技术领域

本发明涉及到酶固定化技术，尤其涉及一种固 定化环脂肽酰基转移酶及其制备方 法和用途。 背景技术

棘球白素作为一类新的抗真菌药物，在治疗由 念珠菌或曲霉引起的感染方面效果 良好。 这类药物又以卡泊芬净、 米卡芬净、 阿尼芬净为代表。 棘球白素类药物通过抑 制 1， 3-β糖苷键的形成来抑制真菌， 从而更好地减小了对人体的伤害， 在高效的同 时尽可能的降低了副作用， 因此它们在使用过程中比传统抗真菌药更安全 。

FK463(米卡芬净)是如式 〔Ie〕 所示的化合物， 它是以式 la化合物 FR901379为 前体通过切侧链得到式 〔Ic〕 化合物 FR179642, 然后经过合成方法得到的。

Anidulafungin (阿尼芬净） 是如式 〔If〕 所示的化合物， 它是以式 lb化合物 echinocandin B为前体通过切侧链得到式 〔Id〕 化合物， 然后经过合成方法得到的。

关于使环状脂肽物质例如 FR901379、 echinocandin B (棘白菌素 B)、 棘孢曲菌素 A等物质及其类似物的酰基侧链脱酰的酶， 已经报道了属于犹他游动放线菌

(Actinoplanes utahensis)IFO- 13244 , (A.utahensis )N L- 12052生产的酶。 在

WO97/32975号专利中， 报道了属于链霉菌属 (Streptomyces)的细菌 (例如环圈链霉菌 (Streptomyces anulatus)481 1号菌株、 环圈链霉菌 8703号菌株、 链霉菌 (Streptomyces sp.)6907号菌株)生产的酶。 另外， 在 WO97/47738号专利中， 报道了 Oidiodendron tenuissimum IFO 6797菌株、 Oidiodendron echinulatum IFO 31963菌株、 Oidiodendron truncatum IFO 9951菌株、 Oidiodendron truncatum IFO 31812菌株、 树粉孢

(Oidiodendron sp.)30084号菌株、 轮枝孢 (Verticillium sp.)30085号菌株生产的酶。

所述酰基转移酶在培养菌丝中及滤液中可以找 到。通常回收这种生物活性物质的 方法为， 培养肉汤经过过滤或离心所得的菌丝及滤液经 传统的方法进行分离、 纯化， 如高浓度盐溶液抽提， 常用溶剂抽提， 减压浓缩， 冷冻干燥， PH调整， 阴离子交换 树脂或阳离子交换树脂、结晶、再结晶等，可 得到该酰基转移酶。在专利 CN 1 161462C 中， 公开了所述酶的脱酰化方法， 该方法用培养液转化环状脂肽物质 (如 FR901379、 echinocandin B等)，其缺点为转化体系中有有机溶剂，产物� ��处理困难， 转化速度慢， 酰基转移酶不可重复使用， 转化产物纯度低， 增加脱酰后产物的纯化难度。

因此人们一直在寻求一种固定所述酶的方法， 来回收、纯化所述酰基转移酶， 提 高该酶的利用率。 发明内容

本发明旨在提供一种固定化环脂肽酰基转移酶 。 本发明还提供上述固定化环脂肽酰基转移酶的 制备方法。

本发明的再一个目的是提供上述固定化环脂肽 酰基转移酶的用途。 在本发明的第一方面，提供了一种固定化环脂 肽酰基转移酶，所述环脂肽酰基转 移酶固定于载体上； 所述环脂肽酰基转移酶来源于天然或人工突变 体、 或者变种及由 通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转化得 到的， 所述载体材料选自无机载体、 或 多孔亲水性酶载体。

所述固定化环脂肽酰基转移酶， 是用于催化如式 I的化合物中的 R1的酰基脱酰 化， 产生如式 II所示的化合物，

式中， R ¹ 为酰基， R ² 为羟基或酰氧基， R ³ 为氢或羟基， R ⁴ 为氢或羟基， R ⁵ 为氢 或羟基磺酰氧基， R ⁶ 为氢或氨基甲酰基。

在另一优选例中，所述能催化进行酰基脱酰化 反应的化合物或其药学上可接受的 盐， 为如式 l a或式 l b所示；

在一优选例中， 所述载体材料选自以下无机载体： 以所述无机载体的总重量计， 其中 SiO2含量大于 50wt%， A12O3含量大于 lwt%； 优选自： 催化剂载体 CELITE、 膨化珍珠岩、 硅藻土、 高岭土、 或多孔玻璃。

