Die Gesundheit eines tierischen oder menschlichen Organismus hängt unter anderem davon ab, inwieweit der Organismus sich ge- gen pathogene Agenzien aus seiner Umwelt schützen kann bezie-

hungsweise inwieweit der Organismus verändertes körpereigenes Material erkennen und eliminieren kann. Das Immunsystem des menschlichen oder tierischen Körpers, das diese Funktionen erfüllt, lässt sich in zwei funktionelle Bereiche unterteilen, nämlich das an- geborene und das erworbene Immunsystem. Die angeborene Immu- nität ist die erste Verteidigungslinie gegen Infektionen und die meis- ten potentiellen Krankheitserreger werden unschädlich gemacht, be- vor sie beispielsweise eine erkennbare Infektion verursachen kön- nen. Das erworbene Immunsystem reagiert auf als Antigene be- zeichnete Oberflächenstrukturen des eindringenden Organismus. Es gibt zwei Typen erworbener Immunreaktionen, nämlich die humorale Immunreaktion und die zellvermittelte Immunreaktion. Bei der humo- ralen Immunreaktion binden in den Körperflüssigkeiten vorhandene Antikörper an Antigene und zerstören diese. Bei der zellvermittelten Immunreaktion werden T-Zellen aktiv, die andere Zellen zerstören können. Wenn beispielsweise mit einer Krankheit im Zusammen- hang stehende Proteine in einer Zelle vorhanden sind, werden sie innerhalb der Zelle proteolytisch zu Peptiden fragmentiert. Danach binden spezifische Zellproteine an die so entstandenen Fragmente des Proteins oder Antigens und transportieren diese an die Oberflä- che der Zelle, wo sie den molekularen Abwehrmechanismen, insbe- sondere T-Zellen des Körpers präsentiert werden.

Die Moleküle, die die Peptide an die Zelloberfläche transportieren und dort präsentieren, werden als Proteine des Haupthistokompatibi- litäts-Komplexes (MHC) bezeichnet. Die Bedeutung der MHC- Proteine besteht insbesondere darin, dass sie T-Zellen ermöglichen, "selbst" (sel0-Antigene von"nicht selbst" (non-sel0-Antigenen zu un- terscheiden. Die MHC-Proteine werden in MHC-Proteine der Klasse 1 und der Klasse II unterteilt. Obwohl die Proteine der beiden MHC-

Klassen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheidet sich ihre Funkti- on relativ deutlich. Proteine der MHC-Klasse I sind auf der Oberflä- che fast aller Körperzellen vorhanden. Die Proteine der MHC-Klasse I präsentieren Antigene, die normalerweise von körpereigenen Prote- inen stammen, gegenüber cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs). Die MHC-Proteine der Klasse II sind nur auf B-Lymphozyten, Makropha- gen und anderen Antigen-präsentierenden Zellen vorhanden. Sie präsentieren hauptsächlich Peptide, die aus externen, also nicht kör- pereigenen Antigen-Quellen stammen, gegenüber T-Helfer (Th) - Zellen.

MHC-Moleküle der Klasse 1 werden konstitutiv auf der Oberfläche fast aller Zelltypen innerhalb des Körpers gebildet. Die von den MHC-Proteinen der Klasse I gebundenen Peptide stammen von normalerweise im gesunden Wirtsorganismus selbst produzierten zytoplasmatischen Proteinen ab, die weder im Zusammenhang mit Fremdzellen noch entarteten Zellen stehen. Normalerweise wird durch solche MHC-Proteine der Klasse I auch keine Immunreaktion stimuliert. Zytotoxische T-Lymphozyten, die solche"self" (selbst)- Peptide präsentierende MHC-Moleküle der Klasse I erkennen, wer- den daher in den Thymus transportiert oder nach ihrer Freisetzung aus dem Thymus vom Körper toleriert. MHC-Moleküle können nur dann eine Immunreaktion stimulieren, wenn ein"non-self" (nicht- selbst)-Peptid gebunden ist, an das zytotoxische T-Lymphozyten binden. Die meisten zytotoxischen T-Lymphozyten besitzen sowohl T-Zell-Rezeptoren (TCR) und CD8-Moleküle auf ihrer Oberfläche.

Die T-Zell-Rezeptoren können nur dann non-self-Peptide erkennen und daran binden, wenn sie in Form eines Komplexes mit den Mole- külen der MHC-Klasse I vorliegen. Damit ein T-Zell-Rezeptor einen Peptid-MHC-Komplex binden kann, müssen zwei Bedingungen erfüllt

sein. Erstens müssen die T-Zell-Rezeptoren eine Struktur aufweisen, die ihnen eine Bindung an den Peptid-MHC-Komplex erlaubt. Zwei- tens muss das CD8-Molekül an die a-3-Domäne der MHC-Klasse I- Moleküle binden. Jeder zytotoxische T-Lymphozyt exprimiert einen unikalen T-Zell-Rezeptor, der nur einen spezifischen MHC-Peptid- Komplex binden kann.

Die Peptide binden an die Moleküle der MHC-Klasse I durch kompe- titive Affinitätsbindung innerhalb des endoplasmatischen Retikulums, bevor sie auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Die Affinität ei- nes einzelnen Peptides steht dabei in direktem Zusammenhang mit seiner Aminosäuresequenz und dem Vorhandensein von spezifi- schen Bindungsmotiven an definierten Positionen innerhalb der Ami- nosäuresequenz. Die Kenntnis der Sequenz eines solchen"non- self'-Peptides ermöglicht es beispielsweise, das Immunsystem ge- gen erkrankte Zellen zu manipulieren, zum Beispiel unter Verwen- dung von Peptid-Impfstoffen. Die direkte Analyse von solchen"non- self'-Peptiden wird jedoch durch mehrere Faktoren erschwert. Bei- spielsweise sind sehr häufig relevante Epitope, d. h. relevante Pep- tidsequenzen unterrepräsentiert. Erschwerend kommt hinzu, dass MHC-Moleküle einen hohen Polymorphismus-Grad aufweisen. So kann ein Individuum allein bei den Molekülen der MHC-Klasse I bis zu sechs verschiedene Polymorphismen aufweisen, wobei in jedem Fall zum Teil sehr unterschiedliche Peptidsequenzen gebunden wer- den.

Unter Verwendung von Computeralgorithmen lassen sich potentielle T-Zell-Epitope, also Peptidsequenzen, die von den MHC-Molekülen der Klasse) oder) ! in Form eines Peptid-präsentierenden Komple- xes gebunden und dann in dieser Form von den T-Zell-Rezeptoren

zytotoxischer T-Lymphozyten erkannt werden, vorhersagen. Das heißt, das Ergebnis solcher Analysen erlaubt Aussagen über die Wahrscheinlichkeit einer Bindung eines Peptides an spezifische MHC-Moleküle, beispielsweise HLA-Phänotypen. Derzeit werden insbesondere zwei Programme, nämlich SYFPEITHI (Rammensee et al., Immunogenetics, 50 (1999), 213-219) und HLAB) ND (Parker et al., J. Immunol., 152 (1994), 163-175) verwendet. Die so ermittel- ten Peptidsequenzen, die potentiell mit MHC-Molekülen der Klasse I eine Bindung eingehen können, müssen dann in vitro hinsichtlich ihrer tatsächlichen Bindungskapazität untersucht werden. Die dazu erforderlichen Verfahren sind jedoch in ihrer Wirksamkeit stark be- schränkt, da nur eine äußerst geringe Anzahl von Peptiden simultan gescreent und untersucht werden kann.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Prob- lem besteht darin, ein verbessertes Verfahren zum Screenen poten- tieller T-Zell-Epitope bereitzustellen, das eine simultane und schnelle Untersuchung einer Vielzahl von Peptidsequenzen, beispielsweise solcher Sequenzen, die unter Verwendung von Computeralgorith- men bereits als potentielle Bindungspartner für spezifische MHC- Moleküle ermittelt wurden, hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bindung an spezifische MHC-Moleküle erlaubt.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens in vitro, wobei eine Population von Peptid-Fragmenten des Antigens einer kompetitiven Bindung an eine erste immobilisierte Rezeptor- Einheit, vorzugsweise und optional in Gegenwart einer zweiten Re- zeptor-Einheit, die zusammen mit der ersten Rezeptor-Einheit einen

Rezeptor bilden kann, unterworfen und das oder die gebundenen Peptid-Fragmente mit Affinität zu dem Rezeptor an zumindest die erste Rezeptor-Einheit, vorzugsweise an die beiden Rezeptor- Einheiten bindet, und das oder die gebundene (n) Peptid-Fragmente anschließend isoliert und analysiert wird beziehungsweise werden, umfassend a) Immobilisierung mindestens der ersten Rezeptor-Einheit, die min- destens eine erste funktionelle Gruppe aufweist, an einem Nanopar- tikel, dessen Oberfläche mindestens eine die erste funktionelle Gruppe bindende zweite funktionelle Gruppe aufweist, b) Herstellung beziehungsweise Bereitstellung einer Population von Peptid-Fragmenten des Protein-Antigens, die unterschiedliche Se- quenzbereiche des Protein-Antigens umfassen, c) Durchführung einer kompetitiven Bindung der Peptidfragment- Population an die am Nanopartikel immobilisierte erste Rezeptor- Einheit, optional, insbesondere bei MHC-Molekülen der Klasse II, in Gegenwart einer zweiten Rezeptor-Einheit, wobei das oder die Pep- tid-Fragmente mit Affinität zu der ersten beziehungsweise beiden Rezeptor-Einheiten, insbesondere, wenn vorhanden, zusammen mit der zweiten Rezeptor-Einheit, an die erste Rezeptor-Einheit bindet und ein an dem Nanopartikel immobilisierter Rezeptor- Peptidfragment-Komplex erhalten wird, und d) Analyse des immobilisierten Rezeptor-Peptid. fragment-Komplex und/oder des beziehungsweise der gebundenen Peptid- Fragmente (s).

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem also durch die Bereitstellung eines Verfahrens, wobei in vitro ein Rezeptor/Ligand-Komplex, insbesondere ein Rezeptor- Peptidfragment-Komplex unter Bedingungen erzeugt wird, die den tatsächlichen in vivo-Verhältnisse, beispielsweise in einer Zelle mit MHC-Molekülen der Klasse 1 weitestgehend entsprechen. Dabei wird erfindungsgemäß eine Population von Peptidfragmenten, die bei- spielsweise die vollständige Aminosäuresequenz eines Protein- Antigens repräsentieren können, erzeugt und die gesamte Peptid- fragment-Population wird dann in einem Schritt einer Bindung an einen immobilisierten Rezeptor, insbesondere einen MHC-Komplex, oder an eine immobilisierte Rezeptor-Einheit, also eine Kette des MHC-Komplexes unterworfen. In Fällen, in denen der Rezeptor ein Protein der MHC-Klasse I ist, kann die Bindung des oder der Peptid- fragmente an die immobilisierte erste Rezeptor-Einheit, insbesonde- re die a-Kette, für die erfindungsgemäße Identifizierung ausreichen, ohne dass eine zweite Rezeptor-Einheit vorhanden sein muss.

