Imipramina para uso como inhibidor de la sobreexpresión de la fascina 1

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los productos medicinales, en particular a los productos terapéuticos contra el cáncer.

Estado de la técnica anterior a la invención.

La identificación de dianas moleculares es uno de los mayores avances en el tratamiento reciente del cáncer. Estas terapias tienen como objetivo bloquear proteínas específicas que se alteran en el cáncer y son responsables del fenotipo tumoral. La metástasis tumoral sigue siendo la principal causa de mortalidad por cáncer (Chen, Yang, Jakoncic, Zhang, & Huang, 2010) y la adquisición previa de capacidad invasora es un requisito previo para que las células de carcinoma tengan acceso a los vasos y se diseminen por todo el cuerpo. Este proceso implica un reordenamiento del citoesqueleto de actina que permite que las células tumorales desarrollen protuberancias celulares, como filopodios e invadopodios, que contribuyen a la migración, invasión y metástasis de las células cancerosas (Machesky & Lia., 2010). La fascina 1 es una proteína clave en la formación de filopodios e invadopodios, ya que posee actividad de unión a actina y de agolpamiento de actina mediante la reticulación de actina filamentosa en paquetes paralelos estrechamente empaquetados. La fascina 1 está ausente en la mayoría de los epitelios normales, pero se expresa en muchos carcinomas humanos (Hashimoto, Kim, & Adams, 2011) y varios estudios anteriores han citado a esta proteína como un biomarcador candidato para carcinomas agresivos. De hecho, varios estudios que incluyen un metaanálisis han demostrado que la expresión de la fascina 1 está asociada con un aumento de los ganglios linfáticos y la metástasis a distancia, la progresión de la enfermedad y la mortalidad en el cáncer colorrectal y de mama (Tan, Lewis, Adams, & Martin, 2013).

El cáncer colorrectal (CRC) es la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en hombres y mujeres en los Estados Unidos. Hay varias formas de tratar el cáncer colorrectal, dependiendo de su tipo y etapa. Como regla general, el tumor localizado se reseca si no hay metástasis a distancia o complicación. Si hay afectación ganglionar, se puede administrar quimioterapia y, en caso de cáncer rectal, se recomienda la terapia con radioterapia (neoadyuvante) antes del tratamiento. Si existe metástasis a distancia, la quimioterapia y los anticuerpos monoclonales son el tratamiento clave asociado con la radioterapia y/o cirugía en algunas ocasiones.

Hay tres tipos de terapia farmacológica en el cáncer:

a) Quimioterapia, que se dirige a las células en proliferación, incluidas, entre otras, las células cancerosas. La quimioterapia común en el CRC incluye 5-fluorouracilo, capecitabina, oxaliplatino, irinotecán y raltitrexed.

b) Inmunoterapia, que se dirige a moléculas alteradas específicas en el cáncer mediante anticuerpos monoclonales (MAbs) o proteínas de fusión recombinantes e incluye cetuximab, panitumumab, bevacizumab y aflibercept. Cetuximab y panitumumab son Mabs dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que solo son útiles en aquellos CRC sin mutación en oncogenes KRAS, NRAS y BRAF. El bevacizumab, a su vez, es un MAb contra el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A). Aflibercept es una proteína de fusión contra VEGF-A y VEGF-B. Finalmente, el pembrolizumab es un MAb contra el punto de control inmunitario y es efectivo en aquellos CRC que muestran Inestabilidad a microsatélite (MSI)

c) Los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) se administran por vía oral y en el CRC están representados por regorafenib que ha demostrado ser eficaz en el CRC metastásico resistente a las terapias estándar.

El adenocarcinoma serrado (SAC) ha sido reconocido recientemente en la última clasificación de la OMS de tumores del sistema digestivo como un nuevo subtipo de CRC (Hamilton, 2010). Los criterios para su diagnóstico histológico han sido propuestos y recientemente validados en una serie de 81 casos. La frecuencia de SAC varía de 7.5 a 8.7% de todos los CRC y se ha demostrado que tiene un peor pronóstico que el carcinoma convencional (CC). En consecuencia, el SAC muestra una mayor frecuencia de características histológicas adversas en el frente invasivo que incluyen brotes tumorales de alto grado y pseudofragmentos citoplásmicos, patrón de crecimiento infiltrante y débil respuesta de linfocitos peritumorales. Más recientemente, un estudio inmunohistoquímico sobre moléculas de adhesión ha demostrado un patrón de expresión diferente de SAC en comparación con CC. De acuerdo con la evidencia previa, dos estudios previos en estudios de perfiles de ARNm, incluido el nuestro, han revelado que SAC mostró una mayor representación de la activación de las funciones relacionadas con el transporte de morfogénesis, hipoxia, citoesqueleto y vesículas y también la sobreexpresión de HIF-1 a (un factor inducible por la hipoxia), el gen antiapoptótico hippocalcina y fascina 1 (proteína que contiene actina asociada con la invasión) en comparación con el carcinoma convencional (CC) (Conesa-Zamora et al., 2013; Laiho et al., 2007; Tuomisto et al., 2016). Además, se encontró que la fascina 1 era el marcador más discriminador para distinguir SAC de CC con una sobreexpresión inmunohistoquímica en el primero de 88.6% en comparación con 14.3% en CC. Incluso los tumores que muestran características histológicas y moleculares de la inestabilidad de microsatélite mostraron una expresión de la fascina 1 más baja que SAC (50%) y los ensayos de qPCR que analizan la expresión de la fascina 1 en estos subtipos de CRC también confirmaron estos hallazgos (Conesa-Zamora et al., 2013). Dado el papel causal de la fascina 1 en el fenotipo invasor de las células tumorales y su sobreexpresión asociada con una peor supervivencia en una amplia variedad de tipos de cáncer (Tan et al., 2013), incluidos muchos sin terapia molecular adaptada como carcinoma de mama triple negativo, es obligatorio para obtener eficientes bloqueadores de la fascina 1. En esta línea, la migrastatina y sus análogos de la macrocetona se consideran inhibidores típicos de la fascina 1 , disminuyendo así la migración de las células tumorales metastásicas, la invasión y la metástasis tumoral (Chen et al. , 2010) a pesar del hecho de que su estructura compleja dificulta el proceso de síntesis. Algunos autores han reportado una actividad anti-fascina 1 , a nti migratoria y antiinvasiva para compuestos derivados de i ndazo l-fura n- carboxamidas (Flan et al., 2016).

