Die Erfindung betrifft eine Bildaufnahmevorrichtung, insbesondere ein Mikroskop, mit mindestens einem Beleuchtungsstrahlengang (zur Beleuchtung einer Probe), der eine modulierbare Lichtquelle umfasst, einem Detektionsstrahlengang (zur Aufnahme eines Bildes der Probe), der einen optoelektronischen Wandler mit einer mindestens zweidimensionalen Matrix von Detektionselementen („Pixel") umfasst, und einer Steuereinheit, die mit der Lichtquelle und dem Wandler verbunden ist, sowie ein Verfahren zum Aufnehmen einer Bildersequenz von einer Probe mittels mindestens eines Beleuchtungsstrahlengangs (zur Beleuchtung der Probe), der eine

modulierbare Lichtquelle umfasst, und eines Detektionsstrahlengangs (zur Aufnahme eines Bildes der Probe), der einen optoelektronischen Wandler mit einer mindestens zweidimensionalen Matrix von Detektionselementen umfasst.

Im Sinne der Erfindung umfasst der Begriff Licht jede mit optischen Mitteln

manipulierbare elektromagnetische Strahlung, also insbesondere ultraviolette, sichtbare und infrarote Strahlung, Probenlicht ist im Sinne der Erfindung Licht, das durch Fluoreszenz von der Probe emittiert wird, angeregt durch die beleuchtenden Lichtpulse. Es kann auch Anteile enthalten, die durch Reflexion und/oder Streuung von Beleuchtungslicht an der Probe entstehen, Eine modulierbare Lichtquelle kann direkt modulierbar sein - wie eine Leuchtdiode (LED) oder eine Laserdiode - oder sie kann indirekt modulierbar sein, indem sie einen zusätzlichen Modulator umfasst, beispielsweise ein einstellbares akustooptlsches Filter (engl,„tunable acousto-optical filter"; AOTF). Ein optoelektronischer Wandler integriert nach Auslösung einer Bildaufnahme in jedem seiner Detektionselemente eine elektrische Größe wie Ladung oder Spannung.

Im Stand der Technik ist als Bildaufnahmevorrichtung beispielsweise ein

Lichtscheiben-Mikroskop (engl,„light sheet microscope") zur

Einzelebenenbeleuchtung (engl,„single-plane Illumination"; SPI) aus

US 2006/033987 A1 bekannt. Darin wird als Wandler eine zweidimensional ortsauflösende Kamera mit CCD-Sensor (CCD für„charge-coupied device") eingesetzt. Die Beleuchtung mit einer Lichtscheibe (auch als Lichtblatt bezeichnet) hat den Vorteil, dass die Probe nur zu einem kleinen Teil beleuchtet und damit nur geringfügig belastet wird. Die SPI-Mikroskopie (SPIM) wird daher vorzugsweise für lebende Proben verwendet.

Zweidimensionale optoelektronische Wandler sind im Stand der Technik

beispielsweise mit einem elektronischen globalen Verschluss (engl,„global shutter" oder "frame shutter") aus US 2009/095986 A1 , wiederum in Form eines CCD- Sensors, oder aus US 2001/035542 A1 in Form eines CMOS-Sensors (CMOS für „complementary metal-oxide semiconductor") bekannt. Daneben sind Wandler mit einem sogenannten elektronischen rollenden Verschluss (engl„rolling shutter") bekannt, beispielweise aus US 2006/ 57758 A1. CCD-Sensoren mit globalem

Verschluss sind für die Aufnahme von Bilderpaaren mit kurzem zeitischen Abstand problematisch, weil sie die durch Photoabsorptton integrierten elektrischen Ladungen nur langsam auslesen können. Auch bei CMOS-Sensoren mit globalem Verschluss dauert das Auslesen aller Detektionselemente („Pixel") je nach ihrer Anzahl

(„Auflösung") relativ lange.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Bildaufnahmevorrichtung der eingangs genannten Art und ein Verfahren zur Aufnahme einer Bildersequenz zu verbessern, so dass unmittelbar aufeinanderfolgende Bilder mit geringerem zeitlichen Abstand zwischen den Bildern aufgenommen werden können. Insbesondere soll dabei die Probenbelastung gegenüber einer kontinuierlichen Beleuchtung verringert werden.

