Der Begriff Parasiten beinhaltet einzellige Parasiten und mehrzellige Parasiten einschließlich Helminthen und Anthro- poden. Diese verursachen Infektionserkrankungen bei Mensch und Tier. Im Sinne dieser Erfindung ist die streng wissen- schaftliche Definition von Parasiten anzuwenden, d. h. unter einzelligen Parasiten sind Protozoen zu verstehen.

Es existiert bereits eine Vielzahl von Mitteln gegen para- sitäre Erkrankungen. Die vorhandenen Mittel werden durch die sich rasch entwickelnden Resistenzen gegen diese Mittel bereits unbrauchbar für die Therapie von Mensch und Tier.

So sind bereits viele Regionen von Malariaparasiten befal- len, die gegen Standard-Medikamente wie Chloroquin resi- stent sind. Auch sind Berichte über Resistenz-Entwicklung gegen Standard-Mittel (Praziquantel) zur Behandlung der Bilharziose bekannt. Diese Resistenzentwicklungen und ande- re Faktoren haben dazu geführt, daß Malaria und Bilharziose bereits zu den häufigsten Erkrankungen in den Tropen ge- zählt werden. Geschätzte 300-500 Millionen Menschen sind an Malaria erkrankt. 2-2,5 Millionen Menschen sterben im Jahr an Malaria. Weiter sind neue Medikamente wie Mefloquin sehr teuer in der Herstellung und sehr nebenwirkungsreich. Es besteht daher ein großer Bedarf an Arzneimitteln zur Thera- pie von Mensch und Tier.

Es gab in der Verganaenheit viele Ansätze zur Entwicklung von Chemotherapeutika gegen Parasiten, insbesondere gegen Krankheitserreger der Malaria und der Bilharziose. Einer dieser Ansätze befaßl sich mit der Inhibition der sogenann- ten IsoprenoidbiosynLhese. Isoprenoide sind Moleküle, die aus einzelnen Isopreneinheiten (Isopentenyldiphosphat) ge- bildet werden, und wichtige Funktionen in der Zelle über- nehmen. Hierzu gehören Sterole, Ubichinone und andere Mole- küle, die für den Haushalt der Parasiten wichtig sind. Die Vorgehensweise basierte hierbei auf einem Modell, das in Pilzen und in Säugerzellen etabliert wurde. In Pilzen und in Säugerzellen entsteht die Untereinheit Isopentenyl- diphosphat auf der Basis der Kondensation von drei Molekü- len Acetyl-CoA zu HMG-CoA. HMG-CoA wird dann von der HMG- CoA-Reduktase zu Mevalonat umgewandelt, welches dann mit Mevalonat-Phosphat als Zwischenstufe zu Isopentenyldiphos- phat umgewandelt wird (siehe Figur 7). Inhibitoren der HMG- CoA-Reduktase wie zum Beispiel Lovastatin, Simvastatin und Pravastatin wurden zur Inhibition des Wachstums der Parasi- ten verwendet. Bei Malaria gelang es zwar, unter Anwendung sehr hoher Dosen Lovastatin und Simvastatin eine in vitro Inhibition zu erreichen, jedoch mißlang die Inhibition in vivo. Die Behandlung Schistosoma-infizierter Mäuse mit Lo- vastatin führte zu einer Inhibition der Eiablage dieser Würmer, jedoch mußten sehr hohe Konzentrationen an Lovasta- tin aufgewendet werden, um einen Teil der Würmer in vivo zu töten.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß Parasiten, insbe- sondere Plasmodien und Trypanosomen (Verursacher der Mala- ria und der Schlafkrankheit) zumindest einen weiteren Stoffwechselweg zur Synthese von Isoprenoiden besitzen.

Dieser Stoffwechselweg beruht auf einer Kondensation von Glycerinaldehyd-3-Phosphat und Pyruvat zu 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat (DOXP). DOXP wird dann umgewandelt zu 2-C-Methyl-D-erythrose-4-Phosphat, das dann mit 2-C-Methyl- erythrithol-4-Phosphat als Zwischenstufe zu Isopentenyl- diphosphat umgewandelt wird. An diesem Stoffwechselweg sind unter anderem die Enzyme DOXP-Synthase und DOXP- Reduktoisomerase beteiligt (Siehe Figur 7). Dieser Stoff- wechselweg war bisher nur in Pflanzen, in Algen und in ei- nigen Bakterien beschrieben worden (Sprenger et al. PNAS, 94 (1997) 12857-62 und Kuzuyama et al. Tetrahedron Letters 39 (1998) 4509-12).

Die Inhibition des oben beschriebenen DOXP-Stoffwechsel- wegs, insbesondere der Enzyme DOXP-Synthase und DOXP- Reduktoisomerase durch die dem Fachmann bekannten Techniken eignet sich zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen, verursacht durch ein-und mehrzellige Parasiten bei Mensch und Tier. Da dieser Stoffwechselweg nicht im Menschen vor- handen ist, eignet er sich hervorragend als Ziel für eine gezielte Chemotherapie von Parasiten. Insbesondere eignen sich die Enzyme Desoxyxylulose-5-Phosphat-Synthase und De- soxyxylulose-5-Phosphat-Reduktoisomerase als Ziel für eine Chemotherapie. Besonders nebenwirkungsarm und geeignet zeigte sich die Inhibition des Enzyms Desoxyxylulose-5- Phosphat-Reduktoisomerase von Malaria, da der Mensch weder über Substrate und deren Vorstufen noch über das Produkt des Enzyms noch über das Enzym selbst verfügt.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen, die den DOXP-Stoffwechselweg hemmen, und diese Wirkstoffe zur Herstellung von Arzneimitteln für die Therapie und Prophylaxe von Infektionskrankheiten verur- sacht durch ein-oder mehrzellige Parasiten.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen zur Therapie von parasitären Erkrankungen bei Mensch und Tier bereitzustellen. Eine wei- tere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Auffindung eines Medikamentes zu entwickeln, das selektiv den Erreger abtötet und nebenwirkungsarm ist.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 realisiert. Die Erfindungsverfahren und ermittelten Wirk- stoffe sind dadurch gekennzeichnet, daß -die Isoprenoidbiosynthese im sogenannten 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Stoffwechselweg gehemmt wird.