El documento WO2015127125 (A1) proporciona compuestos de fórmula general.

composiciones y métodos para inhibir la actividad de fascina 1 o tratar una afección o trastorno mediado por la actividad de fascina 1 en un sujeto que así lo requiera.

Partiendo de esto, existe una necesidad urgente de identificar otro tipo de fármacos con una actividad novedosa antifascina 1.

Dos estudios independientes, incluido el nuestro sobre la población finlandesa y española, han demostrado que los SAC muestran una mayor frecuencia de mutaciones KRAS y BRAF en comparación con el adenocarcinoma colorrectal convencional (García-Solano et al., 2012; Stefanius et al., 201 1), lo que hace que SAC sea más resistente a la terapia anti-EGFR en la cual se obtiene la efectividad cuando KRAS y BRAF no están mutados. Además, los SAC son en su mayoría estables a microsatélite y, por lo tanto, no pueden beneficiarse de los inhibidores del punto de control inmunitario, como el pembrolizumab. Dada la alta expresión de la fascina 1 en SAC y el papel causal de la fascina 1 en la invasión y la metástasis, se ha encontrado que la imipramina es útil para tratar SAC y otros tumores que sobreexpresan fascina 1.

La imipramina es un antidepresivo y un compuesto aprobado por la FDA para el tratamiento de la depresión.

De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que la imipramina es un compuesto que es eficaz en el tratamiento de CRC; y preferiblemente en el tratamiento de adenocarcinoma serrado. La imipramina es un compuesto que es eficaz en el tratamiento de tumores que sobreexpresan fascina 1.

Descripción de la invención.

La presente invención se refiere a la imipramina para su uso como inhibidor de la sobreexpresión de la fascina 1.

La imipramina es el compuesto denominado 3-(10, 11 -dihidro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-il)-N,N-dimetilpropan-1 -amina, de fórmula química de C ₁₉ FI ₂ N ₂ .

De acuerdo con la presente invención, preferiblemente, la sobreexpresión de la fascina 1 está asociada a la presencia de cáncer.

De acuerdo con realizaciones particulares de la invención, el cáncer es cáncer colorrectal.

De acuerdo con una realización preferida, el cáncer colorrectal es un adenocarcinoma serrado.

De acuerdo con una realización preferida adicional, el cáncer colorrectal es cáncer colorrectal metastásico.

La presente invención también se refiere a una composición que comprende imipramina para uso como inhibidor de la sobreexpresión de la fascina 1 .

La presente invención también se refiere a un método para tratar el cáncer mediado por fascina 1 que comprende administrar a un sujeto que así lo requiera una cantidad eficaz de imipramina. Como se usa en este documento, "tratar" significa uno o más de prevenir, curar, administrar, revertir, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir o detener los efectos perjudiciales de las enfermedades descritas anteriormente.

De acuerdo con realizaciones particulares del método, la fascina 1 está sobreexpresada. De acuerdo con realizaciones particulares del método, el cáncer es cáncer colorrectal.

De acuerdo con las realizaciones preferidas del método, el cáncer colorrectal es un adenocarcinoma serrado.

De acuerdo con realizaciones preferidas adicionales del método, el cáncer colorrectal es cáncer colorrectal metastásico.

El cáncer colorrectal también puede seleccionarse entre tumores del estroma gastrointestinal, leiomiosarcomas o melanomas.

Breve descripción de los dibujos.

La Figura 1 muestra los modelos farmacofóricos para la imipramina estimados utilizando el Software LigandScout.

La Figura 2 muestra el ensayo de fluorimetría diferencial de barrido. (A). Curvas derivadas te rmoflu oro métricas que permitieron establecer una concentración fascina 1 a 2 mM. (B). Representación que muestra que la imipramina estabilizó la fascina 1 con una continuidad significativa de Tm alrededor de 2 ^o C en réplicas y utilizando diferentes sondas de fluorescencia.

