Hydroperylen-Derivate, wie Hexahydro-oder Octahydro-perylen-Derivate werden von verschiedenen Mikroorganismen gebildet. Bekannte Hydroperylen-Derivate sind beispielweise : Altertoxine I, II und lil (M. E. Stark et al. J. Nat. Prod. 49,866-871, 1986), das Alteichin (D. Robeson et al. Experientia, 40,1248-1250, 1984), die Aiterlosine (A. Stierle et al. J. Nat. Prod.. 52,42-47, 1989) und das Alterperylenol aus Alternaria Spezies (T. Okuno et al. Tetrahedron Lett. 24, 5653-5656,1983) ; Stemphyltoxine sowie das Stemphypyrenol, die aus Kulturen des Stemphylium botryosum (A. Arnone et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1986, 525-530) stammen.

Die Altertoxine und die Stemphyltoxine sind Phytotoxine, die durch ihre mutagene Wirkung auch den Wert der menschlichen Lebensmittel beeinträchtigen können. Sie sind deshalb in über 70 Publikationen gut beschrieben worden (T. J. Schrader et al.

Teratog., Carcinog., Mutagen. 21,261-274, 2001). Naturgemäß werden hierbei die Gefahren, die von den Altertoxinen und Stemphyltoxinen ausgehen, behandelt ; ein Ergebnis der Untersuchungen ist die weite Verbreitung und die krebserregende Wirkung dieser Epoxide (Oxirane) enthaltenden Verbindungen. Darüber hinaus ist über eine schwache Telomerase-inhibierende Wirkung des Alterperylenois berichtet worden (K.-l.

Togashi et al. Oncol. Res. 10,449-453, 1998), der für die Enzymhemmung charakteristische IC5O-Wert ist jedoch mit 30 uM gering.

Thromboembolische Erkrankungen sind-insbesondere in den westlichen Industrienationen-die häufigste Todesursache. Einer wirksamen Prophylaxe und Therapie dieser Erkrankung kommt somit eine außerordentliche Bedeutung zu. Unter einem Thrombus versteht man ein intravital und intravasal entstandenes Blutgerinnsel.

Thromben entstehen nach Thrombozytenaggregation vor allem in Arterien. Begünstigt wird die Thrombenbildung durch Gefäßwandschädigung, verlangsamte Blutströmung und beschleunigte Gerinnung.

Die Thrombozyten (Blutplättchen) sind diskusförmige, kernlos Blutzellen, die im Verletzungsfall die Blutstillung und Blutgerinnung gewährleisten. Die Thrombozyten bewirken die Blutstillung in einem komplizierten Vorgang durch Aggregation, die Thrombozytenaggregation ist somit ein für Warmblüter lebenswichtiger Vorgang. Die Unterfunktion der Thrombozyten führt schon bei kleineren Verletzungen zu schweren Blutungen, andererseits begünstigt eine erhöhte Gerinnungsneigung die Thrombose- und Emboliegefahr. Da insbesondere die Plättchen-Überfunktion häufig fatale Folgen hat, wurde bereits mehrere Substanzen als Thrombozytenaggregations-Hemmstoffe eingesetzt. Bekannt ist die Acetylsalicylsäure (Aspirin@), das Ticlopidin (Tiklyd0) oder das verwandte Clopidogrel, aber all diese Präparate sind aufgrund von Nebenwirkungen nur begrenzt einsetzbar. Deshalb besteht ein großer Bedarf an Inhibitoren der intrazellulären Plättchenaktivierung für die Therapie und Langzeit-Prophylaxe von arteriellen thrombo-embolischen Ereignissen. Eingesetzt werden können solche Mittel beispielsweise beim Myocardinfarkt, bei der instabilen Angina oder bei Schlaganfällen.

In dem Bestreben, wirksame Verbindungen zur Vorbeugung oder Behandlung von Blutgerinnungs-Erkrankungen zu finden, wurde nun gefunden worden, dass Thioperylenol, der vom Pilzstamm ST 003367, DSM 14452, gebildet wird und weitere Hydroperylen-Derivate die Blutplättchen-Aggregation wirksam hemmen können.

