Domaine de l'invention

Le domaine de l'invention est celui de la prévention des effets indésirables des antibiotiques, secondaires à leur action sur la flore gastro-intestinale et la sélection de souches bactériennes résistantes.

Généralités

De nombreux antibiotiques administrés par voie parentérale peuvent être excrétés par le foie dans la bile sous forme active non modifiée ou de métabolites actifs. Ces antibiotiques peuvent être réabsorbés au niveau iléal et retournent ainsi au foie par voie portale pour être éventuellement excrétés, ce cycle étant dit entéro-hépatique.

Lorsqu'ils sont excrétés dans le tube digestif sous forme active non-modifiée ou de métabolites actifs, ces antibiotiques peuvent exercer une pression de sélection sur les populations bactériennes constituant la microflore normale de l'intestin et du côlon. Une telle sélection microbienne a deux principales conséquences : la survenue de diarrhées aiguës induites par les antibiotiques, ainsi que la sélection et la dissémination de souches bactériennes résistantes.

L'apparition d'une diarrhée aiguë induite par les antibiotiques est d'observation courante en cas d'antibiothérapie parentérale à large spectre. Sa fréquence et sa gravité sont conditionnées par différents facteurs parmi lesquels la durée de traitement, le spectre d'activité de l'antibiotique utilisé et la dose administrée (Aires, Kohler et al. 1999). Une diarrhée aiguë induite par les antibiotiques est ainsi observée chez environ 5-10% des patients recevant une antibiothérapie par amoxicilline, 10-25% sous association amoxicilline- acide clavulanique, et 2-5% sous céphalosporines de 3 ^e génération, fluoroquinolones, azithromycine, clarithromycine, érythromycine et tétracyclines (Gilbert 1994, Bartlett 1996, Hogenauer, Hammer et al. 1998, Wistrom, Norrby et al. 2001).

Si dans la majorité des cas les diarrhées aiguës induites par les antibiotiques sont bénignes, elles peuvent s'accompagner d'une colite dans 10-20% des cas qui peut être sévère. Dans la majorité des cas, cette colite est secondaire à la sélection de Clostridium difficile, une bactérie sporulée Gram-positif anaérobie résistante à la plupart des antibiotiques (Gerding 1989, Anand, Bashey et al. 1994). La pathogénicité de cette bactérie est liée à la production de deux toxines A et B. Ces toxines induisent une réaction inflammatoire intense avec recrutement de polynucléaires au niveau de la lamina propria et dans les formes les plus sévères, une colite pseudomembraneuse, ainsi dénommée en raison de l'aspect que prend la muqueuse colorectale (Kelly, Pothoulakis et al. 1994). La mortalité des colites pseudomembraneuses est élevée, particulièrement chez les jeunes enfants et les sujets âgés. Ces colites auraient été responsables de plus de 7200 décès aux Etats-Unis en 2010 (Sherry, Murphy et al. 2012). D'autres agents pathogènes peuvent être responsables de diarrhées aiguës induites par les antibiotiques de gravité variable, tels que Klebsiella oxytoca, Clostridium perfringens de type A, Staphylocoque aureus et Candida albicans (Sparks, Carman et al. 2001, Gorkiewicz 2009).

La pression de sélection que les antibiotiques exercent sur la microflore intestinale contribue également à la dissémination de bactéries résistantes dans l'environnement. La majorité de ces infections causées par ces micro-organismes en milieu hospitalier, aussi dénommées infections nosocomiales, sont particulièrement fréquentes et graves en soins intensifs et en milieu chirurgical. Il s'agit notamment d'infections de cathéters, d'infections urinaires, de pneumopathies et d'infections post-opératoires. Elles sont principalement causées par des entérobactéries Gram-négatif, des staphylocoques coagulase positif ou négatif, des entérocoques et des Candida albicans (Richards, Edwards et al. 2000).

Les infections nosocomiales constituent une cause importante de mortalité et un véritable enjeu de santé publique. L'émergence de bactéries résistantes, secondaire à la généralisation de l'antibiothérapie, complique le traitement de ces infections nosocomiales et représente un coût considérable pour la société. En Europe, les infections nosocomiales sont directement responsables d'environ 25000 décès chaque année et d'un surcoût de dépenses de santé et des pertes de productivité estimé à plus de 1,5 milliard d'euros par an (ECDC/EMEA Joint Working Group 2009). Aux Etats-Unis, environ 1,7 million d'infections nosocomiales sont responsables directement ou indirectement de près de 99000 décès chaque année (Klevens, Edwards et al. 2007).

Les antibiotiques, en particulier les tétracyclines, sont largement utilisés en médecine vétérinaire pour le traitement d'animaux d'élevage et familiers. De plus, l'utilisation de ces antibiotiques est autorisée aux Etats-Unis pour favoriser la croissance et la prise de poids des animaux d'élevage. Cette utilisation intensive participe bien sûr à la dissémination dans le milieu naturel de bactéries résistantes (Institute of Medicine 1998, Committee on Drug Use in Food Animais 1999, Georgetown University Center for Food and Nutrition Policy 1999).

Bêta-lactamines

Les bêta-lactamines inhibent les transpeptidases et des transglycosylases impliquées dans la formation du peptidoglycane, un constitutif essentiel de la paroi des bactéries Gram positif et négatif (Walsh 2000). Elles possèdent un noyau bêta-lactamine, ainsi que des chaînes latérales variables (e.g. céphalosporines de l ^ere , 2 ^eme , 3 ^eme et 4 ^eme génération) qui modifient leurs propriétés pharmacocinétiques et leur spectre d'efficacité antimicrobien (Turner 2005). Cette classe regroupe les pénicillines, les céphalosporines, les carbapénemes et les monobactames.

Les antibiotiques de la classe des bêta-lactamines sont les agents antimicrobiens les plus communément prescrits. Ils sont très largement utilisés en clinique pour différents types d'infections (e.g. otites, infections respiratoires et gastro-intestinales). Plusieurs voies d'administration peuvent être utilisées mais c'est la voie parentérale qui est préférée pour les sepsis graves, généralement traités en milieu hospitalier. Ils sont fréquemment associés à d'autres classes d'antibiotiques en cas d'infections graves, comme par exemple l'association amoxicilline/acide clavulanique avec un macrolide en cas de pneumopathie atypique.

L'usage intensif des bêta-lactamines a favorisé l'émergence de résistance bactérienne dont le principal mécanisme est l'acquisition de bêta-lactamases, des enzymes capables d'hydrolyser leur noyau bêta-lactamine. Il existe à ce jour plusieurs centaines voire milliers de bêta-lactamases différentes qui peuvent être regroupées en familles selon leur homologie de séquence, leur structure, ou enfin leur propriétés biochimiques (substrat et inhibiteurs). Ces enzymes sont généralement classifiées en fonction de leur substrat préférentiel (pénicillinase, céphalosporinase, imipénèmase, etc.). De plus, les bêta- lactamases ont évolué pour soit devenir résistantes aux inhibiteurs, soit élargir leur spectre d'action sur les bêta-lactamines les plus récentes (Turner 2005, Drawz and Bonomo 2010). Ces inhibiteurs (acide clavulanique, sulbactam, etc.) sont généralement administrés simultanément à des bêta-lactamines et se fixent de manière irréversible aux bêta- lactamases bactériennes.

La classification d'Ambler illustre la gigantesque diversité de ces enzymes bêta-lactamases, qui sont regroupées en quatre familles A, B, C et D selon leurs séquences nucléotidiques (Ambler 1980). Les groupes A, C et D ont une sérine catalytique alors que le groupe B regroupe les métallo-bêta-lactamases dépendantes du zinc.

Les bêta-lactamases de classe A regroupent plusieurs sous-familles, dont les enzymes de type TEM (Bush and Jacoby 1997), enzymes ancestrales permettant la résistance aux pénicillines et aminopénicillines (e.g. ampicilline, amoxicilline, bacampicilline). TEM-36 est une IR-TEM, c'est-à-dire une bêta-lactamase résistante à l'acide clavulanique ((Zhou, Bordon et al. 1994, Henquell, Chanal et al. 1995, Chaibi, Sirot et al. 1999); identifiant TEM-36 ou IRT- 7 sur le site de Lahey Clinic (http://wwwJahey.org/Studies/temtable.asp). L'acide clavulanique est cliniquement utilisé en association avec l'arnoxicilline pour élargir le spectre de l'antibiotique aux germes ayant acquis une bêta-lactamase classique (TEM-1). Sous la pression de sélection, les TEM ont acquis progressivement la résistance à l'inhibiteur en mutant quelques acides aminés aujourd'hui bien caractérisés (Chaibi, Sirot et al. 1999).

Parmi les bêta-lactamases de classe A, nous retrouvons également les cefotaximases, enzymes ayant évolué à partir des TEM pour élargir leur spectre d'action aux céphalosporines de 3 ^eme génération (Salverda, De Visser et al. 2010). Par exemple, l'enzyme CTX-M16 (identifiant Genbank de la protéine: AAK32961) hydrolyse préférentiellement la cefotaxime par rapport aux différentes pénicillines( Bonnet, Dutour et al. 2001).

L'enzyme PCI (identifiant UniProtKB/Swiss-Prot de la protéine: P00807) codée par le gène blaZ est une bêta-lactamase de classe A à serine catalytique (Ambler 1975, Knott-Hunziker, Waley et al. 1979, Kemal and Knowles 1981, Herzberg and Moult 1987). Cette enzyme produite par Staphylococcus aureus coagulase positif et Bacillus subtilis methi-R hydrolyse le noyau bêta-lactamine de la méthicilline (Novick 1963).

Aminoglycosides

Les aminoglycosides, aussi dénommés aminosides, sont des sucres aminés liés par un pont glycosidique à un noyau central aminocyclitol. La structure de ce noyau central permet de distinguer trois groupes : les streptomycines (Streptomycine), les désoxystreptamines (Kanamycine, Amikacine, Gentamicine) et les fortimicines (Dactamicine).

Le spectre antibiotique théorique des aminoglycosides est très large incluant des bactéries Gram-négatif aérobies (bacilles, cocci et coccobacilles), les staphylocoques coagulase positif ou négatif, ainsi que les bacilles Gram-positif. En outre, la streptomycine est active sur Mycobacterium tuberculosis et l'amikacine sur les mycobactéries atypiques (Mycobacterium avium intracellulare, etc.), ainsi que Nocardia astéroïdes. Les aminoglycosides ont une activité synergique avec les bêta-lactamines et la vancomycine.

Les aminoglycosides sont généralement administrés par voie parentérale, car peu ou pas absorbés au niveau digestif. Ils sont éliminés sous forme inchangée principalement dans les urines par filtration glomérulaire (85 à 90 % de la dose administrée est éliminée en 24 heures), ainsi qu'à moindre degré dans la bile sans cycle entéro-hépatique (de l'ordre de 0,5 à 2 % de la dose administrée selon l'antibiotique) (Leroy, Humbert et al. 1978). Cette excrétion digestive des aminoglycosides a pour conséquence la sélection de bactéries résistantes, ce qui expose à un risque faiblement accru de colite pseudomembraneuse par Clostridium difficile (Anand, Bashey et al. 1994).

L'effet bactéricide des aminoglycosides est rapide sur de nombreux agents pathogènes. Les aminoglycosides se fixent sur la sous-unité ribosomale 30S procaryote et altèrent la fidélité de la traduction bactérienne (Poehlsgaard and Douthwaite 2005). La plupart des aminoglycosides se fixe à l'ARN ribosomique 16S, le constituant ARN de la sous-unité ribosomale 30S, au niveau du site de décodage (site A).

Les bactéries peuvent acquérir une résistance aux aminoglycosides par trois mécanismes principaux qui peuvent coexister dans une même cellule (Ramirez and Tolmasky 2010). Un premier mécanisme d'origine chromosomique aboutit à une réduction d'affinité de l'aminoglycoside pour sa cible ribosomale, l'ARN ribosomal 16S, par le biais de sa méthylation (Doi and Arakawa 2007). Un second mécanisme repose sur un défaut de perméabilité cellulaire par modification de la perméabilité membranaire (Hancock 1981) ou un efflux de l'aminoglycoside hors de la cellule par un mécanisme actif (Aires, Kohler et al. 1999). Enfin, l'inactivation enzymatique est le mécanisme le plus fréquemment observé. Les gènes codant pour ces enzymes sont portés par des plasmides et/ou des transposons. Il s'agit donc d'une résistance transférable et donc souvent épidémique en milieu hospitalier. Ces enzymes catalysent la liaison irréversible de l'aminoglycoside à différents groupements chimiques et sont regroupées en trois grandes classes (Shaw, Rather et al. 1993, Ramirez and Tolmasky 2010). Les phosphotransférases (APH) qui catalysent une réaction de transfert d'un radical phosphate de ΓΑΤΡ ou du GTP, les nucléotidyltransférases (ANT) permettent le transfert d'un radical adényl et utilisent l'ATP comme substrat et les acétyltransférases (AAC) transfèrent un radical acétyle utilisant l'acétyl-CoA comme substrat. Chaque classe enzymatique comporte différentes sous-classes suivant le substituant de l'aminoglycoside. Une même enzyme peut inactiver plusieurs aminoglycosides présentant des sites moléculaires identiques.