La Figura 3 muestra los niveles de expresión de ARNm de la fascina 1 en ocho líneas celulares colorrectales utilizando una expresión génica de b-actina para normalizar los datos. FICT-1 16 y SW-480 muestran la expresión de la fascina 1 más alta, mientras que LOVO, DLD-1 y FIT-29 muestran la más baja.

La Figura 4 muestra el ensayo de viabilidad de la línea celular colorrectal. El efecto de la migrastatina (A); Se muestra la imipramina (B) sobre la viabilidad celular de las líneas celulares colorrectales DLD-1 , FICT-1 16 y SW480.

La Figura 5 muestra la inmunofluorescencia de la fascina 1 en dos líneas celulares; FICT-1 16 y una línea celular no tumoral derivada de la línea celular de queratinocitos FlaCaT. Muestra la inmunofluorescencia de la fascina 1 sobre la inhibición de la formación de filopodios.

La Figura 6 muestra la inhibición de tres líneas celulares por imipramina y migrastatina A) FICT-1 16, B) DLD-1 , C) SW- 480, D) La migración se calculó con respecto a las condiciones de control en fase lineal.

La Figura 7 muestra cómo la migrastatina y la imipramina inhiben la capacidad invasiva de las células.

La Figura 8 muestra cómo la imipramina inhibe tanto la profundidad (B) como el área (C) de la invasión de FICT-1 16 en comparación con el control (exento de migrastatina) en un modelo de invasión organotípica de Myoma (A).

Figura 9. Ensayos de invasión en peces cebra. (A) Las imágenes de la derecha muestran la localización de las células de cáncer colorrectal inyectadas (DLD-1 y FICT-1 16) en el saco vitelino de las larvas de pez cebra (flechas). Las imágenes de la izquierda muestran la migración e invasión de células cancerosas a lo largo de la cola, fuera del saco vitelino (flechas). (B) El efecto de la imipramina (IMP) en la disminución de la invasión celular es evidente en comparación con el control.

Ejemplos

Con el objetivo de encontrar nuevos compuestos anti-fascina 1 , llevamos a cabo un flujo de trabajo similar a un embudo en donde la criba de la biblioteca de compuestos in silico entregó moléculas seleccionadas por su potencial para unirse a fascina 1 , las cuales se evaluaron posteriormente in vivo mediante un ensayo fisicoquímico por su interacción real con fascina 1 . Los compuestos que se unen a fascina 1 se probaron en líneas celulares colorrectales para determinar su actividad a fin de evitar tanto la formación de lamelipodios como la localización de fascina 1 en estas estructuras de actina. Posteriormente, se realizó el ensayo de migración e invasión utilizando líneas celulares de cáncer colorrectal para probar la actividad de los compuestos, incluido el uso de un modelo de invasión organotípica de mioma en donde se usó un tejido estromal de tumor humano benigno para sembrar células de cáncer colorrectal con el fin de probar su grado de invasión y el efecto de los inhibidores de fascina 1 . Finalmente, se utilizó un modelo animal vivo de larvas de pez cebra para evaluar la invasión del tumor. Todos estos experimentos que se explican a continuación confirman que la imipramina es un compuesto con actividad de unión a fascina 1 y con efecto antimigratorio y antiinvasión en ensayos in vitro e in vivo.

Criba virtual

Se aplicaron técnicas de criba virtual para proponer compuestos que podrían tener mejores propiedades inhibitorias de fascina 1 que la migrastatina. Se aplicó un modelado farmacofórico al núcleo de la estructura de la migrastatina (MGS_CORE), previamente caracterizado como se puede ver en la siguiente fórmula:

Un modelo de farmacóforo basado en ligando se derivó de MGS_CORE utilizando el programa Ligand Scout (LS) (Gerhard Wolber, 2005). Este modelo se evaluó contra un subconjunto de la biblioteca DrugBank (versión 5.0; de 9,591 compuestos, incluidos 2,037 aprobados por la American Food and Drug Administraron (FDA), 96 nutracéuticos y 6000 experimentales) después del ajuste fino en una concertación de Cómputo de Alto Rendimiento (FIPC) de todos los programas necesarios relacionados del paquete LS. A partir de los cálculos resultantes y después de una inspección visual cuidadosa de los resultados y teniendo en cuenta los conocimientos previos de la literatura, se seleccionó la molécula de imipramina para su posterior validación experimental. En la Figura 1A se representa el modelo de farmacóforo para la imipramina. Se muestra un diagrama 2D de características farmacofóricas coincidentes entre MGS e imipramina. La alineación 3D de MGS (gris oscuro) e imipramina (gris claro) se muestra en la Figura 1 .B.