Die Erfindung betrifft daher die Verbindung der Formel I und/oder alle stereoisomere Formen der Verbindung der Formel I und/oder Gemische diese Formen in jedem Verhältnis, und/oder ein physiologisch verträgliches Salz der Verbindung der Formel I, wobei R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R10 und R11, unabhängig voneinander für 1. Wasserstoffatom, 2. (C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch 2. 1-OH, 2.2 =O, 2. 3-O-(C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch 2.3. 1-CN, 2.3. 2-NH2, 2.3. 3 =N-OH oder 2.3. 4 =N-O-(C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2. 4-0- (C2-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2. 5-O-(C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2. 6-Aryl, worin Aryl unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch 2.6. 1 Halogen, 2.6. 2-(C1-C4)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2.6. 3-O-(C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2.6. 4-OH oder 2.6. 5-(C1-C4)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und ein-, zwei, oder dreifach substituiert ist durch Halogen, 2.7-C (0)-OH, 2.8-C (0)-0-NH2, 2.9-C (O)-O-(C1-C4)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2. 10-NH-(C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2. 11-NH- (C2-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2. 12-NH- (C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2.13-NH2 oder 2.14 Halogen, 3. (C2-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, 4. (C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, 5.-O-R9, worin R9 für 1. (C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, 2. (C2-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, oder 3. (C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, steht 6.-NH-R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, 7. -NH-C (O)-H, 8. -NH-C (O)- R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, 9.-NH-Aryl, worin Aryl unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach durch R9 substituiert ist, 10. =N-OH, 11. =N-O-R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, 12.-S-H, 13. -S-R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, 14. -S (O)-R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, 15. -S (O) 2- R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, oder 16.-SO2 stehen, oder R4 und R5 oder R10 und R11 zusammen mit den Kohlenstoffatomen an die sie jeweils gebunden sind ein 3,4, 5 oder 6 gliedriges Ringsystem bilden, das aromatisch oder gesättigt ist und ein oder zwei Heteroatome aus der Reihe Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel enthält, R7 die Bedeutung von R1 wie oben für 2. bis 16. definiert hat und die Bindung zwischen-C, 4-C, 5- eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung ist.

Die Erfindung betrifft auch eine Verbindung der Formel I, wobei R1, R2, R3 und R6 jeweils für-OH stehen, R4 und R5 zusammen mit den Kohlenstoffatomen an die sie jeweils gebunden sind ein Epoxid bilden, R7 für den Rest-S-CH2-CHOH-COOH steht, R8 für =O steht, R10 und R11 jeweils für Wasserstoffatom stehen und die Bindung zwischen-C, 4-C, 5- eine Einfachbindung ist, und/oder physiologisch verträgliche Salze der Verbindung der Formel I.

Die Erfindung betrifft auch optisch reine Verbindungen der Formel I und deren Stereoisomerengemische, wie Enantiomerengemische und Diasteromerengemische, in jedem Verhältnis zueinander.

Unter dem Begriff"Halogen"wird Fluor, Chlor, Brom oder Jod verstanden. Unter dem Begriff"(C1-C6)-Alkyl"werden Kohlenwasserstoffreste verstanden, deren Kohlenstoffkette geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, i-Propyl, Butyl, tertiär-Butyl, Pentyl und Hexyl.

Unter dem Begriff"(C2-C6)-Alkenyl"werden Kohlenwasserstoffreste verstanden, deren Kohlenstoffkette geradkettig oder verzweigt ist und 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, und die ein, zwei oder drei Doppelbindungen aufweist, beispielsweise die Reste Allyl, Crotyl, 1-Propenyl, Penta-1, 3-dienyl, Pentenyl und Hexenyl. Unter dem Begriff" (C2-C6)-Alkinyl" werden Kohlenwasserstoffreste verstanden, deren Kohlenstoffkette geradkettig oder verzweigt ist und 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, und die ein oder zwei Dreifachbindungen aufweist, beispielsweise die Reste Propinyl, Butinyl und Pentinyl.

Unter dem Begriff"Aryl"werden die Reste Phenyl, Benzyl und 1-oder 2-Naphthyl verstanden.

Unter dem Begriff"R4 und R5 zusammen mit den Kohlenstoffatomen an die sie jeweils gebunden sind ein 3,4, 5 oder 6 gliedriges Ringsystem bilden, das aromatisch oder gesättigt ist und ein oder zwei Heteroatome aus der Reihe Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel enthält"werden Reste verstanden wie Epoxid, Aziridin, Azetidin, Azetin, Pyrrol, Pyrrolidin, Pyridin, Piperidin, Tetrahydropyridin, Pyrazol, Imidazol, Pyrazolin, Imidazolin, Pyrazolidin, Imidazolidin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Piperazin, Pyran, Oxazol, Isoxazol, 2-Isoxazolin, Isoxazolidin, Morpholin, Oxothiolan, Thiopyran, Thiazol, Isothiazol, 2-Isothiazolin, Isothiazolidin oder Thiomorpholin.

Die Erfindung betrifft ferner die Verbindung der Formel II Die Verbindung der Formel II wird im folgenden äls Thioperylenol bezeichnet (Summelformel : C23H20NOgS ; Molekulargewicht 472,47). sowie deren physiologisch verträglichen Salze.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I, und/oder einer stereoisomeren Form der Verbindung der Formel I und/oder Gemische diese Formen in jedem Verhältnis, und/oder ein physiologisch verträgliches Salz der Verbindung der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) den Mikroorganismus DSM 14452 oder dessen Mutanten oder Varianten in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert und die Verbindung Thioperylenol isoliert und reinigt oder b) Thioperylenol durch chemische Derivatisierung in eine Verbindung der Formel I überführt, oder c) eine nach den Verfahren a) oder b) hergestellte Verbindung der Formel I, die aufgrund ihrer chemischen Struktur in enantiomeren Formen auftritt, durch Salzbildung mit enantiomerenreinen Säuren oder Basen, Chromatographie an chiralen Stationärphasen oder Derivatisierung mittels chiraler enantiomerenreinen Verbindungen wie Aminosäuren, Trennung der somit erhaltenen Diastereomeren, und Abspaltung der chiralen Hilfsgruppen in die reinen Enantiomeren auftrennt, oder d) die nach den Verfahren a), b) oder c) hergestellte Verbindung der Formel I entweder in freier Form isoliert oder im Falle des Vorliegens von sauren oder basischen Gruppen in physiologisch verträgliche Salze umwandelt.