在另一优选例中，所述载体材料选自以下多孔 亲水性酶载体： 以聚甲基丙烯酸酯 为基体键合环氧化物或者含氨基功能基团的多 孔亲水性酶载体； 优选自： Relizyme EP403、 SEPABEADS EC-EP、 Relizyme HA403或 SEPABEADS EC-HA。

在一优选例中，所述固定化环脂肽酰基转移酶 ，每克载体固定有 10-1000单位 (u) 环脂肽酰基转移酶； 优选 20-600单位 (u)。

在另一优选例中， 所述固定化环脂肽酰基转移酶， 固定在无机载体上， 每克载体 固定有 10— 100单位 (u)环脂肽酰基转移酶； 优选 20-80单位 (u)。

在另一优选例中， 所述固定化环脂肽酰基转移酶， 固定在多孔亲水性酶载体， 例 如聚甲基丙烯酸酯为基体键合环氧化物或者含 氨基功能基团的酶载体，每克载体可固 定 100-1000单位 (u)环脂肽酰基转移酶； 优选 120-600单位 (u)。 在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的 本发明提供的固定化环脂肽酰基转 移酶的制备方法， 所述的方法包括步骤： 将含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液与载体 混合， 进行吸附、 固定化， 得到如 上所述的本发明提供的固定化环脂肽酰基转移 酶。

在上述制备方法中，所述环脂肽酰基转移酶来 源于天然或人工突变体、或者变种 及由通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转 化得到的。

在上述制备方法中， 所述菌株是放线菌属或链霉菌属的。

在上述制备方法中， 所述含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液通过 下述方式得 到： 菌株培养， 得到含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液； 或菌株培养后将得到的菌 丝体进行破壁， 得到含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液。或 将含有游离的环脂肽酰 基转移酶的溶液纯化， 除去杂蛋白， 得到更加纯净的环脂肽酰基转移酶的溶液。

在上述制备方法中， 所述载体材料选自无机载体、 或多孔亲水性酶载体。

在上述制备方法中，所述无机载体选自： 以所述无机载体的总重量计，其中 SiO2 含量大于 50wt%， A12O3含量大于 lwt%； 优选自： 催化剂载体 CELITE、 膨化珍珠 岩、 硅藻土、 高岭土、 或多孔玻璃。

在上述制备方法中，所述多孔亲水性酶载体选 自： 以聚甲基丙烯酸酯为基体键合 环氧化物或者含氨基功能基团的酶载体； 优选自： Relizyme EP403、 SEPABEADS EC-EP、 elizyme HA403或 SEPABEADS EC-HA。

在上述制备方法中，所述游离的环脂肽酰基转 移酶与载体的混合比例为每克载体 需酶 10-1000单位 (u); 优选每克载体需酶 20-600单位 (u)。

在上述制备方法中，所述游离的环脂肽酰基转 移酶与无机载体的混合比例为每克 载体需酶 10-100单位 (u); 优选每克载体需酶 20-80单位 (u)。

在上述制备方法中，所述游离的环脂肽酰基转 移酶与多孔亲水性酶载体的混合比 例为每克载体需酶 100-1000单位 (u); 优选每克载体需酶 120-600单位 (u)。

在上述制备方法中， 所述含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液的 pH值为 4-9; 优选 6-7。

在上述制备方法中，所述含有游离的环脂肽酰 基转移酶的溶液和载体混合的温度 为 0-80°C ; 优选 20— 35°C ; 最优选 20-25°C。

在上述制备方法中，将含有游离的环脂肽酰基 转移酶的溶液与载体混合后，将游 离的环脂肽酰基转移酶和结合于载体的环脂肽 酰基转移酶分离，得到固定化环脂肽酰 基转移酶。 在本发明的第三方面，提供了一种如式 II所示的化合物的制备方法，所述的方法 包括步骤：

(a)将如式 I的化合物和缓冲溶液混合， 得到溶液 1 ;