Termofluor

Los ensayos de Fluorimetría Diferencial de Barrido (Termofluor) se realizaron utilizando un sistema de CFX96 RT- PCR con Touch Thermal Cycler Biorad C1000 en un formato de 96 pocilios. Se prepararon mezclas de reacción de 25 pL que contenían fascina 1 2 pM (cat. No. 8411-02, Flypermol, Bielefeld, Alemania) en Flepes 20 mM, NaCI 150 mM, DTT 1 mM y sacarosa al 5% a pH 7.4, en presencia de SYPRO Orange (dilución de 1000 veces de la solución madre comercial (Invitrogen) La Figura 2A muestra las curvas derivadas termofluorométricas que permitieron establecer una concentración de fascina a 2 pM. La Figura 2B es una representación que muestra que la imipramina estabilizó la fascina 1 con una Tm significativa con continuidad alrededor de 2° C en réplicas y utilizando diferentes sondas de fluorescencia.

La imipramina se preparó a 10 mM en DMSO al 100% y se añadió a cada pocilio hasta una concentración final de 1 mM y DMSO al 10%. Se incluyeron tres réplicas con seis controles internos, que contenían solo proteína libre en DMSO al 10%, en las placas de 96 pocilios. Las placas de POR se cubrieron y posteriormente se agitaron, se centrifugaron, se incubaron durante 2 minutos a 20 °C dentro de la máquina de RT-PCR y se calentaron de 20 a 100°C a una velocidad de barrido de 1 °C/min. Los perfiles de desnaturalización térmica de fascina 1 se obtuvieron registrando la intensidad de fluorescencia para los filtros predefinidos FAM, HEX y T-Red. El derivado de la curva de fluorescencia se usó para determinar TM. Los cambios en TM asociados a la unión del ligando se estimaron tomando el valor promedio de Tm derivado de los controles internos de la proteína libre.

Titulación por fluorescencia

Se dializó extensivamente Fascina 1 contra el regulador apropiado antes de cada experimento de titulación. La concentración de la fascina 1 se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 67840 cm-T M-1. Los experimentos de titulación de fluorescencia se realizaron en un espectrofluorímetro Cary Eclipse (Varian Inc.). Se valoró una solución de fascina 1 15 mM (14.7 pM) con cada compuesto al agregar volúmenes crecientes de soluciones concentradas. Los espectros de emisión se registraron entre 307 y 500 nm a 25°C en DMSO al 10%, NaC1 100 mM, Flepes 20 mM, pH 7.4, con la longitud de onda de excitación fijada a 280 nm. Las isotermas de unión se generaron utilizando los cambios en el área espectral o en el centro de masa (CM) espectral, dependiendo de si el cambio fue solo en la intensidad de la fluorescencia o también en la longitud de onda de emisión máxima.

Las curvas resultantes se ajustaron utilizando ORIGIN 7.0 (Microcal Inc.) y un modelo de unión en equilibrio de un sitio, de acuerdo con la siguiente ecuación: Ff y Fb son la señal de fluorescencia (área o CM) de la fascina 1 libre y unida, y PT y LT son la concentración total de proteína y ligando, respectivamente, en cada punto de adición.

Los valores de Tm se midieron como el mínimo de la primera derivada del perfil de despliegue térmico. Se obtuvieron valores promedio de Tm para la fascina 1 no unida para cada filtro interno (FAM, FIEX y T-Red) como referencia para la determinación de los cambios en Tm en la unión del compuesto (Tm, FAM = 55.6 ± 0.5 °C, Tm, FIEX = 56.0 ± 0.0°C, Tm, Tred = 56.2 ± 0.6°C, donde los valores de error corresponden a la desviación estándar para las siete réplicas incluidas en cada placa como controles internos).

Los resultados del Ensayo de Desplazamiento Térmico se resumen en la Tabla 1. Algunos compuestos produjeron perfiles de despliegue térmico distorsionados de los cuales no se pudieron extraer valores de Tm confiables, probablemente debido a la interferencia del compuesto con la señal de fluorescencia de Sypro. Dentro de los que pudieron analizarse, la imipramina produjo de manera consistente un aumento significativo de Tm, de aproximadamente 2°C, lo que sugiere una unión específica a la fascina 1 (Figura 2B). La unión de estos compuestos a fascina 1 se validó in vitro utilizando experimentos de titulación de fluorescencia, lo que produjo constantes de disociación en el rango microMolar alto (Kd = 390 mM para imipramina).

Tabla 1 : Resultados del Ensayo de Desplazamiento Térmico

Cultivo de células

Se obtuvieron tres líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal humano de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD): HCT 116, SW480 y DLD1. Las líneas celulares se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa que contenía un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor

(FBS), 50 U/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina (Sigma Aldrich Chemical Co., Estados Unidos) en una atmósfera de 5% de C0 ₂ y 95% de aire humidificado a 37°C. Se realizó subcultivo cuando se obtuvo un 90% de confluencia. La expresión del gen de fascina 1 se midió siguiendo el protocolo descrito previamente [Conesa-Zamora IJCj. El ARN se extrajo tratando los sedimentos de líneas celulares alrededor de 200000 células con 700 pl de Qiazol (Qiagen ref: 1023537) y agregando 140 pl de cloroformo y centrifugando a 12000 g durante 15 minutos a 4°C. La fase acuosa que contenía 350 mI se sometió luego a una extracción automática total de ARN utilizando el equipo Qiacube y el mini Kit miRNeasy (ref: 217004), ambos proporcionados por Qiagen. El ADNc se obtuvo utilizando el kit de síntesis de ADNc Maxima First Strand para RT-qPCR por Thermo Fisher (número de catálogo K1671) siguiendo la información del fabricante. Se agregaron cinco microlitros de ADNc diluido 1 : 5 a la reacción de qPCR que contenía 12.5 pl de 2X QuantiTect SYBR Green PCR Kit (ref: 204145) de Qiagen y 300 nM de cada cebador en un volumen total de 25 mI. El qPCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real 7500F por Applied Biosystems (FosterCity, CA, Estados Unidos) de acuerdo con el manual de instrucciones y siguiendo el protocolo estándar: 50°C 2 min, 95°C 10 min, 40 ciclos de 95°C 15 sec, 60°C 1 min y una etapa de curva de fusión que consiste en 95°C 15 segundos, 60°C 1 min, 95°C 30 segundos y 60°C 30 segundos. La cuantificación relativa se realizó mediante el método 2-ACt usando b-actina como gen de mantenimiento. Las cantidades de ARNm se dan como número de copias por millón de copias de b-actina. Los cebadores de b-actina utilizados para la cuantificación de FSCN fueron 115F y 116R, mientras que los de FIPCA y DAG1 fueron b-a-blgF y b-a-blgR.

Tabla 2. Secuencias de cebadores utilizadas para la validación por PCR cuantitativa (Gen, Nombre del cebador, Secuencia del cebador (5 ^' -3 ^' ), tamaño del fragmento (pb).

Con el fin de elegir líneas celulares colorrectales con expresión de la fascina 1 endógena más alta y más baja, se realizó una RT-qPCR sobre ARN extraído de ocho líneas celulares. La Figura 3 ¡lustra cómo HCT-1 16 y SW-480 muestran la expresión de la fascina 1 más alta, mientras que LOVO, DLD-1 y HT-29 muestran la más baja. Dada la facilidad para el cultivo celular y la morfología adecuada con citoplasma prominente para inmunofluorescencia, en la evaluación de la migración y la invasión, seleccionamos las líneas celulares DLD-1 , SW-480 y HCT-1 16 en los ensayos posteriores.

Ensayo de viabilidad celular

Se sembraron células en crecimiento exponencial por triplicado en placas de 96 pocilios de fondo plano (Nunc, Roskilde, Denmark) a 1200 células/pocillo. Al día siguiente, se agregaron los fármacos en dilución en serie de 5100 nM a 3100 mM. Los pocilios de control contenían medio sin fármaco más DMSO al 0.1 %. Las placas se incubaron durante 3 días en una incubadora humidificada con C0 ₂ al 5% y se analizaron para determinar la viabilidad celular. Se añadió a las células tetrazolio (MTT) disuelto en solución salina regulada con fosfato (PBS), pH 7.2, a 1 .9 mg/mLI (30 mI/pocillo). Después de la incubación a 37°C durante 4 h, se aspiró el medio. Los cristales de formazán se disolvieron en 200 mI de dimetilsulfóxido (DMSO) durante 30 minutos y se leyó la absorbancia a 570 nm en un lector de placas de microtitulación. Los resultados se calcularon como: viabilidad celular (%) = promedio O.D. de pocillos/promedio O.D. de los pocilios de control 1 . La concentración inhibitoria del 50% (IC50) para un fármaco particular se definió como la concentración que produce una disminución del 50% en el crecimiento celular. La Figura 4 muestra el efecto de la migrastatina (A) y la imipramina (B) sobre la viabilidad celular de las líneas celulares colorrectales DLD-1 , FICT-1 16 y SW480. De acuerdo con los datos presentados en la Figura 4, la concentración de trabajo de imipramina y migrastatina se estableció para estudios in vitro posteriores a 20 mM y 100 pM, respectivamente.

Inmunofluorescencia

Con el fin de evaluar el efecto de la imipramina en la localización de la fascina 1 y la formación de lamelipodios, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia. Se sembraron cubreobjetos redondos (Thermo Fisher, Waltham, MA Estados Unidos) con la línea celular FICT1 16 en presencia de FBS al 10%. Una vez que las células alcanzaron el 100% de confluencia, se eliminó el medio suplementado con suero y se reemplazó con medio fresco sin suero durante 24 h. Se realizó herida artificial pasando transversalmente una hoja de afeitar esterilizada en el área central de los cubreobjetos. Luego se colocaron los cubreobjetos en una placa de 6 pocilios con 2 mL de suero libre de DMEM y migrastatina 100 mM, imipramina 20 mM, factor de crecimiento epidérmico (EGF) 10 ng/ml e inhibidor de MEK PD98059 50 mM (MEKi) (ambos de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos) por 24h. Luego, las células se fijaron con Bouin (para proteína fascina 1) o formaldehído al 4% (para proteína actina) y, posteriormente, se permeabilizaron en una solución de Tritón X-100/PBS al 0.3%, y luego se expusieron a un regulador de bloqueo durante 30 min. Las muestras se incubaron durante 1 h con anticuerpo anti-fascina 1 (1/250) (clon 55K-2; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania) o anticuerpo anti-b actina (1/1000) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos) en una cámara húmeda.