Alle beschriebenen Stoffwechselwege sind nicht in Mensch und Tier vorhanden, sondern nur in Pflanzen, Algen, manchen Eubakterien und in Parasiten, wie zum Beispiel Malariapara- siten ; daher zeichnet sich diese Therapie-Strategie als sehr nebenwirkungsarm aus.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Enzyme, die an diesem Stoffwechselweg beteiligt sind, sowie Teilstücke dieser Enzyme. Diese Enzyme sind zur Durchführung des er- findungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation von Wirkstof- fen geeignete Proteine. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter DNA-Sequenzen, die diese Enzyme kodieren, bzw. Teil- stücke dieser Enzyme.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Anti- körper zur Identifizierung der Enzyme oder ihrer Teilstücke sowie die Herstellung der Enzyme oder ihrer Teilstücke über rekombinante Technologie.

Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung dieser Enzyme oder ihrer Teilstücke, oder die Verwendung der DNA- Sequenzen, die diese Enzyme kodieren, bzw. Teilstücke die- ser Enzyme zur Identifizierung von Stoffen mit Wirkung ge- gen ein-oder mehrzellige Erreger.

Die Erfindung betrifft weiter Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Enzyme aufgefunden werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der beiliegenden Zeichnungen genauer beschrieben.

Es zeigen : Fig. la die Nukleotid-Sequenz des Gens, das das Protein 1- Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat-Reduktoisomerase aus Plasmodi- um falciparum codiert, Fig. lb die Nukleotid-Sequenz des Gens, das die 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Synthase aus Plasmodium falciparum co- diert, Fig. 2a die Nukleotid-Sequenz des Gens, die 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Reduktoisomerase aus Plasmodium falci- parum codiert und die entsprechende Aminosäure-Sequenz Fig. 2b die Nukleotid-Sequenz des Gens, die 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Synthase aus Plasmodium falciparum co- diert und die entsprechende Aminosäure-Sequenz, Fig. 3a die Aminosäure-Sequenz des Proteins 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Reduktoisomerase aus Plasmodium falci- parum, Fig. 3b die Aminosäure-Sequenz des Proteins 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Synthase aus dem Parasiten Plasmodium falciparum, Fig 4a einen Ausschnitt aus der Nukleotid-Sequenz nach Fig. lb, Fig. 4b einen Ausschnitt aus der Nukleotid-Sequenz mit der entsprechenden Aminosauresequenz nach Fig. 2b, Fig. 4c einen Ausschnitt aus der Aminosäure-Sequenz nach Fig. 3b, Fig. 5 In-vivo-Daten für die Parasitämie-Werte nach 4-tägi- ger Therapie mit jeweils drei Dosen der Stoffe : Formyl, das 3- (N-Formyl-N-hydroxylamino)-propyl- phosphonsaure-mononatriumsalz entspricht, und Acetyl, das 3- (N-Acetyl-N-hydroxylamino)-propyl- phosphonsäure-mononatriumsalz entspricht, Fig. 6a die Inhibition des Wachstums von P. falciparum nach Zugabe von 3- (N-Formyl-N-hydroxylamino)-propyl- phosphonsäure-mononatriumsalz (offene Kreise) und 3- (N- Acetyl-N-hydroxylamino)-propyl-phosphonsäure- mononatriumsalz (geschlossene Kreise) für den Stamm HB3, Fig. 6b die Inhibition des Wachstums von P. falciparum nach Zugabe von 3- (N-Formyl-N-hydroxylamino)-propyl- phosphonsäure-mononatriumsalz (offene Kreise) und 3- (N- Acetyl-N-hydroxylamino)-propyl-phosphonsäure- mononatriumsalz (geschlossene Kreise) für den Stamm A2, und Fig. 6c die Inhibition des Wachstums von P. falciparum nach Zugabe von 3- (N-Formyl-N-hydroxylamino)-propyl- phosphonsäure-mononatriumsalz (offene Kreise) und 3- (N- Acetyl-N-hydroxylamino)-propyl-phosphonsäure- mononatriumsalz (geschlossene Kreise) für den Stamm Dd2, und Fig. 7 den klassischen Acetat/-Mevalonat-Biosyntheseweg im Vergleich zum alternativen DOX-P-Biosyntheseweg.

Mittels genetischer Verfahren wurden die kodierenden Gene der Enzyme DOXP-Synthase, und DOXP-Reduktoisomerase nachge- wiesen (Figuren la, lb, 2a, 2b). Nach Anreicherung durch die Polymerase-Ketten-Reaktion aus dem Genom von P. falci- parum wurden diese Gene in bakteriellen Plasmiden kloniert und ihre Nukleotidsequenz bestimmt. Die Sequenzdaten zeig- ten eine hohe Homologie dieser Gene mit den entsprechenden Genen aus Algen, Pflanzen und Bakterien. Die sehr hohen Ho- mologien zeigten, daß die drei Gene die Enzyme DOXP- Synthase und DOXP-Reduktoisomerase von P. falciparum codie- ren.

Nach Expression in heterologen Systemen wurden die Enzyme als rekombinante Proteine gereinigt und für Aktivitätsstu- dien in zellfreien Systemen eingesetzt. Die Aktivität der DOXP-Synthase wurde durch Umsetzung von Glycerinaldehyd-3- Phosphat und Pyruvat zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat ge- messen. Die Aktivität der DOXP-Reduktoisomerase wurde durch Umsetzung von 1-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat zu 2-C-Methyl- D-erythritol-4-Phosphat in Gegenwart von NADPH gemessen.

Die Messung der Veränderung der NADPH-Konzentration erfolgt über eine Parametervariation. Dieses Verfahren ist dem Fachmann bekannt.

Die Enzyme können über die sie codierende DNA-Sequenz (Fi- guren la, lb, 2a, 2b) und die davon abgeleitete Aminosäure- sequenz (Figuren 3a und 3b) definiert werden. Die Enzyme der einzelnen Parasiten können sich jedoch von Parasit zu Parasit unterscheiden. Solche Variationen der Aminosäuren sind in der Regel Aminosäureaustausche. Es kann sich aber auch um Deletionen, Insertionen und Additionen von Ami- nosäuren zur Gesamtsequenz handeln. Die erfindungsgemäßen Enzyme können-sowohl im Umfang und Art abhängig von der Zelle und Zelltyp, in dem sie exprimiert werden-glycosy- liert der nicht glyccsyliert sein.

Die erfindungsgemäßen Enzyme oder Teilstücke dieser Enzyme werden durch Expression der erfindungsgemäßen DNA in geeig- neten Expressionssyslemen, beispielsweise in Bakterien, <BR> <BR> <BR> <BR> insbesondere in E. coli, als prokaryontisches Expressions- system oder in einem eukaryontischen Expressionssystem, insbesondere COS-Zellen oder Dictyostelium discoideum, her- gestellt.