Der Mikroorganismus DSM 14452 (interne Bezeichnung ST003367) gehört zur Gruppe der Pilze und besitzt ein weisses Substratmycel und ganz wenig Luftmycel und wurde am 3. August 2001 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 14452 hinterlegt.

Unter Varianten von DSM 14452 werden Stämme von DSM 14452 verstanden, die durch Vereinzelung aus einer Kultur von DSM 14452 gewonnen wurden, soweit sie Thioperylenol herstellen. Unter Mutanten von DSM 14452 werden Stämme von DSM 14452 verstanden, die nach Mutation aus einer Kultur von DSM 14452 gewonnen wurden, soweit sie Thioperylenol herstellen. Mutanten von DSM 14452 können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung wie Ultraviolett-oder Röntgenstrahlung oder durch chemische Mutagene, beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS) ; 2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (MOB) oder N-Methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden.

Das Auffinden der Mutanten erfolgt beispielsweise durch Probennahme aus dem Kultivierungsmediums und Bestimmung der inhibierenden Wirkung von Thioperylenol.

Die Herstellung von Thioperylenol erfolgt durch Kultivierung von DSM 14452. Die Nährlösung enthält Kohlenstoffquellen wie Saccharose, Maisstärke, Dextrose, Lactose, D-Mannit, Molasse oder Malzextrakt und Stickstoffquellen wie Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Proteine, Peptone, Peptide, Tryptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt oder Ammoniumsalze oder Nitrate.

Die Nährlösung enthält auch anorganische Salze wie Natriumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Calciumchlorid, Calciumsulfat, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat oder Kaliumhydrogenphosphat. Ferner kann dem Nährmedium auch Fett wie Ölsäuremethylester oder Sojaöl zugesetzt werden. Daneben werden auch Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Kupfer-, Zink-, Kobalt-oder andere Metallsalze zugegeben.

Eine bevorzugte Nährlösung enthält etwa von 0,05 % bis 5 % Kartoffeldextrose, vorzugsweise von 1 % bis 3 %, und von etwa 0,05 % bis 3 % Hefeextrakt, vorzugsweise von 0,05 % bis 1 %. Die Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.

Die Kultivierung von DSM 14452 erfolgt bei Temperaturen von 18 °C bis 35 °C, bevorzugt bei 23 °C bis 28 °C und bei pH-Werten von 3 bis 10, bevorzugt 5 bis 9, vorzugsweise bei Werten von 4 bis 6. Die Kultivierung erfolgt aerob zunächst im Schüttelkolben und danach im Fermenter unter Rühren und Belüftung mit Luft oder reinem Sauerstoff. Die Kultivierung der Mikroorganismen in den Fermentern erfolgt über einen Zeitraum von 48 bis 720 Stunden, bevorzugt von 72 bis 144 Stunden.

Die Bildung von Thioperylenol erreicht ihr Maximum nach etwa 96 bis 144 Stunden.

In der Nährlösung bildet der Pilzstamm DSM 14452 auch Gemische von mehreren Verbindungen der Formel I. Je nach Zusammensetzung der Nährlösung kann der mengenmäßige Anteil eines oder mehrerer der Verbindungen der Formel I variieren.

Außerdem kann durch die Medienzusammensetzung die Synthese einzelner Verbindungen der Formel I gesteuert werden, so dass einzelne Verbindungen der Formel ! gar nicht oder in einer Menge unterhalb der Nachweisgrenze vom Mikroorganismus hergestellt werden.

Die Isolierung von Thioperylenol erfolgt direkt aus der Nährlösung oder nach Abtrennung der Zellen beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration. Die Isolierung von Thioperylenol kann durch Extraktion mit Lösungsmitteln oder durch Adsorption an Harze wie XAD 16, HP 20, MCI GelS) CHP20P oder lonenaustauscher erfolgen.

Die Reinigung erfolgt beispielsweise durch Chromatographie an Adsoptionsharzen wie an Diaion° HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo), an Amberlites XAD 7 (Rohm and Haas, USA), an Amberchrome CG (Toso Haas, Philadelphia, USA). Die Trennungen können in einem weiten pH-Bereich durchgeführt werden. Bevorzugt ist der Bereich von pH 1 bis pH 9, besonders bevorzugt von pH 2 bis pH 8. Geeignet sind darüber hinaus Reverse Phase-Träger, die im Rahmen der Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) eingesetzt werden. Ein weiteres Isolierungsverfahren ist die Verwendung von Molekularsieben wie Fractogel0 TSK HW-40S oder Sephadex@ LH-20.