Die Aufgabe wird gelöst durch eine Bildaufnahmevorrichtung, welche die in

Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, und durch ein Verfahren, welches die in Anspruch 14 angegebenen Merkmale aufweist.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Erfindungsgemäß ist zum einen vorgesehen, dass ein an sich bekannter

(zeitfensterbasierter) Wandler, wie beispielsweise in US 2009/095986 A1 oder US 2001/035542 A1 beschrieben, eingesetzt wird, der (zur Bereitstellung eines globalen elektronischen Verschlusses) einen Eingang für ein Signal zum Auslösen (und ein Signal zum Beenden) einer simultanen elektrischen Integration in allen Detektionselementen umfasst und der nach dem Ende einer ersten Integration das Auslösen einer zweiten Integration noch während des Auslesens erlaubt. Derartige Wandler sind auf bekannte Weise dazu ausgebildet, als Reaktion auf das

auslösende Signal, beispielsweise in Form einer steigenden Flanke eines TTL- Pulses, selbständig und unabhängig (insbesondere von einem wandlerexternen Takt) folgende Schritte auszuführen:

- Zurücksetzen der Detektionselemente vor Beginn der Integration,

- Aufrechterhaltung der Integration über eine Dauer des Auslösesignals,

- Verschieben des integrierten Inhalts der der betreffenden Detektionselemente in einen jeweiligen (lichtgeschützten) Zwischenspeicher der betreffenden

Detektionselemente,

- Auslesen eines jeweiligen elektrischen Signals aus den Zwischenspeichern der betreffenden Detektionselemente,

- Digitalisieren der ausgelesenen elektrischen Signale und

- Bereitstellen der digitalen Bilddaten an einer Schnittstelle.

Die Auslösung der zweiten Integration noch während des Auslesens wird als

Überlappungsmodus (engl,„overlapping mode") bezeichnet, da sich der

Auslesevorgang im Wandler und die zweite Integration zeitlich (insbesondere vollständig) überlappen. Wird die zweite Integration noch vor dem Ende des

Auslesens beendet, werden die bis dahin durch Photoabsorption in den

Detektionselementen integrierten Inhalte verworfen, so dass nur die Bilddaten aus der ersten Integration bereitgestellt werden. Um das zu vermeiden, geben die beschriebenen Wandler den Status des Auslesevorgangs (dauert an/beendet) über eine Schnittstelle aus.

Es ist zum anderen vorgesehen, dass die Steuereinheit mit dem

(integrationsauslösenden) Eingang des Wandlers verbunden und dazu eingerichtet ist, in dem Wandler eine erste Integration auszulösen und wieder zu beenden und danach, bevor in dem Wandler ein Auslesen eines während der ersten Integration integrierten Inhalts aus allen Detektionselementen beendet ist, eine zweite

Integration auszulösen und erst wieder zu beenden, nachdem in dem Wandler das Auslesen des während der ersten Integration integrierten Inhalts aus allen

Detektionselementen beendet ist, wobei sie während beider Integrationen jeweils für dieselbe (gesamte oder effektive) Belichtungsdauer die Lichtquelle zur (periodisch) gepulsten oder kontinuierlichen Emission mindestens einer Wellenlänge steuert und zwischen den Integrationen (also nach dem Beenden der ersten und vor dem

Auslösen der zweiten) die Emission unterbricht (insbesondere für die gesamte Dauer zwischen dem Beenden der ersten Integration und dem Auslösen der zweiten Integration),

Der Grundgedanke der Erfindung besteht darin, den Überlappungsmodus mit aufeinanderfolgenden, gleichartigen Beleuchtungspulsen zu synchronisieren, um einen kürzeren zeitlichen Abstand zwischen einem Paar unmittelbar

aufeinanderfolgend aufgenommener Bilder zu ermöglichen und dabei die Probe minimal zu belasten.

Die Emission während der Belichtungsdauer kann gepulst oder kontinuierlich erfolgen. Entsprechend umfasst der Begriff der Belichtungsdauer im Sinne der Erfindung verschiedene spezielle Bedeutungen: Die gesamte Belichtungsdauer Ist die Dauer desjenigen Zeitraums, in welchem die Einhüllende der aus der Modulation resultierenden Lichtintensität von Null verschieden ist. Die effektive Belichtungsdauer ist die summierte Dauer derjenigen Zeiträume innerhalb der gesamten

Belichtungsdauer, in welchen die aus der Modulation resultierenden Lichtintensität von Null verschieden ist. Im Falle einer über die gesamte Belichtungsdauer kontinuierlichen Emission ist die effektive Belichtungsdauer gleich der gesamten Belichtungsdauer.

Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen der Erfindung, in denen die zweite Integrationsdauer länger als die erste Integrationsdauer ist, insbesondere mit Ausbildung der Steuereinheit zum Auslösen der zweiten Integration derart, dass ein. mit dem Auslesen zeitlich überlappender Anteil der zweiten Integration länger ist als die erste Integration, wobei vorzugsweise die zweite Integration vollständig mit dem Auslesen überlappt (mit anderen Worten: mit dem Ende oder sogar aufgrund des Endes des Auslesevorgangs des Wandlers beendet wird). Dies stellt eine vorteilhafte Erweiterung des Überlappungsmodus dar, Die Verlängerung der zweiten Integration über die Belichtungsdauer hinaus durch einen entsprechend früheren Beginn noch während des Auslesens der vorhergehenden Integrationsergebnisse durch den Wandler ermöglicht es, den zeitlichen Abstand zwischen dem In der ersten Integration aufgenommenen Bild und dem in der zweiten Integration

aufgenommenen Bild weiter zu verringern. Durch die identische Belichtung während beider Integrationen wird trotz unterschiedlicher Integrationsdauern die gleiche Lichtmenge in beiden aufgenommenen Bildern erzielt

Vorteilhaft kann es ein, wenn die Bildaufnahmevorrichtung ein Bedienelement zur

Einstellung der zweiten Integrationsdauer, eines Quotienten zwischen der zweiten und der ersten Integrationsdauer oder einer Differenz zwischen der ersten und der zweiten Integrationsdauer bereitstellt. Insbesondere in Ausführungsformen, in denen die zweite Integrationsdauer vollständig mit dem Auslesen überlappt (mit dem oder durch das Ende des Auslesevorgangs des Wandlers beendet wird), wird so die variable Einstellung eines zeitlichen Abstands zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildern auf kleinere Werte als die Auslesedauer des Wandlers für alle

Detektionselement ermöglicht. Der zulässige Bereich wird dabei durch die vom Benutzer vorgegebene Belichtungsdauer und durch die Auslesedauer des Wandlers für alle Detektionselemente eingegrenzt.

In einer speziellen Ausführungsform sind die erste Integrationsdauer und die zweite Integrationsdauer gleich lang. Hier entspricht die Bildaufnahme dem einfachen Überlappungsmodus.

Vorzugsweise ist die erste Integration gleich lang wie die (gesamte)

Belichtungsdauer. Durch Vermeidung einer Abweichung wird eine minimale

Probenbelastung erreicht.

Vorteilhaft sind Ausgestaltungen, in denen die Bildaufnahmevorrichtung ein

Bedienelement zur Auswahl eines von mehreren von der Steuereinheit

bereitgestellten Betriebsmodi bereitstellt, wobei in dem ersten Betriebsmodus die zweite Integrationsdauer länger als die erste Integrationsdauer ist (und vorzugsweise vollständig mit dem Auslesen überlappt), insbesondere bei konstanter erster und konstanter zweiter Integrationsdauer, und in dem zweiten Betriebsmodus die erste Integrationsdauer und die zweite Integrationsdauer gleich lang sind. Das ermöglicht dem Benutzer eine einfache Umschaltung zwischen einfachem und erweitertem. Überlappungsmodus. Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen die Steuereinheit dazu eingerichtet ist, die zweite Integration (genau) am Ende oder aufgrund des Endes des Auslesens des Wandlers zu beenden. Dadurch kann sichergestellt werden, dass die zweite Integration zeitlich vollständig mit dem Auslesevorgang der Signale der ersten Integration aus dem Zwischenspeicher überlappt, so dass ein minimaler zeitlicher Abstand der Bilder ermöglicht wird. Zudem kann so ein Verwerfen der Daten der zweiten Integration durch den Wandler aufgrund eines verfrühten

Beendens der zweiten Integration {nämlich vor dem Ende des Auslesevorgangs) vermieden werden. Die Beendigung der zweiten Integration aufgrund des Endes des Auslesevorgangs gelingt beispielsweise, indem der Wandler ein Signal ausgibt, welches den Status (insbesondere das Ende) des Auslesevorgangs zu der vorhergehenden (ersten) Integration anzeigt, und die Steuereinheit die zweite Integration beendet, wenn und sobald sie das Endsignal identifiziert. Beispielsweise beendet sie die zweite Integration ausschließlich dann, wenn und sobald sie das Endsignal identifiziert.

Die Kopplung der Beendigung der zweiten Integration mit dem Ende des

Auslesevorgangs gelingt alternativ beispielsweise durch eine Zeitmessung und den Vergleich mit der (vorgegebenen) Auslesedauer des Wandlers für alle

Detektionselemente. Zweckmäßigerweise kann die Steuereinheit zu diesem Zweck dazu eingerichtet sein, die zweite Integration erst um eine Pausendauer nach dem Beenden der ersten Integration auszulösen. Die Pausendauer definiert den zeitlichen Abstand zwischen dem in der ersten Integration aufgenommenen Bild und dem in der zweiten Integration aufgenommenen Bild, Die Steuereinheit kann die