(b)将溶液 1和如上所述的本发明提供的固定化环脂肽酰� �转移酶混合， 进行脱 酰化反应， 得到如式 II所示的化合物；

式中， R ¹ 为酰基， R ² 为羟基或酰氧基， R ³ 为氢或羟基， R ⁴ 为氢或羟基， R ⁵ 为氢或羟基磺酰氧基， R ⁶ 为氢或氨基甲酰基。

在另一优选例中， 所述固定化环脂肽酰基转移酶和式 I的化合物的比例在 0.01-10 u/g。

在另一优选例中， 所述步骤 (a)中缓冲液的 pH在 4-9; 优选 6-7; 所述步骤 (a) 中缓冲液选自下述溶液中的一种或一种以上： 柠檬酸钠缓冲液、 磷酸二氢钾 -磷酸 氢二钠缓冲液和 Tris-HCl缓冲液。

在另一优选例中，所述步骤 (b)中脱酰化反应的温度为 20-70°C ;优选 40-50°C。 在另一优选例中， 所述步骤 (b)中脱酰化反应后， 将固定化环脂肽酰基转移酶 与含产物的反应液分离， 得到如式 II所示的化合物； 较佳地， 所述将固定化环脂 肽酰基转移酶与含产物的反应液分离的方法包 括过滤或离心。 据此， 本发明提供了一种固定环脂肽酰基转移酶的方 法， 从而回收、 纯化所 述酰基转移酶， 提高了该酶的利用率。 附图说明

图 1为实施例 10固定化酶 (vi)脱酰化产物的 HPCL分析图谱 。

图 2为对比例 1游离酶液脱酰化产物的 HPCL分析图谱 。 具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，找到了一种固 定化环状脂肽酰基转移酶的工业化 生产方法， 以及利用该固定化酶制剂使环状脂肽物侧链的 "酰胺基"脱酰化形成"氨基" 的生产方法， 该方法技术先进， 工艺简单， 操作方便， 脱酰化产物纯度高。

进一步讲， 本发明涉及由微生物 Colephoma sp.F- 11899株 (FERM BP-2635)所产 生的 FR901379物质 (专利号 CN1051757A)、 由微生物 Aspergillus nidulans Nrrl 11440 株所生产的 echinocandin B (棘白菌素 B)(专利号 US4288549)及其它们的类似物的酰基 侧链脱酰化的酰基转移酶的固定化方法， 以及用该固定化酶进行脱酰化的方法。 关于背景技术和本发明涉及的化合物的结构式 列于下表:

式中， R'为酰基， R ² 为羟基或酰氧基， R ^j 为氢或羟基， R ⁴ 为氢或羟基， 为氢或羟基磺酰氧基， 及 R ⁶ 为氢或氨基甲酰基。 本发明的环状脂肽酰基转移酶是固定化的， 其制备过程包括以下步骤： a.制备环状脂肽酰基转移酶液；

b.将环状脂肽酰基转移酶液与载体按一定的比� ��混合，将环脂肽酰基转移酶固定 在载体材料上；

c.将环脂肽酰基转移酶液与酶载体分离， 得到固定化的环脂肽酰基转移酶。 本发明所用的环状脂肽酰基转移酶对于其来源 没有特别的限制，来源于天然或人 工突变体、或者变种及由通过导入外来的环状 酰基转移酶基因后转化得到的所述酶也 全都包括在内。

所述载体材料选自无机载体或多孔亲水性酶载 体。无机载体的优点是不会使酶失 活， 吸附到载体上的酶都是有活性的， 但缺点是比活较低， 单位载体可吸附的酶量远 远低于多孔亲水性酶载体； 而多孔亲水性酶载体虽然能吸附更多的酶， 但会使部分酶 失活， 即吸附到载体上的酶只有部分是有活性的， 回收率较低。

无机载体可以是疏水性载体例如常用于固定化 作用的催化剂载体 CELITE [化学 组成： 87%SiO2， 0.9%CaO， 6.1 %A12O3, 1.6%Fe2O3, 1.6%Na2O+K2O] ,膨化珍珠岩 [化 学组成： SiO2(70-75%)、 CaO(0.1-2.0%)、 A12O3(12-16%)、 Na2O (1.0-5.0%)、 Fe2O3(0.1-1.5%), K2O( 1.0-5.0%)], 硅藻土， 高岭土， 或多孔玻璃等载体， 其化学组 成以无机载体的总重量计， 其中 SiO2含量大于 50wt%， A12O3含量大于 lwt%； 优选 自： 催化剂载体 CELITE、 膨化珍珠岩、 硅藻土、 高岭土、 或多孔玻璃； 最优选的为 催化剂载体 CELITE、 膨化珍珠岩。 多孔亲水性酶载体可以是以聚甲基丙烯酸酯为 基体键合环氧化物或者含氨基功 能基团的酶载体。 例如功能基团为环氧化物的酶载体， 包含有 Relizyme EP403、