Los anticuerpos primarios marcados con fluorescencia apropiados se incubaron más tarde con Alexa flúor 488 conjugado anti-lgG de ratón (de asno) (1/400) o faloidina marcada con Alexa flúor 594, respectivamente (1/1000) (Molecular Probes, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Estados Unidos) y Floechst 33258 (Fluka, Biochemika, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos) durante 30 minutos a temperatura ambiente y oscuridad. Las muestras se examinaron y se tomaron imágenes representativas con un microscopio confocal (LSM 510 META de ZEISS, Jena, Alemania). El efecto de la imipramina sobre la localización de fascina 1 y la reorganización del citoesqueleto de actina, que incluye la protrusión del lamelipodio en la formación de filopodios frente a células y la localización de la fascina 1 , se evaluó mediante inmunofluorescencia. La Figura 5 muestra la inmunofluorescencia de la fascina 1 en dos líneas celulares; la línea celular que expresa un nivel más alto de la fascina 1 , FICT-1 16 y una línea celular no tumoral derivada de la línea celular de queratinocitos FlaCaT, que se usó como control de la tinción con inmunofluorescencia. Se observó una prominente formación de filopodios lamelipodio en las condiciones de control y para las células tratadas con MOCK y EGF, mientras que estas estructuras de citoesqueleto estaban ausentes en aquellas células tratadas con migrastatina e imipramina de manera similar a lo observado con el inhibidor de la migración dirigido a la ruta de Mek, PD98059.

El número de protrusión de lamelipodios se calculó en las diferentes condiciones, siendo significativamente más bajo después de los tratamientos con migrastatina e imipramina (datos no mostrados).

En la Figura 5 se muestra la morfología celular de FICT-1 16 y FlaCaT (como ejemplo de células que forman protuberancias citoplásmicas) después de la inhibición de la formación de filopodios. El recuadro muestra el análisis de inmunofluorescencia del marcador de fascina de los filopodios (protrusionesverdes indicadas en flechas) en condiciones de control, migrastatina 100 uM, imipramina 20 mM y 100 ng/ml de Factor de Crecimiento Epidérmico (estimulador de la migración). Las imágenes se capturaron con un microscopio de fluorescencia confocal LSM 510 META con objetivo de aceite 63X. La migrastatina y la imipramina inhiben la protrusión de lamelipodios (flechas) y, por consiguiente, la localización de la fascina 1.

Ensayo de migración celular Con el objetivo de descubrir si el efecto observado de los inhibidores de la fascina 1 sobre la protrusión de la formación de filopodios lamelipodio tiene un efecto cuantificable sobre la migración celular, se investigaron el estado basal de MOCK, y células tratadas con migrastatina o imipramina para determinar su actividad de migración después de 4 a 7 horas de raspado in vitro.

La Figura 6 muestra el ensayo de migración celular para las tres líneas celulares A) HCT-1 16, B) DLD-1 , C) SW-480, D). La migración se calculó con respecto a las condiciones de control para una pendiente entre 4 y 7 h (fase lineal). ^* p<0.05, ^** p<0.01 . Como se muestra en la Figura 6, la imipramina produce una notable inhibición de la migración en todas las líneas celulares analizadas (p<0.05). Excepto para SW-480, el efecto de la imipramina fue más pronunciado que la migrastatina, especialmente para la DLD-1 . La migración celular se estudió con las tres líneas celulares realizando el ensayo de cicatrización de heridas en presencia de FBS al 5%. Se colocaron células colorrectales de cáncer (50,000 células) en placas bajas de 35 mm con insertos de cultivo (Ibidi, Martinsried, Alemania). Después de la unión celular adecuada y la formación de monocapa (alrededor de 24 h), los insertos se eliminaron con pinzas estériles para crear un campo de herida de aproximadamente 500 pm, según el protocolo del fabricante. Las células separadas se eliminaron suavemente con solución salina regulada con fosfato (PBS, Dubelco) antes de la adición de fármacos. Las células confluentes se incubaron en uno de los siguientes tratamientos: migrastatina 100 pM (AnalytiCon Discovery, cat. No. NP-006108), e imipramina 20 pM ((adquirida a través de Molport, Letonia) y placas de control que se incubaron en presencia de DMSO al 0.1 %. Luego se dejó que las células migrasen en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas. A las 0, 3, 5 y 7 horas (fase de crecimiento lineal), se fotografiaron 10 campos del área de la lesión con un microscopio invertido y de contraste de fases con ampliación a x10 que incorporaba una cámara CCD. Para cada punto de tiempo, el área no cubierta por las células se determinó mediante un análisis de software de procesamiento de imágenes libre con el programa de software Image J.

La velocidad de migración del cierre de la herida se da como el porcentaje del área recuperada en cada punto de tiempo, en relación con el área inicialmente cubierta (0 h). La velocidad de cierre de la herida (% /h) se calculó de acuerdo con la fórmula: Pendiente (%/h) = ((% de área cubierta t_x)-(% de área cubierta t_0))/((t_x-t_0)). Las pendientes se expresan como porcentajes relativos a las condiciones de control.