Pausendauer vorzugsweise anhand einer (vom Benutzer oder einer übergeordneten Steuereinheit) vorgegebenen Periodendauer eines periodischen Vorgangs so ermitteln, dass die Pausendauer zuzüglich der ersten Integrationsdauer einem ganzzahligen Vielfachen der Periodendauer entspricht. Wenn der periodische Vorgang die Modulation der Lichtquelle und/oder einer Positionierung des Lichtfokus in der Probe entspricht, kann so eine gleiche Helligkeit in beiden Bildern erreicht werden. Neben der Periodendauer eines externen Vorgangs wird die Steuereinheit die Pausendauer in der Regel anhand der vom Benutzer vorgegebenen

Belichtungsdauer ermitteln. Vorzugsweise ist die Steuereinheit dazu eingerichtet, die Pausendauer derart zu ermitteln, dass sie länger als oder gleich lang ist wie die Auslesedauer abzüglich der zweiten Integrationsdauer oder die zweite Integrationsdauer derart zu ermitteln, dass sie länger als oder gleich lang ist wie die Auslesedauer abzüglich der Pausendauer. Damit wird vermieden, dass die zweite Integration vor dem Auslesevorgang des Wandlers beendet und die zugehörigen Bilddaten verworfen werden.

Insbesondere kann die Steuereinheit dazu eingerichtet sein, folgende Schritte durchzuführen:

- Ermitteln einer (vorgegebenen, insbesondere vom Benutzer) Belichtungsdauer, einer Auslesedauer für alle Detektionselemente, einer ersten Integrationsdauer, einer Pausendauer (zwischen Ende der ersten Integration und Auslösen der zweiten), wobei die Pausendauer kleiner ist als die Auslesedauer, und einer zweiten

Integrationsdauer (wobei die Pausendauer in Abhängigkeit der zweiten

Integrationsdauer ermittelt wird oder umgekehrt)

- Steuern der Lichtquelle zur (periodisch) gepulsten oder kontinuierlichen ersten Emission von Licht mindestens einer vorgegebenen Wellenlänge für mindestens die Belichtungsdauer,

- Setzen des (integrationsauslösenden) Eingangs des Wandlers synchron zu einem Beginn der ersten Emission (insbesondere durch konstanten Zeitversatz zum

Steuern der Lichtquelle),

-nach Ablauf (insbesondere am Ende) der ersten Integrationsdauer: Beenden der Emission und Zurücksetzen des Eingangs,

- Abwarten der Pausendauer,

- am Ende der Pause: Steuern der Lichtquelle zu einer mit der ersten Emission übereinstimmenden zweiten Emission für dieselbe Belichtungsdauer und

- Setzen des (integrationsauslösenden) Eingangs des Wandlers synchron zu einem Beginn der zweiten Emission (insbesondere durch konstanten Zeitversatz zum Steuern der Lichtquelle)

- nach Ablauf (insbesondere am Ende) der zweiten Integrationsdauer: Beenden der Emission und Zurücksetzen des Eingangs. ln einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist die Bildaufnahmevorrichtung ein SPI-Mikroskop, wobei der Beleuchtungsstrahlengang und der

Detektionsstrahlengang einander (zumindest näherungsweise} in einer Fokusebene des Detektionsstrahlengangs kreuzen und der Beleuchtungsstrahlengang einen Strahlformer zur Erzeugung zumindest eines Segments eines Lichtblatts (oder eines vollständigen Lichtblatts) aufweist, insbesondere durch Fokussierung auf eine Brennlinie, wobei die Brennlinie (zumindest näherungsweise} in der Fokusebene des Detektionsstrahlengangs liegt.

Besonders vorteilhaft ist die Erfindung in einem Mikroskop, in dem die Probe sequentiell von zwei Seiten („links" und„rechts") beleuchtet und ein jeweiliges Teilbild von ihr aufgenommen werden kann. Die Teilbilder werden zu einem Gesamtbild verrechnet, das eine höhere Bildqualität aufweist als die Teilbilder. Bei zeitlich veränderlichen Proben und/oder einer Bewegung der Probe, beispielsweise zur Aufnahme eines Bildstapels, wird die Bildqualität des Gesamtbildes um so höher, je geringer der zeitliche Abstand zwischen den Teilbildern ist. Durch die

erfindungsgemäß ermöglichte Verringerung des zeitlichen Abstands kann die Bildqualität des Gesamtbildes vergrößert werden.