Selbstverständlich kann diese zweite Einheit dennoch vorhanden sein. Dies gilt insbesondere für den Fall, dass der Rezeptor ein Pro- tein der MHC-Klasse II ist. Das oder die Peptid-Fragmente, die Affini- tät zu dem Rezeptor, der einen Rezeptor-Einheit und/oder den bei- den Rezeptor-Einheiten aufweist beziehungsweise aufweisen, kann dann tatsächlich einen in immobilisierter Form vorliegenden Rezep- tor-Ligand-Komplex oder einen Rezeptor-Peptidfragment-Komplex bilden. Da erfindungsgemäß die Immobilisierung an Nanopartikeln erfolgt, kann der resultierende Rezeptor-Ligand-Komplex auf einfa- che Weise von den Peptid-Fragmenten abgetrennt werden, die kei- nen Rezeptor-Ligand-Komplex bilden können, also keine Affinität zu dem ersten oder beiden Rezeptor-Einheiten aufweisen, da sie also

im Vergleich zu dem im Komplex gebundenen Peptid-Fragment kei- ne oder eine erheblich geringere Affinität zu dem Rezeptor aufwei- sen. Erfindungsgemäß kann das Peptid-Fragment oder die Peptid- Fragmente mit Affinität aus der Population von Peptid-Fragmenten abgetrennt und analysiert werden. Dieses Peptid-Fragment kann erfindungsgemäß in gebundener Form, d. h. als Rezeptor-Ligand- Komplex beispielsweise unter Verwendung von MALDI- Massenspektrometrie analysiert werden. Das im Komplex gebunde- ne Peptid-Fragment kann jedoch erfindungsgemäß auch von dem immobilisierten Komplex abgetrennt und separat analysiert werden, beispielsweise einer Sequenzierung unterworfen werden. Die für die erfindungsgemäße Verfahrensweise bereitgestellte Peptid- Fragment-Population enthält die einzelnen, individuellen Peptid- Fragmente jeweils in ausreichender Menge, um eine erfindungsge- mäße Identifizierung zu ermöglichen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "T-Zell-Epitop"eine Peptidsequenz verstanden, die von den MHC- Molekülen der Klasse I oder 11 in Form eines Peptid-präsentierenden MHC-Moleküls oder MHC-Komplexes gebunden und dann in dieser Form von zytotoxischen T-Lymphozyten oder T-Helfer-Zellen erkannt und gebunden werden kann.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Rezeptor"ein biologisches Molekül oder eine Molekülgruppierung verstanden, das/die einen Liganden binden kann. Ein Rezeptor kann zum Beispiel der lnformationsübermittlung in einer Zelle, einem Zell- verband oder einem Organismus dienen. Der Rezeptor besteht aus mindestens einer Rezeptor-Einheit und vorzugsweise aus zwei Re- zeptor-Einheiten, wobei jede Rezeptor-Einheit aus einem Proteinmo-

lekül, insbesondere einem Glykoproteinmolekül bestehen kann. Der Rezeptor weist zu einem Liganden eine komplementäre Struktur auf und kann den Liganden als Bindungspartner komplexieren. Die In- formationsweiterleitung erfolgt insbesondere durch Änderung der Konformation des Rezeptors nach Komplexierung des Liganden an der Oberfläche einer Zelle. Erfindungsgemäß werden unter einem Rezeptor insbesondere Proteine der MHC-Klassen und)) verstan- den, die mit einem Liganden, insbesondere einem Peptid oder Pep- tidfragment geeigneter Länge, einen Rezeptor-Ligand-Komplex bil- den können.

Unter einem"Liganden"wird ein Molekül verstanden, das zu einem Rezeptor eine komplementäre Struktur aufweist und mit diesem ei- nen Komplex bilden kann. Erfindungsgemäß wird unter einem Li- ganden insbesondere ein Peptid oder Peptid-Fragment verstanden, das eine geeignete Länge und in seiner Aminosäuresequenz geeig- nete Bindungsmotive aufweist, so dass das Peptid oder Peptid- Fragment mit Proteinen der MHC-Klasse I oder der MHC-Klasse II einen Komplex bilden kann.

Unter einem"Rezeptor-Ligand-Komplex"wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch ein"Rezeptor-Peptid-Komplex" oder"Rezeptor-Peptidfragment-Komplex", insbesondere ein Peptid- oder Peptidfragment-präsentierendes MHC-Molekül der Klasse I o- der der Klasse II verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter "Proteinen oder Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC)","MHC-Molekülen"oder"MHC-Proteinen"insbesondere Pro- teine verstanden, die Peptide, die aus der proteolytischen Spaltung

von Protein-Antigenen resultieren und potentielle T-Zell-Epitope dar- stellen, binden, an die Zelloberfläche transportieren und dort gegen- über spezifischen Zellen, insbesondere zytotoxischen T- Lymphozyten oder T-Helfer-Zellen präsentieren können. Der Haupthistokompatibilitätskomplex im Genom umfasst die genetische Region, deren exprimierte Genprodukte auf der Zelloberfläche wich- tig für die Erkennung körpereigener und/oder körperfremder Antige- ne und damit für die Regulation immunologischer Vorgänge sind.

Der Haupthistokompatibilitätskomplex wird in zwei Gengruppen ein- geteilt, die unterschiedliche Proteine codieren, nämlich Moleküle der MHC-Klasse I und Moleküle der MHC-Klasse II. Die Moleküle der beiden MHC-Klassen sind auf unterschiedliche Antigen-Quellen spe- zialisiert. Die Moleküle der MHC-Klasse I präsentieren endogen syn- thetisierte Antigene, beispielsweise virale Proteine. Die Moleküle der MHC-Klasse II präsentieren aus exogenen Quellen stammende Pro- tein-Antigene, beispielsweise bakterielle Produkte. Die Zellbiologie und die Expressionsmuster beider MHC-Klassen sind auf diese un- terschiedlichen Rollen ausgerichtet.

MHC-Moleküle der Klasse 1 bestehen aus einer schweren Kette von etwa von etwa 45 kDa und einer leichten Kette von etwa 12 kDa und können ein Peptid von etwa 8 bis 10 Aminosäuren, sofern dieses über geeignete Bindungsmotive verfügt, binden und gegenüber zyto- toxischen T-Lymphozyten präsentieren. Das von den MHC- Molekülen der Klasse I gebundene Peptid stammt von einem endo- genen Protein-Antigen. Bei der schweren Kette der MHC-I\/loleküie der Klasse I handelt es sich vorzugsweise um ein HLA-A-, HLA-B- oder HLA-C-Monomer und bei der leichten Kette um ß-2- Mikroglobulin.

MHC-Moleküle der Klasse II bestehen aus einer a-Kette von etwa 34 kDa und einer ß-Kette von etwa 30 kDa und können ein Peptid von etwa 15 bis 24 Aminosäuren binden, sofern dieses über geeignete Bindungsmotive verfügt, und gegenüber T-Helfer-zellen präsentie- ren. Das von den MHC-Molekülen der Klasse II gebundene Peptid stammt von einem exogenen Protein-Antigen. Bei der a-Kette und der ß-Kette handelt es sich insbesondere um HLA-DR-, HLA-DQ- und HLA-DP-Monomere.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Nanopartikel"eine partikuläre Bindematrix verstanden, die an ihrer Oberfläche mindestens erste funktionelle chemische Gruppen um- fassende molekülspezifische Erkennungsstellen aufweist. Die erfin- dungsgemäß verwendeten Nanopartikel umfassen einen Kern mit einer Oberfläche, auf der die ersten funktionellen Gruppen angeord- net sind, wobei die ersten funktionellen Gruppen komplementäre zweite funktionelle Gruppen eines Moleküls kovalent oder nicht- kovalent binden können. Durch Wechselwirkung zwischen den ers- ten und zweiten funktionellen Gruppen wird das Molekül, vorzugs- weise Biomolekül, an dem Nanopartikel immobilisiert und/oder kann daran immobilisiert werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Na- nopartikel weisen eine Größe von < 500 nm, vorzugsweise <1 50 nm auf. Der Kern der Nanopartikel besteht vorzugsweise aus chemisch inerten anorganischen oder organischen Materialien, besonders be- vorzugt aus Silica.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "ersten funktionellen Gruppe"eine in einer Rezeptor-Einheit, insbe- sondere einer Kette eines MHC-Moleküls, vorhandene chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer komplementären

funktionellen Gruppe, die beispielsweise auf der Oberfläche des Na- nopartikels vorhanden ist, derart zu interagieren, dass eine affine, bevorzugt kovalente Bindung zwischen den beiden Bindungspart- nern stattfinden kann. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die erste funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Biotin- Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag l-Gruppen, Strep-Tag II- Gruppen, Histidin-Tag-Gruppen und FLAG-Tag-Gruppen.

Die zweite funktionelle Gruppe, also die funktionelle Gruppe auf der Oberfläche des Nanopartikels, ist erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Ma- leinimido-Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravi- din-Gruppen und Metallchelatkomplexen.

Ein erfindungsgemäß verwendetes Nanopartikel weist also an seiner Oberfläche mindestens eine zweite funktionelle Gruppe auf, die ko- valent oder nicht-kovalent mit einer ersten funktionellen Gruppe einer Rezeptor-Einheit verknüpft wird, wobei die erste funktionelle Gruppe eine andere Gruppe als die zweite funktionelle Gruppe ist. Die bei- den miteinander in Bindung tretenden Gruppen müssen komplemen- tär zueinander sein, das heißt fähig sein, eine kovalente oder nicht- kovalente Bindung miteinander einzugehen.

Wird erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppe beispielsweise eine Carboxy-Gruppe eingesetzt, so ist die zweite funktionelle Grup- pe auf der Oberfläche der Nanopartikel eine Amino-Gruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Amino-Gruppe als erste funktio- nelle Gruppe der Rezeptor-Einheit verwendet, ist erfindungsgemäß die zweite funktionelle Gruppe auf der Nanopartikel-Oberfläche eine

Carboxy-Gruppe. Wird erfindungsgemäß eine Thiol-Gruppe als erste funktionelle Gruppe der Rezeptor-Einheit ausgewählt, ist die zweite funktionelle Gruppe erfindungsgemäß eine Maleinimido-Gruppe.