Mit Hilfe der erfindungsgemßen Nukleinsäuresequenz ist es möglich, im Genom von beliebigen Parasiten die kodierenden Gene oder deren Varianten zu suchen, diese zu identifizie- ren und die gewünschten kodierenden Gene für die Enzyme zu isolieren. Derartige Verfahren und die hierfür geeigneten Screening-Methoden sind dem Fachmann bekannt.

Durch die Anwendung der rekombinanten Technologie ist es möglich, eine Vielzahl von Varianten von Enzymen oder Teil- stücke von Enzymen herzustellen. Derartige Derivate können beispielsweise in einzelnen oder mehreren Aminosäuren durch Substitution, Deletion oder Addition modifiziert sein. Die Derivatisierung kann beispielsweise über site directed mutagenesis (ortsspezifische Mutagenese) erfolgen. Derarti- ge Variationen sind für einen Fachmann ohne weiteres durch- führbar. Es muß lediglich sichergestellt sein, daß die cha- rakteristischen Eigenschaften der Enzyme erhalten bleiben.

Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind deshalb die Enzyme, die am DOXP-Stoffwechselweg beteiligt sind, insbe- sondere DOXP-Synthase und DOXP-Reduktoisomerase, die a) das Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression einer exogenen DNA sind, b) codiert werden von einer Sequenz in Figuren la, lb, 2a und 2b c) codiert werden von DNA-Sequenzen, die mit den in Figuren la, lb, 2a und 2b gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmen- ten dieser DNA-Sequenzen (siehe z. B. Figuren 4a und 4b) im DNA-Bereich, der das reife Protein kodiert, hybridi- sieren, oder d) codiert werden von DNA-Sequenzen, die ohne die Degenera- tion des genetischen Codes mit den in b) bis c) defi- nierten Sequenzen hybridisieren würden und ein Polypep- tid mit derselben Aminosäuresequenz kodieren.

Bevorzugt sind Enzyme, welche von den Nukleotiden aus Figu- ren la, lb, 2a und 2b oder von DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz codieren wurden, codiert wer- den.

Die beiden erfindungsgemäßen Enzyme (Sequenz in Figuren 3a und 3b) können als neue Prototypen von spezifischen Protei- nen ein-und mehrzelliger Parasiten, insbesondere der ein- zelligen Parasiten angesehen werden.

Ein Gegenstand dieser Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, welche die Enzyme kodieren und ausgewählt sind aus der Gruppe a) der in den Figuren la, lb, 2a, und 2b gezeigten DNA- Sequenzen oder deren komplementäre Sequenzen, b) Nukleinsäuresequenzen, die mit einer der Sequenzen von a) hybridisieren, c) Nukleinsäuresequenzen, die ohne die Degeneration des ge- netischen Codes mit einer der in a) oder b) genannten Sequenzen hybridisieren würden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Enzyme aus be- liebigen Parasiten, welche im wesentlichen Pyruvat und Gly- ceraldehyd-3-Phosphat zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat kondensieren (DOXP-Synthase) und 1-Desoxy-D-xylulose-5- Phosphat zu 2-C-Methyl-D-erythritol-4-Phosphat umsetzen (DOXP-Reduktoisomerase). Diese den Enzymen aus Malaria- Parasiten analogen Enzyme können dadurch erhalten werden, daß mit einer Hybridisierungsprobe, die Enzyme aus Malaria- Parasiten codierende Sequenzen enthält, eine cDNA- Bibliothek oder genomische Bibliothek des entsprechenden Parasiten nach dem Fachmann geläufigen Methoden gescreent wird oder über den Sequenzvergleich der DNA und Proteinse- quenz für Enzyme von Malaria-Parasiten mit anderen Parasi- ten-Enzymen.

Mit Hilfe der Nukleinsäuren können erfindungsgemäße Enzyme in reproduzierbarer Weise in großen Mengen gewonnen werden.

Zur Expression in prokaryontischen und eukaryontischen Or- ganismen wird die Nukleinsäure nach dem Fachmann geläufigen Verfahren in geeignete Expressionsvektoren integriert. Vor- zugsweise enthält ein solcher Expressionsvektor einen regu- lierbaren/induzierbaren Promotor. Zur Expression werden diese rekombinanten Vektoren dann nach bekannten Verfahren in geeignete Wirtszellen eingeführt und die transformier- ten, transfizierten bzw. transduzierten Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression des heterologen Gens ermöglichen. Als Wirtszellen eignen sich prokaryonti- sche Zellen, wie z. B. E. coli, und eukaryontische Zellen, insbesondere Hefen (z. B. Saccharomyces cervisiae, Schizo- saccharomyces pombe, Pichia pastoris), Insektenzellen (z. B.

Zellinien von Drosophila melanogaster wie S2-Zellen, Spo- doptera frugiperda, Trichoplusia ni), Wirbeltierzellinien, vor allem Teratokarzinoma-Zellinien wie CHO-oder COS- Zellen, und pflanzliche Zellinien.

Die erfindungsgemäßen Enzyme können auch in transgenen Pflanzen und Tieren (z. B. Mäuse, Schafe, Ziegen, Schweine, Meerschweinchen) exprimiert werden. Das Expressionssystem ist dabei vorteilhafterweise durch dem Fachmann bekannte Techniken so zu gestalten, daß die produzierten Enzyme mit der Milch der Tiere ausgeschieden werden bzw. aus leicht zu gewinnenden Pflanzenteilen (Früchten, Blättern, Blüten, Sproß-und Wurzelteilen) erhalten werden können.

Als Expressionsvektoren für Wirbeltierzellinien eignen sich besonders Systeme, die von Papillomaviren (z. B. SV40), Re- troviren, Sindbisviren, Cytomegaloviren und Vacciniaviren abgeleitet sind. Für Insektenzellen eignet sich besonders das Baculovirus-System, für Pflanzenzellen Systeme auf der Basis des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens und der Beschuß der Zellen mit Nukleinsäure überzogenen Partikeln.