AAC(6')-lb-cr (identifiant Genbank de la protéine : ABC17627.1) est une enzyme appartenant à la famille des N-acétyltransférases naturellement produite par des entérobactéries. Elle catalyse l'acétylation d'un groupement -NH ₂ en position 6', ce qui confère à cette enzyme un profil de résistance identique à celui d'autres enzymes de la sous-classe AAC(6') (Robicsek, Strahilevitz et al. 2006). Tout comme les autres enzymes de la famille AAC(6'), AAC(6')-lb-cr est active sur une large gamme d'aminoglycosides parmi lesquels l'amikacine et les énantiomères Cla et C2 de la gentamicine, mais a une activité très faible sur l'énantiomère Cl de la gentamicine (Robicsek, Strahilevitz et al. 2006). AAC(6')-lb-cr, qui résulte probablement de l'évolution de l'enzyme AAC(6')-lb par mutation des résidus Trpl02Arg et Aspl79Tyr. Ceci a pour conséquence l'acquisition d'une activité enzymatique vis-à-vis de la ciprofloxacine, une fluoroquinolone, activité qui est nettement plus faible pour la norfloxacine et la péfloxacine.

Fluoroquinolones

Les fluoroquinolones (e.g. norfloxacine, ofloxacine, ciprofloxacine et péfloxacine) constituent une large classe d'antibiotiques bactéricides de synthèse qui dérivent des quinolones par modifications chimiques, notamment addition d'un atome de fluor.

Les fluoroquinolones sont des antibiotiques à large spectre qui diffère d'un antibiotique à l'autre. Le spectre des fluoroquinolones inclut notamment des bacilles Gram-négatif (Salmonella spp., Escherichia spp., Shigella spp., Proteus spp., Enterobacter spp. ,Helicobacter pylori), des cocci gram positif (staphylocoque coagulase positif et négatif, streptocoque, entérocoque), des cocci gram négatif (gonocoque, méningocoque) et des bacilles Gram positif.

La distribution tissulaire des fluoroquinolones est excellente y compris dans le liquide céphalo-rachidien, la prostate, les os, et la bile. Les fluoroquinolones sont donc largement utilisées en cas d'infections tissulaires (méningite, pneumopathie, infection ostéoarticulaire, infection urinaire haute ou prostatique,etc). Par contre, le taux sérique de fluoroquinolones est souvent bas et peut même être inférieur à la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) de certains germes, favorisant l'émergence de résistances bactériennes. La voie d'élimination des fluoroquinolones dépend du produit utilisé. Elle est principalement hépatique pour la péfloxacine, alors qu'elle est principalement rénale pour l'ofloxacine et les autres fluoroquinolones. Leur élimination biliaire et digestive explique le risque de colite pseudomembraneuse par Clostridium difficile, notamment par la souche BI/NAP1/027 qui est particulièrement virulente (Vardakas, Konstantelias et al. 2012, Deshpande, Pasupuleti et al. 2013, Slimings and Riley 2013).

Les fluoroquinolones ont pour cible l'ADN gyrase et les topoisomérases II et IV bactériennes. Elles forment un complexe irréversible entre ces enzymes et l'ADN bactérien, ce qui empêche la réplication de l'ADN et entraine la mort de la bactérie.

Quatre mécanismes de résistance aux quinolones ont été caractérisés (Robicsek, Jacoby et al. 2006) : (/ ^' ) une augmentation d'activité de pompes à efflux, ce qui entraine une diminution de la concentration intracellulaire de l'antibiotique (Morita, Kodama et al. 1998), (/ ^' / ^' ) la production de protéines se liant à l'ADN gyrase ou la topoisomérase IV, les protégeant ainsi de la fixation des fluoroquinolones (Robicsek, Jacoby et al. 2006), (/ ^' // ^' ) une modification de l'ADN gyrase ou de la topoisomérase IV responsables des résistances à haut niveau par réduction d'affinité des fluoroquinolones pour leurs cibles (Robicsek, Jacoby et al. 2006), (/V) enfin, la production d'une aminoglycoside N-acétyltransférase, AAC(6')-lb-cr (identifiant Genbank de la protéine : ABC17627.1), susceptible de cataboliser la modification de la ciprofloxacine, ainsi qu'à moindre degré de la norfloxacine et la péfloxacine (Robicsek, Strahilevitz et al. 2006).

Ces mécanismes de résistance, dont la fréquence augmente rapidement, ont été identifiés dans de nombreuses espèces bactériennes, parmi lesquelles des Staphylocoques aureus coagulase positif, des streptocoques bêta-hémolytiques et des entérocoques (Robicsek, Jacoby et al. 2006).

Macrolides

Les macrolides constituent une famille homogène d'antibiotiques naturels et semi- synthétiques dont le nombre de représentants est relativement limité (e.g. érythromycine, spiramycine, josamycine, clarithromycine, roxithromycine, azithromycine et télithromycine).

Le spectre d'activité des macrolides est large et inclut des cocci Gram positif aérobies (streptocoque, pneumocoque, staphylocoque et entérocoque) et anaérobies, des cocci gram négatif, certains bacilles gram négatif comme Helicobacter pylori, et différentes bactéries à réplication intracellulaire stricte comme Legionella pneumophilia, Mycoplasma pneumoniae et Mycoplasma urealyticum, Clamydiae pneumoniae et Clamydiae trachomatis. Par contre, les entérobactéries sont intrinsèquement résistantes aux macrolides, leur membrane cellulaire externe empêchant le passage de molécules hydrophobes comme les macrolides.

Les macrolides se distribuent de façon large dans l'organisme, à l'exception du liquide céphalorachidien, du cerveau et des urines. Leur élimination est essentiellement biliaire, après métabolisation par le cytochrome P450. L'administration de macrolides est associée à un risque accru de colite pseudomembraneuse secondaire à la sélection de Clostridium difficile (Gilbert 1994, Bartlett 1996, Hogenauer, Hammer et al. 1998, Wistrom, Norrby et al. 2001).

Les macrolides sont des inhibiteurs qui se lient de façon réversible à la sous-unité 50S des ribosomes procaryotes, au niveau du site P. Ils empêchent ainsi le transfert et la dissociation du complexe peptidyl-ARNt (ARN de transfert) depuis le site P vers le site A, et ainsi inhibent l'élongationde la chaîne peptidique (Tenson, Lovmar et al. 2003).

Trois mécanismes de résistance acquise aux macrolides sont connus (Roberts, Sutcliffe et al. 1999, Roberts 2008): (/ ^' ) une modification de la cible par méthylation ou mutation de l'ARN ribosomal bactérien 23S, qui compose l'ARN ribosomal 50S. Ce mécanisme de résistance, qui est celui le plus fréquemment rencontré, est macrolides, lincosamides et les streptogramines B (Weisblum 1995), (/ ^' / ^' ) production par cellule de pompes qui effluent l'antibiotique hors de la cellule, ce qui entraine une diminution de sa concentration intracellulaire, (/ ^' // ^' ) une inactivation par des enzymes (érythromycine estérases et érythromycine phosphotransférases) modifiant les macrolides au point de réduire fortement leur affinité pour le ribosome. Ce type de résistance est également transmis par des éléments génétiques mobiles.

Les enzymes érythromycine estérases inactivent les macrolides par hydrolyse du noyau macrolactone. La plupart de ces enzymes appartient à deux sous-classes : ereA (Ounissi and Courvalin 1985) et ereB (Arthur, Autissier et al. 1986). L'enzyme ereB (identifiant UniProtKB/Swiss-Prot de la protéine : P05789.1) a un spectre très large (érythromycine, clarithromycine, roxithromycine et azithromycine), la télithromycine étant par contre résistante à l'hydrolyse (Morar, Pengelly et al. 2012).

Tétracyclines

Les cyclines ou tétracyclines constituent une famille d'antibiotiques bactéricides dérivés de la tétracycline (e.g. chlorotétracycline, doxycycline, minocycline). Ces molécules ont pour caractéristique de posséder quatre cycles accolés, d'où leur nom.

Le spectre d'activité des tétracyclines s'étend à de nombreuses bactéries gram positif et négatif, aérobies et anaérobies. Les tétracyclines sont également actifs sur des agents pathogènes non conventionnels tels que Mycoplasma spp., Chlamydia spp., rickettsies tréponèmes, ainsi que certains protozoaires (Babesia divergens, Babesia microti, Theileria parva). Les mycobactéries, et les entérobactéries des genres Proteus et Pseudomonas sont naturellement résistants.

La plupart des tétracyclines est éliminée par filtration glomérulaire sous forme active à l'exception de la chlorotétracycline. Les tétracyclines sont également éliminées par voie biliaire avec cycle entéro-hépatique. La prise de tétracyclines est également associée à un risque accru de colite pseudomembraneuse secondaire à la sélection de Clostridium difficile (Gilbert 1994, Bartlett 1996, Hogenauer, Hammer et al. 1998, Wistrom, Norrby et al. 2001).

Les antibiotiques de la famille des cyclines inhibent la fixation de l'aminoacyl-ARNt du site A de la sous-unité ribosomale30S et inhibent ainsi la traduction (Chopra and Roberts 2001). Au moins trois mécanismes de résistance ont été identifiés : (/ ^' ) l'expression de protéines d'efflux, ce qui entraine une diminution de la concentration intracellulaire de tétracyclines, (/ ^' / ^' ) une modification enzymatique de la cible moléculaire, ce qui empêche la liaison des tétracyclines, (/ ^' / ^' /) une inactivation par TetX (identifiant GenBank de la protéine : AAA27471.1), une tétracycline oxydoréductase NADPH-dépendante (Speer, Bedzyk et al. 1991). Cette enzyme induit une résistance bactérienne vis-à-vis de toutes les tétracyclines.

Lincosamides

Les lincosamides (lincomycine et son dérivé semi-synthétique clindamycine) sont des antibiotiques bactériostatiques qui, bien que de structure chimique distincte de celle des macrolides, possèdent un mode d'action similaire et sont regroupés avec les spectogramines B dans une même famille dite MLS (macrolides, lincosamides et streptogramines).

Le spectre d'action des lincosamides recouvre à la majorité des bactéries gram positif (e.g. Bacillus cereus, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecium, Staphylococcus méti-S et méti-R, Streptococcus B, Streptococcus non groupable, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes) à quelques exceptions près telles Streptococcus faecalis, ainsi que de nombreuses bactéries anaérobies à l'exception notable de Clostridium difficile (e.g. actinomyces, bacteroides, fusobacterium, Propionibacterium acnés). La plupart des bactéries gram négatifs sont résistantes en dehors de quelques rares exceptions (i.e. Bordetella pertussis, Campylobacter, Chlamydia, Helicobacter, et Legionella).

Les lincosamides sont principalement éliminées par voie urinaire, ainsi qu'à moindre degré par voie biliaire avec cycle entéro-hépatique. Leur élimination par voie digestive et leur spectre d'activité antibactérien explique la fréquence élevée de colites pseudomembraneuses par sélection de Clostridium difficile.

Comme les macrolides, les lincosamides inhibent la traduction bactérienne en se fixant de façon réversible à la sous-unité 50S des ribosomes, au niveau des sites A et P (Tu, Blaha et al. 2005). Trois mécanismes de résistance acquise aux lincosamides sont connus (Roberts, Sutcliffe et al. 1999) : (/ ^' ) une modification de la cible par méthylation ou mutation de l'ARN ribosomal bactérien 23S, qui compose l'ARN ribosomal 50S. Ce mécanisme de résistance qui est celui le plus fréquemment rencontré, est commun aux macrolides, lincosamides et les streptogramines B (Weisblum 1995), (/ ^' / ^' ) expression par la bactérie de pompes qui effluent l'antibiotique hors de la cellule, ce qui entraine une diminution de sa concentration intracellulaire, (/ ^' / ^' /) une inactivation enzymatique des lincosamides qui réduit leur affinité pour leur cible moléculaire. Les enzymes susceptibles d'inactiver les lincosamides appartiennent à la famille des lincomycine nucleotidyltransferases Inu(A) ou lin(A) chez staphylocoques, Inu(B) ou lin(B) chez Enterococcus faecium, et linB-like chez des anaérobies (Leclercq, Brisson-Noel et al. 1987, Bozdogan, Berrezouga et al. 1999). Par exemple, l'enzyme Inu(B) (identifiant UniProtKB/TrEMBLde la protéine : Q.9WVY4) catalyse le transfert d'un résidu adenyl sur le groupement hydroxyle en position 3 de la lincomycine et la clindamycine (Bozdogan, Berrezouga et al. 1999).

Contrer les effets secondaires de ces antibiotiques

Il est connu de l'art antérieur des inhibiteurs d'antibiotiques visant à diminuer les effets secondaires précédemment présentés au niveau intestinal. Ces inhibiteurs sont essentiellement ciblés contre les bêta-lactamines et consistent principalement en des bêta- lactamases administrées par voie orale pour leur diffusion au niveau du tractus intestinal.