Werden erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppen der Rezep- tor-Einheit Biotin-Gruppen und/oder Strep-Tag l-Gruppen und/oder Strep-Tag 11-Gruppen'verwendet, ist die zweite funktionelle Gruppe auf der Nanopartikel-Oberfläche eine Avidin-Gruppe und/oder eine Streptavidin-Gruppe oder eine Neutravidin-Gruppe. Wird erfindungs- gemäß als erste funktionelle Gruppe der Rezeptor-Einheit eine Thiol- Gruppe eingesetzt, ist die zweite funktionelle Gruppe auf der Nano- partikel-Oberfläche eine Maleinimido-Gruppe.

Die vorgenannten ersten und/oder zweiten funktionellen Gruppen können mit Hilfe eines Spacers mit der zu immobilisierenden Rezep- tor-Einheit beziehungsweise der Oberfläche der Nanopartikel ver- bunden beziehungsweise mittels eines Spacers an die Nanopartikel- oberfläche oder in die Rezeptor-Einheit eingeführt werden. Der Spacer dient also einerseits als Abstandshalter der funktionellen Gruppe zur Nanopartikel-Oberfläche beziehungsweise Rezeptor- Einheit, andererseits als Träger für die funktionelle Gruppe. Ein der- artiger Spacer kann erfindungsgemäß Alkylen-Gruppen oder Ethy- lenoxid-Oligomere mit 2 bis 50 C-Atomen sein, der in bevorzugter Ausführungsform substituiert ist und Heteroatome aufweist. Der Spacer kann flexibel und/oder linear sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die ersten funktionellen Gruppen ein natürlicher Bestandteil der Rezeptor-Einheit sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungs- form der Erfindung ist vorgesehen, die ersten funktionellen Gruppen mittels gentechnischer Verfahren, biochemischer, enzymatischer

und/oder chemischer Derivatisierung oder chemischer Synthesever- fahren in die Rezeptoreinheit einzuführen. Beispielsweise können unnatürliche Aminosäuren durch gentechnische Verfahren oder wäh- rend einer chemischen Proteinsynthese in die Rezeptor-Einheit ein- gefügt werden, beispielsweise zusammen mit Spacern oder Linkern.

Derartige unnatürliche Aminosäuren sind Verbindungen, die eine Aminosäurefunktion und einen Rest R aufweisen und nicht über den natürlich vorkommenden genetischen Code definiert sind, wobei die- se Aminosäuren in bevorzugter Weise eine Thiol-Gruppe aufweisen.

Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure, beispielsweise Lysin, zu modifizieren, beispielsweise durch Derivatisierung ihrer Seitenkette, insbesondere deren primäre Amino-Gruppe mit der Carbonsäurefunktion von Lävu- linsäure.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können funktionelle Gruppen durch Modifikation in die Re- zeptor-Einheit eingeführt werden, wobei der Rezeptor-Einheit Tags, also Markierungen, hinzugefügt werden, vorzugsweise an den C- Terminus oder den N-Terminus. Diese Tags können jedoch auch intramolekular angeordnet sein. Insbesondere ist vorgesehen, dass ein Protein-Rezeptor dadurch modifiziert wird, dass mindestens ein Strep-Tag, beispielsweise ein Strep-Tag I oder Strep-Tag II oder Bio- tin, zum Beispiel über BirA, hinzugefügt wird. Erfindungsgemäß wer- den unter einem Strep-Tag auch funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente verstanden, sofern sie Streptavidin-Gruppen und/oder dessen Äquivalente binden können. Der Begriff"Streptavidin"erfasst erfindungsgemäß also auch dessen funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente.

Die Oberfläche des Nanopartikels ist erfindungsgemäß dadurch cha- rakterisiert, dass sie durch Aufbringen der die ersten funktionellen Gruppen bindenden komplementären zweiten funktionellen Gruppen modifiziert ist. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die funktionellen Gruppen unter Verwendung von Standardverfahren wie Pfropf-Polymerisation, Silanisierung, chemischer Derivatisierung und ähnlicher geeigneter Verfahren auf die Nanopartikel-Oberfläche aufgebracht sind.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Nanopartikel-Oberfläche durch Aufbringen zusätzlicher Funktionalitäten modifiziert sein kann.

In bevorzugter Ausführungsform kann die Oberfläche der Nanoparti- kel chemische Verbindungen aufweisen, die eine unspezifische Ad- sorption von anderen Proteinen an den Nanopartikeln verhindern oder verringern. Besonders bevorzugt weist die Oberfläche Ethylen- glykol-Oligomere auf.

Erfindungsgemäß besteht auch die Möglichkeit, dass auf der Ober- fläche der Nanopartikel separat oder zusätzlich lonenaustausch- Funktionen verankert sind. Dies gilt insbesondere für den Fall, dass die Analyse des erhaltenen Rezeptor-Ligand-Komplexes, insbeson- dere des Peptid-präsentierenden MHC-Moleküls und/oder des darin gebundenen Peptid-Fragmentes unter Verwendung von MALDI- Verfahren analysiert werden soll. In der MALDI-Arialytik ist der Salz- Gehalt der Matrix oft eine kritische Größe, da es durch lonenanlage- rung zu einer Unterdrückung der lonisation oder zu einer Peak- Verbreiterung kommt beziehungsweise dass sich auch Störpeaks ergeben. Mit Nanopartikeln, die eine hohe lonenaustausch-Kapazität

besitzen und dadurch störende Salze in der Matrix fixieren, lässt sich dieses Problem umgehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver- fahrens zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell- Epitopen ist vorgesehen, dass die bevorzugt vorhandene zweite Re- zeptor-Einheit vor Durchführung der kompetitiven Bindungsreaktion frei in Lösung vorliegt, insbesondere bei MHC 1-Molekülen ß-2-Mikro- globulin. Das heißt, in dieser bevorzugten Ausführungsform, in der eine zweite Rezeptor-Einheit eingesetzt wird, enthält der zur Durch- führung der erfindungsgemäßen kompetitiven Bindungsreaktion ver- wendete Puffer sowohl die zweite Rezeptor-Einheit als auch die Po- pulation der Peptidfragmente des Protein-Antigens. Die Nanopartikel mit der immobilisierten ersten Rezeptor-Einheit, wobei die Immobili- sierung durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe an der Nanopar- tikel-Oberfläche erfolgt, werden dann zu dem die zweite Rezeptor- Einheit und die Peptidfragment-Population enthaltenden Puffer ge- geben und in diesem inkubiert, wobei die erste Rezeptor-Einheit, die zweite Rezeptor-Einheit und das mindestens eine Peptidfragment mit Affinität zu den beiden Rezeptor-Einheiten beziehungsweise dem durch die beiden Rezeptor-Einheiten gebildeten Rezeptor oder Re- zeptor-Dimer einen Rezeptor-Ligand-Komplex, irisbesondere ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül bilden können. Der gebildete Rezeptor-Ligand-Komplex ist dabei über die immobilisierte erste Re- zeptor-Einheit an den Nanopartikeln immobilisiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge- mäßen Verfahrens zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T- Zell-Epitopen ist vorgesehen, das die zweite Rezeptor-Einheit zu-

sammen mit der ersten Rezeptor-Einheit vor Durchführung der kom- petitiven Bindungsreaktion in Form eines den Rezeptor, insbesonde- re ein MHC-Molekül, bildenden Dimers an den Nanopartikeln immo- bilisiert wird. In dieser Ausführungsform ist vorgesehen, dass die zweite Rezeptor-Einheit mindestens eine dritte funktionelle Gruppe aufweist und die Oberfläche des Nanopartikels mindestens eine komplementäre, die dritte funktionelle Gruppe bindende vierte funk- tionelle Gruppe aufweist. Vorzugsweise werden beide Rezeptorein- heiten, die das Rezeptor-Dimer bilden, gerichtet und unter Beibehal- tung der biologischen Aktivität des Rezeptors an dem Nanopartikel immobilisiert.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der <BR> <BR> <BR> <BR> Begriff"gerichtet immobilisiert"oder"gerichtete Immobilisierung", dass ein Molekül, insbesondere das Rezeptor-Dimer an definierten Positionen innerhalb der beiden Rezeptor-Einheiten dergestalt an einem Nanopartikel immobilisiert ist, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderlichen Domäne (n) des Rezeptors gegenüber dem nicht-immobilisierten Zustand nicht verändert ist und dass diese Rezeptor-Domäne (n), insbesondere die Bindungstasche zur Bindung eines geeigneten Peptides, bei Kontakt mit geeigneten Peptiden für diese frei zugänglich ist/sind."Gerichtet immobilisiert"bedeutet auch, dass die Fixierung der beiden Rezep- tor-Einheiten, die das Rezeptor-Dimer bilden, so erfolgt, dass der immobilisierte Rezeptor bei einer späteren Verwendung in einer zel- lulären beziehungsweise zellähnlichen Umgebung durch Protein- degradierende Enzyme nicht oder nur sehr langsam degradiert wer- den kann. Das heißt, dass das immobilisierte Rezeptor-Dimer auf der Oberfläche der Nanopartikel so ausgerichtet ist, dass es so we- nig wie möglich Angriffspunkte für Proteasen bietet.