SEPABEADS EC-EP。 功能基团为已二胺的酶载体， 包含有 Relizyme HA403。 功能基 团为六亚甲基亚胺的酶载体， 包含有 SEPABEADS EC-HA。 使用无机载体在固定化过程中， 酶和载体的比例范围是每克载体需酶 10-100 u， 优选的酶 20-80u/g载体。 当酶用量小于 10 u/g载体时， 固定化的酶活太低， 酶促反应 很难发挥出来， 但酶活大于 100u/g载体时， 酶的固定化效率太低， 部分酶呈游离状 态， 使用一次就会流失。

使用多孔亲水性酶载体在固定化过程中， 酶和载体的比例范围是每克载体需酶 100-lOOOu，优选的酶 120-600u/g载体。特别地，使用多孔亲水性酶载� �固定化过程中， 使用的酶液优选纯化的， 酶液中杂蛋白的比例越小越有利于固定化。

使用无机载体的固定化条件是： 将上述得到的粗酶液中的环状脂肽酰基转移酶 ， 用高效液相色谱 (HPLC)测定酶活力， 按一定的酶 \载体比例，加入固态载体。 pH4-9，温 度 0-80°C， 搅拌半小时以上， 充分洗涤， 过滤， 低温干燥， 可得固定化环状脂肽酰基 转移酶， 于 0-5 °C保存。

使用功能基团为环氧化物的多孔亲水性酶载体 的固定化条件是：将上述得到的较 为纯净的酶液中环状脂肽酰基转移酶，用高效 液相色谱 (HPLC)测定酶活力，按一定的 酶\载体比例， 加入功能基团为环氧化物的酶载体。 pH4-9，温度 0-80°C， 搅拌 24小时 以上充分洗涤， 过滤， 低温干燥， 可得固定化环状脂肽酰基转移酶， 于 0-5°C保存。

使用功能基团为氨基的多孔亲水性酶载体的固 定化条件是:预先将酶载体用戊二 醛活化， 活化完成后充分洗涤去除残余的戊二醛， 将上述得到的较为纯净的酶液中环 状脂肽酰基转移酶， 用高效液相色谱 (HPLC)测定酶活力， 按一定的酶 \载体比例， 加 入戊二醛活化好的酶载体， pH4-9，温度 0-80°C， 搅拌 24小时以上充分洗涤， 过滤， 低温干燥， 可得固定化环状脂肽酰基转移酶， 于 0-5°C保存。

在本发明中， 上述酶活力单位定义为： 40°C时， 在一小时内生成 1微摩尔产物所 需的酶量， 即定义为 l u。 步骤为: 分别量取 17.5ml粗酶液， 含有 FR901379的磷酸 二氢钾缓冲盐 (0.25mol/L)pH6.0的缓冲液 5ml，2.5ml甲醇。 于 40°C水浴条件下， 反应 一小时。 去离子水适当稀释， 0.22um尼龙膜过滤， HPLC测定产物浓度。 或者

在本发明中， 上述酶活力单位定义为： 40°C时， 在一小时内生成 1微摩尔产物所 需的酶量， 即定义为 l u。 步骤为: 分别量取 17.5ml粗酶液， 将 echinocandin B 的二 甲基亚砜溶液 (100mg/ml)2.5ml， 加入 1.2M氯化钾、 0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓 冲液 5.0ml。于 40°C水浴条件下， 反应一小时。去甲醇适当稀释， 0.22um尼龙膜过滤， HPLC测定产物浓度。 在本发明的一个优选例中在上述步骤 a中环状脂肽酰基转移酶的制备方法包括 下述步骤： 菌株培养， 将得到的菌丝体进行破壁， 获得环脂肽酰基转移酶液。

所述的菌株是指具有能分泌环状脂肽酰基转移 酶的优良菌株，是放线菌属或链霉 菌属的。 主要有以下几种： 犹他游动放线菌 (Actinoplanes utahensis)IFO-13244、 (A.utahensis)NRRL-12052生产的酶。在 WO97/32975号专利中， 报道了属于链霉菌属 (Streptomyces)的细菌 (例如环圈链霉菌 (Streptomyces anulatus)481 1号菌株、 环圈链霉 菌 8703号菌株、 链霉菌 (Streptomyces sp.)6907号菌株)生产的酶生产的酶。 另外， 在 WO97/47738号专利中，报道了 Oidiodendron tenuissimum IFO 6797菌株、 Oidiodendron echinulatum IFO 31963菌株、 Oidiodendron truncatum IFO 9951菌株、 Oidiodendron truncatum IFO 31812菌株、树粉孢 (Oidiodendron sp.)30084号菌株、轮枝孢 (Verticillium sp.)30085号菌株生产的酶。