Le brevet EP0671942 se rapporte à une application médicale, à un procédé médical et à une préparation pharmaceutique. Cette invention permet de cibler l'action des bêta-lactamines administrés par voie parentérale et de réduire leurs effets secondaires grâce à l'inactivation d'une partie de l'antibiotique dans le tractus digestif, en administrant, séparément de l'antibiotique ou simultanément à lui, une enzyme, telle que la β-lactamase, par voie orale qui entraîne la dégradation de l'antibiotique.

La demande de brevet EP2086570 utilise d'une manière similaire une bêta-lactamase de classe A, plus spécifiquement l'enzyme PIA, pour réduire les effets secondaires intestinaux associés à une antibiothérapie combinant une bêta-lactamine et un inhibiteur de bêta- lactamase.

L'efficacité de la bêta-lactamase PIA a été évaluée pré-cliniquement et cliniquement. Cette enzyme hydrolyse les aminopénicillines (e.g. amoxicilline) et les ureidopénicillines (e.g. pipéracilline), mais est sensible aux inhibiteurs des bêta-lactamines. Son administration orale chez le chien, simultanément à une administration parentérale d'ampicilline, réduisait de manière dose dépendante la quantité d'ampicilline détectée dans la lumière du jéjunum de ces animaux. De plus, la présence de la bêta-lactamase PIA n'était pas détectée au niveau circulant et les concentrations sériques d'ampicilline n'étaient pas significativement modifiées (Harmoinen, Vaali et al. 2003, Harmoinen, Mentula et al. 2004). L'administration de cette enzyme par voie orale à des souris recevant une administration parentérale de pipéracilline a permis de réduire de manière très significative le nombre de microorganismes résistants à cet antibiotique dans les selles (VRE-Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae et Candida glabrata) (Stiefel, Pultz et al. 2003, Mentula, Harmoinen et al. 2004).

Enfin, une étude clinique a montré que l'administration orale de la bêta-lactamase PIA permettait de diminuer le nombre d'isolats d'entérobactéries résistantes à l'ampicilline chez les volontaires sains après administrations intraveineuses d'ampicilline, ainsi que le nombre d'isolats d'entérobactéries résistantes à d'autres classes d'antibiotiques, en particulier résistants aux tétracyclines (Tarkkanen, Heinonen et al. 2009).

Des enzymes bêta-lactamases recombinantes appartenant à d'autres classes de bêta- lactamases ont également été développées. Le brevet EP2038411 décrit une métallo bêta- lactamase mutante et son procédé de synthèse pour réduire les effets secondaires intestinaux chez des patients recevant des carbapénemes.

On connaît également de l'art antérieur des formes galéniques pour cibler la délivrance de ces enzymes au niveau de l'intestin. Le brevet FR2843302 décrit des formes galéniques multi-particulaires administrables par voie orale pour la délivrance limitée au colon d'enzymes capables d'inhiber des macrolides, par exemple l'érythromycine estérase.

Inconvénient des solutions de l'art antérieur

Les solutions de l'art antérieur utilisent des enzymes ne ciblant qu'un seul type d'antibiotique, les bêta-lactamases dégradant les bêta-lactamines ou l'érythromycine estérase inhibant les macrolides.

Différents antibiotiques sont généralement utilisés chez les malades en milieu hospitalier, voire même combinés chez un même malade. L'inhibition d'une seule classe d'antibiotique n'a donc qu'un effet attendu modeste ou minime sur l'émergence de souches bactériennes résistantes.

A titre d'exemple, les infections sévères à bacilles gram négatifs sont fréquemment traitées par association d'une céphalosporine de 3 ^e génération et d'un aminoglycoside, alors que les pneumopathies atypiques sont volontiers traitées par association amoxicilline-acide clavulanique et macrolide ou tétracycline.

Les inhibiteurs d'antibiotiques décrits dans l'art antérieur étant dirigés contre une unique classe d'antibiotiques, ils ne permettent pas de prévenir efficacement l'émergence de souches bactériennes résistantes dans un environnement où sont utilisées simultanément différentes classes d'antibiotiques, notamment en milieu hospitalier.

Solution apportée par l'invention

La présente invention se propose dans son acceptation la plus générale de remédier aux inconvénients de l'art antérieur en proposant une molécule protéique hybride comportant au moins deux protéines aptes à inhiber l'activité d'au moins un antibiotique, chaque protéine ayant des caractéristiques biochimiques différentes, lesdites protéines étant liées entre elles. Dans un mode de réalisation, lesdites protéines aptes à inhiber l'activité d'au moins un antibiotique sont liées entre elles de manière covalente. La molécule protéique hybride conformément à l'invention inhibe l'activité d'au moins un antibiotique pour diminuer les effets secondaires intestinaux des antibiotiques, tels que les diarrhées aiguës induites par les antibiotiques et les infections nosocomiales secondaires à une antibiothérapie parentérale.

L'on comprend que la présente invention présente donc un spectre d'action élargi par rapport aux solutions de l'art antérieur.

Préférentiellement, la molécule protéique hybride de la présente invention est administrée oralement. La molécule protéique hybride conforme à l'invention peut comporter des protéines aptes à inhiber de nombreuses classes d'antibiotiques, et notamment les associations les plus couramment utilisées en pratique clinique. Ainsi, l'administration de la seule molécule protéique hybride permet de cibler plusieurs antibiotiques, ce qui réduit le nombre de produits prescrits.

On entend par molécule protéique hybride une protéine hybride constituée par l'assemblage artificiel de deux ou plusieurs chaînes polypeptidiques.

On entend par inhibition de l'activité antibiotique tout processus aboutissant à une réduction ou une suppression de l'activité biologique de l'antibiotique considéré, ce qui inclus, sans être limité, à une fixation de l'antibiotique à une autre molécule de manière spécifique (e.g. grâce à un anticorps monoclonal ou un fragment d'anticorps monoclonal) ou aspécifique (e.g. par adsorption), une modification de l'antibiotique par addition enzymatique ou non-enzymatique d'un groupement chimique, ou l'hydrolyse de l'antibiotique par un mécanisme antibiotique ou non-antibiotique.

Avantageusement, l'une au moins des protéines est une enzyme apte à inhiber l'activité d'au moins un antibiotique.

Selon un autre mode de réalisation, chaque protéine est une enzyme apte à inhiber préférentiellement l'activité d'au moins un antibiotique.

Avantageusement, chaque protéine inhibe préférentiellement l'activité d'antibiotiques différents.

L'on comprend que dans un mode particulier de réalisation de la présente invention, la molécule protéique hybride comporte au moins deux enzymes aptes à inhiber l'activité d'au moins un antibiotique, chaque enzyme ayant des caractéristiques biochimiques différentes, lesdites enzymes étant liées entre elles de manière covalente.

L'on comprend que chaque enzyme dégrade préférentiellement deux antibiotiques différents.

La présente invention démontre, de manière inattendue, que les molécules protéiques hybrides comme définies précédemment combinent les activités fonctionnelles respectives des protéines les constituant, ce qui aboutit à l'élargissement de leur spectre d'action et la potentialisation de leur efficacité dans un environnement hospitalier soumis à forte pression de sélection.

Plusieurs types de protéines capables d'inactiver un ou plusieurs antibiotiques peuvent être utilisés pour constituer cette molécule protéique hybride, incluant des fragments d'anticorps monoclonaux (par exemple ScFv monovalent ou bivalent), des enzymes de type hydrolase ou catalysant d'autres types de modifications.

Avantageusement, la molécule protéique hybride selon l'invention est constituée d'une ou plusieurs protéines aptes à inhiber l'activité d'un antibiotique, et de préférence un antibiotique choisi parmi une bêta-lactamine, un aminoglycoside, une fluoroquinolone, un macrolide, une tétracycline et/ou une lincosamide. Préférentiellement, chaque protéine de la molécule protéique hybride inhibe l'activité d'antibiotiques différents. Dans un mode de réalisation, la molécule protéique hybride comporte deux protéines aptes à inhiber l'activité d'antibiotiques appartenant à la même classe.

Avantageusement, la séquence de l'une au moins des protéines constitutives de la protéine hybride présente une homologie de séquence protéique d'au moins 40% avec les SEQ. ID1 à SEQ ID7. Cette homologie de séquence est déterminée au moyen du logiciel CLUSTALW2 ou CLUSTALOMEGA avec des paramètres standards de calculs (Thompson, Higgins et al. 1994, Larkin, Blackshields et al. 2007). Préférentiellement, cette homologie de séquence est d'au moins 50%, encore plus préférentiellement d'au moins 60% avec les séquences SEQ. ID1 à SEQ ID7.

Les protéines ou enzymes constitutives de la molécule protéique hybride peuvent comporter aucune, une ou plusieurs glycosylations.

Selon un mode de réalisation, les protéines ou enzymes sont fusionnées en une protéine unique monocaténaire.

Dans un mode préféré de réalisation, la molécule protéique hybride comporte deux enzymes inhibant l'activité d'au moins un antibiotique, l'une desdites enzymes étant une bêta- lactamase et l'une desdites enzymes étant une enzyme choisie parmi les bêta-lactamases, les enzymes inhibant un aminoglycoside, les enzymes inhibant une fluoroquinolone, les enzymes inhibant un macrolide, les enzymes inhibant une tétracycline ou les enzymes inhibant une lincosamide, lesdites enzymes étant liées entre elles.

L'on comprend que la molécule protéique hybride peut comporter : deux enzymes bêta-lactamases liées entre elles ; ou

une enzyme choisie parmi les bêta-lactamases et une enzyme inhibant un aminoglycoside liées entre elles, ladite enzyme inhibant un aminoglycoside étant une phosphotransférase, une nucléotidyltransférase ou une acétyltransférase ; ou une enzyme choisie parmi les bêta-lactamases et une enzyme inhibant une fluoroquinolone liées entre elles, ladite enzyme inhibant une fluoroquinolone étant une aminoglycoside N-acétyltransférase ; ou

une enzyme choisie parmi les bêta-lactamases et une enzyme inhibant un macrolide liées entre elles, ladite enzyme inhibant un macrolide étant une érythromycine estérase ou une érythromycine phosphotransférase ; ou

une enzyme choisie parmi les bêta-lactamases et une enzyme inhibant une tétracycline liées entre elles, ladite enzyme inhibant une tétracycline étant une tétracycline oxydoréductase NADPH dépendante ; ou

une enzyme choisie parmi les bêta-lactamases et une enzyme inhibant une lincosamide liées entre elles, ladite enzyme inhibant une lincosamide étant une lincomycine nucléotidyltransférase.

Les inventeurs ont de façon inattendue et surprenante constaté que la molécule protéique hybride présente une efficacité à rencontre de ses antibiotiques cibles équivalente aux enzymes la constituant prises isolément.

Ces protéines hybrides peuvent être obtenues artificiellement sous la forme d'une seule chaîne protéique résultant de la traduction d'un unique cadre de lecture obtenu soit par fusion directe des cadres de lecture respectifs des protéines la constituant, soit par l'intermédiaire d'une séquence nucléotidique codant pour un adaptateur constitué d'un ou plusieurs acides-aminés. Cet adaptateur, réputé inerte et sans action biologique particulière, peut être souple, semi-rigide ou rigide (Chen, Zaro et al. 2013).

Selon un autre mode de réalisation, les protéines ou enzymes sont liées entre elles de manière covalente par cross-linking.

Ces protéines hybrides peuvent également être obtenues artificiellement par cross-linking au moyen d'agents chimiques (Chen, Nielsen et al. 2013), d'une catalyse enzymatique (Paguirigan and Beebe 2007), d'une exposition aux ultra-violets (Fancy and Kodadek 1999), ou tout autre procédé aboutissant à la formation d'une liaison covalente. Alternativement, ces protéines hybrides peuvent être obtenues par assemblage entre elles de plusieurs sous- unités protéiques de manière non covalente au moyen de ligands de forte affinité, tels que par exemple le complexe (strept)avidin/biotine (Schultz, Lin et al. 2000, Lin, Pagel et al. 2006, Pagel, Lin et al. 2006).

La présente invention selon un autre aspect porte sur une composition pharmaceutique à usage humain ou vétérinaire comportant la molécule protéique hybride conformément à l'invention pour une utilisation dans la prévention de modifications de la flore intestinale.

Avantageusement, l'invention porte sur une composition pharmaceutique pour une utilisation dans la prévention des infections nosocomiales. Avantageusement, l'invention porte sur une composition pharmaceutique pour une utilisation dans la prévention des diarrhées associées à la prise d'antibiotiques.

Selon un mode de réalisation préférentiel, la composition pharmaceutique comportant la molécule protéique hybride conforme à l'invention est sous une forme galénique pour une administration par voie orale.

L'on comprend que l'invention porte sur une composition pharmaceutique comportant une molécule protéique hybride pour la prévention de modifications de la flore intestinale normale dans le but de prévenir la dissémination de bactéries résistantes dans l'environnement, réduire le risque et/ou la gravité des infections nosocomiales causées par des microorganismes multi-résistants, ainsi que de diminuer la fréquence et la gravité de diarrhées induites par les antibiotiques.