"Beibehaltung der biologischen Aktivität"bedeutet, dass die den Re- zeptor bildenden Rezeptor-Einheiten nach Immobilisierung an der Oberfläche eines Nanopartikels die gleichen oder nahezu gleichen biologischen Funktionen in zumindest ähnlichem Ausmaß ausüben können wie die gleichen Rezeptor-Einheiten oder der durch beide Einheiten gebildete Rezeptor im nicht-immobilisierten Zustand unter geeigneten in vitro-Bedingungen beziehungsweise die gleichen Re- zeptor-Einheiten oder der gleiche Rezeptor in ihrer/seiner natürlichen zellulären Umgebung.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Dimer"oder"Rezeptor-Dimer"eine Verbindung verstanden, die durch Verknüpfung von zwei Untereinheiten oder Einheiten gebildet wird. Bei den zwei verknüpften Rezeptor-Untereinheiten handelt es sich um unterschiedliche Moleküle, die sich sowohl bezüglich ihrer Zusammensetzung, das heißt Aminosäuresequenz, als auch bezüg- lich ihrer Länge unterscheiden können. Vorzugsweise ist bei dem immobiliserten Rezeptor-Dimer jede Rezeptor-Untereinheit oder Re- zeptor-Einheit an der Oberfläche des Nanopartikels gebunden. Er- findungsgemäß ist auch vorgesehen, dass nur eine Rezeptor-Einheit des Rezeptor-Dimers über eine kovalente Bindung zwischen der ers- ten funktionellen Gruppe und der zweiten funktionellen Gruppe am Nanopartikel fixiert ist.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die dritte funktionelle Gruppe der zweiten Rezeptor-Einheit von der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit verschieden ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Thi- ol-Gruppen, Biotin-Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag I- Gruppen, Strep-Tag 11-Gruppen, Histidin-Tag-Gruppen und FLAG-

Tag-Gruppen. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die dritte funk- tionelle Gruppe ein natürlicher Bestandteil der zweiten Rezeptor- Einheit oder mittels gentechnischer Verfahren, enzymatischer Ver- fahren und/oder chemischer Derivatisierung in die zweite Rezeptor- Einheit eingeführt wird.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die vierte funktionelle Grup- pe auf der Nanopartikel-Oberfläche von der die erste funktionelle Gruppe bindenden zweiten funktionellen. Gruppe der Nanopartikel verschieden ist. Die vierte funktionelle Gruppe, also die funktionelle Gruppe auf der Oberfläche des Nanopartikels, ist erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carbo- xy-Gruppen, Maleinimido-Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin- Gruppen, Neutravidin-Gruppen und Metalichelatkomplexen. Erfin- dungsgemäß ist vorgesehen, dass die vierte funktionelle Gruppe e- benso wie die zweite funktionelle Gruppe mittels Propfsilanisierung, Silanisierung, chemischer Derivatisierung oder ähnlicher geeigneter Verfahren auf die Nanopartikel-Oberffläche aufgebracht wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die erste und zweite Rezeptor-Einheit natürlicherweise vor- kommende oder mittels gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellte Moleküle, insbesondere Ketten eines MHC-Moleküls, sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Rezep- tor ein MHC-Molekül der Klasse I. Erfindungsgemäß bevorzugt han- delt es sich bei der ersten Rezeptor-Einheit um eine schwere Kette von etwa 45 kDa und der zweiten Rezeptor-Einheit um eine leichte Kette von etwa 12 kDa oder bei der ersten Rezeptor-Einheit um eine

leichte Kette von etwa 12 kDa und der zweiten Rezeptor-Einheit um eine schwere Kette von etwa 45 kDa. Selbstverständlich können auch Modifikationen, Mutationen oder Varianten dieser Ketten ein- gesetzt werden, zum Beispiel verkürzte Formen dieser Ketten, zum Beispiel solche, denen die Transmembranregion fehlt. Derartige truncierte Formen können zum Beispiel schwere Ketten ohne Transmembranregion mit einem Molekulargewicht von 35 kDa sein.

Wenn also erfindungsgemäß die erste und die zweite Rezeptor- Einheit einen MHC-Komplex der Klasse 1 bilden können, können sie ein Peptid-Fragment von etwa 8 bis 18, vorzugsweise etwa 8 bis 10 Aminosäuren in der kompetitiven Bindungsreaktion binden und so ein Peptid-präsentierender Rezeptor bilden. Vorzugsweise handelt es sich bei der schweren Kette um ein HLA-A-, HLA-B-oder HLA-C- Monomer und bei der leichten Kette um ß-2-Microglobulin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse II. Erfindungsgemäß bevor- zugt handelt es sich bei der ersten Rezeptor-Einheit um eine a-Kette von etwa 34 kD und bei der zweiten Rezeptor-Einheit um eine ß- Kette von etwa 30 kD oder bei der ersten Rezeptor-Einheit um eine ß-Kette von etwa 30 kD und der zweiten Rezeptor-Einheit um eine a- Kette von etwa 34 kD. Vorzugsweise handelt es sich bei der a-Kette und der ß-Kette um HLA-DR-, HLA-DQ-oder HLA-DP-Monomere.

Erfindungsgemäß können auch Mutationen, Modifikationen oder Va- rianten davon eingesetzt werden. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass bei Verwendung der a-Kette und der ß-Kette das zu analysie- rende Peptid-Fragment von einem exogenen Protein-Antigen ab- stammt, Wenn also erfindungsgemäß die erste und die zweite Re- zeptor-Einheit einen MHC-Komplex der Klasse II bilden, können sie ein Peptid-Fragment von etwa 8 bis 18, vorzugsweise etwa 8 bis 10

Aminosäuren in der kompetitiven Bindungsreaktion binden und so ein Peptid-präsentierender Rezeptor bilden. Erfihdungsgemäß ist vorgesehen, dass die erste und die zweite Rezeptor-Einheit natürli- cherweise vorkommende oder mittels gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellte Ketten sind.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Population von Peptid- Fragmenten des zu analysierenden Protein-Antigens mittels enzyma- tischer Protein-Spaltung, gentechnischer Verfahren oder chemischer Syntheseverfahren hergestellt wird.

In einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die so erhaltenen Peptid-Fragmente der hergestellten Popu ! ation die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins-Antigens vollständig rep- räsentieren. In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung ist vor- gesehen, dass die Peptidfragmente der Population die Aminosäure- sequenz des Protein-Antigens nur teilweise repräsentieren. Dabei handelt es sich insbesondere um Peptid-Fragmente, die, wie mittels eines Computer-Algorithmus bestimmt, potentielle T-Zell-Epitope darstellen. Erfindungsgemäß können zur Vorhersage potentieller T- Zell-Epitope Computer-Algorithmen wie SYFPEETHI (Rammensee et al., 1999) und HLA BIND (Parker et al., 1994) eingesetzt werden.

Wenn es sich bei dem Rezeptor um ein MHC-Molekül vom Typ I handelt, ist vorgesehen, dass die Peptid-Fragmente der herzustel- lenden Population eine Länge von 8 bis 10 Aminosäuren aufweisen.

Handelt es sich hingegen bei dem Rezeptor um ein MHC-Molekül vom Typ II, weisen die Peptid-Fragmente der herzustellenden Popu- lation vorzugsweise eine Länge von 15 bis 24 Aminosäuren auf.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Peptid-Fragmente der Population mit einem Marker und/oder einer fünften funktionellen Gruppe versehen werden. Der Marker dient insbesondere zum Nachweis der Peptid-Fragmente. Bei dem Marker. kann es sich bei- spielsweise um einen Fluoreszenzmarker oder einen radioaktiven Marker handeln. Die fünfte funktionelle Gruppe der Peptid- Fragmente dient vorzugsweise zur Isolierung und/oder Aufreinigung der Peptidfragmente. Beispielsweise kann das im Peptid- präsentierenden MHC-Molekül gebundene Peptid-Fragment nach Freisetzung aus dem Komplex durch Bindung der fünften funktionel- len Gruppe an komplementäre sechste funktionelle Gruppen an ge- eignete Nanopartikel immobilisiert und so von den übrigen Bestand- teilen des Komplexes abgetrennt werden. Die fünfte funktionelle Gruppe ist vorzugsweise von der ersten, zweiten, dritten und/oder vierten funktionellen Gruppe verschieden und kann mit diesen keine Bindung eingehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Im- mobilisierung der ersten Rezeptor-Einheit oder die Immobilisierung der ersten und zweiten Rezeptor-Einheit an die Nanopartikel durch eine Inkubation der Rezeptor-Einheit (en) mit den Nanopartikeln in einen PBS-Puffer über einen Zeitraum von einer Stunde bis vier Stunden, vorzugsweise zwei Stunden, bei Raumtemperatur in einer Schüttelvorrichtung, wobei Nanopartikel mit immobilisierten ersten Rezeptor-Einheiten oder Nanopartikel mit immobilisierten ersten und zweiten Rezeptor-Einheiten erhalten werden.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Immobili- sierung von Rezeptor-Einheiten an die Nanopartikel auch dadurch erfolgen, dass unter Verwendung eines Peptides bekannter Sequenz

und geeigneter Länge, von dem bekannt ist, dass es an den ver- wendeten Rezeptor, also das verwendete MHC-Molekül binden kann, sowie der ersten Rezeptor-Einheit und der zweiten Rezeptor- Einheit in Lösung ein Peptid-präsentierender Rezeptor hergestellt wird. Der so hergestellte Peptid-präsentierende Rezeptor wird dann an den Nanopartikeln immobilisiert und die dabei erhaltenen Nano- partikeln mit den immobilisierten Peptid-präsentierenden Rezeptor werden dann einer Behandlung zur Entfernung von mindestens dem gebundenen Peptid unterworfen, so dass Nanopartikel mit einer oder mehreren immobilisierten Rezeptor-Einheiten erhalten werden. Er- findungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass der Peptid- präsentierende Rezeptor durch Inkubation der ersten Rezeptor- Einheit, der zweiten Rezeptor-Einheit und des eingesetzten Peptides in einem Puffer, enthaltend 100 mM Tris, 2 mM EDTA, 400 mM L- Arginin, 5 mM reduziertes Glutathion und 0,5 mM oxidiertes Glu- tathion über einen Zeitraum von mehr als 36 Stunden, vorzugsweise 48 Stunden, bei einer Temperatur von weniger als 20°C, vorzugs- weise 10°C, hergestellt wird.

Wird zur Herstellung des Peptid-präsentierenden Rezeptors eine erste Rezeptor-Einheit mit ersten funktionellen Gruppen und eine zweite Rezeptor-Einheit, die keine funktionellen dritten Gruppen ent- hält, verwendet, wird der in Lösung hergestellte Peptid- präsentierende Rezeptor nur durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Grup- pe der Nanopartikel an den Nanopartikeln immobilisiert. Werden hingegen zur Herstellung des Peptid-präsentierenden Rezeptors in Lösung eine erste Rezeptor-Einheit mit ersten funktionellen Gruppen und eine zweite Rezeptor-Einheit mit dritten funktionellen Gruppen eingesetzt, so erfolgt die Immobilisierung des Rezeptor-Ligand-

Komplexes an die Nanopartikel über die Bindung zwischen der ers- ten und zweiten funktionellen Gruppe und die Bindung der dritten und vierten funktionellen Gruppe.

Nach Immobilisierung des Peptid-präsentierenden Rezeptors an den Nanopartikeln werden die so erhaltenen Nanopartikel mit dem im- mobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplex mit einem Stripping-Puffer, pH-Wert 3,0, enthaltend 50 mM Natriumcitrat, über einen Zeitraum von weniger als 20 Sekunden, vorzugsweise 10 Sekunden, behan- delt. Erfindungsgemäß wird dabei im Fälle, dass der Rezeptor- Ligand-Komplex nur durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe an die zweite funktionelle Gruppe immobilisiert ist, bei der Behand- lung der erhaltenen Nanopartikel neben dem gebundenen Peptid auch die zweite Rezeptor-Einheit von den Nanopartikeln entfernt, so dass ein Nanopartikel mit der immobilisierten ersten Rezeptor- Einheit erhalten wird. Im Falle, dass der Peptid-präsentierende Re- zeptor durch Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nanopartikel und Bindung der dritten funktionellen Gruppe der zweiten Rezeptor- Einheit an die vierte funktionelle Gruppe der Nanopartikel an den Nanopartikeln immobilisiert ist, wird bei der Behandlung der erhalt- nen Nanopartikel mit dem Stripping-Puffer nur das gebundene Pep- tid von den Nanopartikeln entfernt. Dabei werden also Nanopartikel mit der immobilisierten ersten und zweiten Rezeptor-Einheit erhalten.