Vorteilhaft ist die Erfindung auch in Mikroskopen, in denen der

Beleuchtungsstrahlengang eine variabel einstellbare Ablenkeinheit zur Verschiebung des Lichtblatts, insbesondere innerhalb der Fokusebene des

Detektionsstrahlengangs, aufweist. Zweckmäßigerweise kann die Steuereinheit hier dazu eingerichtet: sein, die Ablenkeinheit zur periodischen Verschiebung des

Lichtblatts mit einer vorgegebenen Periodendauer zu steuern (und die Pausendauer anhand der Periodendauer zu ermitteln), wobei die (gesamte) Belichtungsdauer, insbesondere auch die Dauer der ersten Integration, einem ganzzahligen Vielfachen der Periodendauer entspricht. Dadurch wird eine gleiche Helligkeit in beiden aufeinanderfolgenden Bildern erreicht. Insbesondere kann die Steuereinheit zum Modulieren einer Intensität der Emission der Lichtquelle während der jeweiligen Belichtungsdauer eingerichtet sein. Dann ist die jeweilige effektive Belichtungsdauer kürzer als die jeweilige gesamte Belichtungsdauer. Vorteilhaft sind zudem Ausführungsformen des Mikroskops mit einem Probenhalter, wobei die Steuereinheit dazu eingerichtet ist, den Probenhalter während der

Emission der Lichtquelle längs einer optischen Achse des Detektionsstrahlengangs zu verschieben.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise:

- eine Pausendauer (unter anderem) anhand einer {vom Benutzer) vorgegebenen Belichtungszeit und einer (vom Wandler/vom Benutzer für den Wandler)

vorgegebenen Auslesedauer für alle Detektionselemente ermittelt,

- die Lichtquelle für eine Dauer einer (vom Benutzer) vorgegebenen Belichtungszeit zur periodisch gepulsten oder kontinuierlichen ersten Emission von Licht mindestens einer vorgegebenen Wellenlänge (und danach zum Beenden der Emission) gesteuert und synchron zu einem Beginn der ersten Emission für eine erste

Integrationsdauer der (integrationsauslösenden) Eingang des Wandlers gesetzt (und nach Ablauf der ersten Integrationsdauer zurückgesetzt),

- die Pausendauer abgewartet und

- die Lichtquelle für die Dauer der Belichtungszeit zu einer mit der ersten Emission (spektral und in ihrem zeitlichen Intensitätsverlauf) übereinstimmenden zweiten Emission {und danach zum Beenden der Emission) gesteuert und synchron zu einem Beginn der zweiten Emission für eine zweite Integrationsdauer der

(integrationsauslösenden) Eingang des Wandlers gesetzt (und nach Ablauf der zweiten Integrationsdauer zurückgesetzt).

Wiederum sind solche Ausführungsformen besonders bevorzugt, in denen die zweite Integrationsdauer länger als die erste Integrationsdauer ist, wobei die Pausendauer kürzer ist als eine Auslesedauer für alle Detektionselemente abzüglich der zweiten Integrationsdauer, so dass die zweite Integration beendet wird, nachdem oder zumindest sobald der Wandler das Auslesen der Detektionselemente beendet hat.

In einer speziellen Ausführungsform können die erste Integrationsdauer und die zweite Integrationsdauer gleich lang und die Pausendauer kürzer als eine Dauer einer Auslesedauer für alle Detektionselemente und mindestens, insbesondere genau, gleich der Auslesedauer für alle Detektionselemente abzüglich der

Belichtungsdauer sein. Die Erfindung umfasst auch ein Computerprogramm und eine Steuereinheit, die jeweils zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Verfahrensansprüche eingerichtet sind.

Die Steuereinheit kann beispielsweise zur Durchführung der beschriebenen Schritte eingerichtet sein, Indern sie programmtechnisch entsprechend konfiguriert ist.

Insbesondere kann zu jedem Schritt ein entsprechendes Softwaremodul eingerichtet sein.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen: Fig. 1 ein SPI-Mikroskop,

Fig. 2 ein erstes Signaldiagramm und Fig. 3 ein zweites Signaldiagramm.

Sn allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.

Fig. 1 zeigt ein Lichtscheibenmikroskop als Bildaufnahmevorrichtung 1 mit einer Lichtquelle 2, welche einen breitbandigen Laser 2.1 und ein akusto-optisches einstellbares Filter 2.2 zur externen Wellenlängenselektion und Intensitätsmodulation aufweist. Beispielsweise kann der Laser 2.1 in einem Wellenlängenbereich von 450 nm bis 700 nm Lichtpulse mit einer Länge von 20 ps erzeugen. Die

Wiederholrate der Pulse liegt beispielsweise bei 40 MHz. Bei der Ausgangsstrahlung des Lasers 2.1 kann es sich um ein Weißlichtkontinuum handeln, aus dem dann die in der Beleuchtungsstrahlung verwendeten Wellenlängen extern herausgefiltert werden, beispielsweise durch das akusto-optische einstellbare Filter 2.2, oder der Laser 2.1 kann selbst ein geeignetes Mittel zur Wellenlängenselektion und

Intensitätsmodulation beinhalten, wie beispielsweise ein internes akusto-optisches einstellbares Filter oder eine Frequenzkonversionseinheit. Bei dem Laser 2.1 kann es sich um einen faserbasierten Superkontinuum-Laser handeln. In dem Fall, dass der Laser 2.1 selbst Mittel zur Wellenlängenselektion und Intensitätsmodulation

beinhaltet, kann auf das akusto-optische einstellbare Filter 2.2 verzichtet werden. Ein geeigneter Laser ist beispielsweise über die Firma Fianium Ltd. kommerziell

verfügbar.