Avantageusement, la composition pharmaceutique est destinée à une administration chez l'Homme, y compris en pédiatrie. L'on comprend que la composition pharmaceutique selon la présente invention peut être administrée, préférentiellement par voie orale, avant, simultanément ou après à une administration d'un ou plusieurs antibiotiques.

Selon un autre mode de réalisation, la composition pharmaceutique est à usage vétérinaire pour une utilisation dans la prévention de la dissémination de résistance bactérienne aux antibiotiques par les animaux domestiques de compagnie et chez les animaux d'élevage recevant des antibiotiques.

La composition pharmaceutique selon la présente invention comporte également toute substance pharmaceutiquement acceptable telle que des adjuvants, des excipients, des stabilisants, des sels, des texturants, des liants, des lubrifiants, des agents d'enrobage, des colorants, des arômes, ou tout autre agent classiquement utilisé et connu de l'Homme du métier.

La composition pharmaceutique selon l'invention peut être sous forme solide ou liquide, non limitativement sous forme de gel, de sirop, de gélules, de comprimés, de suspension ou d'émulsion.

Selon une variante, la composition pharmaceutique comporte au moins un agent gastroprotecteur.

L'on entend par agent gastroprotecteur un agent résistant aux sucs gastriques pour une libération différée de la molécule protéique hybride au niveau de l'intestin, préférentiellement au niveau du duodénum et du jéjunum. L'agent gastroprotecteur peut également être un agent d'enrobage tel que non limitativement despolyméthacrylates (par exemple Eudragit ^® ), des polymères à base de cellulose (éthers de cellulose : par exemple Duodcell ^® , esters de cellulose ), des copolymères d'acétate de polyvinyl (par exemple Opadry ^® ) ou tout autre agent d'enrobage ou d'encapsulation ou procédé connus de l'Homme du métier.

Selon un autre aspect, l'invention porte sur un procédé de production de la molécule protéique hybride dans un organisme recombinant vivant non humain.

L'on entend par organisme recombinant vivant toute cellule apte à être génétiquement modifiée pour la production de la molécule protéique hybride.

De façon non limitative, on entend par cellule apte à être génétiquement modifiée toute cellule procaryote (e.g. Escherichia coli), levure (e.g. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica), cellules d'insecte infectées ou non par un baculovirus, cellules de mammifères (e.g. CHO, CHO-K1, HEK293, H EK293T).

Description

La présente invention sera mieux comprise à la lumière de la description des exemples non limitatifs suivants.

Description des figures

La figure 1 décrit un alignement de séquences protéiques de différentes bêta-lactamases appartenant à la famille des I R-TEM (Amber Classe A). L'alignement a été effectué avec le logiciel CLUSTALW2 sur le site https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ en utilisant les paramètres par défaut. La figure 1 montre par un alignement de plusieurs séquences, que les enzymes I R-TEM présentent >90% d'identité protéique entre elles. Ces enzymes sont relativement bien conservées partageant entre 80 et 99% d'identité de séquence protéique entre elles, et également bien caractérisées (Bonnet 2004).

La figure 2 décrit un alignement de séquences protéiques de différentes bêta-lactamases appartenant à la famille des CTX-M cefotaximases (Ambler Classe A). L'alignement a été effectué sur le site https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ en utilisant les paramètres par défaut du logiciel.

La figure 3 représente une illustration de la technique de PCR utilisée pour générer les protéines hybrides. Deux protéines sont tout d'abord amplifiées séparément avec une séquence commune (aux extrémités 3' et 5' respectivement) constitutive d'un linker. Les deux fragments sont alors hybridés au niveau de la séquence d'ADN complémentaire (celle du linker) et le tout est réamplifié à l'aide d'amorces externes.

La figure 4 décrit l'ensemble des constructions utilisées pour exprimer les protéines TEM-36 (SEQ. ID1), CTXM-16 (SEQ. I D2), TEM36-GGGGGG-CTXM 16 (SEQ ID8), CTXM 16-GGGGGG- TEM36 (SEQ I D9) et TEM36-G(EAAAK)2-CTXM 16 (SEQ ID 10) chez Pichia pastoris. Le clonage dans le vecteur pJexpress915 a été effectué en Xhol/Notl en utilisant lorsque nécessaire des digestions modérées pour préserver les sites Notl internes à la séquence ADN codante de CTXM 16.

La figure 5 montre les fragments d'ADN clonés en Xhol / Notl codant pour TEM-36 (SEQ I D1), CTXM-16 (SEQ I D2), TEM36-GGGGGG-CTXM 16 (SEQ ID8), CTXM 16-GGGGGG-TEM36 (SEQ I D9) et TEM36-G(EAAAK)2-CTXM 16 (SEQ I D 10) et qui ont été obtenus par PCR en utilisant les amorces pJexpress915-SEQ-F et pJexpress915-SEQ-R et le programme suivant (95°C 30 sec - 25 cycles [95°C 30sec - 53°C 45sec - 72°C 1min] - 72°C 5 min - 4°C).

La figure 6 montre les protéines hybrides et leurs enzymes constitutives TEM-36 (SEQ I D1) et CTXM-16 (SEQ I D 2) sur un gel SDS-PAGE 12% telles que obtenues par expression et purification dans Pichia Pastoris ainsi qu'après avoir subi un traitement de déglycosylation par EndoHf.

La figure 7 décrit l'ensemble des constructions utilisées pour exprimer les protéines TEM-36 (SEQ ID1), CTXM-16 (SEQ ID2) et les protéines hybrides TEM36-GGGGG-CTXM 16, CTXM 16- GGGGG-TEM36 chez Escherichia coli. Le clonage dans le vecteur pET-26b(+) a été effectué en Ndel/Hindl ll .

La figure 8 montre les fragments d'ADN clonés en Ndel / Hindll l dans le pET-26b(+) codant pour TEM-36 (SEQ I D1), CTXM-16 (SEQ ID2), TEM36-GGGGG-CTXM 16, CTXM 16-GGGGG- TEM36 et qui ont été obtenus par PCR en utilisant les amorces T7-F et T7-R et le programme suivant (95°C 30 sec - 25 cycles [95°C 30sec - 55°C 45sec - 72°C 1min] - 72°C 5 min - 4°C).

La figure 9 montre les protéines hybrides (TEM36-G ₅ -CTXM 16 et CTXM 16-G ₅ -TEM36) et leurs enzymes constitutives TEM-36 (SEQ ID1) et CTXM-16 (SEQ I D 2) sur un gel SDS-PAGE 12% telles que obtenues par expression dans E. coli et purification à partir de la fraction périplasmique.

La figure 10 montre les fragments d'ADN codant pour AAC-6'-l b-cr (SEQ ID4), CTXM-16 (SEQ I D2), et AAC-H6-CTXM16 qui ont été obtenus dans la construction de la fusion AAC-H6- CTXM 16 (SEQ I D 18).

La figure 11 montre la protéine hybride AAC-H ₆ -CTXM 16 et ses enzymes constitutives AAC- 6'-l b-cr (SEQ I D4) et CTXM-16 (SEQ I D 2) sur un gel SDS-PAGE 12% telles que obtenues après expression et purification dans E. coli pour AAC-6'-l b-cr et la protéine hybride et P. pastoris pour CTXM16.

La figure 12 montre les fragments d'ADN codant pour EreB (SEQ ID5), TEM36 (SEQ I D1), et EreB-H6-TEM36 qui ont été obtenus dans la construction de la fusion EreB-H6-CTXM 16 (SEQ I D 20). Description du listage de séquences

La table 1 ci-après récapitule les séquences du listage de séquence et fait correspondre à chaque identifiant SEQ.-ID (N° ID dans la table) le type de séquence, son nom, son origine, son organisme d'expression, sa taille.

Table 1. Identification des séquences 1 à 22 du listage de séquences

Micro¬

N° Nom Identifiant

Nature Hôte d'origine organisme Longueur Description

ID commun

d'expression

Non E. coli /P. β-lactamase

Protéique 1 TEM36 Escherichia coli 263 aa

disponible pastoris (aminopenicillinase)

E. coli /P. β-lactamase

Protéique 2 CTXM16 AAK32961 Escherichia coli 263 aa

pastoris (cefotaximase)

Staphylococcus E. coli /P. β-lactamase

Protéique 3 PCI P00807 257 aa

aureus pastoris (methicillinase) fluroquinolone

AAC-6'-lb- E. coli /P. acetylating

Protéique 4 ABC17627.1 Escherichia coli 199 aa

cr pastoris aminoglycoside acetyltransferase

E. coli /P. Erythromycine

Protéique 5 EreB P05789.1 Escherichia coli 419 aa

pastoris estérase

Tétracycline oxydo-

Bacteroides E. coli /P.

Protéique 6 TetX AAA27471.1 388 aa reductase NADPH- fragilis pastoris

dépendante

LnuB (ou Enterococcus E. coli /P. Lincomycine

Protéique 7 Q9WVY4 267 aa

linB) faecium pastoris nucleotidyltransferase

Fusion TEM36 et

TEM36-G ₆ - Non Pichia

Protéique 8 Artificielle 532 aa CTXM16 avec linker

CTXM16 applicable Pastoris

flexible 6 Glycines

Fusion CTXM16 et

CTXM16- Non Pichia

Protéique 9 Artificielle 532 aa TEM36 avec linker

G ₆ -TEM36 applicable Pastoris

flexible 6 Glycines

TEM36- Fusion TEM36 et

Non Pichia

Protéique 10 G(EAAAK) ₂ - Artificielle 537 aa CTXM16 avec linker applicable Pastoris

CTXM16 rigide G(EAAAK) ₂

Séquence totale du

Non E. coli /P. vecteur pJexpress915

Nucléotidique 11 TEM36 Escherichia coli 4158 bp

disponible pastoris avec l'insert TEM36 cloné en Xhol/Notl

E. coli /P.

Nucléotidique 12 CTXM16 AAK32961 Escherichia coli 900 bp Séquence de l'insert pastoris

CTXM16 cloné en Xhol/Notl

Séquence de l'insert

TEM36-G ₆ - Non Pichia

Nucléotidique 13 Artificielle 1680 bp TEM36-G ₆ -CTXM16

CTXM16 applicable Pastoris

cloné en Xhol/Notl

Séquence de l'insert

CTXM16- Non Pichia

Nucléotidique 14 Artificielle 1634 bp CTXM16-G ₆ -TEM36

G ₆ -TEM36 applicable Pastoris

cloné en Xhol/Notl

Séquence de l'insert

TEM36-

Non Pichia TEM36-G(EAAAK) ₂ -

Nucléotidique 15 G(EAAAK) ₂ - Artificielle 1648 bp

applicable Pastoris CTXM16 cloné en CTXM16

Xhol/Notl

Insert Ndel/Hindlll codant pour CTX-M16

Nucléotidique 16 CTXM16 AAK32961 Escherichia coli E. coli 870

dans le vecteur pET26b+

Insert Ndel/Hindlll

AAC-6'-lb-

Nucléotidique 17 ABC17627.1 Escherichia coli E. coli 627 codant pour AAC dans cr

le vecteur pJ404.

Fusion AAC-6'-lb-cr

AAC-H6- Non avec CTX-M16 avec un

Nucléotidique 18 Artificielle E. coli 1416

CTXM16 applicable linker de type Tag polyhistidine

Insert Ndel/Hindlll

Nucléotidique 19 EreB P05789.1 Escherichia coli E. coli 1287 codant pour AAC dans le vecteur pET26b+.

Fusion EreB avec

EreB-H6- Non TEM36 avec un linker

Nucléotidique 20 Artificielle E. coli 2076

TEM36 applicable de type Tag polyhistidine

Fusion AAC-6'-lb-cr

AAC-H6- Non avec CTX-M16 avec un

Protéique 21 Artificielle E. coli 468

CTXM16 applicable linker de type Tag polyhistidine

Fusion EreB avec

EreB-H6- Non TEM36 avec un linker

Protéique 22 Artificielle E. coli 688

TEM36 applicable de type Tag polyhistidine Exemple 1 : molécule protéique hybride constituée de la fusion de TEM-36 et de CTX-M16 par un linker flexible

Le premier mode de réalisation de la présente invention décrit la fusion d'une I R-TEM (SEQ. I Dl ; (Chaibi, Sirot et al. 1999)) avec une cefotaximase (SEQ I D2 ; (Bonnet, Dutour et al. 2001)) par l'intermédiaire d'un linker flexible polyglycine (6 résidus glycine dans cet exemple) et donnant naissance à une protéine hybride (SEQ ID8) capable d'hydrolyser l'amoxicilline même en présence d'acide clavulanique ainsi que la ceftriaxone.