Die so hergestellten Nanopartikel, die entweder die immobilisierte erste Rezeptor-Einheit oder die immobilisierte erste und zweite Re- zeptor-Einheit enthalten, können dann, gegebenenfalls nach einer Aufreinigung, beispielsweise mittels mindestens einer Zentrifugation und mindestens eines Waschvorganges, vom Puffer abgetrennt und erneut in einem geeigneten Puffer suspendiert werden. Die so erhal-

tenen Nanopartikel können zur Durchführung der kompetitiven Bin- dungsreaktionen der hergestellten Population von Peptidfragmenten eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die kompetitive Bindung der hergestellten Peptidfragment-Population an die Nanopartikel, die die erste oder die erste und zweite immobilisierte Rezeptor-Einheit auf- weisen, mittels Inkubation der Peptidfragment-Population mit den Nanopartikeln in einem PBS-Puffer über einen Zeitraum von 2 Stun- den bis 6 Stunden, vorzugsweise 4 Stunden, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 39°C, vorzugsweise 37°C, durchgeführt.

Wird. Falls die Nanopartikel nur die immobilisierte erste Rezeptor- Einheit aufweisen, enthält der zur kompetitiven Bindung verwendete PBS-Puffer auch die zweite Rezeptor-Einheit.

Nach Bindung des oder der Peptid-Fragmente mit Affinität zu einer oder den beiden Rezeptor-Einheiten wird ein immobilisierter Rezep- tor-Ligand-Komplex erhalten, der dann mittels einer Zentrifugation und mindestens eines Waschvorganges vom Puffer und den nicht gebundenen Peptid-Fragmenten der Population abgetrennt und er- neut in einem Puffer suspendiert wird.

Anschließend erfolgt erfindungsgemäß die Analyse des erhaltenen Peptid-präsentierenden Rezeptors und/oder des gebundenen Pep- tid-Fragmentes. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Suspen- sion der Nanopartikel, die den immobilisierten Peptid- präsentierenden Rezeptor mit dem gebundenen Peptid aufweisen, mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-lonis. ations- (MALDI)- Verfahren analysiert werden.

Bei den MALDI-Verfahren handelt es sich um massenspektrometri- sche Verfahren. Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zur Strukturaufklärung von Substanzen, wobei atomare und molekulare Teilchen entsprechend ihrer Masse abgetrennt werden. Sie beruht auf einer Reaktion zwischen Molekülen und Elektronen oder Photo- nen. Durch Beschuss der Probe mit Elektronen entstehen infolge der Abspaltung von Elektronen positive Molekülionen, die anschließend in verschiedene ionische, radikalische und/oder neutrale Fragmente zerfallen. Molekülionen und Fragmente werden in geeigneten Trenn- systemen nach der Größe der Massezahl aufgetrennt. Bei einer Massenspektrometrie werden also die aufgrund chemischer Zerfall- reaktionen infolge eines lonisationsprozesses entstehenden Molekü- lionen beziehungsweise Fragmente zur Strukturaufklärung von Stof- fen herangezogen. Ein erfindungsgemäß bevorzugt eingesetztes MALDI-Verfahren ist das MALDI-TOF-MS-Verfahren (Matrix-unter- <BR> <BR> <BR> <BR> stützte Laser-Desorption/lonisations-Flugzeit-Massenspektrometrie).

Die Hauptvorteile dieses Verfahrens umfassen die äußerst schnelle positive Identifizierung eines zu analysierenden Stoffes, beispiels- weise eines Proteins oder Peptides, durch dessen Masse-zu La- dungs-Verhältnis (m/z) und die äußerst geringe Nachweisgrenze, die im Femtomol-Bereich oder darunter liegt.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die erhaltenen Nanopartikel, beispielsweise in Form einer Suspension, nach Zentri- fugieren und Waschen auf einem MALDI-Probenträger oder MALDI- Target abgeschieden und analysiert werden. Dabei kann eine im Verlauf des MALDI-Verfahrens, insbesondere MALDI-TOF-MS- Verfahrens eingesetzte Matrix vor oder nach dem Abscheiden der Nanopartikel-haltigen Suspension oder gemeinsam damit auf den MALDI-Probenträger aufgetragen werden.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das in dem immobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplex gebun- dene mindestens eine Peptid-Fragment aus dem Rezeptor heraus- gelöst, isoliert und analysiert wird. Beispielsweise können die Nano- partikel, die den immobilisierten Rezeptor mit dem mindestens einen gebundenen Peptid-Fragment aufweisen, zur Freisetzung des Pep- tid-Fragmentes in einem Stripping-Puffer, pH-Wert 3,0, enthaltend 50 mM Natriumcitrat, über einen Zeitraum von weniger als 20 Se- kunden, vorzugsweise 10 Sekunden, behandelt werden. Erfindungs- gemäß besteht auch die Möglichkeit, dass das mindestens eine Pep- tid-Fragment, falls es eine fünfte funktionelle Gruppe aufweist, unter Verwendung von Nanopartikeln isoliert und aufgereinigt wird. In die- sem Fall enthalten diese Nanopartikel eine die fünfte funktionelle Gruppe bindende sechste funktionelle Gruppe, so dass die Möglich- keit gegeben ist, die freigesetzten Peptid-Fragmente spezifisch aus einer wässrigen Lösung oder Suspension zu isolieren. Erfindungs- gemäß ist vorgesehen, dass das mindestens eine isolierte Peptid- fragment anschließend sequenziert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptid-Impfstoffes gegen ein Protein-Antigen, insbesondere gegen das Protein-Antigen exprimierende oder präsentierende Zel- len oder biologische Materialien, wobei die Aminosäuresequenz ei- nes T-Zell-Epitopes des Protein-Antigens in vitro identifiziert wird, ein Peptid mit der identifizierten Aminosäuresequenz hergestellt wird und in bevorzugter Ausführung danach unter Verwendung des her- gestellten Peptides und einer ersten und gegebenenfalls zweiten Rezeptor-Einheit, insbesondere einer ersten und zweiten Kette eines MHC-Moleküs, ein Rezeptor-Ligand-Komplex, insbesondere ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül hergestellt wird, welches als

Impfstoff eingesetzt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst a) die Bereitstellung einer Population von Peptid-Fragmenten des Protein-Antigens, b) die Bereitstellung von Nanopartikeln, die an ihrer Oberfläche mindestens eine erste immobilisierte Kette eines MHC- Moleküls aufweisen, wobei die Kette eine die Bildung eines MHC-Moleküls ermöglichende Konformation aufweist, c) die Durchführung einer kompetitiven Bindung der Peptidfrag- ment-Population an die an den Nanopartikeln immobilisierte erste Kette, optional und vorzugsweise in Gegenwart einer zweiten Kette eines MHC-Moleküls, wobei das Peptidfragment mit Affinität, insbesondere der größten Affinität zu der ersten Kette, insbesondere zu den beiden Ketten des MHC- Moleküls, gegebenenfalls zusammen mit der zweiten Kette, an die erste Kette bindet und ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül erhalten wird, und d) die Isolierung des Peptid-Fragmentes aus dem MHC-Molekül und Bestimmung seiner Aminosäuresequenz zum Erhalt des Peptid-Impfstoffes, der in Form des Peptidfragmentes selbst oder seines MHC-Komplexes eingesetzt werden kann.

Optional können sich daran die folgenden Schritte anschließen 1) gentechnische Herstellung oder chemische Synthese eines Peptids auf der Basis der bestimmten Aminosäu-

resequenz des Peptid-Fragmentes in geeigneten Men- gen, 2) gentechnische Herstellung oder chemische Synthese der ersten und zweiten Kette in geeigneten Mengen, 3) Herstellung von Peptid-präsentierenden MHC- Molekülen in geeigneten Mengen durch gemeinsame Inkubation der ersten Kette, der zweiten Kette und des hergestellten Peptids, und 4) Herstellung eines Peptid-Impfstoffes in Form eines Ly- ophilisats oder einer wässrigen kolloidalen Lösung oder Suspension der Peptid-präsentierenden MHC- Moleküle.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Impfstoff"eine Zusammensetzung zur Erzeugung einer Immunität zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krankheitszuständen ver- standen. Impfstoffe sind daher Arzneimittel, die Antigene enthalten, und die dazu bestimmt sind, bei Mensche oder Tieren zur Erzeugung von spezifischen Abwehr-und Schutzstoffen mittels Impfen ange- wandt zu werden. Impfstoffe dienen zur aktiven Bildung von Antikör- pern.

Erfindungsgemäß ist dabei vorgesehen, dass die Population von Peptid-Fragmenten des Protein-Antigens mittels enzymatischer Pro- tein-Spaltung, gentechnischer Verfahren oder chemischer Synthese- verfahren hergestellt wird. In bevorzugter Ausführungsform repräsen- tieren die in der Peptid-Population enthaltenen Peptide die gesamte Aminosäuresequenz des Protein-Antigens vollständig. In einer alter-

nativen Ausführungsform repräsentieren die in der. Peptid-Population enthaltenen Peptidfragmente die Aminosäuresequenz des Protein- Antigens nur teilweise, wobei die Peptid-Fragmente der Population vorzugsweise solche Aminosäuresequenzen aufweisen, die mittels eines Computer-Algorithmus bestimmte potentielle T-Zell-Epitope darstellen. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Peptid- Fragmente, wenn das herzustellende MHC-Molekül ein MHC- Molekül Typ I ist, eine Länge von 8 bis 10 Aminosäuren aufweisen.

Wenn das herzustellende MHC-Molekül ein MHC-Molekül Typ II ist, weisen die Peptid-Fragmente vorzugsweise eine Länge von 15 bis 24 Aminosäuren auf.

Wenn das herzustellende MHC-Molekül ein MHC-Molekül Typ I ist, handelt es sich bei der ersten Kette um eine schwere Kette von etwa 45 kDa und bei der zweiten Kette um eine leichte Kette von etwa 12 kDa. Insbesondere handelt es sich in diesem Fall bei der ersten Ket- te um ein HLA-A-, HLA-B-oder HLA-C-Monomer und bei der zweiten Kette um ß-2-Mikroglobulin.