Die Bildaufnahmevorrichtung 1 umfasst weiterhin einen

Beleuchtungsstrahlengang B, in welchem die von der Lichtquelle 2 erzeugte

Beleuchtungsstrahlung über eine optische Weiche 3, beispielsweise ein

Mikrospiegelfeld, schaltbar entweder in einen linken Zweig B _L oder in einen rechten Zweig B _R gelangt. In den Beleuchtungsstrahlengangzweigen BR/L ist jeweils ein Strahlformer 4 angeordnet, der eine Zylinderoptik 5 sowie Abbildungsoptiken 6 umfasst, welche eine Formung der Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt 7 bewirken. In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann stattdessen die Zylinderoptik 5 und/oder die Abbildungsoptik 6 vor der optischen Weiche 3 im konstanten Beleuchtungsstrahlengangabschnitt B angeordnet sein oder ganz wegfallen, wobei das Lichtblatt 7 dann mittels der Ablenkeinheit 11 erzeugt wird. Insbesondere kann die Zylinderoptik in den Strahlengang ein- und ausschwenkbar sein. Das Lichtblatt 7 ist auf die Probe 8, beispielsweise eine biologische Probe, welche in ein transparentes Gel eingebettet ist, gerichtet und schneidet diese in einer Fokusebene des Beleuchtungsstrahlengangs B. Je nach Stellung der optischen Weiche 3 wird die Probe entweder von der einen Seite (links) oder von der anderen Seite (rechts) beleuchtet.

Die Bildaufnahmevorrichtung 1 umfasst weiterhin einen Detektionsstrahlengang A, in welchem ein Detektionsobjektiv 9 angeordnet ist, über welches von der Probe 8 emittiertes oder gestreutes Probenlicht aufgenommen wird. Die Achse des

Detektionsstrahlengangs A steht im wesentlichen senkrecht auf der Achse des Beleuchtungsstrahlengangs B und insbesondere im wesentlichen senkrecht auf der Schnittebene des Lichtblatts 7 mit der Probe 8. Die Probe 8 wird folglich

näherungsweise nur in einer Ebene beleuchtet. Das Detektionsobjektiv 9 dient der Fokussierung in einer Fokusebene des Detektionsstrahlengangs A. Der

Beleuchtungsstrahlengang B und der Detektionsstrahlengang A sind vollständig voneinander getrennt und kreuzen sich lediglich in der jeweiligen Fokusebene. Es sind auch Anordnungen mit einem abweichenden Winkel zwischen

Detektionsstrahlengang und Beleuchtungsstrahlengang möglich, der beispielsweise zwischen 0" und 90° liegt. Entscheidend für SPIM ist, dass der

Beleuchtungsstrahlengang B und der Detektionsstrahlengang A nicht parallel ausgerichtet sind,

Die Bildaufnahmevorrichtung 1 umfasst weiterhin eine Vorrichtung 10 zur

Positionierung der Probe 8 relativ zu dem Lichtblatt 7 durch Verschiebung des Probenhalters, so dass durch eine Relativbewegung der Probe 8 entlang der Achse des Detektionsstrahlengangs A und/oder relativ zu dem Beleuchtungsstrahlengang B verschiedene optische Schnitte der Probe 8 aufgenommen werden können, welche als Grundlage für dreidimensionale Bilddatensätze dienen können. Die

Relativbewegung kann auch eine Rotation der Probe 8 umfassen. Daneben weist der Beleuchtungsstrahlengang B eine Ablenkeinheit 11 zum Verschieben des Lichtblatts innerhalb der Probe 8 auf, die ebenfalls von der Steuereinheit 15 gesteuert wird.

Der Detektionsstrahlengang A umfasst weiterhin eine Tubuslinse 12, über welche die von dem Detektionsobjektiv 9 erfasste Emissionsstrahlung einem optoelektronischen Wandler 1 , beispielsweise ein CCD-Sensor mit einem globalen elektronischen Verschluss, zugeführt wird. Weiterhin kann in dem Detektionsstrahlengang A ein Emissionsfilter 13 vorgesehen sein, welches über die Probe 8 in den

Detektionsstrahlengang A reflektierte oder gestreute Beleuchtungslichtanteile im Probenlicht blockiert. Das Emissionsfilter 13 ist jedoch nicht für alle Betriebsweisen des Mikroskops erforderlich und ist daher bevorzugt herausnehmbar. Bei einigen Betriebsweisen kann die Erfassung von reflektierter oder gestreuter

Beleuchtungsstrahlung über den Wandler 14 sogar wünschenswert sein.