Les séquences nucléotidiques codant pour les protéines TEM-36 (SEQ I Dl) et CTX-M 16 (SEQ I D2) ont été obtenues commercialement par synthèse de gène dans un vecteur d'expression pour Pichia pastoris (https://www.dna20.com/services/Qene- synthesis?gcÎid ^~ CPnQÎp3c9rOCFaoewwodnREAlq). La séquence nucléotidique de TEM-36 insérée dans le vecteur d'expression correspond à la SEQ I D 11 et la séquence nucléotidique de CTX-M 16 insérée dans le vecteur d'expression correspond à la SEQ I D 12. Ces séquences ont alors été amplifiées par PCR (95°C 30 sec - 25 cycles [95°C 30 sec - TM°C45sec - 72°C 1min] - 72°C 5 min - 4°C) en utilisant une ADN polymerase de haute-fidélité (Pfu, Promega) et des amorces partiellement complémentaires et constitutives du linker protéique (GGGGGG dans cet exemple) comme indiqué dans la Table 2. TEM-36 a été amplifiée en utilisant le couple d'amorce TEM36-F et TEM36-6G-R avec un TM de 57°C. CTXM 16 a été amplifiée en utilisant le couple d'amorce 6G-CTXM 16-F et CTXM 16-R avec un TM de 57°C. Les séquences constitutives du linker GGGGGG sont indiquées en gras souligné dans la table 2.

Table 2. Liste des amorces utilisées pour construire et séquencer la protéine hybride TEM- 36/CTX-M 16 à linker rigide.

Les deux fragments PCR ainsi obtenus ont été hybridés à un TM de 55°C et complémentés pendant 5 cycles de PCR sans amorces (95°C 30sec - 55°C 45 sec - 72°C 2minl5) en utilisant une ADN polymérase de haute-fidélité (Pfu, Promega). La séquence totale codant pour la protéine hybride a été réamplifiée après rajout des amorces externes (TEM36-F + CTXM 16- R). Ce mode de réalisation des fusions par PCR est schématiquement représenté dans la Figure 3.

La fusion TEM36-GGGGGG-CTXM16 ainsi réalisée a été clonée avec les enzymes de restrictions Xhol et Notl dans le vecteur pJexpress915 (expression Pichia pastoris) (Figure 4). La séquence de la construction hybride a été vérifiée dans les 2 sens et correspond à la fusion décrite. La figure 5 récapitule les fragments PCR obtenus avec les amorces pJexpress915-SEQ-F &pJexpress915-SEQ-R.

Les vecteurs d'expressions pJexpress915 exprimant TEM-36, CTX-M16 et la fusion TEM36- GGGGGG-CTXM16 ont été amplifiés dans Escherichia coli DH10B en maintenant une pression de sélection Zéocine (Invitrogen) à 25 μg/ml sur milieu LB appauvri en sel (Extrait de Levure 5 g/1 ; Tryptone 10 g/1 ; NaCI 5 g/1 pH=7.5). Pour transformer Pichia pastoris, 2 μg de vecteur linéarisé avec l'enzyme Swa I ont été électroporés dans 60 μΙ de cellules compétentes par un choc à 1500 V. Les cellules transformées sont reprises dans 1 ml de Sorbitol 1 M froid et cultivées 2 heures à 30°C avant étalement (par 200 μΙ) sur milieu YPD-agar (Extrait de levure 10 g/1 ; Peptone 20 g/1 ; Dextrose 20 g/L ; agar 15g/l - Phosphate lOmM pH=6.8) contenant 100 à 400 μg/ml de Zéocine et de la nitrocéfine (20 μg/ml).

L'expression dans Pichia pastoris à partir du vecteur pJexpress915 aboutit à une sécrétion des protéines d'intérêt qui se retrouvent dans le milieu de culture. Sur boîtes YPD-agar contenant de la nitrocéfine, les bêta-lactamases sécrétées induisent un halo d'hydrolyse rouge (λ = 486 nm) autour des colonies qui est représentatif du niveau d'expression. Après 48 heures d'incubation, les transformants présentant la meilleure expression pour chaque construction sont inoculés en tube sterilin contenant 5 ml de YPD et 100 μg/ml de Zéocine et cultivés pendant 48 heures à 30°C et 200 rpm pour l'agitation.

Les pré-cultures sont alors inoculées dans 400 ml (200 ml par erlen baflé) de milieu YPD frais sans pression de sélection antibiotique avec une densité optique initiale de 0.2 à 600 nm. La culture est réalisée 48 heures à 30°C sous une agitation de 100 rpm. Après centrifugation à 10,000 xg pendant 15 minutes à 4°C, le milieu de culture (surnageant) est conservé à 4°C en présence de benzamidine (1 mM final). Les protéines du milieu de culture sont concentrées 10 fois par filtration tangentielle sur une membrane de 10 kDa (Module Vivaflow 10, Sartorius) jusqu'à un volume de 40 ml, puis jusqu'à 10 ml par ultrafiltration sur membrane de 10 kDa (Centricon, Millipore). Les 10 ml sont injectés sur une colonne de chromatographie d'exclusion (Superdex G75 pour les protéines TEM-36 et CTX-M16, Superdex G200 pour la fusion ; colonnes 26*60 GE Healthcare), et éluées en tampon phosphate de sodium 10 mM pH = 7.0 par fraction de 1 ml et avec un débit de 1 ml/min.

Les fractions présentant la plus forte activité sur nitrocéfine (VWR) et la meilleure pureté (SDS-PAGE) sont combinées et concentrées à environ 0.1-0.5 mg/ml. La teneur protéique des échantillons est mesurée par BCA (Pierce), absorbance à 280 nm et vérification sur gel SDS-PAGE. La figure 6 présente les résultats obtenus.

Pour CTX-M16 et la fusion, qui présentent des sites de N-glycosylation, la glycosylation est vérifiée par coupure des sucres avec l'enzyme EndoHf (New EnglandBiolabs) selon les recommandations du fabricant (sur la nuit à 37°C en conditions non-dénaturantes). Les protéines produites et purifiées ont été confirmées par digestion trypsique et analyse spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Comme indiqué par la figure 6, la protéine TEM-36 n'est pas glycosylée et présente une taille compatible avec la taille attendue de 28 kDa, contrairement aux protéines CTX-M16 et les différentes fusions réalisées. Ces dernières ont un poids moléculaire apparent supérieur sur gel SDS-PAGE (45 kDa contre 28 kDa et >66 kDa contre 56 kDa pour CTX-M16 et les fusions respectivement). La coupure avec EndoHf permet d'obtenir des protéines de poids moléculaire attendu (28 kDa et 56 kDa pour CTX-M16 et les fusions respectivement) ce qui confirme que ces protéines sont glycosylées.

Les protéines purifiées ont été testées sur différentes bêta-lactamines (amoxicilline (Apollo Scientific), Augmentin® (GlaxoSmithKIine) et Ceftriaxone (Rocéphine®, Roche)). Les dosages sont effectués au pH-STAT (Titrino 2.5, Metrohm) dans un volume réactionnel de 25 ml à 37°C et pH = 7.0. Les substrats sont préparés à 4 g/1 dans un tampon Tris 0.3 mM, NaCI 150 mM. L'hydrolyse enzymatique des noyaux bêta-lactame libère un acide et entraine une baisse du pH. Le principe du dosage consiste à compenser cette acidification par ajout de soude 0,1 N de manière à rester à pH = 7.0. Dans ces conditions, une unité correspond à 1 μιηοΐθ de soude ajoutée par minute, c'est-à-dire une μιηοΐθ de bêta-lactame hydrolysée par minute. La table 3 ci-dessous récapitule les activités spécifiques mesurées pour chaque protéine sur les trois substrats (moyenne de 6 réplicats).

Table 3. Activités spécifiques de protéine hybride TEM-36/CTX-M16 à linker flexible et de leurs enzymes constitutives produites et purifiées dans Pichia pastoris

Ces résultats montrent que la fusion entre TEM-36 et CTX-M16 génère une protéine hybride ayant une activité à la fois sur une aminopénicilline même en présence d' inhibiteur de bêta-lactamase et une céphalosporine de troisième génération. Ces deux activités étant décrites comme antagonistes dans la littérature (Ripoll, Baquero et al. 2011), il n'existe aucune enzyme naturelle connue ayant des constantes catalytiques aussi élevées sur ces deux substrats.

Exemple 2 : molécule protéique hybride constituée de la fusion de CTX-M16 et de TEM-36 par un linker flexible

Le deuxième mode de réalisation de la présente invention décrit la fusion d'une céfotaximase (SEQ. ID2 ; (Bonnet, Dutour et al. 2001)) avec une IR-TEM (SEQ. ID1 ; (Chaibi, Sirot et al. 1999)) par l'intermédiaire d'un linker flexible polyglycine (6 résidus glycine dans cet exemple) et donnant naissance à une protéine hybride (SEQ. ID9) capable d'hydrolyser l'amoxicilline même en présence d'acide clavulanique ainsi que la céftriaxone.

Ce mode de réalisation est identique à celui décrit dans l'exemple 1 à l'exception des amorces de PCR utilisées pour l'amplification des séquences CTXM16 et TEM-36.

CTXM-16 a été amplifiée en utilisant le couple d'amorce CTXM16-F et CTXM16-6G-R avec un TM de 58°C. TEM-36 a été amplifiée en utilisant le couple d'amorce 6G-TEM36-F et TEM36-R avec un TM de 58°C. Les séquences constitutives du linker GGGGGG sont indiquées en gras souligné dans la table 4.

Table 4. Liste des amorces utilisées pour construire et séquencer la protéine hybride CTX- M16/TEM-36 à linker flexible.

Les deux fragments PCR ainsi obtenus ont été hybridés à un TM de 55°C et complémentés pendant 5 cycles de PCR sans amorces (95°C 30 sec - 55°C 45 sec - 72°C 2minl5) en utilisant une ADN polymérase de haute-fidélité (Pfu, Promega). La séquence totale codant pour la protéine hybride a été réamplifiée après rajout des amorces externes (CTXM16-F + TEM-36- R).

Les conditions utilisées pour l'expression et la purification de la protéine hybride CTXM16- GGGGGG-TEM36 ont été strictement identiques à celles décrites dans l'exemple 1. La protéine hybride ainsi obtenue est également glycosylée comme le montre la figure 6 et combine une activité pénicillinase persistante en présence d'acide clavulanique avec une activité céfotaximase.

Comme dans le cas de l'exemple 1, aucune protéine naturelle ne présente les activités spécifiques décrites dans la table 5 sur les deux substrats amoxicilline/acide clavulanique et céftriaxone.

Table 5. Activités spécifiques de protéine hybride CTX-M16/TEM-36 à linker rigide et de leurs enzymes constitutives produites et purifiées dans Pichia pastoris Exemple 3 : molécule protéique hybride constituée de la fusion de TEM-36 et de CTX-M16 par un linker rigide

Le troisième mode de réalisation de la présente invention décrit la fusion d'une IR-TEM (SEQ. ID1 ; (Chaibi, Sirot et al. 1999)) avec une cefotaximase (SEQ. ID2 ; (Bonnet, Dutour et al. 2001)) par l'intermédiaire d'un linker protéique rigide (motif G(EAAAK) ₂ dans cet exemple) et donnant naissance à une protéine hybride (SEQ ID10) capable d'hydrolyser l'arnoxicilline même en présence d'acide clavulanique ainsi que la ceftriaxone.

Ce mode de réalisation est identique à celui décrit dans l'exemple 1 à l'exception des amorces de PCR utilisées pour l'amplification des séquences CTXM16 et TEM-36. TEM-36 a été amplifiée en utilisant le couple d'amorce TEM36-F et TEM36-G(EAAAK) ₂ -R avec un TM de 58°C. CTXM16 a été amplifiée en utilisant le couple d'amorce CTXM16-G(EAAAK) ₂ -F et CTXM16-R avec un TM de 58°C. Les séquences constitutives du linker G(EAAAK) ₂ sont indiquées en gras souligné dans la table 6.

Table 6. Liste des amorces utilisées pour construire et séquencer la protéine hybride CTX- M16 et TEM-36 à linker rigide.

Les 2 fragments PCR ainsi obtenus ont été hybridés à un TM de 55°C et complémentés pendant 5 cycles de PCR sans amorces (95°C 30 sec - 55°C 45 sec - 72°C 2minl5) en utilisant une ADN polymérase de haute-fidélité (Pfu, Promega). La séquence totale codant pour la protéine hybride a été réamplifiée après rajout des amorces externes (TEM36-F + CTXM16- R).

Les conditions utilisées pour l'expression et la purification de la protéine hybride TEM36- G(EAAAK) ₂ -TEM36 ont été strictement identiques à celles décrites dans l'exemple 1. La protéine hybride ainsi obtenue est également glycosylée (Figure 6) et combine une activité pénicillinase persistante en présence d'acide clavulanique avec une activité céfotaximase.

Table 7. Activités spécifiques de protéine hybrideCTX-M16/TEM-36 à linker flexible et de leurs enzymes constitutives produites et purifiées dans Pichia pastoris Comme dans les exemples 1 et 2, aucune protéine naturelle ne présente les activités spécifiques décrites dans la table 7 sur les deux substrats amoxicilline/acide clavulanique et ceftriaxone.