La Tabla 3 muestra la reducción en la migración tras el tratamiento con migrastatina e imipramina en líneas celulares de cáncer colorrectal DLD1 , SW-480 y FICT-116.

Ensayo de invasión Transwell

La invasión de células tumorales no solo involucró la adquisición de propiedades de migración sino también la capacidad de degradar la matriz extracelular (ECM). Por esa razón, se realizó un ensayo Transwell en Matrigel que se parece a la composición de ECM. Las capacidades invasivas de las células HCT1 16 se determinaron utilizando el ensayo de invasión de células de 24 pocilios Cytoselect TM (Formato colorimétrico de membrana basal) con cámaras Transwell recubiertas (tamaño de poro de 8 pm). En resumen, las células se resuspendieron con medio sin suero y se trataron con los inhibidores correspondientes (migrastatina 100 pM e imipramina 20 pM). Se sembraron células (9.5 x 10 ⁴ ) en la cámara superior, y en la cámara inferior se agregaron 500 pL de DMEM que contenía FBS al 10%. Después de 30 horas de incubación, las células que quedaron en la cámara superior se rasparon con un hisopo de algodón y las células que migraron al fondo del filtro se tiñeron con la solución de tinción de células. El número de células invadidas se fotografió bajo un microscopio de contraste de fases invertido y se cuantificó D.O.D mediante un espectrofotómetro a l=560 nm. También se analizaron las células invasoras utilizando el software Image J. La Figura 7 muestra el ensayo de invasión de Transwell realizado para evaluar la capacidad invasiva de las células FICT116. A) Invasión de células después del tratamiento con diferentes fármacos. Las imágenes fueron tomadas bajo un microscopio de contraste de fases invertido. El aumento fue de x200 y las barras de escala = 50 pm. B) Cuantificación de las células invasoras D.O. por un espectrofotómetro a l = 560 nm. C) Número de células invasivas que utilizan el software Image J. Los datos se presentan como media ± SD; en comparación con el control ^* P<0.01 .

Como se muestra en la Figura 7, tanto la migrastatina como la imipramina inhiben la migración de células tumorales de HCT-116, siendo ligeramente más evidente el efecto de la imipramina que el de la migrastatina.

Modelo de invasión organotípica de mioma.

Para mejorar la confiabilidad del modelo experimental en comparación con el microentorno del tumor real, la invasión de células cancerosas se evaluó en los cultivos organotípicos de mioma y se realizó de acuerdo con el modelo de mioma publicado anteriormente (Ástróm, P., Heljasvaara, R., Nyberg, P., Al-Samad¡, A., y Salo, 2018). Brevemente, los tejidos del leiomioma uterino se obtuvieron de una cirugía de rutina después del consentimiento informado de los donantes y su uso fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Oulu. El tejido del mioma se cortó en 5 mm y los discos se hicieron con un punzón de biopsia de 8 mm (Kai Industries Co., Gifu, Japan). Los discos de mioma se preincubaron en 100 mM MGS, 10 pM y 20 pM de imipramina o 0.1 % de DMSO-DMEM a +4°C durante 48 h. Los discos de mioma se colocaron en los insertos Transwell (diámetro 6.5 mm; Corning Incorporated, Corning, NY) y se agregaron 700,000 células en 50 pl de medio sobre cada disco de mioma. Se dejó que las células se unieran durante la noche y los discos de mioma se transfirieron a discos de nylon sin recubrimiento que descansaban sobre rejillas de acero curvadas en placas de 12 pocilios con placas de 12 pocilios con 1 ml de medio más migrastatina e imipramina en cada pocilio. Se dejó que las células cancerosas invadieran los discos de mioma durante 14 días, mientras se cambiaban los medios de tratamiento cada 3 días. Posteriormente, los discos de mioma se fijaron con formalina regulada neutra al 4% a temperatura ambiente durante 24 h, y se procesaron para histología. Se cortaron secciones de seis pm y se tiñeron con citoqueratina AE1/AE3 (M3515, Dako). Las secciones se documentaron con un aumento de ^c 10, utilizando la cámara DFC 480 del microscopio Leica DMRB con el paquete de aplicaciones Leica v3.8 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Se utilizó Image J v1 .46o (National Institute of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos) para medir las áreas de invasión y las profundidades. Cada tratamiento se realizó por triplicado. La Figura 8 muestra el modelo de invasión organotípica de mioma que muestra el efecto de la imipramina en la línea celular colorrectal HCT-1 16 (A) sobre la profundidad (B) y el área (C) de la invasión. Como se muestra en la Figura 8, la imipramina inhibe tanto la profundidad como el área de invasión de HCT-1 16 en comparación con el control en una medida comparable a la migrastatina.

Ensayo in vivo en el modelo de invasión de peces cebra

Finalmente, para averiguar si las propiedades antiinvasivas de la imipramina podrían ser extrapolabas a un sistema animal, se utilizó el bien establecido modelo de invasión de larvas de pez cebra. Se realizó un ensayo de xenoinjerto tiñendo con CM-Dil fluorescente (Vibrant, Invitrogen) dos líneas celulares de cáncer colorrectal (DLD-1 y HCT-1 16) y se inyectó en peces cebra. El resultado obtenido se refiere al porcentaje de invasión celular.