Wenn das herzustellende MHC-Molekül ein MHC-Molekül Typ II ist, handelt es sich erfindungsgemäß bei der ersten Kette um eine a- Kette von etwa 34 kDa und bei der zweiten Kette um eine ß-Kette von etwa 30 kDa. Vorzugsweise handelt es sich in diesem Fall bei der ersten Kette und der zweiten Kette um HLA-DR-, HLA-DQ-oder HLA-DP-Monomere. Sowohl die Ketten der MHC-Typ I-als auch der MHC-Typ II-Klasse können in mutierter, abgewandelter, modifizier- ter, insbesondere verkürzter Form eingesetzt werden.

Vorzugsweise enthält die erste Kette eine erste funktionelle Gruppe, so dass die erste Kette durch Bindung der ersten funktionellen

Gruppe an einer auf der Oberfläche der Nanopartikel vorhandene zweite funktionelle Gruppe an der Oberfläche der Nanopartikel im- mobilisiert wird. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die funktio- nelle Gruppe ein natürlicher Bestandteil der ersten Kette ist oder mit- tels gentechnischer Verfahren, biochemischer, enzymatischer und/oder chemischer Derivatisierung oder chemischer Synthesever- fahren in die erste Kette eingeführt ist. Bei der ersten funktionellen Gruppe handelt es sich vorzugsweise um eine Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen Thiol-Gruppen, Biotin-Gruppen, His-Tag, Flag-Tag, Strep-Tag I- Gruppen, Strep-Tag 11-Gruppen, Histidin-Tag-Gruppen und Flag- Tag-Gruppen. Die an der Oberfläche der Nanopartikel vorhandene zweite funktionelle Gruppe ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Malein- mido-Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravidin- Gruppen und Metallgelatkomplexen. Dabei kann die zweite funktio- nelle Gruppe mittels Pfropfsilanisierung, Silanisierung, chemischer Derivatisierung oder ähnlicher geeigneter Verfahren auf die Oberflä- che der Nanopartikel aufgebracht sein. Bei den einzusetzenden Na- nopartikeln handelt es sich vorzugsweise um solche, die einen Kern aus einem chemisch inerten Material, vorzugsweise Silika, und einen Durchmesser von 30 bis 400 nm, vorzugsweise 50 nm bis 150 nm, aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die an ihrer Oberflä- che eine erste immobilisierte Kette aufweisende Nanopartikel durch folgende Schritte erhalten : a) Inkubation der die erste funktionelle Gruppe enthaltende erste Kette, der zweiten Kette und eines Peptids, von dem die Aminosäu-

resequenz und die Fähigkeit zur Bildung eines MHC-Moleküls unter geeigneten Bedingungen bekannt ist, b) Inkubation des gebildeten MHC-Moleküls mit Nanopartikeln, deren Oberfläche eine die erste funktionelle Gruppe bindende zweite funk- tionelle Gruppe aufweist, unter geeigneten Bedingungen zur Immobi- lisierung des MHC-Moleküls an den Nanopartikeln, c) Behandlung des Nanopartikels mit den immobilisierten MHC- Molekülen mit einem geeigneten Puffer zur Entfernung der zweiten Kette und des Peptids bekannter Aminosäuresequenz aus dem MHC-Molekül, und d) Aufreinigung der die erste immobilisierte Kette aufweisenden Na- nopartikel.

Erfindungsgemäß ist bevorzugt vorgesehen, dass die kompetitive Bindung der Peptidfragment-Population an die die erste immobilisier- te Kette aufweisende Nanopartikels durch Inkubation der Peptid- Fragment-Population mit den Nanopartikeln in einem geeigneten Puffer unter geeigneten Bedingungen erfolgt. Nach Bindung des mindestens einen Affinität aufweisenden Peptidfragmentes der Po- pulation und gegebenenfalls der zweiten Kette unter Bildung eines immobilisierten MHC-Moleküls werden die Nanopartikel mit den im- mobilisierten MHC-Molekül mittels Zentrifugation und Waschen vom Puffer und den nicht gebundenen Peptid-Fragmenten abgetrennt.

Anschließend werden die das immobilisierte MHC-Molekül aufwei- sende Nanopartikel mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise ei- nem Stripping-Puffer, zur Freisetzung des gebundenen Peptid- Fragmentes behandelt. Das freigesetzte Peptid-Fragment wird dann isoliert und seine Aminosäuresequenz ermittelt.

Auf der Basis der ermittelten Aminosäuresequenz kann das gebun- dene Peptid-Fragment anschließend in großen Mengen, beispiels- weise unter Verwendung gentechnischer Verfahren hergestellt wer- den. Beispielsweise kann auf der Basis der ermittelten Aminosäure- sequenz des freigesetzten Peptid-Fragmentes eine die ermittelte Aminosäuresequenz codierende Nucleinsäure erzeugt und in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert werden. Dieser Vektor wird dann in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der Aminosäurese- quenz überführt. Dadurch kann in der Wirtszelle ein Peptid in größe- ren Mengen exprimiert und daraus isoliert werden.

Auf der Basis der ermittelten Aminosäuresequenz des freigesetzten Peptid-Fragmentes lässt sich auch eine größere Peptid-Menge auf synthetischem Wege herstellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Qualität- kontrolle von Rezeptor-Ligand-Komplexen und/oder deren Bestand- teilen, umfassend die Herstellung oder Bereitstellung eines Rezep- tor-Ligand-Komplexes in Lösung aus mindestens einer Rezeptor- Einheit, vorzugsweise zwei Rezeptor-Einheiten, wobei mindestens eine Rezeptor-Einheit eine erste funktionelle Gruppe aufweist, und eines Liganden, die Immobilisierung des Rezeptor-Ligand- Komplexes an Nanopartikeln, die an ihrer Oberfläche mindestens eine die erste funktionelle Gruppe bindende zweite funktionelle Gruppe aufweisen, und Analyse der den immobilisierten Rezeptor- Ligand-Komplex aufweisenden Nanopartikel unter Verwendung ei- nes MALDI-Verfahrens.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Rezeptor um ein MHC- Molekül, bei dem der Liganden um ein an den Rezeptor bindendes Peptid bekannter Sequenz und definierter Länge. und bei dem Re-

zeptor-Ligand-Komplex um ein Peptid-präsentierendes MHC- Molekül.

In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Rezeptor um ein MHC-Molekül der Klasse I, wobei die Rezeptor-Einheiten eine schwere Kette von etwa 45 kDa und die Rezeptor-Einheit eine leich- te Kette von etwa 12 kDa sind. Dabei ist die schwere Kette ein HLA- A-, HLA-B-oder HLA-C-Monomer und die leichte Kette ß-2- Microglobulin.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah- rens ist der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse II, wobei eine Re- zeptor-Einheit eine a-Kette von etwa 34 kDa und eine Rezeptor- Einheit eine ß-Kette von etwa 30 kDa ist. Dabei sind die a-Kette und die ß-Kette HLA-DR-, HLA-DQ-oder HLA-DP-Monomere.

Zur Analyse wird erfindungsgemäß ein MALDI-Verfahren, insbeson- dere ein MALDI-TOF-Verfahren eingesetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Her- stellung von Nanopartikeln, die an ihrer Oberfläche mindestens eine immobilisierte Rezeptor-Einheit oder einen immobilisierten Rezeptor aufweisen, umfassend a) Herstellung eines Rezeptor-Ligand-Komplexes durch Inku- bation einer ersten Rezeptor-Einheit mit einer ersten funk- tionellen Gruppe, gegebenenfalls in bevorzugter Ausfüh- rungsform einer zweiten Rezeptor-Einheit, die mit der ers- ten Rezeptor-Einheit einen Rezeptor bilden kann, und ei- nes Liganden in Lösung, b) Immobilisierung des gebildeten Rezeptor-Ligand- Komplexes an Nanopartikeln, die mindestens eine die ers- te funktionelle Gruppe bindende zweite funktionelle Grup- pen an der Oberfläche aufweisen, und

c) Behandlung der den immobilisierten Rezeptor-Ligand- Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren Puffer zur Freisetzung mindestens des gebundenen Ligan- den, wobei Nanopartikel mit immobilisierten Rezeptor- Einheiten erhalten werden.

In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Immobilisierung des Rezeptor-Ligand-Komplexes an der Nanopartikel-Oberfläche auschließlich über die Bindung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nano- partikel. In diesem Fall wird nach Behandlung der den immobilisier- ten Rezeptor-Ligand-Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren Puffer neben dem Liganden auch die zweite Rezeptor-Einheit freigesetzt und es werden Nanopartikel mit der immobilisierten ers- ten Rezeptor-Einheit erhalten.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah- rens weist die zweite Rezeptor-Einheit eine dritte funktionelle Gruppe auf, während die Nanopartikel an ihrer Oberfläche eine die dritte funktionelle Gruppe der zweiten Rezeptor-Einheit bindende vierte funktionelle Gruppe aufweisen. Die Immobilisierung des Rezeptor- Ligand-Komplexes an den Nanopartikeln erfolgt also über die Bin- dung der ersten funktionellen Gruppe der ersten Rezeptor-Einheit an die zweite funktionelle Gruppe der Nanopartikel und die Bindung der dritten funktionellen Gruppe der zweiten Rezeptor-Einheit an die vier- te funktionelle Gruppe der Nanopartikel. In diesem Fall wird nach Behandlung der den immobilisierten Rezeptor-Ligand-Komplex auf- weisenden Nanopartikel mit einem sauren Puffer ausschließlich der Ligand freigesetzt und es werden Nanopartikel mit der immobilisier- ten ersten und zweiten Rezeptor-Einheit erhalten. Vorzugsweise lie- gen die erste und zweite Rezeptor-Einheit gerichtet immobilisiert vor und bilden einen Rezeptor, der einen Liganden binden kann.

In bevorzugter Ausführungsform ist der Rezeptor ein MHC-Molekül, der Ligand ein an den Rezeptor bindendes Peptid bekannter Se- quenz und definierter Länge und der Rezeptor-Ligand-Komplex ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül.