Exemple 4 : molécules protéiques hybrides non-glycosylées constituées de la fusion de TEM-36 et de CTX-M16 (et inversement) par un linker flexible

Les séquences codantes pour TEM-36 (SEQ. ID1) et CTXM16 (SEQ. ID2) ont été obtenues commercialement par synthèse génique (https://www.dna20.com/services/gene- synthesis?qdid=:CPnQ.lp3c9rOCFaoewwodnREAIq) dans un vecteur d'expression périplasmique pour E. coli. Les séquences nucléotidiques ont été obtenues en phase avec le cadre de lecture codant pour un peptide d'adressage périplasmique (MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFA) avec un site de restriction Ndel au niveau de la méthionine initiatrice et un site de restriction Hindi 11 après le codon stop. Les fragments gèniques Ndel/Hindlll ont ensuite été sous-clonés dans le vecteur pET-26b(+) (Invitrogen).

Comme indiqué dans la figure 3, nous avons réalisé deux molécules protéiques hybrides par PCR de chevauchement . La séquence nucléotidique de TEM-36 et de CTX-M16 ont été amplifiées par PCR (95°C 30 sec - 25 cycles [95°C 30 sec - TM°C45sec - 72°C 1min] - 72°C 5 min - 4°C) en utilisant une ADN polymerase de haute-fidélité (Pfu, Promega) et des amorces partiellement complémentaires et constitutives du linker protéique (GGGGGG dans cet exemple). TEM-36 a été amplifiée avec un TM de 55°C en utilisant soit le couple d'amorce T7-F et TEM36-G6-R-co soit le couple d'amorces TEM36-G6-F-CO et T7-R. CTXM16 a été amplifiée avec un TM de 55°C en utilisant le couple d'amorce CTXM16-G6-F-co et T7-R soit le couple d'amorce CTXM16-G6-R-co et T7-F. Les séquences constitutives du linker GGGGGG sont indiquées en gras souligné dans la table 8.

Table 8. Liste des amorces utilisées pour construire et séquencer la protéine hybride TEM- 36/CTX-M16 à linker flexible.

Les fragments PCR ainsi obtenus (TEM36-G6 + G6-CTXM16 et CTXM16-G6 + G6-TEM36) ont été hybridés à un TM de 53°C et complémentés pendant 5 cycles de PCR sans amorces (95°C 30 sec - 53°C 45 sec - 72°C 2minl5) en utilisant une ADN polymérase de haute-fidélité (Pfu, Promega). La séquence totale codant pour la protéine hybride a été réamplifiée après rajout des amorces externes (T7-F + T7-R) fonctionnant à un TM de 55°C. Les fusions TEM36-GGGGGG-CTXM 16 et CTX-M 16-GGGGGG-TEM36 ainsi réalisées ont été clonées avec les enzymes de restrictions Ndel et Hindl ll dans le vecteur pET26b+ (expression dans E. coli) (Figure 7).

Les séquences des constructions hybrides ont été vérifiées dans les 2 sens et ont révélé que le linker des 2 molécules protéiques hybrides était en fait constitué de seulement 5 glycines. Un réarrangement nucléique plus favorable a probablement eu lieu au moment des PCR d'hybridations. La figure 8 récapitule les fragments PCR obtenus avec les amorces T7-F & T7- R.

Les vecteurs d'expressions pET-26b(+) exprimant TEM-36 (SEQ. I D1), CTX-M 16 (SEQ. I D2) et les fusions TEM36-G ₅ -CTXM 16 et CTXM16-G ₅ -TEM36 ont été amplifiés dans Escherichia coli DH10B en maintenant une pression de sélection Kanamycine (Euromedex) à 50 μg/ml sur milieu LB (Extrait de Levure 5 g/1 ; Tryptone 10 g/1 ; NaCllO g/1 pH=7). La souche d'expression BL21(DE3) pLysS a été transformée avec les vecteurs d'expression par choc thermique. Les cellules transformées sont étalées sur milieu LB-agar (Extrait de levure 5 g/1 ; TryptonelO g/1 ; NaCllO g/L ; agar 15g/lpH=7) contenant 50 μg/ml de Kanamycine.

L'expression dans E. coli à partir du vecteur pET-26b(+) aboutit à un adressage des protéines d'intérêt dans le compartiment périplasmique des bactéries où elles sont fonctionnelles. Les fusions créées telles que décrites dans l'exemple 4 ont été évaluées de 2 façons complémentaires, i) en caractérisant biochimiquement les protéines partiellement purifiées et ii) en comparant les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de différents b-lactams (amoxicilline, Augmentin et Rocéphine) sur les souches d'expressions.

Purification des molécules protéiques hybrides et de leur constituant dans E. coli :

Les bactéries transformées sont mises en culture dans 100 ml de LB + 50 μg/ml de Kanamycine à 37°C et sous 200 rpm d'agitation jusqu'à saturation. Les pré-cultures sont alors inoculées au l/40 ^eme dans 1 L de milieu LB + Kanamycine 50 μg/ml. Lorsque la DO600 nm a atteint une valeur de 0.6 (environ 2 heures), la production de protéine est induite par ajout d'I PTG 0.5 mM final et se poursuit pendant 16 heures à 20°C sous une agitation de 200 rpm. Les cellules sont centrifugées à 5,000 xg pendant 15 minutes à 4°C et le culot immédiatement repris dans un tampon d'osmolyse pour casser la membrane externe et récupérer le périplasme. Les cellules sont reprises avec 1 ml de tampon (Phosphate 100 mM, Sucrose 500 mM, EDTA 1 mM pH = 7.0) pour 120 Unités de DO600 nm et incubées quelques minutes avec homogénéisation au vortex (protocole adapté de (Schlegel, Rujas et al. 2013)). Après centrifugation à 12,000 xg pendant 20 minutes à 4°C, le surnageant contenant les protéines périplasmiques est concentré sur Amicon Ultra (15 ml, 10 kDa, Millipore) jusqu'à un volume inférieur à 10 ml. La totalité des protéines est injectée sur une colonne de chromatographie d'exclusion (Superdex G75, GE Healthcare) et les protéines sont éluées en tampon phosphate (Phosphate 10 mM, NaCI 100 mM pH = 7.0) par fraction de 1 ml et avec un débit de 1 ml/min. Les fractions présentant la plus forte activité sur nitrocéfine (VWR) et la meilleure pureté (SDS-PAGE) sont combinées et concentrées à environ 0.1-0.5 mg/ml. La teneur protéique des échantillons est mesurée par absorbance à 280 nm et vérification sur gel SDS-PAGE. La figure 9 présente les protéines partiellement purifiées telles qu'obtenues avant caractérisation biochimiques.

Les activités enzymatiques des protéines purifiées ont été mesurées sur différentes bêta- lactamines (amoxicilline (Apollo Scientific), Augmentin® (GlaxoSmithKIine) et Ceftriaxone (Rocéphine®, Roche)) tel que décrit dans les exemples précédents et les résultats sont compilés dans la table 9 ci-dessous.

Table 9. Activités spécifiques des molécules protéiques hybrides TEM36-G ₅ -CTXM 16 et CTXM 16-G ₅ -TEM36 (linker flexible) et de leurs enzymes constitutives produites et purifiées dans Escherichia coli BL21(DE3) pLysS.

Comme dans les exemples 1 à 3, aucune protéine naturelle ne présente les activités spécifiques décrites dans le tableau 9 sur les deux substrats amoxicilline et ceftriaxone.

Résistance des souches d'E. coli exprimant les molécules protéiques hybrides aux divers β- lactames:

Les bactéries transformées (exprimant TEM36, CTXM 16 ou les fusions TEM36-G5-CTXM 16 et CTXM 16-G5-TEM36) ou la souche vide (BL21(DE3)pLysS) sont mises en culture dans 5 ml de LB + 50 μg/ml de Kanamycine lorsque nécessaire à 37°C et sous 200 rpm d'agitation jusqu'à saturation. Les pré-cultures sont alors inoculées au l/40 ^eme dans 5 ml de milieu LB + Kanamycine 50 μg/ml et lorsque la DO600 nm a atteint une valeur de 0.6 (environ 2 heures), la production de protéine est induite par ajout d'I PTG 1 mM final et se poursuit pendant 1.5 heure à 37°C sous une agitation de 200 rpm.

Les cellules sont normalisées à 10 ⁸ cfu/ml et diluées en cascade à 10 ⁷ , 10 ⁶ , 10 ⁵ , 10 ⁴ cfu/ml et 5 μΙ de chaque suspension sont déposés sur une boite LB-Agar contenant des concentrations croissantes d'antibiotiques (Amoxicilline 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 μg/ml ; Augmentin 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 μg/m\ et Rocéphine 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 Mg/ml).

Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit et les résultats sont enregistrés le lendemain. Les CMIs correspondent à la concentration d'antibiotique la plus faible à laquelle le plus fort inoculum ne pousse plus.

Les données sont répertoriées dans la table 10 ci-dessous.

Table 10. CMIs d'antibiotiques β-lactames pour des souches ά' E.coli exprimant les molécules protéiques hybrides TEM36-G ₅ -CTXM16 et CTXM16-G ₅ -TEM36 (linker flexible) et de leurs enzymes constitutives.

Les cellules d'E.coli exprimant les molécules protéiques hybrides telles que décrites dans l'exemple 4 présente un phénotype de résistance multiple aux aminopénicillines (avec ou sans inhibiteurs comme l'acide clavulanique) et aux céphalosporines de 3 ^eme génération comme la ceftriaxone. Aucune souche bactérienne naturelle n'a pour l'instant été décrite dans la littérature avec un tel phénotype.

Exemple 5 : molécule protéique hybride constituée de la fusion de CTX-M16 et de AAC-6'- Ib-cr par un linker de type poly-histidine

Les séquences nucléotidiques codant pour les protéines CTX-M16 (SEQ ID2) et AAC-6'-lb-cr (ci-après abrégée AAC) (SEQ. ID4) ont été obtenues commercialement par synthèse de gène dans un vecteur d'expression pour E. coli, respectivement pJexpress411 (KanR) et pJ404(AmpR). La séquence nucléotidique de CTX-M16 insérée dans le vecteur pJexpress411 correspond à la SEQ. ID 16 et la séquence nucléotidique de AAC insérée dans le vecteur pJ404 correspond à la SEQ ID 12. Ces séquences ont alors été amplifiées par PCR (95°C 30 sec - 25 cycles [95°C 30 sec - TM°C45sec - 72°C 1min] - 72°C 5 min - 4°C) en utilisant une ADN polymérase de haute-fidélité (Pfu, Promega) et des amorces partiellement complémentaires et constitutives du linker protéique (HHHHHH dans cet exemple) comme indiqué dans la Table 11. CTX-M16 a été amplifiée en utilisant le couple d'amorce 6H-CTX-F et T7R avec un TM de 62°C. ACC a été amplifiée en utilisant le couple d'amorce AAC-F_coli et AAC-6H-R avec un TM de 50°C. Les séquences constitutives du linker HHHHHH sont indiquées en gras souligné dans la table 11.

Table 11. Liste des amorces utilisées pour construire et séquencer la protéine hybride AAC- H6-CTXM16 à linker polyhistidine.

Les deux fragments PCR ainsi obtenus ont été hybridés à un TM de 62°C et complémentés pendant 5 cycles de PCR sans amorces (95°C 30sec - 62°C 45 sec - 72°C 2minl5) en utilisant une ADN polymérase de haute-fidélité (Pfu, Promega). La séquence totale codant pour la protéine hybride a été réamplifiée après rajout des amorces externes (AAC-F_coli + T7R). Ce mode de réalisation des fusions par PCR est schématiquement représenté dans la Figure 3. Les inserts codant pour AAC, CTXM 16 et la fusion AAC-6H-CTXM 16 ont été chargés sur gel d'agarose 1% pour illustrer leur taille respective (Figure 10).

La fusion AAC-6H-CTXM 16 ainsi réalisée a été clonée avec les enzymes de restrictions Ndel et HinDII I dans le vecteur pET26b+ (expression E. coli) selon le principe illustré par la Figure 7.

La séquence de la construction hybride a été vérifiée dans les 2 sens et correspond à la fusion décrite.

Les vecteurs d'expressions pJ404-AAC exprimant AAC et pET-AAC-6H-CTXM 16 exprimant la fusion AAC-H6-CTXM 16 ont été transformés dans Escherichia coli BL21(DE3)pLysS en maintenant respectivement une pression de sélection Ampicilline (Euromedex) à 100 μg/ml et Kanamycine (Euromedex) à 50 μg/ml sur milieu LB (Extrait de Levure 5 g/1 ; Tryptone 10 g/1 ; NaCI 10 g/1 pH=7.5). L'expression de AAC ainsi que la fusion AAC-6H-CTX dans E. coli à partir du vecteur pJ404 aboutit à des corps d'inclusions pour les protéines d'intérêt.