优选犹他游动放线菌 (Actinoplanes utahensis)IFO-13244、

(A.utahensis )N L- 12052, 链霉菌 (Streptomyces sp.)6907号菌株生产的酶。

菌株培养所用的培养基包括以下几种物质： 蔗糖 1-10%， 大豆蛋白胨 0.1-0.1%，

K2HPO4 0.1-0.2%,KH2PO4 0.01-0.1%, MgSO4.7H2O 0.01-0.05%。 培养条件是在 25-36°C , 优选 30°C， 通气量 l-2vvm， 搅拌速度 200-800r/min。 经过 3-5天培养， 获 得大量菌丝体。

上述得到的菌丝体可以先进行破壁，收集这些 菌体细胞的胞内酶，这样可以获得 较好的环状脂肽酰基转移酶， 所述的菌体破壁可用已知的方法， 如： 高浓度盐溶液抽 提法， 超声波破碎法， 机械破碎法， 溶菌酶法等将环状脂肽酰基转移酶转移到细胞 的 胞外， 再用过滤法或离心法将酶液与菌丝体分离， 得到粗酶液。

为了获得更好的固定化酶，还可以先将环状脂 肽酰基转移酶液进行纯化：将上述 所得的粗酶液， 按照一定的比例加入所用的无机载体吸附游离 酶。将吸附有酶的无机 载体与酶液分离， 经过充分洗涤后， 用高浓度的盐溶液将环状脂肽酰基转移酶从无 机 载体上解吸下来， 得到较为纯净的酶液。

环状脂肽酰基转移酶的纯化过程还可以参照文 献 Membrane-associate

echinocandin B deacylase of Actinoplanes utahensis: purification, characterization, heterologous cloning and enzymatic deacylation reaction使用超滤、 离子交换树月旨的方 法纯化环状脂肽酰基转移酶， 此方法能够得到更加纯净的酶液， 但此方法的缺点是酶 的回收率很低。 本发明使用固定化酶进行脱酰化过程， 包括以下步骤：

A.加入缓冲溶液， 制备含有环状脂肽物的溶液 1 ;

B.在溶液 1中加入固定化酰基转移酶， 进行脱酰化反应；

C.将固定化酰基转移酶与含产物的反应液分离� ��

其中， 固定化酰基转移酶与环状脂肽物的比例在 0.01-10u/g， 优选 0.1-5u/g。 步骤 A中所述缓冲液的 pH控制在 4-9， 优选 pH 5-7， 更佳地 pH约 6.0。 缓冲 液的种类为 0.5M柠檬酸钠缓冲液、 0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液和 Tris-HCl 缓冲液的的一种或它们的混合物， 优选 0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液。

步骤 B中所述脱酰化反应的温度控制在约为 20-70°C， 优选的温度范围是约 30-50°C。

步骤 C中所述的将固定化酶与含产物的反应液分离� �方法包括过滤法或离心法。 当将酶固定到合适的载体上时，本发明的脱酰 化作用可顺利地在连续搅拌反应釜 器中进行而不是分批地进行。