Von besonderer Bedeutung ist die Expression der erfindungs- gemäßen Enzyme in Schleimpilzen wie Dictyostelium discoi- deum, Polysphondylium pallidum und Physarum polycephalum, da ihre Zellen kostengünstig in großen Mengen auf einfachen Medien kultiviert werden können. Die Verwendung von Dic- tyostelium discoideum bietet den weiteren Vorteil, daß die- ser Organismus ähnliche Codone für die jeweiligen Aminosäu- ren benutzt wie Plasmodium falciparum und dadurch eine be- sonders effektive Produktion der erfindungsgemäßen Enzyme erreicht wird. Außerdem sind induzierbare Promotoren (z. B. durch Nahrungsmangel) für Expressionsvektoren für Dic- tyostelium discoideum bekannt. Dadurch kann die Ausbeute an rekombinantem Enzym weiter gesteigert werden.

Für die Expression der erfindungsgemäßen Enzyme eignen sich besonders solche Wirtszellen und Organismen, die keine in- trinsischen Enzyme besitzen, die Pyruvat und Glyceraldehyd- 3-Phosphat zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat kondensieren (DOXP-Synthase) und 1-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat zu 2-C- Methyl-D-erythritol-4-Phosphat umsetzen (DOXP-Reduktoiso- merase). Dies trifft für Archaebacterien, Tiere, Pilze, Schleimpilze und einige Eubakterien zu. Durch das Fehlen dieser intrinsischen Enzymaktivitäten wird die Detektion und Aufreinigung der rekombinanten Enzyme wesentlich er- leichtert. Auch wird es erst dadurch möglich, mit geringem Aufwand die Aktivität und insbesondere die Hemmung der Ak- tivität der erfindungsgemäßen rekombinanten Enzyme durch verschiedenen Chemikalien und Pharmaka in Rohextrakten aus den Wirtszellen zu messen.

Die Expression der erfindungsgemäßen Enzyme erfolgt vor- teilhafterweise dann in eukaryontischen Zellen, wenn post- translatorische Modifikationen und eine native Faltung der Polypeptidkette erreicht werden soll. Außerdem wird in Ab- hängigkeit vom Expressionssystem bei der Expression genomi- scher DNA-Sequenzen erreicht, daß Introns durch Spleißen der DNA beseitigt und die Enzyme in der für die Parasiten charakteristischen Polypeptidsequenz produziert werden.

Introns codierende Sequenzen können auch durch rekombinante DNA-Technologie aus den zu exprimierenden DNA-Sequenzen be- seitigt oder experimentell eingefügt werden.

Die Isolierung des Proteins kann aus der Wirtszelle oder dem Kulturüberstand der Wirtszelle nach dem Fachmann be- kannten Verfahren erfolgen. Es kann auch eine in vitro Re- aktivierung der Enzyme erforderlich sein.

Zur Erleichterung der Aufreinigung können die erfindungsge- mäßen Enzyme oder Teilsequenzen der Enzyme als Fusionspro- tein mit verschiedenen Peptidketten exprimiert werden. Dazu eigenen sich besonders Oligo-Histidin-Sequenzen und Sequen- zen, die von der Glutathion-S-Transferase, Thioredoxin oder Calmodulin-bindenden Peptiden abgeleitet sind. Fusionen mit Thioredoxin-abgeleiteten Sequenzen eignen sich besonders für prokaryontische Expression, da dadurch die Löslichkeit der rekombinanten Enzyme erhöht wird.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Enzyme oder Teilse- quenzen der Enzyme als Fusionsprotein mit solchen, dem Fachmann bekannten, Peptidketten exprimiert werden, daß die rekombinanten Enzyme in das extrazelluläre Milieu oder in bestimmte Kompartimente der Wirtszellen transportiert wer- den. Dadurch kann sowohl die Aufreinigung, als auch die Un- tersuchung der biologischen Aktivität der Enzyme erleich- tert werden.

Bei der Expression der erfindungsgemäßen Enzyme kann es sich als zweckmäßig erweisen, einzelne Codone zu verändern.

Dabei ist der gezielte Austausch von Basen in der kodieren- den Region auch sinnvoll, wenn die genutzten Codone in den Parasiten abweichend sind von der Codonnutzung im heterolo- gen Expressionssystem, um eine optimale Synthese des Pro- teins zu gewährleisten. Zudem sind oft Deletionen von nicht-translatierten 5'bzw. 3'-Abschnitten sinnvoll, bei- spielsweise wenn mehrere destabilisierende Sequenzmotive ATTTA im 3-Bereich der DNA vorliegen. Dann sollten diese bei der bevorzugen Expression in Eukaryonten deletiert wer- den. Veränderungen dieser Art sind Deletionen, Additionen oder Austausch von Basen und ebenfalls Gegenstand der vor- liegenden Erfindung.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Enzyme unter stan- dardisierten Bedingungen durch dem Fachmann bekannte Tech- niken durch in vitro-Translation gewonnen werden. Dafür ge- eignete Systeme sind Kaninchen-Reticulozyten-und Weizen- keim-Extrakte. Auch kann in vitro transskribierte mRNA in Xenopus-Oocyten translatiert werden.

Durch chemische Synthese können Oligo-und Polypeptide her- gestellt werden, deren Sequenzen aus der Peptidsequenz der erfindungsgemäßen Enzyme abgeleitet sind. Bei geeigneter Wahl der Sequenzen besitzen derartige Peptide Eigenschaf- ten, die für die vollständigen erfindungsgemäßen Enzyme charakteristisch sind. Derartige Peptide können in großen Mengen hergestellt werden und eignen sich besonders für Studien über die Kinetik der Enzymaktivität, die Regulation der Enzymaktivität, die dreidimensionale Struktur der Enzy- me, die Hemmung der Enzymaktivität durch verschiedene Che- mikalien und Pharmaka und die Bindungsgeometrie und Bin- dungsaffinität verschiedener Liganden.

Vorzugsweise wird zur rekombinanten Herstellung der erfin- dungsgemäßen Enzyme eine DNA mit den Nukleotiden aus den in den Figuren la, lb, 2a und 2b dargestellten Sequenzen oder ein Fragment gemäß den Figuren 4a und 4b verwendet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Gewinnung der Enzyme, die beteiligt sind am DOXP- Stoffwechselweg, insbesondere die Enzyme DOXP-Synthase und DOXP-Reduktoisomerase durch Isolierung aus den Parasiten.

Die Isolierung der Enzyme erfolgt aus Parasiten-Extrakten über chromatographisch, elektrophoretische und andere dem Fachmann bekannte Verfahren. Die Enzyme werden mittels Mes- sung der jeweiligen enzymatischen Aktivität oder Reaktivi- tät mit entsprechenden Antikörpern ermittelt.