Pour chaque protéine, IL de LB est ensemencé au l/40 ^eme à partir d'une pré-culture saturée puis cultivée à 37°C 200 rpm d'agitation jusqu'à une DO(600nm) d'environ 0,4-0,6. Les cultures sont induites 4 heures à 37°C et 200 rpm par l'ajout d'I PTG 0.5 mM final. En fin de production, les cellules sont centrifugées et le culot est repris à 40 ml/L de culture dans du tampon de lyse (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0.1% Triton X100 pH=8.0 et 0.25 mg/ml lysozyme) puis congelé à -80°C. Les cellules sont décongelées et lysées pendant 45 minutes à température ambiante en présence de MgS0 ₄ (20 mM) et DNAse (10 μg/ml). Le lysat est centrifugé (30 min à 12,000 xg à 4°C) et le culot contenant les corps d'inclusion des protéines d'intérêt (AAC et AAC-6H-CTXM16) est repris dans un tampon A (10 mM Phosphate, 150 mM NaCI, 10 mM I midazole, 8 M Urée pH=8.0). Les protéines sont purifiées par chromatographie d'affinité Nickel et éluées avec un gradient de tampon B (10 mM Phosphate, 150 mM NaCI, 500 mM imidazole, 8 M Urée pH=8.0).

Les fractions contenant les protéines d'intérêt sont mélangées, incubées 1 heure à 4°C en présence de ImM DTT, puis renaturées par 3 dialyses successives en tampon 10 mM Phosphate, 150 mM NaCI pH=8. Les protéines sont clarifiées par centrifugation puis concentrées jusqu'à un volume inférieur à 10 ml par ultrafiltration sur membrane de 10 kDa (Centricon, Millipore). Les protéines sont injectées sur une colonne de chromatographie d'exclusion (Superdex G200 ; colonnes 26*60 GE Healthcare), et éluées en tampon 10 mM phosphate, 150 mM NaCI pH = 8.0 par fraction de 1 ml et avec un débit de 1 ml/min.

Les fractions présentant la plus forte activité sur nitrocéfine (VWR) et la meilleure pureté (SDS-PAGE) sont combinées et concentrées à environ 0.5 mg/ml. La teneur protéique des échantillons est mesurée par BCA (Pierce), absorbance à 280 nm et vérification sur gel SDS- PAGE. La figure 11 présente les résultats protéines purifiées obtenues.

Les protéines purifiées ont été testées sur différents antibiotiques : Ceftriaxone (Rocéphine®, Roche) pour les beta-lactamines et kanamycine pour les Aminoglycosides. Les dosages sur ceftriaxone sont effectués au pH-STAT (Titrino 2.5, Metrohm) dans un volume réactionnel de 25 ml à 37°C et pH = 7.0. Les substrats sont préparés à 4 g/1 dans un tampon Tris 0.3 mM, NaCI 150 mM. L'hydrolyse enzymatique des noyaux bêta-lactames libère un acide et entraine une baisse du pH. Le principe du dosage consiste à compenser cette acidification par ajout de soude 0,1 N de manière à rester à pH = 7.0. Dans ces conditions, une unité correspond à 1 μιηοΐθ de soude ajoutée par minute, c'est-à-dire une μιηοΐθ de bêta-lactame hydrolysée par minute.

La mesure d'activité acétyl-transferase se fait par un dosage colorimétrique indirect avec de l'acetyl-CoA (Sigma-AIdrich) comme donneur de groupement acetyl, de la Kanamycine comme accepteur et du réactif d'Elleman (DTNB, Sigma-aldrich) pour titrer les molécules de CoEnzymeA réduites (-SH) libérées au cours de la réaction enzymatique [Ref]. La réaction se fait en plaque de microtitration avec des quantités croissantes d'enzymes purifiées, dans un volume final de 200 μΙ et avec les concentrations de 500 μΜ Kanamycine, 500 μΜ AcetylCoA et 250 μΜ DTNB. Dans ces conditions expérimentales, l'ion TNB ^2" absorbe à 412 nm avec un ε( apparent de 19 000 M ^"1 . puits ^"1 (puits d'une plaque 96 puits rempli avec 200 μΙ) et 1 unité correspond à une nanomole de TNB ^2" libérée par minute à 37°C.

La table 12 ci-dessous récapitule les activités spécifiques mesurées pour chaque protéine sur les trois substrats (moyenne de 6 expériences soit n=6).

Table 12. Activités spécifiques de la protéine hybride AAC-H6-CTX-M16 et de leurs enzymes constitutives.

Ces résultats montrent que la fusion entre AAC-6'-lb-cr et CTX-M16 génère une protéine hybride capable d'hydrolyser une céphalosporine de troisième génération et d'inactiver un aminoglycoside par acétylation. Il n'existe aucune enzyme naturelle connue susceptible d'inactiver un antibiotique de ces deux classes. Exemple 6 : molécules protéiques hybrides non-glycosylées constituées de la fusion de EreB et de TEM36 par un linker de type tag polyhistidine.

Les séquences codantes pour TEM-36 (SEQ I D1) et EreB (SEQ I D5) ont été obtenues commercialement par synthèse génique dans un vecteur d'expression pour E. coli. Les fragments géniques Ndel/Hindl II ont ensuite été sous-clonés dans le vecteur pET-26b(+) (I nvitrogen).

Selon le principe décrit dans la figure 3, nous avons réalisé une molécule protéique hybride EreB-H6-TEM36 par PCR de chevauchement. La séquence nucléotidique de TEM-36 et de EreB ont été amplifiées par PCR (95°C 30 sec - 25 cycles [95°C 30 sec - TM°C45sec - 72°C 1min] - 72°C 5 min - 4°C) en utilisant une ADN polymérase de haute-fidélité (Pfu, Promega) et des amorces partiellement complémentaires et constitutives du linker protéique (tag 6 histidine dans cet exemple). TEM-36 a été amplifiée avec un TM de 65°C en utilisant le couple d'amorces EreB6HTEM36_coli_F et T7_R. EreB a été amplifiée avec un TM de 65°C en utilisant le couple d'amorces EreB_coli_F et EreB6HTEM36_R. Les séquences constitutives du linker HHHHHH sont indiquées en gras souligné dans la table 13.

Table 13. Liste des amorces utilisées pour construire et séquencer la protéine hybride EreB- H6-TEM-36.

Les fragments PCR ainsi obtenus ont été hybridés à un TM de 55°C et complémentés pendant 5 cycles de PCR sans amorces (95°C 30 sec - 55°C 45 sec - 72°C 2minl5) en utilisant une ADN polymérase de haute-fidélité (Pfu, Promega). La séquence totale codant pour la protéine hybride a été réamplifiée après rajout des amorces externes (EreB_coli_F + T7-R) fonctionnant à un TM de 55°C.

La fusion EreB-H6-TEM36 ainsi réalisée a été clonée avec les enzymes de restrictions Ndel et Hindl ll dans le vecteur pET26b+ (expression dans E. coli) (Figure 7).

La séquence de la construction hybride a été vérifiée dans les 2 sens. La figure 12 récapitule les fragments PCR obtenus avec les amorces T7-F & T7-R sur la série pET-TEM36, EreB et EreB-H6-TEM36.

Les vecteurs d'expressions pET-26b(+) exprimant TEM-36 (SEQ. I D1), EreB (SEQ. I D2) et la fusion EreB-H6-TEM36 ont été amplifiés dans Escherichia coli DH 10B en maintenant une pression de sélection Kanamycine (Euromedex) à 50 μg/ml sur milieu LB (Extrait de Levure 5 g/1 ; Tryptone 10 g/1 ; NaCI 10 g/1 pH=7). La souche d'expression BL21(DE3) pLysS a été transformée avec les vecteurs d'expression par choc thermique. Les cellules transformées sont étalées sur milieu LB-agar (Extrait de levure 5 g/1 ; TryptonelO g/1 ; NaCllO g/L ; agar 15g/lpH=7) contenant 50 μg/ml de Kanamycine. La fonctionnalité des protéines d'intérêt (TEM36, EreB et la fusion EreB-H6-TEM36) dans E. coli a été évaluée en mesurant la résistance des souches d'expression à différents antibiotiques de type b-lactams (amoxicilline et augmentin) et macrolides (erythromycine).

Les bactéries transformées (exprimant TEM36, EreB ou EreB-H6-TEM36) ou la souche vide (BL21(DE3)pLysS) sont mises en culture dans 5 ml de LB + 50 μg/ml de Kanamycine lorsque nécessaire à 37°C et sous 200 rpm d'agitation jusqu'à saturation. Les pré-cultures sont alors inoculées au l/40 ^eme dans 5 ml de milieu LB + Kanamycine 50 μg/ml et lorsque la DO600 nm a atteint une valeur de 0.6 (environ 2 heures), la production de protéine est induite par ajout d'IPTG 1 mM final et se poursuit pendant 1.5 heure à 37°C sous une agitation de 200 rpm.

Les cellules sont normalisées à 10 ⁸ cfu/ml et diluées en cascade à 10 ⁷ , 10 ⁶ , 10 ⁵ , 10 ⁴ cfu/ml et 5 μΙ de chaque suspension sont déposés sur une boite LB-Agar contenant des concentrations croissantes d'antibiotiques (Amoxicilline 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048 μg/m\ ; Augmentin 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 μg/m\ et Erythromycine 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 μg/m\).

Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit et les résultats sont enregistrés le lendemain. Les CMIs correspondent à la concentration d'antibiotique la plus faible à laquelle le plus fort inoculum ne pousse plus.

Les données sont répertoriées dans la table 14 ci-dessous.

Table 14. CMIs d'antibiotiques de type β-lactames et macrolide pour des souches d'E.coli exprimant la molécule protéique hybride EreB-H6-TEM36 et leurs enzymes constitutives.

Les cellules d'E.coli exprimant la molécule protéique hybride telles que décrite dans l'exemple 6 présente un phénotype de résistance multiple aux aminopénicillines (avec ou sans inhibiteurs comme l'acide clavulanique) et aux macrolides comme l'erythromycine. Aucune souche bactérienne naturelle n'a pour l'instant été décrite dans la littérature avec un tel phénotype résultant de l'expression d'une seule et même protéine. Références

Aires, J. R., T. Kohler, H. Nikaido and P. Plesiat (1999). "Involvement of an active efflux System in the natural résistance of Pseudomonas aeruginosa to aminoglycosides." Antimicrob Agents Chemother43(ll): 2624-2628.

Ambler, R. P. (1975). "The amino acid séquence of Staphylococcus aureus penicillinase." Biochem J 151(2): 197-218.

Ambler, R. P. (1980). "The structure of beta-lactamases." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sçi289(1036): 321-331.

Anand, A., B. Bashey, T. Mir and A. E. Glatt (1994). "Epidemiology, clinical manifestations, and outcome of Clostridium difficile-associated diarrhea." Am J Gastroenterol89(4): 519-523. Arthur, M., D. Autissier and P. Courvalin (1986). "Analysis of the nucleotide séquence of the ereB gene encoding the erythromycin esterase type II." Nucleic Acids Resl4(12): 4987-4999. Bartlett, J. G. (1996). "Management of Clostridium difficile infection and other antibiotic- associated diarrhoeas." Eur J Gastroenterol Hepatol8(ll): 1054-1061.

Bonnet, R. (2004). "Growing group of extended-spectrum beta-lactamases: the CTX-M enzymes." Antimicrob Agents Chemother48(l): 1-14.

Bonnet, R., C. Dutour, J. L. Sampaio, C. Chanal, D. Sirot, R. Labia, C. De Champs and J. Sirot

(2001). "Novel cefotaximase (CTX-M-16) with increased catalytic efficiency due to substitution Asp-240->Gly." Antimicrob Agents Chemother45(8): 2269-2275.

Bozdogan, B., L. Berrezouga, M. S. Kuo, D. A. Yurek, K. A. Farley, B. J. Stockman and R.

Leclercq (1999). "A new résistance gene, NnB, conferring résistance to lincosamides by nucleotidylation in Enterococcus faecium HM1025." Antimicrob Agents Chemother43(4):

925-929.

Bush, K. and G. Jacoby (1997). "Nomenclature of TEM beta-lactamases." J Antimicrob Chemother39(l): 1-3.

Chaibi, E. B., D. Sirot, G. Paul and R. Labia (1999). "Inhibitor-resistant TEM beta-lactamases: phenotypic, genetic and biochemical characteristics." J Antimicrob Chemother43(4): 447- 458.

Chen, F., S. Nielsen and R. Zenobi (2013). "Understanding chemical reactivity for homo- and heterobifunctional protein cross-linking agents." J Mass Spectrom48(7): 807-812.

Chen, X., J. L. Zaro and W. C. Shen (2013). "Fusion protein linkers: property, design and functionality." Adv Drug Deliv Rev65(10): 1357-1369.

Chopra, I. and M. Roberts (2001). "Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial résistance." Microbiol Mol Biol Rev65(2): 232-260 ; second page, table of contents.

Committee on Drug Use in Food Animais (1999). The use of drugs in food animais, benefits and risks. Washington, D.C., National Academy Press.

Deshpande, A., V. Pasupuleti, P. Thota, C. Pant, D. D. Rolston, T. J. Sierra, A. V. Hernandez and C. J. Donskey (2013). "Community-associated Clostridium difficile infection and antibiotics: a meta-analysis." J Antimicrob Chemother68(9): 1951-1961.