Die Bildaufnahmevorrichtung 1 umfasst weiterhin eine Steuereinheit 15, die über Signalleitungen 16/17/18/19 mit der Lichtquelle 2, mit dem Wandler 14 und mit der Ablenkeinheit 11 verbunden ist. Die Steuereinheit 15 erzeugt odulationssignale, welche über die Signalleitung 16 an die Lichtquelle 2, dort insbesondere den

AOTF 2.2, übermittelt werden, und Zeitfenstersteuerungssignale zum Auslösen und Beenden der Lichtintegration, welche über die Signalleitung 17 an einen

Signaleingang des Wandler 14 übermittelt werden, und Ablenksignale, welche über die Signalleitung 19 an die Ablenkeinheit 11 übermittelt werden. Der Wandler 14 übermittelt wiederum über die Signalleitungen 18 ein Statussignal über den

Auslesevorgang der Daten aus dem jeweils vorhergehenden Integration und - nach dem Ende des Auslesevorgangs - die digitalisierten Bilddaten an die

Steuereinheit 15,

In Fig. 2 und Fig. 3 sind Signaldiagramme einer Ausführungsform der Bildaufnahme im einfachen Überlappungsmodus (Fig. 2) beziehungsweise im erweiterten

Überlappungsmodus (Fig. 3) dargestellt, in dem der zeitliche Verlauf der über die Signaileitungen 16/17/18/19/20 übermittelten Signale erkennbar ist. Die einzelnen Spuren enthalten von oben nach unten folgende Angaben:

Die Belichtung (schräg schraffiert) und die Integration (horizontal schraffiert), die wie abgebildet vorzugsweise synchron erfolgen, sind zudem durch die Pause der Dauer D2wandier zwischen den beiden Integrationsvorgängen mit der periodischen

Bewegung der Ablenkeinheit 11 synchronisiert. Da der AOTF 2.2 eine gewisse Trägheit aufweist, kann sein Steuersignal 18 gegenüber dem im Wandler 14 integrationsauslösenden und integrationsbeendenden Signal 17 um einen

konstanten Zeitversatz vorgezogen werden, so dass die Pausendauern DIAOTF- _S « und D2 _A0 TF-start um die Anlaufdauer des AOTF kürzer ist als die

Pausendauern D1 Wandler beziehungsweise D2Wandler. Deutlich erkennbar sind die identischen Belichtungsdauern für alle Integrationen. In anderen Ausführungsformen (nicht abgebildet) können die Signale 17 und 18 auch simultan ausgegeben werden. Mit dem ersten Zurücksetzen des Auslösesignals 17 kopiert der Wandler selbständig die Inhalte aller Detektionselemente in den verdeckten Zwischenspeicher und beginnt das Auslesen und Digitalisieren aus dem Zwischenspeicher, was er durch Setzen des Auslesestatus 18 anzeigt.

Im einfachen Überlappungsmodus (Fig. 2) wird zu einem Zeitpunkt, der um eine Belichtungsdauer vor dem Ende des ersten Auslesevorgangs das Auslösesignal 17 für die zweite Integration gesetzt, so dass die zweite Integration von dem Wandler 14 zeitlich überlappend mit dem ersten Auslesevorgang durchgeführt, wird. Das Ende des ersten Austesevorgangs kann die Steuereinheit 15 aus dem Zeitpunkt des ersten Zurücksetzens des Auslösesignals 17 und der für den Wandler 14 feststehenden Auslesedauer ermitteln. Sobald der Wandler 14 den ersten Äuslesevorgang beendet hat und den Auslesestatus 18 zurücksetzt, wird das Auslösesignal 17 zum zweiten Mal zurückgesetzt und so der zweite Auslesevorgang im Wandler 14 angestoßen. Die zweite Integration dauert auf diese Weise genau so lang wie die erste

Integration.

Durch den einfachen Überlappungsmodus kann der zeitliche Abstand zwischen beliebig vielen aufeinanderfolgenden Bildern verringert werden, so dass die mittlere Bildfrequenz (engl,„frame rate") gegenüber regulären Integrations-Auslese-Abfolgen durch (nahezu) nahtlose Auslese-Auslese-Abfolgen bei maximaler Probenschonung erhöht werden kann.