Der Nachweis von transformierten, transfizierten bzw. transduzierten Wirtszellen, welche die Enzyme rekombinant produzieren, sowie die Aufreinigung des Proteins erfolgen vorzugsweise über Antikörper, die an diese Enzyme binden.

Derartige Antikörper sind mit Hilfe der erfindungsgemäßen Enzyme oder Teile der Enzyme als Antigen oder Immunogen in einfacher Weise nach bekannten Verfahren erhältlich.

Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern gegen die Proteine können beispielsweise durch Western-Blotting-Analysen homo- loge bzw. kreuzreagierende Proteine anderer Parasiten de- tektiert werden.

Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind Methoden zur Bestimmung der enzymatische Aktivität der DOXP-Enzyme, ins- besondere der Enzyme DOXP-Synthase und DOXP- Reduktoisomerase. Dies kann nach den bekannten Anleitungen bestimmt werden (Sprenger et al. PNAS, 94 (1997) 12857-62 und Kuzuyama et al. Tetrahedron Letters 39 (1998) 4509-12).

Hierbei wird die Kondensation von Pyruvat und Glyceralde- hyd-3-Phosphat zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat (DOXP- Synthase) und die Umwandlung von 1-Desoxy-D-xylulose-5- Phosphat zu 2-C-Methyl-D-erythritol-4-Phosphat (DOXP- Reduktoisomerase) detektiert. Ein weiterer Gegenstand die- ser Erfindung ist die Verwendung diese Meßverfahren zur Er- mittlung von Stoffen, die die Aktivität der jeweiligen En- zyme inhibieren.

Durch die Anwendung der rekombinanten Technologie ist es möglich, eine Vielzahl von Varianten von Enzymen oder Teil- stücken von Enzymen herzustellen. Derartige Derivate können beispielsweise modifiziert sein in einzelnen oder mehreren Aminosäuren durch Substitution, Deletion oder Addition. Die Derivatisierung kann beispielsweise über site directed mutagenesis (ortsspezifische Mutagenese) erfolgen. Derarti- ge Variationen sind für einen Fachmann ohne weiteres durch- führbar. Es muß lediglich sichergestellt sein, daß die cha- rakteristischen Eigenschaften der Enzyme erhalten bleiben.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Enzyme und ihrer Homologen können neue spezifische Wirkstoffe gegen Parasiten gefunden werden.

Insbesondere können die oben beschriebenen Detektions- Methoden in geeigneten Testkits zum Screening auf antipara- sitäre Wirkung von Stoffen verwendet werden. Hierzu gehören Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und sich zum Scree- ning von Naturstoffen aus Flora und Fauna, aus Pflanzen, Algen, Bakterien oder Tieren eignen, und deren Derivate, chemischen Bibliotheken, auch Bibliotheken, die mittels dem Fachmann bekannter Techniken, einschließlich der kombinato- rischen Chemie erstellt wurden (Pindur et al. Pharmazie in unserer Zeit 26 (1997) 24-30 ; Broach et al. Nature 384 (1997) 14-6 ; Lack et al. Chimia 50 (1996) 445-7 ; Czarnik und Ellmann Accounts of chemical research 29 (1996) ; Chemi- cal and engineerings News 74 (1996) 28-73 ; Lorin et al.

Chemical reviews 96 (1996) 555-600 ; Weber et al. Nachrich- ten aus Chemie, Technik und Laboratorium 42 (1994) 698- 702).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Proteinen oder Teilstücken dieser Proteine, hierzu gehören Proteine oder Teilstücke von Proteinen mit oder auch ohne enzymatischer Aktivität in dem Fachmann bekannten Techniken zur Ermittlung von Strukturen des Proteins, insbesondere die Charakterisierung der Bindungsstellen, die sich für die Entwicklung von Mitteln mit inhibierender Wirkung auf die enzymatische Aktivität eignen.

Wirkstoffe die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Proteine aufgefunden werden, sind für die Medizin und der Tiermedi- zin von hohem Interesse.

Die Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Protei- ne gefunden werden, eignen sich bei günstiger Warmblüterto- xizität zur Bekämpfung von pathogenen Parasiten, die bei Menschen und in der Tierhaltung und Tierzucht bei Nutz-, Zucht-, Zoo-, Labor-, Versuchs-und Hobbytieren vorkommen.

Sie sind dabei gegen alle oder einzelne Entwicklungsstadien der Schädlinge, sowie gegen resistente und normal sensible Parasiten wirksam. Durch die Bekämpfung der Parasiten sol- len Krankheiten, Todesfälle und Leistungsminderungen (z. B. bei der Produktion von Fleisch, Milch, Wolle, Häuten, Eiern usw.) vermindert werden, so daß der Einsatz der Wirkstoffe eine wirtschaftlichere und einfachere Tierhaltung möglich ist.

Unter Verwendung dieser erfindungsgemäßen Verfahren ein- schließlich der etablierten Assays (Ansätze) konnte gezeigt werden, daß die Aktivität der DOXP-Reduktoisomerase durch 3- (N-acetyl-N-hydroxyamino) propylphosphonat und derivative 3- (N-formyl-N-hydroxyamino) propylphosphonat (fosmidomycin) gehemmt wird. Beide Substanzen stammen aus einer chemischen Library von Acylhydroxylaminoalkylphosphonsäurederivaten.

Diese Verbindungsgruppe wurde in der Vergangenheit als her- bizid und als bakterizid beschrieben (US 4693742, DE2733658). Hier zeigte sich die Effizienz des Systems für das Auffinden von antiparasitären Wirkstoffen. Die Ergeb- nisse aus den Enzymassays konnten auch in der Malariakultur (siehe Beispiele) und im Tierversuch (siehe Beispiele) be- stätigt werden. Die mittels dieser Enzymassays ermittelten Inhibitoren konnten das Wachstum von Malariaparasiten in vitro und in vivo hemmen. Eine Behandlung der Tiere über einem Zeitraum von 8 Tagen zeigte eine Heilung der Tiere.

Hier zeigte die Acetylform eine dreifach höhere Wirksamkeit als die Formylform. Dieses Ergebnis ist sehr überraschend, da wesentlich höhere (bis zu 1000x) Konzentrationen 3- (N- acetyl-N-hydroxyamino) propylphosphonat benötigt werden, um das Bakterienwachstum zu hemmen.