本发明中所讲 "环状脂肽物 "或"环脂肽 "指含有多肽环， 该环上侧链含有"酰基氨 基"的物质， 该物质也可有其它的侧链。

该"环状脂肽物"的代表为 FR901379、 echinocandin B (棘白菌素 B)， 该类物质是 具有抗真菌活性的已知物。

该发明的固定化环状脂肽酰基转移酶，能使环 状脂肽物侧链的"酰胺基 "脱酰化形 成"氨基"， 具体的讲它能使物质 FR901379或其盐的棕榈酰侧链或含有 FR901379、式 I中所示的化合物的酰基侧链脱酰化， 形成式 II所示的环状肽物质。 如本文所用， "药学上可接受的盐"优选： 包括金属盐例如碱金属盐 (如钠盐、 钾 盐)、 碱土金属盐 (如钙盐、 镁盐等)、 铵盐、 与有机碱形成的盐 (如三甲胺盐、 三乙胺 盐、 吡啶盐、 甲基吡啶盐、 二环己铵盐、 N，N，-二苄基乙二胺盐、 二异丙基乙胺盐等) 等、 有机酸加成盐 (如甲酸盐、 乙酸盐、 三氟乙酸盐、 马来酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸 盐、 苯磺酸盐、 甲苯磺酸盐等)、 无机酸加成盐 (如盐酸盐、 氢溴酸盐、 氢碘酸盐、 硫 酸盐、 磷酸盐等)、 与氨基酸 (如精氨酸、 天冬氨酸、 谷氨酸等)形成的盐等。 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征 可以任意组合。本案说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用， 说明书中所揭示的各个特征， 可以任何可提供 相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。 因此除有特别说明， 所揭示的特征仅为均 等或相似特征的一般性例子。 本发明的主要优点在于：

1、 本发明提供的脂肽酰基转移酶固定化方法， 可反复使用该酶， 提高环状脂肽 酰基转移酶的利用率、 降低生产成本， 有利于工业化生产和降低成本。

2、 本发明的脱酰化产物纯度得到特别显著提高。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照 常规条件或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则所有的百分数、 比率、 比例、 或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域 技术人员所熟知的， 例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学 用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等 的方法及材料皆可应用于本发明方法中。 文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用 。 下述实施例中化合物 〔II〕 HPLC检测所用的方法：

样本在 Waters 分析性 HPLC体系上进行分析。 反相 HPLC分析用于测定

FR179642、棘白菌素 B核物质及其它类似物。反相分析采用 PLATISIL ODS色谱柱 (粒 径 5μιη， 4.6mmi.dx250cm), 并且保持在 30°C。 以 3%乙腈 /0.5%磷酸二氢钠作流动相， 流速为 1 ml/分钟， 并在 21 Onm下 UV检测。 实施例 1

犹他游动放线菌 (Actinoplanes utahensis)IFO-13244株生产的酰基转移酶 a 的制备

采用犹他游动放线菌 IFO-13244菌株， 按照 US5376634专利上的发酵方法， 进行发酵培养， 得到菌丝体培养液 150 L。 加入 0.01 M磷酸二氢钾缓冲盐， pH调 至 6.0， 加入 1.0 M氯化钾， 低温下搅拌抽提 20小时以上。 然后于铺有滤纸的布 氏漏斗过滤，收集含有酰基转移酶的滤液 1 16 L,即游离酶液 (a)，收集滤液经 HPLC 检测酶活 2.3x l0 ⁵ u。 实施例 2

犹他游动放线菌 (A.utahensis )NRRL-12052株生产的酰基转移酶 b的制备 采用犹他游动放线菌 NRRL-12052菌株， 按照 US4320053 专利上的发酵方法， 进行发酵培养，得到菌丝体培养液 160L。加入 0.01M磷酸二氢钾缓冲盐， pH调至 6.0， 加入 1.0M氯化钾， 低温下搅拌抽提 20小时以上。 然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤， 收集含有酰基转移酶的滤液 121L， 即游离酶液 (b)，收集滤液经 HPLC检测酶活

2.1 x l0 ⁵ u。 实施例 3

链霉菌 (Streptomyces sp.)6907号菌株生产的酰基转移酶 c的制备

采用链霉菌 6907号菌株， 按照 WO97/32975专利上的发酵方法，进行发酵培养， 得到菌丝体培养液 160L。 加入 0.01M磷酸二氢钾缓冲盐， pH调至 6.0， 加入 1.0M氯 化钾， 低温下搅拌抽提 20小时以上。 然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤， 收集含有酰 基转移酶的滤液 124L, 即游离酶液 (c)，收集滤液经 HPLC检测酶活 2.9x l0 ⁵ u。 实施例 4

酰基转移酶 b的纯化

参照文献 Membrane-associate echinocandin B deacylase of Actinoplanes utahensis: purification, characterization, heterologous cloning and enzymatic deacylation reaction的方法纯化实施例 2中得到的粗酶液，最终得到纯净的酰基转移� �液 3.0L, 即 游离酶液 (d)， 收集酶液经 HPLC检测酶活 0.5x l0 ⁵ u。 实施例 5