Als Ausgangsstoff für die Herstellung der Thioperylenolderivate dient das mikrobiologisch hergestellte Thioperylenol. Die Herstellung der Verbindungen der Formel I erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise kann die Epoxidgruppe des Thioperylens durch Hydrolyse oder Solvolyse zu Alkoholen oder Estern umgesetzt werden. Epoxide sind sehr reaktionsfähige Verbindungen, die außer Wasser und Säuren auch andere nukleophile Reagenzien, wie Alkohole, Thiole, Amine, Grignard- Verbindungen in Gegenwart saurer oder basischer Katalysatoren addieren. Die Addition von Blausäure führt weiter zu ß-Hydroxy-propionitrilderivaten. Darüber hinaus können Epoxide zu Carbonyl-Derivaten umgelagert werden, zum Beispiel durch Lewis-Säuren katalysiert. Die Reaktionsprodukte können ferner weiteren Reaktionen unterworfen werden. Diese Umsetzungen sind an sich bekannt und werden beispielsweise von Jerry March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4t"Edition, 1992, beschrieben.

Weitere Derivate erhält man wenn der 3-Thio-milchsäure-Rest des Thioperylenols reduktiv oder oxidativ umgesetzt wird. Auch kann es vorteilhaft sein das Sulfid als sogenannte Abgangsgruppe zu benützen und sie durch geeignete andere Reste in literaturbekannter Weise zu ersetzten.

Um Umsetzungen selektiv durchzuführen, kann es vorteilhaft sein vor der Reaktion geeignete, in an sich bekannter Weise, Schutzgruppen einzuführen. Die Schutzgruppen werden nach der Reaktion abgespaltet und anschließend wird das Reaktionsprodukt gereinigt.

Unter pharmakologisch verträglichen Salzen der Verbindung der Formel I versteht man sowohl anorganische als auch organische Salze, wie sie in Remington's Pharmaceutical Sciences (17. Auflage, Seite 1418 (1985)) beschrieben sind. Die Herstellung physiologisch verträglicher Salze aus zur Salzbildung befähigten Verbindungen der Formel I, einschließlich deren stereoisomeren Formen, erfolgt in an sich bekannter Weise. Die Carbonsäure bildet mit basischen Reagenzien wie Hydroxiden, Carbonaten, Hydrogencarbonaten, Alkoholaten sowie Ammoniak oder organischen Basen, beispielsweise Trimethyl-oder Triethylamin, Ethanolamin oder Triethanolamin oder auch basischen Aminosäuren, etwa Lysin, Ornithin oder Arginin, stabile Alkali-, Erdalkali-oder gegebenenfalls substituierte Ammoniumsalze. Sofern die Verbindung der Formel I basische Gruppen aufweist, lassen sich mit starken Säuren auch stabile Säureadditionssalze herstellen. Hierfür kommen sowohl anorganische als auch organische Säuren wie Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Benzolsulfon-, Phosphor-, Methansulfon-, p-Toluolsulfon-, 4-Brombenzol-sulfon-, Trifluormethylsulfon-, Cyclohexylamidosulfon-, Essig-, Oxal-, Wein-, Bernstein-und Trifluoressigsäure in Frage.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen wirksamen Gehalt an mindestens einer Verbindung der Formel I und/oder eines physiologisch verträglichen Salzes der Verbindung der Formel I und/oder eine gegebenenfalls stereoisomere Form der Verbindung der Formel I, zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Trägerstoff, Zusatzstoff und/oder anderen Wirk-und Hilfsstoffen.

Aufgrund der pharmakologischen Eigenschaften eignen sich die Verbindungen der Formel I zur Prophylaxe und Therapie all solcher Erkrankungen bei denen erhöhte Blutplättchenaggregationen auftreten und die durch Thrombenbildung oder Embolien verursacht werden. Dazu gehören beispielsweise Herzinfarkt (myocardial infarction), instabil Angina pectoris (unstable angina), Hirnschlag (stroke), transitorische ischämische Attacken (transitory ischaemic attacks) oder periphere arterielle Verschlußkrankheiten (peripheral vascular disease) wie intermittierendes Hinken (intermited claudication).