Damit sind das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizie- rung von Wirkstoffen und die erfindungsgemäßen Wirkstoffe zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung von In- fektionen bei Mensch und Tier geeignet, die durch Parasi- ten, Pilze oder Viren hervorgerufen werden. Die Verbindun- gen sind als Prophylaxe gegen sowie zur Behandlung von In- fektionen, hervorgerufen durch Erreger der Malaria und der Schlafkrankheit sowie der Chagas-Krankheit, der Toxoplasmo- se, der Amöbenruhr, der Leishmaniosen, der Trichomoniasis, der Pneumozystose, der Balantidiose, der Kryptosporidiose, der Sarkozystose, der Akanthamöbose, der Naeglerose, der Kokzidiose, der Giardiose und der Lambliose geeignet.

Die erfindungsgemäßen Verfahren und erfindungsgemäßen Wirk- stoffe eignen sich besonders zur Behandlung der Malaria, der Schlafkrankheit und der Leishmaniosen.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe eignen sich auch zur Inhi- bition des Stoffwechselwegs von Bakterien, und von Pflan- zen. Damit eignen sich Substanzen, die erfindungsgemäß als Inhibitoren des DOXP-Stoffwechselweges identifiziert wer- den, auch zur Anwendung als Herbizide und zur Anwendung bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Mensch und Tier.

Zu den für eine Behandlung geeigneten Nutz-und Zuchttieren gehören Säugetiere, wie z. B. Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kamele, Wasserbüffel, Esel, Kaninchen, Salz-und Süßwasserfische, wie z. B. Forellen, Karpfen und Aale. Zu den geeigneten Labor-und Versuchstieren gehören Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Goldhamster, Hunde, Katzen und Schweine. Zu den geeigneten Hobbytieren gehören Hunde und Katzen. Die Anwendung kann sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch erfolgen. Die Anwendung der Wirkstoffe erfolgt direkt oder in Form von geeigneten, dem Fachmann bekannten Zubereitungen wie enteral, parenteral, dermal oder nasal.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können in Kombination mit allen dem Fachmann bekannten Antiinfektiva verwendet wer- den. Hierzu gehören Substanzen, die antibakterielle, anti- parasitäre, antivirale oder fungizide Wirkungen haben.

Hierzu gehören Antiinfektiva, die in der Roten Liste und in der Fachliteratur (Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikololgie von Forth et al. BI-Wissenschaftsverlag, Mannheim 1998 ; Antibiotikatherapie von Simon und Stille, Schattauer-Verlag, Stuttgart 1993) aufgeführt sind.

Da einige Parasiten sowohl über dem Mevalonat- Stoffwechselweg, als auch über dem DOXP-Stoffwechselweg verfügen, betrifft die Erfindung weiter die Kombination von Inhibitoren des DOXP-Stoffwechselweges mit Mitteln, die den Fettstoffwechselweg inhibieren, einschließlich Inhibitoren der Synthese oder der Aufnahme von Lipiden, insbesondere Inhibitoren des Mevalonat-Stoffwechselweges. Hier seien insbesondere die Inhibitoren der Ezyme HMG-COA-Synthase und Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase genannt. Zu den Inhibito- ren der HMG-CoA-Reduktase zählen insbesondere Lovastatin und Derivate, Mevastatin und Derivate, Compactin und Deri- vate, Simvastatin und Derivate, Pravastatin und Derivate, Atorvastatin und Derivate, Fluvastatin und Derivate und Ce- rivastatin und Derivate.

Beispiel 1 Expressionsklonierung des die DOXP-Reductoisomerase codie- renden Gens von P. falciparum. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Die Klonierung des die DOX-Reductoisomerase von P. falci- parum codierenden Gens erfolgte durch PCR-Amplifikation der entsprechenden Sequenzen von genomischer DNA als Matrize. <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Zur Gewinnung von genomischer DNA wurde der P. falciparum- Stamm HB3 nach der Kerzentopf-Methode kultiviert (Tranger und Jensen (1976), Science 193,673-675). Als Kulturmedium wurde RPMI 1640 (mit HEPES und L-Glutamin, Gibco) mit 10 % humanem Serum, 0.3 ug/ml Gentamycin und 0.1 mM Hypoxan- thin supplementiert und mit humanen Erythrozyten ein Häma- tokrit von 5 % eingestellt. Für die Präparation der DNA wurden 15 Kulturschalen mit je 35 ml Kulturvolumen bei ca.

4 % Parasitämie verwendet. Die infizierten Erythrozyten wurden durch Zentrifugation geerntet und zweimal in Trager- Puffer (57 mM NaCl, 58 mM KC1,1 mM NaH2PO4,7 mM K2HPO4,11 mM NaHCO3,14 mM Glucose) gewaschen. Die Parasiten wurden aus den Erythrozyten freigesetzt, indem das Zellsediment mit einem 10fachen Volumen 1 figer Saponinlösung in Trager- Puffer für 5 min auf Eis lysiert wurde (modifiziert nach Kilejian (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,4650-4653).

Die freien Parasiten wurden zweimal durch Zentrifugation (10 min, 10.000 rpm, 4 °C) mit einer Lösung von 1 % BSA in Trager-Puffer gewaschen. Die DNA-Präparation aus den gewon- nenen freien Parasiten erfolgte nach Standardprotokollen.

Zunächst wurden die Parasiten mit Proteinase K verdaut.

Dann wurde der Ansatz viermal mit Phenol/Chloroform ex- trahiert, die DNA-Lösung über Nacht gegen TE dialysiert und anschließend mit Isopropanol präzipitiert.

Für die PCR-Amplifikation wurden folgende Primer verwendet : PfYAEMfor 5-CTGAATTTCATATTACAAAATTAATAGATG-3 PfYAEMrev 5-GTACTATGAAGAATTATGTTTGTTGTATAT-3.

Für die PCR-Reaktion wurde folgender Ansatz verwendet : 3 ul 10 x PCR-Puffer 2,4 pi 25 mM MgS09 2,4 ul 2,5 mM dNTP 2 ul Matrizen-DNA (0,2 ug/ml) 2 ul Primer 1 (7,5 pM) 2 ul Primer 2 (7,5 uM) 0.2 ul Taq-Polymerase (5 U/ul) 16 ul H20 Die Amplifikation erfolgte mit folgendem Profil : 3 Zyklen : 96°C 1 min 48°C 1 min 72°C 3 min 32 Zyklen : 95 °C 40 sec 48°C 1 min 72°C 3 min Nach dem letzten Zyklus wurde der Ansatz zur vollständigen Verlängerung aller Produkte noch 10 min bei 72°C inkubiert.