Doi, Y. and Y. Arakawa (2007). "16S ribosomal RNA methylation: emerging résistance mechanism against aminoglycosides." Clin Infect Dis45(l): 88-94.

Drawz, S. M. and R. A. Bonomo (2010). "Three décades of beta-lactamase inhibitors." Clin Microbiol Rev23(l): 160-201.

ECDC/EMEA Joint Working Group (2009). The bacterial challenge: time to react". Estimâtes based on bacteria most frequently isolated from blood cultures in Europe. E. E. J. T. Report. Fancy, D. A. and T. Kodadek (1999). "Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light." Proc Natl Acad Sci U S A96(ll): 6020-6024.

Georgetown University Center for Food and N utrition Policy (1999). Antibiotic use in animais: food safety and risk assessment, Washington, D.C.

Gerding, D. N. (1989). "Disease associated with Clostridium difficile infection." Ann I ntern Medll0(4) : 255-257.

Gilbert, D. N. (1994). "Aspects of the Safety Profile of Oral Antibacterial Agents." I nfectious Diseases in Clinical Practice3(4): 236-245.

Gorkiewicz, G. (2009). "Nosocomial and antibiotic-associated diarrhoea caused by organisms other than Clostridium difficile." I nt J Antimicrob Agents33 Suppl 1: S37-41.

Hancock, R. E. (1981). "Aminoglycoside uptake and mode of action-with spécial référence to streptomycin and gentamicin. I. Antagonists and mutants." J Antimicrob Chemother8(4):

249-276.

Harmoinen, J., S. Mentula, M . Heikkila, M . van der Rest, P. J. Rajala-Schultz, C. J. Donskey, R. Frias, P. Koski, N . Wickstrand, H. Jousimies-Somer, E. Westermarck and K. Lindevall (2004). "Orally administered targeted recombinant Beta-lactamase prevents ampicillin-induced sélective pressure on the gut microbiota : a novel approach to reducing antimicrobial résistance." Antimicrob Agents Chemother48(l): 75-79.

Harmoinen, J., K. Vaali, P. Koski, K. Syrjanen, O. Laitinen, K. Lindevall and E. Westermarck (2003). "Enzymatic dégradation of a beta-lactam antibiotic, ampicillin, in the gut: a novel treatment modality." J Antimicrob Chemother51(2): 361-365.

Henquell, C, C. Chanal, D. Sirot, R. Labia and J. Sirot (1995). "Molecular characterization of nine différent types of mutants among 107 inhibitor-resistant TEM beta-lactamases from clinical isolâtes of Escherichia coli." Antimicrob Agents Chemother39(2): 427-430.

Herzberg, O. and J. Moult (1987). "Bacterial résistance to beta-lactam antibiotics: crystal structure of beta-lactamase from Staphylococcus aureus PCI at 2.5 A resolution." Science236(4802): 694-701.

Hogenauer, C, H. F. Hammer, G. J. Krejs and E. C. Reisinger (1998). "Mechanisms and management of antibiotic-associated diarrhea." Clin Infect Dis27(4): 702-710.

I nstitute of Medicine, D. o. H . P. a. D. P. (1998). Report of a study. Human health risks with the subtherapeutic use of penicillin or tetracyclines in animal feed. Washington, D.C, National Academy Press.

Kelly, C. P., C. Pothoulakis and J. T. LaMont (1994). "Clostridium difficile colitis." N Engl J Med330(4): 257-262.

Kemal, C. and J. R. Knowles (1981). "Penicillanic acid sulfone: interaction with RTEM beta- lactamase from Escherichia coli at différent pH values." Biochemistry20(13): 3688-3695. Klevens, R. M., J. R. Edwards, C. L. Richards, Jr., T. C. Horan, R. P. Gaynes, D. A. Pollock and D. M . Cardo (2007). "Estimating health care-associated infections and deaths in U.S. hospitals, 2002." Public Health Repl22(2): 160-166.

Knott-H unziker, V., S. G. Waley, B. S. Orlek and P. G. Sammes (1979). "Penicillinase active sites: labelling of serine-44 in beta-lactamase I by 6beta-bromopenicillanic acid." FEBS Lett99(l): 59-61.

Larkin, M . A., G. Blackshields, N. P. Brown, R. Chenna, P. A. McGettigan, H. McWilliam, F. Valentin, I. M . Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J. D. Thompson, T. J. Gibson and D. G. Higgins (2007). "Clustal W and Clustal X version 2.0." Bioinformatics23(21): 2947-2948. Leclercq, R., A. Brisson-Noel, J. Duval and P. Courvalin (1987). "Phenotypic expression and genetic heterogeneity of lincosamide inactivation in Staphylococcus spp." Antimicrob Agents Chemother31(12): 1887-1891.

Leroy, A., G. Humbert, G. Oksenhendler and J. P. Fillastre (1978). "Pharmacokinetics of aminoglycosides in subjects with normal and impaired rénal function." Antibiot Chemother (1971)25: 163-180.

Lin, Y., J. M. Pagel, D. Axworthy, A. Pantelias, N. Hedin and 0. W. Press (2006). "A genetically engineered anti-CD45 single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted radioimmunotherapy of hématologie malignancies." Cancer Res66(7): 3884-3892.

Mentula, S., J. Harmoinen, P. Koski, E. Westermarck, M. Rautio, P. Huovinen and E. Kononen

(2004). "Inhibition of ampicillin-induced émergence of résistance in intestinal coliforms by targeted recombinant beta-lactamase." Int J Antimicrob Agents24(6): 555-561.

Morar, M., K. Pengelly, K. Koteva and G. D. Wright (2012). "Mechanism and diversity of the erythromycin esterase family of enzymes." Biochemistry51(8): 1740-1751.

Morita, Y., K. Kodama, S. Shiota, T. Mine, A. Kataoka, T. Mizushima and T. Tsuchiya (1998).

"NorM, a putative multidrug efflux protein, of Vibrio parahaemolyticus and its homolog in

Escherichia coli." Antimicrob Agents Chemother42(7): 1778-1782.

Novick, R. P. (1963). "Analysis by Transduction of Mutations Affecting Penicillinase Formation in Staphylococcus Aureus." J Gen Microbiol33: 121-136.

Ounissi, H. and P. Courvalin (1985). "Nucleotide séquence of the gene ereA encoding the erythromycin esterase in Escherichia coli." Gene35(3): 271-278.

Pagel, J. M., Y. Lin, N. Hedin, A. Pantelias, D. Axworthy, D. Stone, D. K. Hamlin, D. S. Wilbur and O. W. Press (2006). "Comparison of a tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein and an antibody-streptavidin chemical conjugate for pretargeted anti-CD20 radioimmunotherapy of B-cell lymphomas." Bloodl08(l): 328-336.

Paguirigan, A. L. and D. J. Beebe (2007). "Protocol for the fabrication of enzymatically crosslinked gelatin microchannels for microfluidic cell culture." Nat Protoc2(7): 1782-1788. Poehlsgaard, J. and S. Douthwaite (2005). "The bacterial ribosome as a target for antibiotics." Nat Rev Microbiol3(ll): 870-881.

Ramirez, M. S. and M. E. Tolmasky (2010). "Aminoglycoside modifying enzymes." Drug Resist Updatl3(6): 151-171.

Richards, M. J., J. R. Edwards, D. H. Culver and R. P. Gaynes (2000). "Nosocomial infections in combined medical-surgical intensive care units in the United States." Infect Control Hosp Epidemiol21(8): 510-515.

Ripoll, A., F. Baquero, A. Novais, M. J. Rodriguez-Dominguez, M. C. Turrientes, R. Canton and J. C. Galan (2011). "In vitro sélection of variants résistant to beta-lactams plus beta- lactamase inhibitors in CTX-M beta-lactamases: predicting the in vivo scénario?" Antimicrob Agents Chemother55(10): 4530-4536.

Roberts, M. C. (2008). "Update on macrolide-lincosamide-streptogramin, ketolide, and oxazolidinone résistance gènes." FEMS Microbiol Lett282(2): 147-159.

Roberts, M. C, J. Sutcliffe, P. Courvalin, L. B. Jensen, J. Rood and H. Seppala (1999). "Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B résistance déterminants." Antimicrob Agents Chemother43(12): 2823-2830.

Robicsek, A., G. A. Jacoby and D. C. Hooper (2006). "The Worldwide émergence of plasmid- mediated quinolone résistance." Lancet Infect Dis6(10): 629-640. Robicsek, A., J. Strahilevitz, G. A. Jacoby, M. Macielag, D. Abbanat, C. H. Park, K. Bush and D. C. Hooper (2006). "Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase." Nat Medl2(l): 83-88.

Salverda, M. L, J. A. De Visser and M. Barlow (2010). "Natural évolution of TEM-1 beta- lactamase: expérimental reconstruction and clinical relevance." FEMS Microbiol Rev34(6): 1015-1036.

Schlegel, S., E. Rujas, A. J. Ytterberg, R. A. Zubarev, J. Luirink and J. W. de Gier (2013). "Optimizing heterologous protein production in the periplasm of E. coli by regulating gene expression levels." Microb Cell Factl2: 24.

Schultz, J., Y. Lin, J. Sanderson, Y. Zuo, D. Stone, R. Mallett, S. Wilbert and D. Axworthy (2000). "A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy." Cancer Res60(23): 6663-6669.

Shaw, K. J., P. N. Rather, R. S. Hare and G. H. Miller (1993). "Molecular genetics of aminoglycoside résistance gènes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes." Microbiol Rev57(l): 138-163.

Sherry, L, B. Murphy, J. Xu. and K. D. Kochanek (2012). Deaths: Preliminary Data for 2010. National Vital Statistics Reports. 60: 1-69.

Slimings, C. and T. V. Riley (2013). "Antibiotics and hospital-acquired Clostridium difficile infection: update of systematic review and meta-analysis." J Antimicrob Chemother.

Sparks, S. G., R. J. Carman, M. R. Sarker and B. A. McClane (2001). "Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolâtes associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America." J Clin Microbiol39(3): 883-888.

Speer, B. S., L. Bedzyk and A. A. Salyers (1991). "Evidence that a novel tetracycline résistance gene found on two Bacteroides transposons encodes an NADP-requiring oxidoreductase." J Bacterioll73(l): 176-183.

Stiefel, U., N. J. Pultz, J. Harmoinen, P. Koski, K. Lindevall, M. S. Helfand and C. J. Donskey (2003). "Oral administration of beta-lactamase préserves colonization résistance of piperacillin-treated mice." J Infect Disl88(10): 1605-1609.

Tarkkanen, A. M., T. Heinonen, R. Jogi, S. Mentula, M. E. van der Rest, C. J. Donskey, T. Kemppainen, K. Gurbanov and C. E. Nord (2009). "P1A recombinant beta-lactamase prevents émergence of antimicrobial résistance in gut microflora of healthy subjects during intravenous administration of ampicillin." Antimicrob Agents Chemother53(6): 2455-2462. Tenson, T., M. Lovmar and M. Ehrenberg (2003). "The mechanism of action of macrolides, lincosamides and streptogramin B reveals the nascent peptide exit path in the ribosome." J Mol Biol330(5): 1005-1014.

Thompson, J. D., D. G. Higgins and T. J. Gibson (1994). "CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple séquence alignment through séquence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice." Nucleic Acids Res22(22): 4673-4680.

Tu, D., G. Blaha, P. B. Moore and T. A. Steitz (2005). "Structures of MLSBK antibiotics bound to mutated large ribosomal subunits provide a structural explanation for résistance." Celll21(2): 257-270.

Turner, P. J. (2005). "Extended-Spectrum β-Lactamases." Clinical Infectious Diseases41(Supplement 4): S273-S275.

Vardakas, K. Z., A. A. Konstantelias, G. Loizidis, P. I. Rafailidis and M. E. Falagas (2012). "Risk factors for development of Clostridium difficile infection due to BI/NAP1/027 strain: a meta- analysis." Int J Infect Disl6(ll): e768-773. Walsh, C. (2000). "Molecular mechanisms that confer antibacterial drug résistance." Nature406(6797): 775-781.

Weisblum, B. (1995). "Erythromycin résistance by ribosome modification." Antimicrob Agents Chemother39(3): 577-585.

Wistrom, J., S. R. Norrby, E. B. Myhre, S. Eriksson, G. Granstrom, L. Lagergren, G. Englund, C. E. Nord and B. Svenungsson (2001). "Frequency of antibiotic-associated diarrhoea in 2462 antibiotic-treated hospitalized patients: a prospective study." J Antimicrob Chemother47(l): 43-50.

Zhou, X. Y., F. Bordon, D. Sirot, M. D. Kitzis and L. Gutmann (1994). "Emergence of clinical isolâtes of Escherichia coli producing TEM-1 derivatives or an OXA-1 beta-lactamase conferring résistance to beta-lactamase inhibitors." Antimicrob Agents Chemother38(5): 1085-1089.