Insbesondere ist der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse I, der als erste Einheit eine schwere Kette von etwa 45 kDa und als zweite Rezeptor-Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa aufweist oder als erste Rezeptor-Einheit eine leichte Kette von etwa 12 kDa und als zweite Rezeptor-Einheit eine schwere Kette von etwa 45 kDa. Bei der schweren Kette handelt es sich um ein HLA-A-, HLA-B-oder HLA-C-Monomer und bei der leichten Kette um b-2-Microglobulin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Rezeptor ein MHC-Molekül der Klasse II, der als erste Rezeptor- Einheit eine a-Kette von etwa 34 kDa und als-zweite Rezeptor- Einheit eine ß-Kette von etwa 30 kDa aufweist oder als erste Rezep- tor-Einheit eine ß-Kette von etwa 30 kDa und als zweite Rezeptor- Einheit eine a-Kette von etwa 34 kDa. Bei der a-Kette und der ß- Kette handelt es sich um HLA-DR-, HLA-DQ-oder HLA-DP- Monomere.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass sich die erste funktionelle Gruppe und die dritte funktionelle Gruppe voneinander unterschei- den und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Carboxy- Gruppen, Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Biotin-Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag l-Gruppen, Strep-Tag II-Gruppen, Histidin- Tag-Gruppen und FLAG-Tag-Gruppen.

Erfindungsgemäß ist ebenfalls vorgesehen, dass sich die zweite funktionelle Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche, die die erste funktionelle Gruppe bindet, und die vierte funktionelle Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche, die die dritte funktionelle Gruppe bindet, voneinander unterscheiden und ausgewählt sind aus der Gruppe

bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Maleinimido- Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravidin- Gruppen und Metallchelatkomplex.

Vorzugsweise werden die den immobilisierten Rezeptor-Peptid- Komplex aufweisenden Nanopartikel zur Entfernung des gebunde- nen Peptids mit einem Stripping-Puffer, pH-Wert 3,0, enthaltend 50 mM Natriumcitrat, über einen Zeitraum von weniger als 20 s, vor- zugsweise 10 s, behandelt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstel- lung von Nanopartikeln mit immobilisierten Peptid-präsentierenden MHC-Molekülen, wobei Nanopartikel mit mindestens einer ersten immobilisierten Kette eines MHC-Moleküls, die nach einem erfin- dungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln mit mindestens einer immobilisierten Rezeptor-Einheit oder mit einem immobilisierten Rezeptor hergestellt wurden, in Gegenwart einer zweiten Kette, die mit der ersten Kette ein MHC-Molekül bilden kann, mit einem Peptid, das an das MHC-Molekül binden kann, inkubiert und ein an den Nanopartikein immobilisierter Peptid-präsentierendes MHC-Molekül erhalten wird.

Bei dem MHC-Molekül handelt es sich vorzugsweise um ein Molekül der Klasse I, wobei das Peptid eine Länge von etwa 8 bis etwa 10 Aminosäuren aufweist. Bei dem MHC-Molekül kann es sich auch um ein Molekül der Klasse II handeln, wobei das Peptid eine Länge von etwa 15 bis etwa 24 Aminosäuren aufweist.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Anreiche- rung und/oder Isolierung spezifischer CD4+-T-Lymphocyten oder CD8+-T-Lymphocyten aus peripheren mononucleären Blutzellen (PBMCs), umfassend

a) Herstellung von Nanopartikeln mit immobilisierten Peptid- präsentierenden MHC-Molekülen, wobei das Peptid ein T- Zell-Epitop ist b) Isolierung peripherer mononucleärer Blutzellen aus einem geeigneten Ausgangsmaterial, c) Inkubation der isolierten mononucleärer Blutzellen mit den die immobilisierten Peptid-präsentierenden MHC-Molekülen aufweisenden Nanopartikeln, wobei T-Lymphozyten an das T-Zell-Epitop der immobilisierten Peptid-präsentierenden MHC-Moleküle binden, d) Abtrennung der Nanopartikel mit den an die immobilisierten Peptid-präsentierenden MHC-Molekülen gebundenen T- Lymphozyten von den nicht-gebundenen peripheren mono- nucleären Zellen.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die gebundenen T- Lymphozyten von den Nanopartikeln anschließend freigesetzt und in vitro clonal vermehrt werden. Die freigesetzten und/oder clonal vermehrten T-Lymphozyten können dann beispielsweise in einen Organismus eingeführt werden.

In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist das Peptid- präsentierende MHC-Molekül ein Molekül--der Klasse 1 und die ge- bundenen T-Lymphozyten sind CD8+-T-Lymphocyten. In einer weite- ren bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid-präsentierende MHC-Molekül ein Molekül der Klasse II, wobei die gebundenen T- Lymphozyten CD4+-T-Lymphocyten sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Primen und/oder Restimulieren einer CD4+-T-und/oder CD8+-T-Lympho- cyten-Reaktion in vitro, umfassend

a) Identifizierung eines T-Zell-Epitops und Bestimmung von dessen Aminosäuresequenz, b) Herstellung einer Nucleinsäure, die ein Peptid mit der Ami- nosäuresequenz des T-Zell-Epitops codiert, c) Einführung der bei b) hergestellten Nucleinsäure in einen geeigneten Vektor, d) Einführung des bei c) erhaltenen Vektors in dendritische Zel- len, die gegebenenfalls aus kultivierten peripheren mononuc- leären Blutzellen isoliert wurden, e) Vermehrung der bei d) resultierenden, den Vektor aufwei- senden dendritischen Zellen in vitro, und Stimulation autologer CD4+ und/oder CD8+-Zellen in vitro un- ter Verwendung der bei d) oder e) erhaltenen dendritischen Zellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Nanopartikel, enthaltend an der Oberfläche mindestens eine Rezeptor-Einheit, insbesondere eine immobilisierte Kette eines MHC-Moleküls. Dabei kann die im- mobilisierte Kette durch Bindung eines Peptids von 8 bis 24 Amino- säuren und einer zweiten Kette eines MHC-Moleküls ein Peptid- präsentierendes MHC-Molekül bilden. Die MHC-Molekül-Kette ist durch Bindung einer in ihr enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funk- tionellen Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisiert. Bei den erfindungsgemäßen Nanopartikeln entweder die schwere Kette oder die leichte Kette eines MHC-Moleküls der Klasse 1 oder entwe- der die a-Kette oder die ß-Kette eines MHC-Moleküls der Klasse II in immobilisierter Form.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nanopartikel mit einem im- mobilisierten MHC-Molekül, wobei das MHC-Molekül eine erste und zweite Kette umfasst und das MHC-Molekül durch Bindung einer in der ersten Kette enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe oder durch Bindung der in der ersten Kette enthaltenen ers- ten funktionellen Gruppe mit der an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe und Bindung einer in der zweiten Kette enthaltenen dritten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen vierten funktionellen Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisiert ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Nanopartikel mit einem an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisierten Peptid- präsentierenden MHC-Molekül, wobei das Peptid-präsentierende MHC-Molekül eine erste Kette, eine zweite Kette und ein Peptid von 8 bis 24 Aminosäuren umfasst und das MHC-Molekül durch Bindung einer in der ersten Kette enthaltenen ersten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen zweiten funktio- nellen Gruppe oder durch Bindung der in der ersten Kette enthalte- nen ersten funktionellen Gruppe mit der an der Nanopartikel- Oberfläche vorhandenen zweiten funktionellen Gruppe und Bindung einer in der zweiten Kette enthaltenen dritten funktionellen Gruppe mit einer an der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen vierten funk- tionellen Gruppe an der Nanopartikel-Oberfläche immobilisiert ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Peptid-Impfstoff um- fassend mindestens ein Peptid-präsentierendes MHC-Molekül oder das erfindungsgemäß identifizierte Peptidfragment selbst, wobei der Peptid-Impfstoff gemäß erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist.

In einer Ausführungsform kann der Peptid-Impfstoff als Lyophylisat vorliegen. In einer anderen Ausführungsform liegt der Impfstoff als wässrige kolloidale Lösung oder Suspension vor. Der erfindungsge- mäße Peptid-Impfstoff kann zusätzlich mindestens ein Adjuvans enthalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen Kit zur Identifizie- rung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein- Antigens in vitro, umfassend einen Behälter mit eienr Suspension von Nanopartikeln mit einem immobilisierten MHC-Molekül. In einer weiteren Ausführungsform kann der Kit einen Behälter mit einer Suspension von Nanopartikeln mit daran immobiliserten ersten Ket- ten eines MHC-Moleküls sowie einen Behälter mit einem Lyophylisat einer zweiten Kette umfassen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nanopartikels zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen eines Protein-Antigens in vitro.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines erfin- dungsgemäßen Nanopartikels zur Herstellung eines Peptid- Impfstoffes.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Na- nopartikels zur Anreicherung und/oder Isolierung spezifischer CD4+- T-Lymphozyten oder CD8+-T-Lymphozyten in vitro : Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines erfin- dungsgemäßen Nanopartikels zum Primen und/oder Restimulieren einer CD4+-T-oder/und CD8+-T-Lymphozyten-Reaktion in vitro. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines erfin-

dungsgemäßen Peptid-Impfstoffes zur aktiven Immunisierung eines tierischen oder menschlichen Organismus gegen ein Protein- Antigen.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren 1 bis 3 und Beispiele näher erläutert.

Figur 1 zeigt in schematischer Form eine bevorzugte Ausführungs- form des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von T-Zell-Epitopen, wobei ein in Lösung hergestellter, das Peptid präsentierender HLA-A2-Komplex an Na- nopartikeln immobilisiert wird. Anschließend erfolgt eine Behandlung der den Komplex aufweisenden Nanopartikel mit einem sauren "Stripping"-Puffer, wobei das EBV-EBNA-6-Peptid (Position 284-293, LLDFVRFMGV) und ß2-Mikroglobulin (ß2-m) entfernt werden. Die so hergestellten Nanopartikel mit der immobilisierten HLA-Kette werden dann zur Durchführung einer kompetitiven Bindungsreaktion unter Verwendung einer Peptid-Population in Gegenwart von ß2-m einge- setzt, wobei das oder die Peptide mit Affinität an HLA und ß2-m bin- det/binden, wobei ein dieses Peptid präsentierender HLA-Komplex an der Nanopartikel-Oberfläche gebildet wird. Nach Entfernung der nicht gebundenen Peptide und von überschüssigem ß2-m werden die Nanopartikel, die den immobilisierten Peptid-präsentierenden Kom- plex aufweisen, einer Analyse mittels MALDI-Massenspektrometrie unterworfen.

Figur 2 zeigt mittels MALDI-Massenspektrometrie erhaltene Mas- senspektrogramme von Nanopartikeln mit immobilisierten Peptid- präsentierenden HLA-Komplexen. Figur 2.1 betrifft das Peptidge- misch aus äquimolaren Mengen der in Beispiel 4 genannten 5 Pepti-

de und Figur 2.2 die zwei Peptide, die nach Selektion als bindend erkannt wurden.