Im erweiterten Überlappungsmodus (Fig. 3) wird das Auslösesignal 17 für die zweite Integration noch früher gesetzt, um den zeitlichen Abstand zur ersten Integration weiter zu verringern. Wieder bleibt das Auslösesignal 17 bis zum Ende des ersten Auslesevorgangs gesetzt. Sobald der Wandler 14 den ersten Auslesevorgang beendet hat und den Auslesestatus 18 zurücksetzt, wird das Auslösesignal 17 zum zweiten Mal zurückgesetzt und so der zweite Auslesevorgang im Wandler 14 angestoßen. Die zweite Integrationsdauer ist dadurch deutlich länger als die erste Integrationsdauer. Aufgrund der identischen Belichtungsdauern sind die Intensitätsund Helligkeitsverhältnisse jedoch vergleichbar mit jenen während der ersten Integration. Durch den erweiterten Überlappungsmodus kann gegenüber dem einfachen

Überlappungsmodus lediglich der zeitliche Abstand innerhalb jeweils eines Paares aufeinanderfolgender Bilder weiter verringert werden (entspricht einer lokalen Erhöhung der Bildfrequenz), während die mittlere Bildfrequenz nicht weiter erhöht werden kann. Die lokale Erhöhung der Bildfrequenz ist für veränderliche Proben, insbesondere für abwechselnd beidseitige Teilbildaufnahmen, aber besonders vorteilhaft. Bei Systemen mit mehr als einem Wandler und geeigneter Aufteilung des Probenlichts, beispielsweise durch Strahlteiler, können noch mehr Bilder (2 x Anzahl der Wandler) kurz hintereinander aufgenommen werden, wenn man die Signale des erweiterten Überlappungsmodus für die einzelnen Kameras entsprechend verzögert.

Dem Benutzer wird von der Steuereinheit 1 5 ein Bedienelement 21 zur Vorgabe der gewünschten Belichtungsdauer, der gewünschten mittleren Bildfrequenz und der gewünschten lokalen Bildfrequenz bereitgestellt. Ist dort die Bildfrequenz höher eingestellt als eine Bildfrequenz, die mit der Auslesedauer (Signal 18 gesetzt) korrespondiert, so verwendet die Steuereinheit 15 den erweiterten

Überlappungsmodus, wenn die lokale Bildfrequenz kleiner als die mittlere

Bildfrequenz eingestellt ist, und ansonsten den einfachen Überlappungsmodus. Die Pausendauer D2wandier (und die abgeleitete Pausendauer D2 _A oTF-start) ermittelt die Steuereinheit beispielsweise anhand der vom Benutzer vorgegebenen

Belichtungsdauer, der vom Benutzer vorgegebenen Bildfrequenz und der

(konstanten, wandlereigenen) Auslesedauer.

Die Erfindung ist nicht nur in SPI-Mikroskopen einsetzbar, sondern in beliebigen Bildaufnahmevorrichtungen, auch in solchen, In denen der

Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang parallel oder gar abschnittsweise koaxial verlaufen. Sie ist auch ohne Ablenkeinheit 1 1 und/oder ohne beidseitige Beleuchtung einsetzbar, wobei die Signale 19 und 20 entfallen. Bezugszeichenliste

1 Bildaufnahmevorrichtung

2 Lichtquelle

2.1 Laser

2.2 AOTF

3 Optische Weiche

4 Strahlformer

5 Zylinderoptik

6 Abbildungsoptiken

7 Lichtblatt

8 Probe

9 Detektionsobjektiv

10 Positioniervorrichtung

11 Ablenkeinheit

12 Tubuslinse

13 Emissionsfilter

14 Wandler

15 Steuereinheit

16 Signal(leitung)

17 Signal(leitung)

18 Signal(leitung)

19 Signal(leitung)

20 Signal(leitung)

21 Bedienelement

A Detektionsstrahlengang

B Beleuchtungsstrahlengang

Dscanner Verzögerung ab Start der Ablenkeinheit

a Totzeit

D1 Wandler Verzögerung bis Auslösen der ersten Integration

Dl AOTF-start Verzögerung bis Einschalten des AOTF für erste Emission DAOTF-ende Verzögerung bis Ausschalten des AOTF

D2wandier Verzögerung bis Auslösen der zweiten Integration

D2AOTF-star _t Verzögerung bis Einschalten des AOTF für zweite Emission L2 _W andier Dunkelintegration

wandier Identische erste und zweite Integrationsdauer

T1 andier Erste Integrationsdauer

T2 _W andier Zweite Integrationsdauer

TAOTF Belichtungsdauer

D3wandier Verzögerung bis dritte Integration

D3AOTF-siart Verzögerung bis Einschalten des AOTF für dritte Emission