Das PCR-Produkt von 4 derartigen Ansätzen wurde vereinigt und über ein 0.7 %iges Agarosegel gereinigt. Die Elution der DNA aus dem Agaroseblöckchen erfolgte mit dem"Kit for DNA extraction" (Millipore, Kat. Nr. S667). Die eluierte DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in 10 ul H20 aufge- nommen. Anschließend wurde das PCR-Produkt nach den Vor- schriften des Herstellers mit dem TA-cloning kit (Invitro- gen) kloniert. Dabei wurden 20 mg insert-DNA für einen Li- gationsansatz verwendet. Bakterienkolonien, die das ge- wünschte rekombinante Plasmid trugen, wurden durch analyti- sche Plasmidpräparation und EcoR I-Verdau der Plasmide identifiziert. Die klonierten PCR-Produkte wurden dann un- ter Verwendung von Standard-Forward-und Reverse-Primern sequenziert ; die Sequenzen wurden mit der Technik des Pri- mer Walkings vervollständigt.

Für die Expression in COS-7-Zellen wurde ein PCR-Produkt, das in der entsprechenden Orientierung im pCR2.1-Vektor vorlag, in den Expressionsvektor pBK-CMV (Stratagene) um- kloniert. Die Umklonierung erfolgte dabei über die Schnitt- stellen der Restriktionsenzyme Not I und BamH I, die im Po- lylinker beider Vektoren vorkommen. Für die Transfektion der COS-7-Zellen wurde der Expressionsvektor mit dem PCR- Produkt als Insert über Anionenaustausch-Chromatographie (Qiagen) im präparativen Maßstab hergestellt.

Alle für die Klonierung verwendeten Methoden sind ausführ- lich beschrieben in J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning : a laboratory manual, 2nd editi- on, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA.

Die COS-7-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10 % FCS unter Standardbedingungen kultiviert. Pro Zellkulturflasche wur- den 30 ml Kulturmedium berechnet. Für die Transfektion wur- den Zellen bei ca. 50 % Konfluenz verwendet, die am Vortag frisch gesplittet worden waren. Als Transfektionsreagenz wurde DOTAP (Boehringer) verwendet. 40 ul DNA-Lösung (0,5 pg/ml) wurden mit 110 pl 20 mM HEPES (pH 7,4) gemischt.

Außerdem wurden 100 ul DOTAP mit 230 ul 20 mM HEPES (pH 7,4) in einem Polystyrol-Reaktionsgefäß gemischt. Dann wur- de die DNA-Lösung zu der DOTAP-Lösung zupipettiert und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz mit 20 ml Kulturmedium gemischt und das Medium der COS-7-Zellen durch dieses Gemisch ersetzt. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit frischem Medium in neue Zellkultur- flachen transferriert. Nach weiterer 48stündiger Inkubation wurden die transfizierten COS-7-Zellen geerntet. Dazu wur- den die Zellen abgeschabt und dreimal durch Zentrifugation in Assay-Puffer (100 mM TrisHCl (pH 7,5), 1 mM MnCl2) ge- waschen. Die Zellen wurden in einem minimalen Volumen As- say-Puffer resuspendiert und durch dreimaliges Einfrieren (in flüssigem Stickstoff) und Auftauen aufgeschlossen.

Zellfragmente wurden in einem 1.5 ml Reaktionsgefäß abzen- tifugiert (13 000 rpm, 10 min, 4 °C) und der Überstand di- rekt für die Messung der Enzymaktivität oder zur Aufreini- gung des Enzyms verwendet.

Beispiel 2 Reinigung der rekombinanten DOXP-Reductoisomerase von P. falciparum Zur genaueren Charakterisierung wurde die in COS-7-Zellen <BR> <BR> <BR> <BR> exprimierte rekombinante DOXP-Reductoisomerase von P. fal- ciparum zur weitgehenden Homogenität aufgereinigt. Die Rei- nigung erfolgte über einen affinitätschromatogrphischen und einen gelpermeationschromatographischen Schritt.

Zur Herstellung einer geeigneten Affinitätschromatographie- Säule wurden zunächst Antikörper gegen die DOXP- <BR> <BR> <BR> <BR> Reductoisomerase von P. falciparum hergestellt. Dazu wurden aus der von der DNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäurensequenz solche Abschnitte ausgewählt, für die eine besonders hohe antigene Wirkung vorausgesagt werden konnte. Entsprechende Peptide wurden synthetisiert und für die Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Qualität der erhaltenen Antiseren wurde sowohl anhand ihrer Reaktivität mit den synthetischen Peptiden, als auch durch Western blot-Analysen bestätigt.

Für die Western blot-Analysen (BM Western Blotting Kit, <BR> <BR> Boehringer) wurden Extrakte aus P. falciparum und rekombi- nanten COS-Zellen verwendet.

Zur Herstellung der Affinitätchromatographie-Säule wurde das Antiserum zur Beseitigung niedermolekularer Amine gegen PBS dialysiert. Die Antikörper wurden dann an Protein A- Sepharose gebunden und durch Cross-linking mit DMP kovalent gekoppelt (IgG Orientation Kit, Pierce). Der Proteinextrakt wurde wie in Beispiel 1 beschrieben aus 55 Zellkulturfla- chen mit transfizierten COS-7-Zellen gewonnen und auf die mit Assay-Puffer äquilibrierte Säule geladen. Nach exzessi- vem Waschen mit Assay-Puffer wurde die Säule mit Elutions- Puffer (100 mM GlycinHCl (pH 2,8), 0.4 % CHAPS) eluiert.

Das Eluat wurde sofort mit 1 M TrisHCl (pH 7,5) neutrali- siert. Die Hauptfraktionen wurden durch Westen blot-Analyse identifiziert. Dazu wurden für die Detektion biotinylierte Antikörper verwendet, um eine Störung durch von der Säule in geringer Menge eluierte Antikörper zu vermeiden. Die Hauptfraktionen wurden vereinigt, gegen Assay-Puffer dialy- siert und durch Ultrafiltration (30 kDa, Amicon) konzen- triert. Die weitere Reinigung erfolgte durch Gelpermeation- schromatogrphie (Superdex 200, Pharmacia) mit Assay-Puffer als Start-und Elutions-Puffer. Die Hauptfraktionen wurden wie oben beschrieben identifiziert, vereinigt und konzen- triert, mit 20 % Glygerin versetzt und bei-70°C eingefro- ren. Durch SDS-PAGE (12 % Acrylamid) unter reduzierenden Bedingungen und Silberfärbung (Gelcode Colour Silver Stain Kit, Pierce) wurde die gereinigte DOXP-Reductoisomerase von P. falciparum als einheitliche Bande bei 54 kDa darge- stellt.