La Figura 9 muestra la migración de líneas celulares de cáncer colorrectal que se pueden visualizar en las larvas de peces cebra. Inyección y migración de diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal en el modelo de pez cebra (A). Dos líneas celulares de cáncer colorrectal (DLD-1 y HCT-166) se trataron con migrastatina e imipramina y se inyectaron en larvas de peces cebra. El efecto de la imipramina (IMP) en la disminución de la invasión celular es evidente en comparación con el control tratado con migrastatina (B).

Análisis de los datos

Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Los datos se analizaron en busca de diferencias estadísticas mediante la prueba t de Student para datos emparejados y no emparejados después de probar la distribución normal de los datos. Para los experimentos in vitro, se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de una prueba poshoc de Tukey para comparar cada grupo. Las diferencias se consideraron significativas con una probabilidad de error de Pp < 0.05. El software SPSS 18.0 se utilizó para el resto de los análisis estadísticos (SPSS, Inc, Chicago, Illinois, Estados Unidos).

Referencias

• Ástróm, P., Heljasvaara, R., Nyberg, P. , Al-Samadi, A., & Salo, T. (2018). Human Tumor Tissue-Based 3D In Vitro Invasión Assays. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1731 , 213-221.

• Chen , L., Yang, S. , Jakoncic, J., Zhang, J. J. , & Huang, X. Y. (2010). Migrastatin analogues target fascin to block tumour metástasis. Nature. https://doi.org/10.1038/nature08978

• Conesa-Zamora, P., García-Solano, J., García-García, F., Turpin, M. D. C. , Trujillo-Santos, J., Torres-Moreno, D. , ... Pérez-Guillermo, M. (2013). Expression profiling shows differential molecular pathways and provides potential new diagnostic biomarkers for colorectal serrated adenocarcinoma. International Journal of Cáncer, 132(2), 297-307. https://doi.org/10.1002/ijc.27674 • García-Solano, J. , Conesa-Zamora, P., Carbonell, P., Trujillo-Santos, J., Torres-Moreno D, D., Pagán-Gómez, I. , ... Pérez-Guillermo, M. (2012). Colorectal serrated adenocarcinoma shows a different profile of oncogene mutations, MSI status and DNA repair protein expression compared to conventional and sporadic MSI-H carcinomas. International Journal of Cáncer https://doi.org/10.1002/ijc.27454

• Gerhard Wolber, T. L. (2005). LigandScout: 3-D Pharmacophores Derived from Protein-Bound Ligands and Their Use as Virtual Screening Filters. Journal of Chemical Information and Modeling, 45(1), 160-169.

• Hamilton, S. R. et al. (2010). Carcinoma of the colon and rectum. In, WHO classification of tumours of the digestive system. In WHO Classification of Tumours, Volume 3 IARC WHO Classification of Tumours, No 3 Bosman, F.T. , Carneiro, F. , Hruban, R.H. , Theise, N.D (IARC, p. 134).

• Han, S., Huang, J. , Liu, B., Xing, B. , Bordeleau, F. , Reinhart-King, C. A . Huang, X.-Y. (2016). Improving fascin inhibitors to block tumor cell migration and&nbsp; metástasis. Molecular Oncology, 10, 966-980. https://doi.Org/10.1016/j.molonc.2016.03.006

• Hashimoto, Y., Kim, D. J., & Adams, J. C. (201 1). The roles of fascins in health and disease. Journal of Pathology. https://doi.org/10.1002/path.2894

• Laiho, P., Kokko, A., Vanharanta, S., Salovaara, R., Sammalkorpi, H., Járvinen, H . Aaltonen, L. A. (2007).

Serrated carcinomas form a subclass of colorectal cáncer with distinct molecular basis. Oncogene, 26(2), 312-320. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1209778

• Machesky, L. M. , & Lia., A. (2010). Fascin: Invasive filopodia promoting metástasis. Communicative and Integrative Biology. https://doi.Org/10.4161/cib.3.3.1 1556

• Stefanius, K., Ylitalo, L. , Tuomisto, A., Kuivila, R., Kantola, T. , Sirnió, P . Mákinen, M. J. (201 1). Frequent mutations of KRAS in addition to BRAF in colorectal serrated adenocarcinoma. Histopathology. https://doi.Org/10.1 1 1 1/j.1365-2559.201 1 .03821 .x

• Tan, V. Y., Lewis, S. J., Adams, J. C., & Martin, R. M. (2013). Association of fascin-1 with mortality, disease progression and metástasis in carcinomas: A systematic review and meta-analysis. BMC Medicine, 1 1 (1), 1-17. https://doi.Org/10.1 186/1741-7015-1 1 -52

• Tuomisto, A., GarcÁ-a-Solano, J. , SirniÁTf, P., VÁnyrynen, J., PÁ©rez-Guillermo, M., MÁnkinen, M. J. , & Conesa- Zamora, P. (2016). HIF-1 a expression and high microvessel density are characteristic features in serrated colorectal cáncer. Virchows Archiv. https://doi.org/10.1007/s00428-016-1988-8