无机载体固定酰基转移酶

为了固定化， 分别取 50升游离酶液 (a)、 （b)、 (c), 然后分别加入 1.5公斤的膨化 珍珠盐， 25°C下，搅拌吸附 1小时以上。过滤收集固定化酰基转移酶，即� �定化酶（ i )、 ( ii)、（iii)用 0.01M磷酸二氢钾缓冲盐， pH6.0的缓冲液洗涤三次， 并在室温下干燥几 小时。 该固定化酶用前储存在 4 。

实施例 6

功能基团为环氧化物的多孔亲水性酶载体固定 酰基转移酶

为了固定化， 分别取 0.8升上述实施例 4制备的纯净的酰基转移酶液 (d)两份， 分 别加入 59.2g氯化钾，和 0.01mol/L的磷酸二氢钾缓冲盐， pH7.0，分别加入 30g elizyme EP403和 SEPABEADS EC-EP 30g, 25°C下，搅拌 24小时以上， 过滤收集固定化酰基转 移酶， 即固定化酶 (iv)、 （V )用 0.01M磷酸二氢钾缓冲盐， pH7.0的缓冲液洗涤三次， 并在室温下干燥几小时。 该固定化酶用前储存在 4 。

表 2 用环氧化物的多孔亲水性酶载体对游离酶液的 固定情况 实施例 7

功能基团为氨基的多孔亲水性酶载体固定酰基 转移酶

为了固定化， 先对载体进行活化： 分别取 8g Relizyme HA403和 SEPABEADS EC-HA 8g，加入 90毫升 2%的戊二醛溶液， 0.02mol/L的磷酸氢二钾缓冲盐， pH8.0，在 20-25 °C下搅拌 1小时， 去除上清， 纯化水清洗树脂。 分别取 0.4升上述实施例 4制备 的纯净的酰基转移酶液 (d)两份，将两份活化好的酶载体添加到酶液中 ，在 20-25 °C下， 搅拌 20小时以上， 过滤收集固定化酰基转移酶， 即固定化酶 (vi)、（vii)用 0.01M磷酸 二氢钾缓冲盐， pH7.0的缓冲液洗涤三次，并在室温下干燥几小� ��。该固定化酶用前储 存在 4°C。

表 3 用氨基型的多孔亲水性酶载体对游离酶液的固 定情况 实施例 8

用固定化酶进行分批脱酰化反应

分别向 FR901379物质的水溶液 (20mg/ml、 HPLC纯度 79.2%)2升 (FR901379物 20g，16.7mmol)中加入缓冲液 (0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液； pH6.0)2升禾卩 15g 固定化酶（ i )、 固定化酶（ϋ )、 固定化酶 (iii)， 40°C反应 4小时， 通过 HPLC测得 F 179642物质的产量和纯度。

表 4 固定化酶 4小时脱酰化后 FR901379物质的转化率及 FR179642物质的纯度 实施例 9

用固定化酶进行分批脱酰化反应

分别向 FR901379物质的水溶液 (20mg/ml、 HPLC纯度 79.2%)2升 (FR901379物 20g, 16.7mmol)中加入缓冲液 (0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液； pH6.0)2升禾卩 15g 固定化酶 (iv)、 固定化酶 ( v )、 固定化酶 (vi)、 固定化酶 (vii)， 40°C反应 1小时， 通过 HPLC测得 FR 179642物质的产量和纯度。

表 5 固定化酶 1小时脱

对比例 1

用游离酶液进行分批试验

按照 WO97/32975专利上的脱酰化方法， 将 FR901379物质的水溶液 (100mg/ml、 HPLC纯度 79.2%) 100ml(FR901379物 10g，38.35mmol)、加入缓冲液 (0.2M磷酸二氢钾 -磷酸氢二钠缓冲液； pH6.0)100ml， 甲醇 100ml, 然后加入游离酶液 (c)700ml，40°C反 应 Ί小时，转化率 71.1%，生成的 FR17964物质的纯度，经 HPLC检测纯度为 75.7%， 其 HPLC分析色谱图见图 2和表 10。

转化后的液体， 测定酶活， 经过测定基本上检测不到酶活。酶在转化过程 中几乎 全部失活。

表 10

从上述实施例和对比例 1可以得出，利用固定酶进行脱酰基化与游离� �液脱酰基 相比较具有显著地优势。 转化率和产物的纯度都得到极大地提高。 实施例 10

在连续搅拌釜式反应器中的连续脱酰化反应

在 50升连续搅拌釜式反应器中于 45°C进行 FR901379到 FR179642物质的连续 脱酰化反应， 加入固定化酶 (vi)0.3Kg， FR901379物质的水溶液 (20mg/ml、 HPLC纯 度 79.2%)20升， 缓冲液 (0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液； pH6.0)20升。 底物在 3小时后转化率达到 95%以上， F 179642物质经 HPLC检测纯度为 95.99%，其 HPLC 分析色谱图见图 1和表 6。