Beispiel 3 Bestimmung der Aktivität des gereinigten Enzyms und Scree- ning nach Inhibitoren Die DOXP-Reductoisomerase-Aktivität des gereinigten Enzyms wurde in einem in vitro-Versuchssystem bestätigt. Für einen typischen Versuchsansatz wurdenlO0 ul Assay-Puffer mit 0,3 mM NADPH, 0,3 mM DOXP und 10 ug rekombinantem Enzym verwen- det. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von DOXP zum kom- pletten Ansatz gestartet. Die Oxidation von NADPH wurde photometrisch bei 340 nm in Mikroquarzküvetten bei 37°C verfolgt. Dieses Versuchssystem wurde verwendet, um die In- hibition der rekombinanten DOXP-Reductoisomerase von P. falciparum durch verschiedene Substanzen zu zeigen. Nach Zugabe von 1 uM 3-(N-Formyl-N-hydroxylamino)-propyl- phosphonsäure-mononatriumsalz und und 1 pM 3- (N-Acetyl-N- hydroxylamino)-propyl-phosphonsäure-mononatriumsalz zum Re- aktionsansatz war keine Veränderung der Absorption bei 340 nm zu beobachten. Unter diesen Bedingungen wurde die DOXP- Reductoisomerase von P. falciparum vollständig inhibiert.

Beispiel 4 Test der Wirksamkeit der Substanzen gegen Malaria in vivo Die verschiedenen Derivate wurden nach dem modifizierten Peters'Test getestet. Die Substanzen wurden dabei in einem Viertel der halblethalen Dosis (LD50) appliziert. Bei dem Versuchsansatz wurden zehn Mäuse mit Plasmodium vinckeii, dem Erreger der Mäusemalaria, infiziert. Nach Bestätigung der Infektion durch Blutuntersuchung erfolgte die Behand- lung in vier Mäusen. Als Kontrolle dienten sechs Mäuse, die nicht behandelt wurden. Die Behandlung mit 1-1000 mg/kg/d, 3- (N-Formyl-N-Hydroxylamino)- propylphosphonsäuremononatriumsalz über 3 Tage führte zu einer Abtötung der Parasiten im Blut der Mäuse. Die behan- delte Gruppe war bereits nach einem Tag frei von lebenden Parasiten. Die Kontrollmäuse mußten am Tag 5 nach Infektion bei einer Parasitämie von > 80% getötet werden. Die behan- delten Mäuse waren auch 8 Wochen nach Behandlungsende immer noch frei von Parasiten. Weitere Experimente zeigten eine Wirksamkeit von 50 mg/kg/d 3- (N-Formyl-N-hydroxylamino)- propyl-phosphonsäure-mononatriumsalz in Mäusen mit einer Parasitämie von 80%. Auch diese Mäuse waren nach 1 Tag frei von lebenden Parasiten. Die weiteren Ergebnisse für 3- (N- Formyl-N-hydroxylamino)-propyl-phosphonsäure- mononatriumsalz und 3- (N-Acetyl-N-hydroxylamino)-propyl- phosphonsäure-mononatriumsalz sind in Figur 5 dargestellt.

Beispiel 5 Schutzwirkung vor Malaria beim Versuch mit infizierten Mäu- sen Die Wirksamkeit der Verbindungen in vivo gegenüber Malaria wurde unter Heranziehen von 20 bis 25 g schweren männlichen Mäusen (BALB/c-Stamm) getestet. Einen Tag vor der Infektion wurden vier Mäuse intraperitoneal mit 50 mg/kg 3- (N-Formyl- N-hydroxylamino)-propylphosphonsäure-mononatriumsalz behan- delt. Die Mäuse wurden dann mit Plasmodium vinckeii infi- ziert. Mäuse, die nicht mit der Substanz vorbehandelt wur- den, dienten als Kontrolle. Es konnte in den behandelten Mäusen keine Infektion nachgewiesen wurden, während die Kontrollmäuse nach 5 Tagen mit einer Parasitämie über 80% getötet werden. Die behandelten Mäuse waren auch 8 Wochen nach der Infektion frei von Parasiten.

Beispiel 6 In vitro Inhibition des Wachstums von Malaria Parasiten Zum Prinzip der IC50-Bestimmung (die Konzentration, bei der die Vitalität der Parasiten um die Hälfte reduziert wird) Zur Bestimmung der IC50-Werte werden die Malariaparasiten zunächst für einen vollständigen 48-Stunden-Zyklus in Ge- genwart von Inhibitoren kultiviert, in den anschließenden 24 Stunden wurde die Uberlebensrate durch [3H]-Hypoxanthin- Einbau gemessen. Auf einer Mikrotiterplatte wird eine Ver- dünnungsreihe von 3-(N-Formyl-N-hydroxylamino)- propylphosphonsäuremononatriumsalz in 10-fach konzentrier- ten 20-ul-Aliquots vorgelegt. Dann werden zu jedem Well 180 ul Parasitensuspension in Kulturmedium zugefügt. Es werden asynchrone Kulturen mit ca. 0,4% Parasitämie und 2 % Häma- tokrit verwendet. Anschließend werden die Mikrotiterplatten für 48 h inkubiert. Dann werden zu jedem Well 30 ul [3H]- Hypoxanthin zugefügt. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen geerntet und die inkorporierte Radioaktivität wurde gemessen. In den Figuren 6a, 6b und 6c sind die Er- gebnisse mit den Stämen HB3, A2 und Dd2 mit bekannten Re- sistenzen gegen andere Malaria-Medikamente dargestellt. In beiden Stämmen ergibt sich ein IC-50-Wert von unter 0,5 uM.

Die Resistenzen dieser Stämme sind : Plasmodium falciparum HB3 (Honduras) ist gegen Pyrimethamin resistent.

Plasmodium falciparum Dd2 (Indochina) ist gegen Cloroquin, Chinin, Pyrimethamin, Cycloguanil und Sulfadoxin resistent.

Plasmodium falciparum A2 (Gambia) ist gegen Chloroquin und Cycloguanil resitent. Es wurden keine Kreuzresistenzen mit Anti-Malaria-Mitteln gefunden.