관찰, 측정하였으며 , 그결과는도 4와같다. 도 4를 참조하면, 제 1 바이오 잉크만을포함하는 비교예 1, 제 1 바이오 잉크

17 대체용지 (규칙제 26조) 2019/245110 1»（：1^1{2018/012996 와 제 2 바이오 잉크를 8:2 의 부피비（ 로 혼합한 실시예 2 및 제 1 바이오 잉크 와 제 2 바이오 잉크를 5: 5의 부피비 八）로 혼합한 비교예 2는 형상의 변화가미미 한 반면, 제 2 바이오 잉크의 비율이 제 1 바이오 잉크의 비율보다 높은 비교예 3, 비교예 4의 경우 형상의 변화가 크게 나타나, 가교 후의 성형성이 보장이 되지 않 는문제가 있었다.

[실험예 4] 하이브리드 바이오 잉크의 압축강도측정 실험

상기 제조예 2에 의해 제조된 비교예 1내지 4및 실시예 1내지 4를국제규 격인 쇼요ä 0 790을 기준으로 압축강도 기기（1애比011）을 이용하여 압축강도를 측정 하였으며 , 그 결과는도 5및 도 6과같다. 도 5 및 도 6의 결과를 살펴보면, 제 2 바이오 잉크의 비율이 높아짐에 따라 압축강도가증가하여, 물리적 강도가우수해지는 것을확인할수 있었다.

구체적으로, 실시예 1 내지 실시예 4의 미만의 압축 강도로 측 정되었으며， 제 2 바이오 잉크만을포함한 비교예 4의 압축 강도는 72.98 3로, 상 대적으로높은 압축 강도를 나타낸 것을 확인할수 있었다.

[실험예 5] 인공조직의 세포 생존율, 증식률실험

비교예 1 내지 2, 실시예 2에 생쥐 배아 유래 섬유아세포어111-況3）을 1x1（广 7 _/ ½1의 비율로 혼합하여 30프린팅 장치를 이용하여 프린팅 한 뒤, 열을 가하 시켰다. 이후, 2001 농도의 염화칼슘 용액과 함께 30분동안 교

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대체용지（규칙제 26조） 2019/245110 1»（：1^1{2018/012996 반하여 가교시켰다. 이후， 37 ^° C의 세포배양장치에서 4일 동안 세포 배양하였으며, 세포 배양 1일차부터 4일차까지의 세포 생존율을 Live/dead cel l viabi l ity kit (Li fe Technologies)를 사유하여 평가하고, 세포 증식률을 Cel l count ing ki t (CCK-8, Doj indo)를통해 평가하여 도 7내지 도 9에 나타내었다. 도 7 내지 도 8을 참조하면, 제 1 바이오 잉크만포함된 비교예 1, 제 1 바이 오 잉크의 비율이 제 2 바이오 잉크의 비율보다 높은 실시예 2의 세포 생존율은 배 양 1일차일 때 각각 90%, 83%로 비교적 높은 값을 보였으며， 배양 4일차일 때 각각 92%, 90%의 값을 나타내 제 1 바이오 잉크의 비율이 높아지거나， 배양 기간이 길어 질수록세포 생존율이 증가하는 것을확인할수 있었다.

반면， 제 1 바이오 잉크와제 2 바이오 잉크의 비율 (v八 0이 5:5 인 비교예 2의 경우 배양 1일 차일 때의 세포 생존율은 67%정도이나, 배양 4일 차일 때 62%로 오 히려 배양기간이 길어질수록세포 생존율이 감소하는경향을보였다.

도 9를 참조하면, 세포 증식률의 경우 또한 제 1 바이오 잉크의 비율이 높아 질수록 값이 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 배양 4일 차일 때 비교예 1 의 값은 1.6 , 실시예 2의 값은 1.2, 비교예 2의 값은 0.8로측정되어 배양 1일 차 일 때의 값인 0.3, 0.4， 0.5보다 상대적으로 큰 차이 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 6] 인공조직의 공극관찰실험

상기 실험예 5에서 제조된 배양 4일차의 비교예 1 내지 2, 실시예 2의 조직

19 대체용지 (규칙제 26조) 2019/245110 1»（：1^1{2018/012996 학적인 구조를 확인하기 위해 헤마록 염색한 후， 현미경을사용하여.공극을관찰하였다.

도 10을 참조하면, 제 1 바이오 잉크와 제 2 바이오 잉크가 1 : 1 의 부피 비（V八 0로 혼합된 비교예 2의 경우， 제 1 바이오 잉크가 제 2 바이오 잉크보다 높은 비율로 포함된 비교예 1 및 실시예 2에 비해 상대적으로 많은 공극이 관찰되었다. 이 공극은 세포 간에 서로 응집 가능하도록 하는 역할을 하지만, 상대적으로 세포 가부착할수 있는 3차원적인부착공간은 적은 것으로판단된다.

반면에 제 1 바이오 잉크만포함하는 비교예 1의 경우， 공극이 극소량으로관 찰되었으며, 이는 세포가 부착할 수 있는 3차원적인 부착 공간을 제공하나， 세포 간에 서로응집하는 효과는 적을 것으로 예상된다.

저 바이오 잉크와제 2바이오 잉크가 8 : 2의 부피비로혼합된 실시예 2의 경우， 적절한 공극을 포함하는 것으로 관찰되어, 세포간에 서로 응집하는 효과를 갖는 동시에 세포가부착할 수 있는 3차원적인 부착공간도 제공할수 있을 것으로 보여진다.

본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에 서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며， 그와 같은 변 형은본발명의 보호 범위 내에 있게 된다.

【산업상 이용가능성】

본 발명은, 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한제 1 바이오 잉크와 알지 네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제 2 바이오 잉크를 혼합하여， 생체 적합성이

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대체용지（규칙제 26조） 0 2019/245110 1»（：1^112018/012996 우수하여 세포의 생존， 증식 및 분화에 유리하고， 물리적 강도가우수하여 이온 가 교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 하이브리드 바이오 잉크와 그 제조 방법， 및 이를 이용하여 바끼오 30프린팅 공정을 통해 인공 조직을 제조하는 방법 에 관한 것으로， 인공 조직을 제조할 때 소요되는 가교 시간이 짧고, 본 발명에 따 라 제조된 인공조직의 경우에는， 세포가부착가능한 3차원적인 부착 공간을포함 하는 동시에 세포가 부착할 수 없는 공극을 포함하여 세포 간의 응집이 가능하므 로， 세포의 생존， 증식 및 분화에 유리한 효과가 있으므로， 산업상 이용가능성이 존재한다.

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대체용지（규칙제 26조）