Figur 3 zeigt das MALDI-Spektrum aller SAV-Nanopartikel- immobilisierter molekularer Komponenten des HLA-A2-EBNA-6- Komplexes. Das Insert zeigt das MALDI-Spektrum des EBNA-6- Peptides [M+H] + mit der Sequenz LLDFVRFMGV (theoretische mo- noisotopische Masse [M+H] + 1196. 6502 u). Der Peak bei 11727 kennzeichnet ß2-m, die Peaks bei etwa 12900 kennzeichnen die SAV-Nanopartikel in monomerer Form und der Peak bei 34383 kennzeichnet die biotinylierte alpha-Kette.

Beispiel 1 Peptidsynthese Peptide wurden unter Verwendung des Fmoc-Festphasen- Verfahrens auf einer kontinuierlichen Mi) ! Gen 9050 Flow-Synthese- Vorrichtung (Millipore, Bedford, USA) synthetisiert. Nach RP-HPLC- Aufreinigung wurden die Peptide lyophilisiert und in PBS-Puffer in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst.

Beispiel 2 Herstellung von löslichen biotinylierten HLA-A2-Monomeren Lösliche HLA-A*0201-Peptid-Tetramere wurden synthetisiert, wie von Altman et al., Science, 274 (1996), 94-96, beschrieben. Dabei wurden rekombinante schwere HLA-A*0201-Ketten (Positionen 1- 276) in löslicher Form und ß-2-Mikroglobulin (ß2-m) separat in Esche- richia coli-Zellen, die mit entsprechenden Expressionplasmiden

transformiert worden waren, exprimiert. Das 3'-Ende der extrazellulä- ren Domänen der schweren HLA-A*0201-Kette wurde mit einer Bir A-Biotinylierungssequenz modifiziert. Die Escherichia coli-Zellen, die mit den entsprechenden die HLA-A*0201-Kette beziehungsweise ß2- m codierenden Expressionsplasmiden transformiert worden waren, wurden bis zur mid-log-Wachstumsphase kultiviert. Danach erfolgte eine Induktion mit 0, 5 Isopropyl-ß-Galactosidase. Nach weiterer Kul- tivierung und Expression der rekombinanten Proteine wurden die Escherichia coli-Zellen geerntet und gereinigt. Nach Zellaufschluss wurden die in den Zellen enthaltenen Einschlusskörperchen isoliert, aufgereinigt und in 8 M Harnstoff, pH 8,0, solubilisiert. Die schwere HLA-A*0201-Kette und ß2-m wurden in 100 mM Tris, 2 mM EDTA, 400 mM L-Arginin, 5 mM reduziertem Glutathion und 0,5 mM oxidier- tem Glutathion verdünnt und mit 10 uM des Peptides LLDFVRFMGV (EBV EBNA-6, Positionen 284-293) versetzt. Anschließend erfolgte eine 48-stündige Inkubation bei 10°C unter Rühren. Die gefalteten 48 kDa-Komplexe (a-Kette : etwa 35 kDa, ß2-m : etwa 12 kDa, Peptid : etwa 1 kDa) wurden mittels Ultrafiltrations-Verfahren unter Verwen- dung einer Membran mit einem Rückhaltevermögen von 10 kDa (Mil- lipore, Bedford, USA) aufkonzentriert und mittels HPSEC-Verfahren unter Verwendung einer Superdex G75 HiLoad 26/60-Säule (Amers- ham Pharmacia Biotech. Upsala, Schweden) und 150 mM NaCI, 20 mM Tris-HCI, pH 7,8, als Laufpuffer aufgereinigt. Nach Gelfiltration wurden die aufgereinigten Monomere mit einer Biotinligase (BirA ; Avidity, Denver, USA) biotinyliert und mittels HPSEC erneut aufge- reinigt. Der Komplex wurde anschließend mittels Ultrafiltration auf eine Konzentration von 1 ug/ul eingestellt.

Beispiel 3 Herstellung und Charakterisierung von Streptavidin- modifizierten Nanopartikeln (SAV-Nanoperlen) Silika-Partikel wurden, wie von Stoeber et al., J. Coll. inter. Sci., 26 (1968), 62-62, beschrieben, hergestellt. Dabei wurden kugelförmige Silika-Partikel mit einem mittleren hydrodynamischen Partikel- Durchmesser von 100 nm erhalten, wie mittels dynamischen Lichtstreuungs-Messungen mit einer Zetasiser 3000 HSA- Vorrichtung (Malvern Instruments, Herrenberg, Deutschland) be- stimmt. 500 lug der Carboxy-modifizierten Partikel wurden mit 15 ug Streptavidin (Roche, Tutzing, Deutschland) gemischt. Das immobili- sierte Streptavidin wurde durch Quenchen der Fluoreszenz von Bio- tin-4-fluorescein quantifiziert. Es zeigte sich, dass die gesamten 15 pg Streptavidin an den Nanopartikeln immobilisiert waren. Etwa 57 % der theoretischen Biotin-Bindungsstellen waren an der Partikel- Oberfläche frei zugänglich. Da dsilica = 100 nM, Silica = 4 g/mi und MStreptavidin = 52 kDa betragen, waren an jedem Partikel etwa 730 Streptavidin-Tetramere gebunden, so dass an der Oberfläche etwa 1600 Biotin-Bindungsstellen frei zugänglich waren. Die Streptavidin- modifizierten Partikel wurden auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml in PBS eingestellt.

Beispiel 4 HLA-A2-Peptid-Selektionstest Alle Wasch-Schritte der Nanopartikel wurden mittels 10-minütiger Zentrifugation bei 15000 x g bei 20°C in einer Temperatur- kontrollierten Zentrifuge in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen und mittels Re-

suspension der Perlen unter Verwendung einer Mikropipette durch- geführt. 55 ug SAV-Nanopartikel und 3, 5 ug des löslichen HLA-A2- Komplexes, der das Peptid LLDFVRFMGV (EBV EBNA-6, Positio- nen 284-293) enthielt, in 20 ut PBS suspendiert. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur in einem horizontalen Schüttler in- kubiert, um eine Sedimentation zu verhindern. Nach einer 10- minütigen Zentrifugation bei 20°C wurde der Überstand verworfen und die Nanopartikel wurden mit 50 ul Wasser gewaschen. Zur Frei- setzung von ß2 m-Molekülen und des im Komplex enthaltenen Pepti- des LLDFVRFMGV wurden die Perlen in 150 ul"Stripping"-Puffer (50 mM Natriumcitrat, pH 3,0) 90 Sekunden inkubiert und nach Zentrifugation mit 150 ul Wasser gewaschen. Die Perlen wurden dann mit 30 pI PBS, enthaltend 1,2 ug ßz m-Moleküle (Sigma, Mün- chen, Deutschland) und ein Peptid-Gemisch, resuspendiert. Das Gemisch umfasste insgesamt 5 Peptide in einer Menge von jeweils 0, 072 Bug. Die 5 Peptide wiesen die Sequenzen ILMEHIHKL, DQKDHAVF, ALSDHHIYL, VITLVYEK und SNEEPPPPY auf. Nach einer vierstündigen Inkubation bei 37°C wurden die Nanopartikel mit- tels Zentrifugation pelletiert und nach Entfernung des Überstandes mit 50 ul PBS-Puffer und anschließend 50 ul Wasser gewaschen.

Nach der letzten Zentrifugation wurden die Nanopartikel in 0,1 % Wasser/TFA (Vol. Nol.) resuspendiert und auf ein MALDi-Target transferiert. Die Analyse wurde unter Verwendung eines Voyagers DE-STR-Massenspektrometers (Applied Biosystems Foster City, USA) in positive Ion Reflectron-Betriebsweise durchgeführt. Lösun- gen, die Proteine und Peptide enthielten, wurden auf dem Target mit einem gleichen Matrix-Volumen unter Verwendung einer 1 : 20- Verdünnung einer gesättigten a-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure oder Sinapinsäure in 30 % Acetonitril/0, 3 % TFA (Vol. Nol.) gemischt. Alle

MALDI-Spektren wurden unter Verwendung eines Standard- Peptidgemisches extern kalibriert.

Erfindungsgemäß wurden folgende Ergebnisse erhalten : Alle Bestandteile des biotinolierten HLA-A2-Komplexes lassen sich unter Verwendung des MALDI-TOF-Verfahren nachweisen und quantitativ bestimmen.

Vollständige Komplexe, die auf den SAV-Partikeln (SAV- Nanoperlen) über Biotin immobilisiert waren, konnten mittels MALDI- Massenspektrometrie visualisiert werden, wobei die entsprechenden Masse-Signale für die biotinylierte HLA-A2-a-Kette 34379 Da, für ß2- m-Moleküle 11727 Da, das Streptavidin-Monomer 12907 Da und für das gebundene Peptid LLDFVRFMGV 1196,63 Da betrugen (Figur 3). Unter Verwendung des MALDI-TOF-Verfahrens konnten daher einerseits sowohl die korrekten Eigenschaften des HLA-A2- Komplexes als auch die Wirksamkeit des Verfahrens zur Immobili- sierung des biotinylierten Komplexes an die SAV-lslanopartike kontrolliert werden.

HLA-A2-komplexierte SAV-Nanopartikel binden bei kompetitiver Bin- dung unter Verwendung eines Peptidgemisch nur die für HLA-A2 vorhergesagten Peptide.

Figur 2 zeigt die MALDI-Spektren eines Peptidgemisches umfassend zwei HLA-A2-Peptide, die binden, und drei Peptide, die nicht binden, wobei jedes Peptid etwa in einer Menge von 70 pmol vorlag Die vor- hergesagte Bindung der Peptide wurde mit dem SYFPEITHI- Programm bestimmt, wobei bei einer sehr starken Bindung eine Punktzahl von 32 für das Peptid ILMEHIHKL, bei einer starken Bin-

dung eine Punktzahl von 23 für das Peptid ALSDHHIYL und für die drei nicht bindenden Proteine eine Punktzahl von 0 bestimmt wurde.

Die Unterschiede der Signalintensitäten jedes Peptides in dem ver- wendeten Gemisch sind auf unterschiedliche lonisierungsfähigkeiten zurückzuführen. Die Identität der beobachteten Peaks wurde mittels MALDI-PSD-Sequenzierung bestätigt. Nach Selektion der Peptide mit HLA-Rezeptoren verblieben nach Behandlung, das heißt Wa- schen mit dem PBS-Puffer, nur die Signale für die bindenden Pepti- de. Das im Falle der nicht-bindenden Proteine kein Signal nachweis- bar war, zeigt, dass keine unspezifischen Wechselwirkungen auftre- ten. Die Spektren zeigen die monoisotopische Masse für jedes Pep- tid in der protonierten Form ([M+H] +) als auch das Monoisotop in Natrium-Form ( [M+Na] ).