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von mindestens einer Verbindung der Formel I und/oder alle stereoisomere Formen der Verbindung der Formel I und/oder Gemische diese Formen in jedem Verhältnis, und/oder ein physiologisch verträgliches Salz der Verbindung der Formel I zur Herstellung von Arzneimitteln zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen bei denen erhöhte Blutplättchenaggregationen auftreten, wobei R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10 und R11, unabhängig voneinander für 1. Wasserstoffatom, 2. (C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch 2.1-OH, 2.2 =O, 2. 3-O-(C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch 2.3. 1-CN, 2.3. 2-NH2, 2.3. 3 =N-OH oder 2.3. 4 =N-O-(C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2. 4-O-(C2-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2. 5-O-(C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2. 6-Aryl, worin Aryl unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch 2.6. 1 Halogen, 2.6. 2- (C1-C4)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2.6. 3-O-(C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2.6. 4-OH oder 2.6. 5-(C1-C4)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und ein-, zwei, oder dreifach substituiert ist durch Halogen, 2.7-C (0)-OH, 2.8-C (O)-O-NH2, 2.9-C (O)-O-(C1-C4)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, 2. 10-NH-(C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2. 11-NH-(C2-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2. 12-NH- (C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl. geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.3. 1 bis 2.3. 4, 2. 13-NH2 oder 2.14 Halogen, 3. (C2-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, 4. (C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, 5.-O-R9, worin R9 für 1. (C1-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, 2. (C2-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, oder 3. (C2-C6)-Alkinyl, worin Alkinyl geradkettig oder verzweigt ist und unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach unabhängig voneinander substituiert ist durch wie oben beschrieben unter 2.1 bis 2.14, steht 6. -NH-R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, <BR> <BR> <BR> <BR> 7. -NH-C (O)-H,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 8. -NH-C (O)- R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, 9.-NH-Aryl, worin Aryl unsubstituiert oder ein-, zwei, oder dreifach durch R9 substituiert ist, 10. =N-OH, 11. =N-O-R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, 12.-S-H, 13.-S-R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, 14. -S (O)-R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, 15.-S (O) 2- R9, worin R9 wie oben unter 5. definiert ist, oder 16.-SO2 stehen, oder R4 und R5 oder R10 und R11 zusammen mit den Kohlenstoffatomen an die sie jeweils gebunden sind ein 3,4, 5 oder 6 gliedriges Ringsystem bilden, das aromatisch oder gesättigt ist und ein oder zwei Heteroatome aus der Reihe Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel enthält, und die Bindung zwischen-C14-C15-eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung ist.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von mindestens einer Verbindung der Formel I zur Herstellung von Arzneimitteln zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen bei denen erhöhte Blutplättchenaggregationen auftreten, wobei R1, R3 und R8 unabhängig voneinander für-OH oder =O stehen, R2 für-OH steht, R4 und R5 unabhängig voneinander für-OH oder Wasserstoffatom stehen, oder R4 und R5 zusammen mit den Kohlenstoffatomen an die sie jeweils gebunden sind ein Epoxid bilden, R6, R10 und R11 unabhängig voneinander für-OH oder Wasserstoffatom stehen, oder R10 und R11 zusammen mit den Kohlenstoffatomen an die sie jeweils gebunden sind ein Epoxid bilden, R7 für Wasserstoffatom oder den Rest-S-CH2-CHOH-COOH steht, und die Bindung zwischen-C14-C15-eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung ist.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von mindestens einer Verbindung der Formel I zur Herstellung von Arzneimitteln zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen bei denen erhöhte Blutplättchenaggregationen auftreten, wobei Thioperylenol, eine Verbindung der Formel I, worin R1, R2, R3 und R6 jeweils für-OH stehen, R4 und R5 zusammen mit den Kohlenstoffatomen an die sie jeweils gebunden sind ein Epoxid bilden, R7 für den Rest-S-CH2-CHOH-COOH steht, R8 für =O steht, R10 und R11 jeweils Wasserstoffatom sind, und die Bindung zwischen-C14-C15-eine Einfachbindung ist, Alterperylenol, eine Verbindung der Formel I, worin R1, R2, R5 und R6 jeweils für-OH stehen, R3 und R8 jeweils für =O stehen, R4, R7, R10 und R11 jeweils für Wasserstoffatom stehen, und die Bindung zwischen -C14-C15- eine Doppelbindung ist, Altertoxin I, eine Verbindung der Formel I, worin R1, R2, R5 und R6 jeweils für-OH stehen, R3 und R8 jeweils für =O stehen, R4, R7, R10 und R11 jeweils für Wasserstoffatom stehen, und die Bindung zwischen-C14-C15-eine Einfachbindung ist, Altertoxin II, eine Verbindung der Formel I, worin R1, R2 und R6 jeweils für-OH stehen, R3 und R8 jeweils für =O stehen, R4 und R5 zusammen mit den Kohlenstoffatomen an die sie jeweils gebunden sind ein Epoxid bilden, R7, R10 und R11 jeweils für Wasserstoffatom stehen, und die Bindung zwischen -C14-C15- eine Einfachbindung ist, A) tertoxin iii, eine Verbindung der Formel I, worin R1 und R3 jeweils für =O stehen, R2 und R8 jeweils für-OH stehen, R4 und R5 und R10 und R11 zusammen mit den Kohlenstoffatomen an die sie jeweils gebunden sind ein Epoxid bilden, R6 und R7 jeweils für Wasserstoffatom stehen, und die Bindung zwischen-C14-C15-eine Einfachbindung ist, eingesetzt wird.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Verbindung der Formel I mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und gegebenenfalls weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz-oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.

Geeignete feste oder galenische Zubereitungsformen. sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit-oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig verwendete Hilfsstoffe seien Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Cellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuß-oder Sesamöl, Polyethylen-glykol und Lösungsmittel wie etwa steriles Wasser und ein-oder mehrwertige Alkohole wie Glycerin, genannt.

Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung der Formel I enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln, Dragees oder Suppositorien, kann diese Dosis von 0,1 mg/kg Körpergewicht bis 1000 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise von 0,2 mg/kg Körpergewicht bis 100 mg/kg Körpergewicht betragen. Sie werden zweckmäßig in Dosierungseinheiten verabreicht, die mindestens die wirksame Tagesmenge der Verbindung der Formel 1, etwa'bis zu 1000 mg, bevorzugt jedoch etwa 50 bis 300 mg und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu etwa 300 mg, vorzugsweise aber etwa 10 bis 100 mg, enthalten.

Für die Behandlung eines erwachsenen, etwa 70 kg schweren Patienten sind je nach Wirksamkeit der Verbindung gemäß Formel I, Tagesdosen von etwa 20 mg bis 1000 mg Wirkstoff, bevorzugt etwa 100 mg bis 500 mg indiziert. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber mehrerer kleinerer Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist der Mikroorganismus DSM 14452.

Die folgenden Beispiele sollen der näheren Erläuterung der Erfindung dienen, ohne die Breite der Erfindung in irgendeiner Weise begrenzen zu wollen.

Beispiel 1 Herstellung einer Glycerinkultur des Pilzstammes ST 003367, DSM 14452 30 ml Nährlösung (Malzextrakt 2,0%, Hefeextrakt 0,2 %, Glucose 1,0 %, (NH4) 2 HP04 0,05 %, pH 6,0) in einem sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben wurden mit dem Pilzstammes ST 003367, DSM 14452, beimpft und 6 Tage bei 25° C und 140 Umdrehungen pro Minute (UpM) auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. 1,5 ml dieser Kultur wurden anschließend mit 2,5 ml 80 % igem Glycerin verdünnt und bei- 135°C gelagert.

Beispiel 2 Herstellung einer Vorkultur des Pilzes ST 003367, DSM 14452, im Erlenmeyerkolben 100 ml Nährlösung (Malzextrakt 2,0%, Hefeextrakt 0,2 %, Glucose 1,0 %, (NH4) 2HP04 0,05 %, pH 6) in einem sterilen 300 mi Erlenmeyerkolben wurden mit dem Pilzstamm ST 003367, DSM 14452, beimpft und 4 Tage bei 25° C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. 2 ml dieser Vorkultur wurden anschließend für die Herstellung der Hauptkulturen benötigt.

Beispiel 3 Herstellung des Thioperylenols durch Kultur des Pilzstammes ST 3367, DSM 14452.

Im Kolben : Ein steriler 300 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der folgende Nährlösung : Kartoffel- Dextrose 2,4%, Hefeextrakt 0,2 %, pH 5,1, wurde mit einer auf einem Schrägröhrchen (gleiche Nährlösung, jedoch mit 2 % Agar) gewachsenen Kultur oder mit 2 mi einer Vorkultur, wie in Beispiel 2 beschrieben, beimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25 °C inkubiert. Die maximale Produktion einer oder mehrerer Verbindungen der Formel I wurde nach etwa 96 Stunden erreicht.

Im Fermenter : Die Vorkulturanzucht des Stammes ST 003367, DSM 14452, erfolgte bei 25 °C und 140 Upm im 2 L-Erlenmeyerkolben (Füllvolumen 500 mL). Nach 72 h wurde der Fermenter beimpft. Die Fermentation des Stammes erfolgte in 8 L-Fermentern. Die Bedingungen für die Fermentation wurden wie folgt eingestellt und führten zu der Produktion der erfindungsgemäßen Verbindung Thioperylenol : Temperatur = 25°C ; Begasung = 0.5 vvm ; Drehzahl = 200-220 Umdrehungen pro Minute (Upm) ; Inokulum = 6 % ; Kultivierungszeit = 96 Stunden (h).

Nährmedien : Vorkultur Malzextrakt 20 g/L Hefeextrakt 2 g/L Glucose 10 g/L (NH4) 2PO4 0,5 g/l Hauptkultur Potato Dextrose Broth 24 g/L Hefeextrakt 2 g/L Desmophen 1,25 mL/L Durch wiederholte Zugabe von ethanolischer Polyollösung konnte die Schaumbildung unterdrückt werden. Das Produktionsmaximum wurde nach etwa 96 bis 144 Stunden erreicht.

Beispiel 4 : Isolierung des Naturstoffes Thioperylenol.