表 6

固定化的酰基转移酶至少可保持 30小时的稳定性和活性， 因此在生产过程中可 连续重复使用 5次以上。

从实施例 10与对比例 1相比可以得出，固定化酶的另一大优势是可� �重复利用。 极大地提高使用效率， 减少对环境的破坏污染。 实施例 11 不同载体对游离酶的固定化及固定化酶脱酰化 比较

为了固定化， 分别取 5升游离酶液 (c)， 然后分别加入 0.15公斤的膨化珍珠盐， 硅藻土 (CELITE), 和活性碳 (SiO2含量小于 1%)， 分子筛、 多孔玻璃。 30°C下， 搅拌 吸附 1小时以上。 过滤收集固定化酰基转移酶， 即固定化酶 (viii)、 （ix)、 （x )、 （xi)、 (xii)用 0.01M磷酸二氢钾缓冲盐， pH6.0的缓冲液洗涤三次， 并在室温下干燥几小时， 该固定化酶用前储存在 4 。

然后，分别向 FR901379物质的水溶液 (20mg/ml、HPLC纯度 79.2%)2升 (FR901379 物质 20g，16.7mmol)中加入缓冲液 (0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液； pH6.0)2升和 15g(viii)、 (ix)、 ( x )、 （xi)、 （xii)， 40°C反应 4小时， 通过 HPLC测得 FR179642物质 的产量和纯度。

实施例 12

不同比例载体对游离酶的固定化及固定化酶脱 酰化比较

为了固定化， 分别取 5升游离酶液 (c)， HPLC检测酶活 1.17xl0 ⁴ U， 然后分别加 入 0.05公斤、 0.12公斤、 0.15公斤、 0.24公斤、 0.58公斤、 1.17公斤、 1.75公斤的 硅藻土 (CELITE), 30°C下， 搅拌吸附 1小时以上。 过滤收集固定化酰基转移酶， 用 0.01M磷酸二氢钾缓冲盐， pH6.0的缓冲液洗涤三次， HPLC检测滤液中的酶活。 固定 化酶在室温下干燥几小时， 该固定化酶用前储存在 4°C。

然后，分别向 FR901379物质的水溶液 (20mg/ml、 HPLC纯度 79.2%) 1升 (FR901379 物 10g， 8.35mmol)中， 加入缓冲液 (0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液； pH6.0)l升 和 75g上述制备获得的固定化酶， 40°C反应 4小时， 通过 HPLC测得 FR179642物质 的生产量和纯度。

表 8 不同比例载体对游离酶的吸附率及固定化酶脱 酰化比较

实施例 13

不同 pH对载体固定化游离酶的比较

为了固定化， 分别取 5升游离酶液 (a)， HPLC检测酶活 1.0xl0 ⁴ U， 然后分别加入 0.15公斤的硅藻土 (CELITE)，用 2mol/L的盐酸或 2mol/L氢氧化钠溶液调节 pH至 3.5， 4.0， 6.0， 9.0， 9.5。 25°C下， 搅拌吸附 1小时以上。 过滤收集固定化酰基转移酶。 固 定化酶在室温下干燥几小时， 该固定化酶用前储存在 4°C。

然后，分别向 FR901379物质的水溶液 (20mg/ml、 HPLC纯度 79.2%) 1升 (FR901379 物 10g， 8.35mmol)中， 加入缓冲液 (0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液； pH6.0)l升 和 75g上述制备获得的固定化酶， 40°C反应 4小时， 通过 HPLC测得 FR179642物质 的生产量。

表 9 不同 pH对载体固定化游离酶的比较

实施例 14

将 echinocandin B的二甲基亚砜溶液（100mg/ml)100ml (棘白菌素 B为 10g; 9.43mmol), 加入 1.2M氯化钾、0.5M磷酸二氢钾 -磷酸氢二钠缓冲液 500ml， pH7.0 然后加入固定化酶（ii )25g，于 50°C转化 2小时， 转化率 85.6%。 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并非用以限定本发明的实质技术内 容范围， 本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的 权利要求范围中， 任何他 人完成的技术实体或方法， 若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同 ， 也或 是一种等效的变更， 均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。