15 Liter der nach Beispiel 3 gewonnenen Kulturlösung wurden durch Zentrifugieren von der Zellmasse befreit. Das Mycel (1,5 Liter) wird mit 5 Liter Methanol extrahiert. Die klare alkoholische Phase wurde unter verminderten Druck auf etwa 2 Liter eingeengt und mit dem Kulturfitrat vereinigt. Anschließend trug man die trübe wässrige Lösung auf eine 1 L fassende, mit dem Adsorptionsharz MCI GelO CHP20P gefüllte Säule auf. Säulen- maße : Breite x Höhe : 6 cm x 35 cm. Eluiert wurde mit einem Lösungsmittel-Gradienten von 0,1 % Ammoniumformiat-Puffer, pH 4.5 in Wasser nach Propanol-2. Der Säulenausfluß (60 Minute) wurde in Fraktionen je 220 mL aufgefangen. Die Thioperylenol-haltigen Fraktionen 21 und 22, die durch HPLC-Analysen überprüft wurden, wurden gesammelt und unter verminderten Druck konzentriert. Das Thioperylenol wurde in reiner Form durch wiederholte präparative HPLC an SP 250/21 NUCLEOSIL 100-7 C18 HD@-Säulen (Macherey-Nagel, Düren) mit dem Elutionsmittel 0,1 % Ammon-iumformiat, pH 4.8, in Wasser/95 % Acetonitril im Gradienten-Verfahren gewonnen. Der Säulendurchfluß betrug 25 mL/Minute, das Thioperylenol wurde mit etwa 25 % Acetonitrilanteil von der Trennsäule eluiert. Durch langsames Konzentrieren unter verminderten Druck wurden 10 mg kristallines Thioperylenol erhalten.

Beispiel 5 : Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) des Thioperylenols.

Säule : YMC-Pack Pro C18 (g), AS-303,250 x 4.6 mm, S-5 um ; Mobile Phase : 0 bis 2 Minuten : 0,02 % Trifluoressigsäure (TFA), 2 bis 20 Minuten : 0 % bis 100 % Acetonitril in 0, 1% TFA, 20 bis 25 Minuten : 100 % Acetonitril.

Flußgeschwindigkeit : 1 mL pro Minute, Detektion durch UV-Absorption bei 210 nm.

Es wurde für das Thioperylenol die Retentionszeit von 12,1 Minuten gefunden.

Beispiel 6 : Eigenschaften des Thioperylenols.

Die physikalisch-chemischen sowie spektroskopischen Eigenschaften des Thioperylenols lassen sich wie folgt zusammenfassen : Aussehen : Bräunliche Kristalle, die in mittelpolaren, polaren organischen Lösungsmitteln und in wässrigen neutralen Puffern löslich sind. Stabil in neutralem und mild saurem, nicht oxidierendem Milieu, jedoch unbeständig in stark-saurer und stark-alkalischer Lösung.

Summenformel : C23H20O9S, Molekulargewicht : 472,47 H-und 13C-NMR : siehe Tabelle 1 ; UV-Maxima in Wasser/Acetonitril (1 zu 1), pH 3.0 : 216 nm, 259 nm, 292 nm und 383 nm.

Tabelle 1 : Chemische Verschiebungen von V-2474 in DMSO bei 300 K. Position 1H 13C 1-160. 14 2 7.01 118.22 3 8. 05 132. 57 4-125. 12 5 - 137. 09 6 - 113. 86 7-122. 82 8 7.53 123. 75 9 6.79 113. 50 10 - 156.37 11 - 122. 66 12-128. 08 13 - 204. 10 14 3.62/3.06 # 39. 1 15 4. 29 46. 56 16 - 70. 80 17 3.64 41.35 18 3. 93 49. 15 19 3. 44 55. 30 20 5.11 59.67 21 2. 92/2. 76 36. 23 22 3. 72 72. 96 23 - 174.38 Beispiel 7 : Massenspektrometrische Charakterisierung des Thioperylenols.

Dem Thioperylenol wird die Masse 472 zugeordnet aufgrund folgender Befunde : ESI+- Spektrum lieferte schwache Peaks bei 490 amu (M+NH4) + und 962 amu (2M+NH4) +.

ESI-Spektrum lieferte u. a. einen Peak bei 471 amu (M-H)-.

Mit einem FTICR-Massenspektrometer wurde im ESI-Modus unter Phosphorsäure- zusatz u. a. ein Peak bei 569.0525 amu beobachtet. Der Messwert stimmt gut mit dem für (M+H2P04)-= C23H22013PS = 569.0524 amu berechneten überein (0,2 ppm Abweichung).

MS/MS-Experimente mit einem FTICR-Massenspektrometer führten zu folgenden Fragmentierungen im ESI-Modus : 471 amu zu 349 amu (-C3H603S), 331 amu (-C3H804S), 313 amu (-C3H1005S), 303 amu (-C4H805S), 285 amu (-C4H1006S), 261 amu (-C6H1006S) und kleineren Fragmenten.

Pharmakologische Beispiele Gemessen werden kann die Plättchenaggregations-Hemmung unter anderem durch die turbimetrische Plättchenaggregationsbestimmung nach Born (Born, GV, Nature, 1962, 194 : 927-929).

Testprinzip : Die Methode beruht auf der Eigenschaft, daß die optische Dichte einer Partikelsuspension abhängig von der Partikeizahl und nicht der Größe ist. Nach Stimulation einer Plättchensuspension setzt die Aggregation der Plättchen ein. Dies führt zum Auftreten größerer Plättchenäggregate und der Zunahme der Lichttransmission. Diese wird fortlaufend photometrisch registriert und in Kurvenform kontinuierlich aufgezeichnet. Aus den Änderungen der Lichttransmission leiten sich die Maße der Aggregabilität der Thrombozyten bzw. deren Hemmung ab.

Zur Bestimmung der Zytotoxizität, wurde die Methode der Calcein Färbung von Zellen angewandt (Hollo Z et al., Biochim Biophys Acta 11 ; 1191 (2) : 384-8,1994).

Lebende Zellen inkorperieren das Substrat Calcein-Acetoxymethyl-Ester (C-AM), welches innerhalb der Zellen durch unspezifische Esterasen hydrolysiert wird. Der C-AM ist farblos und fluoresziert nicht. Innerhalb der lebenden Zelle erfolgt die Umwandlung zu dem fluoreszierenden Hydrolyseprodukt und die Vitalität der Zellen kann anhand der Fluoreszenz gemessen werden (Aex : 485nm/Aem : 538nm).

Die Tabelle 2 faßt die Hemmwirkungen einiger Hydroperylen-Derivate als IC5o-Wert beispielhaft zusammen. Der iCgo-Wert gibt die Konzentration an, die die Thrombocytenaggregation unter bestimmten Bedingungen zu 50% hemmt.

Tabelle 2. Die Konzentrationen einiger Hydroperylen-Derivate, die die Thrombocyten- Aggregation zu 50% hemmen (IC5o).

Verbindung IC5o (Plättchenaggregation) IC5o (Toxizität) Thioperylenol 7,2 uM 61 uM Alterperylenol 1, 6 pM > 100 pM Altertoxin I 29 µM > 100 µM Altertoxin II 2,6 uM 10uM Altertoxin III 6,1 µM 20 uM Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, weisen die Hydroperylenderivate neben einer Hemmung der Thrombocytenaggregation auch zum Teil eine erhebliche Zelltoxizität auf.

Die Zelltoxizität ist besonders stark bei Verbindungen, die Epoxyd-Gruppen tragen.

Deshalb sind von den Verbindungen der Formel I besonders diejenigen wertvoll, die zwar eine hemmende Wirkung auf die Plättchenaggregation besitzen, aber wenig toxisch sind. Bevorzugt sind also epoxydfreie Hydroperylenol-Derivate.

Beispiel 8 : Test auf Hemmung der Thrombocytenaggregation.

Für die Durchführung des Thrombocytenaggregationstestes werden folgende Reagenzien benötigt : Materialien Lieferant Katalog Nr. Water tissue culture Sigma W-3500 grade NaCI Merck 1. 06404 KCI Merck 1.04933 CaCl2 Merck 1. 02083 Albumin, Rind (BSA) Sigma A-6003 Calcein AM Molecular Probes C-1430 Collagen reagent Nycomed 5368 Human alpha Haemochrom HT1002A Thrombin Diagnostica Der Assay wurde folgendermaßen durchgeführt : Tyrode Puffer : NaCi 120mM KCI 2, 6mM NaHC03 12mM NaH2PO4 x H20 0,39mM Hepes 10mM Glucose 5, 5mM BSA 0,35% Zugabe von Glucose und BSA täglich frisch pH-Wert auf 7,4 einstellen Calcein AM : 1 mg Calcein AM in 1 ml DMSÖ (1 mM) Humanes a-Thrombin (Stammlösung) : 1000 units in 1 mi NaCl 0,9% Endkonzentration Aktivator : 0,05 U/ml Thrombin oder 1 ug/ml Collagen Wortmannin, Stammlösung : 1 mg in 233, 43 ul DMSO (10 mM).

Aggregation in Aggregometer (PAP 4) -Zelizahl 3 x 105Thrombozyten/pl - Ansatz in siliconisierten Microröhrchen aus Glas - Gesamtvolumen 400 µl/tube pro Microröhrchen : - 320 pl Thrombozyten -20p1 CaCI2 10mM (f. c. 0, 5 mM) - 20µl Testsubstanz -40p1 Agonist Kontrollen : - blank : 400 pI Puffer (Tyrode, 0,35% BSA) - Negativ-Kontrolle : 320 pi Thrombozyten 40, CaCl2 5 mM (f. c. 0,5 mM) 40, Puffer - Positv-Kontrolle : 320pi Puffer 40u CaCI2 5mM (f. c. 0, 5 mM) 40u Aktivator Der Leerwert für die Kanäle des Aggregometers wird zunächst mit Puffer eingestellt.

Dann werden die Thrombozyten in Microtubes pipettiert und nach Zugabe der Thrombozyten im Aggregometer für ein paar Minuten auf 37 °C erwärmt. Nach Zugabe eines Magnetrührers in jedes Reaktionsgefäß werden die Substanzen sowie CaCl2 zugegeben und die Aufzeichnung des Kurvenverlaufs im Aggregometer gestartet. Nach 2 Minuten Inkubation erfolgt die Zugabe des Aktivators, bzw. von Puffer in der Kontrolle. Der Kurvenverlauf wird für weitere 6 min bei 37 °C und einer Rührergeschwindigkeit von 1050 Umdrehungen pro Minute aufgezeichnet