Immobilisierte Substrate, damit gefertigte Trenngele und Ver- fahren zum Nachweis von Enzymaktivitäten nach elektrophoreti- scher Protein-Trennung Für die hochauflösende Trennung von komplexen Proteingemi- schen, z. B. aus Zellextrakten oder synthetischen Reaktionsge- mischen (chemische Synthese, biologische Synthese wie in vitro Translation), ist die Elektrophorese in Gelen aus Polyacryla- mid, Agarose, Stärke etc. Stand der Technik (siehe : G. M. Ro- the, Elektrophoresis of Enzymes-Laboratory Methods, 1994, Springer Verlag, Berlin). Elektrophoretische Trennverfahren umfassen Elektrophorese, Isotachophorese, Isoelektrische Fo- kussierung. Insbesondere wird die Elektrophorese in einem de- naturierenden Milieu (in Gegenwart von SDS, Harnstoff, Guani- dinium Salzen, Mercaptoethanol etc.) durchgeführt, wodurch ei- ne Entfaltung der Proteinketten und eine Trennung überwiegend nach MolekülgröBe erreicht wird. Durch diese Denaturierung wird natürlich auch jede biologische Aktivität (Ligandbindung, Substratbindung und-transformation) der Proteinkomponenten aufgehoben. Proteine können aber mittels einer Renaturie- rungsprozedur wieder zur aktiven natürlichen Struktur zurück- gefaltet werden. Diese Renaturierung kann auch direkt im Gel durchgeführt werden (ibid, S. 135 ff). Sind die Proteine groß gegenüber der Porenstruktur der Gelmatrix, dann bleiben die Proteine ohne einen großen Verlust an Trennauflösung am Ort der Trennung lokalisiert. Enzymproteine können dann ihre Akti- vität gegenüber einem Substrat ausüben, das nach elektrophore- tischer Trennung und gegebenenfalls Renaturierung in das Gel eindiffundiert wird oder dem Gel vor dessen Polymerisation zu- gegeben wurde (ibid, S. 165 ff.). Das Produkt dieser Enzymreak- tion kann dann zur lokalen Charakterisierung und Identifizie- rung des Enzyms genutzt werden, wenn dieses Produkt ebenfalls im Gel am (gleichen) Ort der Reaktion lokalisiert bleibt.

Hierfür wurden eine Vielzahl von Beispielen beschrieben (ibid, S. 141 ff), für die jedoch folgende Einschränkungen gelten : a) das Substrat ist klein gegenüber der Gelporenstruktur und wird nach elektrophoretischer Trennung und gegebenenfalls Re- naturierung in das Gel eindiffundiert ; die Enzymreaktion wird dann durch Bildung eines farbigen unlöslichen (also örtlich präzipitierenden) Produktes detektiert. b) das Substrat ist groß gegenüber der Gelporenstruktur und wird dem Gel vor dessen Polymerisation zugegeben ; das Produkt der Enzymreaktion bleibt groß und wird entsprechend detek- tiert, oder das Substrat wird zu kleinen Fragmenten degra- diert, welche aus dem Gel ausgewaschen werden, und die En- zymaktivität wird durch die Abwesenheit des Substrats am ent- sprechenden Ort detektiert (negative staining).

Die Auswahl an nutzbaren Substratmolekülen für das Verfahren in diesen Ausführungen ist jedoch wegen der vielfältigen spe- ziellen Anforderungen an das Substrat bzw. Produkt sehr be- grenzt. Viele Enzyme können auch kleine und in großer Vielfalt auch synthetisch zugängliche Substrate umsetzen, deren Pro- dukte nicht an die obigen Bedingungen zur in situ Detektion im Gel angepaßt werden können. Als Mittel zur Benutzung auch sol- cher Substrate in flexibler Weise haben zum Beispiel Kameshita und Fujisawa die kovalente Verknüpfung mit einem großen Trä- germolekül beschrieben (Anal. Biochem. 1996, Bd. 237, S. 198- 203). Das Prinzip bleibt das Gleiche wie unter b) beschrieben, nämlich der physikalische Einschluß des Substratkonjugates in die Gelmatrix.

Für den Nachweis von Proteinkinasen wurden kurze synthetische Oligopeptide, die N-terminal mit einem Cysteinbaustein verse- hen waren, kovalent über das bifunktionelle Reagenz N- (E-male- imidocaproyl)-succinimid mit verschiedenen Polyaminosäuren der Größe 23000 bis 198200 Dalton verknüpft. Die katalytische Un- tereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA), CaM-Kinase II und CaM-Kinase IV konnten so mit den synthetischen Peptid- substraten Kamptide (CLRRWSVA), C-Syntide-2 (CPLARTLSVAGLLPLKK) und CAMKAKS (CSQPSFQWRQPSLDVDVGD) im Gel nach radioaktiver Phosphorylierung in Gegenwart von [y-32P] ATP und Autoradiographie detektiert werden. (Diese Peptide sind im Ein-Buchstaben-Kode mit dem N-Terminus links und dem C-Termi- nus rechts wiedergegeben.) Allerdings wurde beobachtet, daß die Art des Trägermoleküls, hier die Zusammensetzung aus Ami- nosäureeinheiten, Einfluß auf die Substratnutzung hat, bzw. daß das Trägermolekül selbst als Substrat wirken kann. Letzte- res ist unter Umständen sehr unerwünscht, wenn die Enzyme nur selektiv und spezifisch detektiert werden sollen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren und ein verbessertes Gel zur Detektion und Trennung von Enzymaktivitäten bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik und insbesondere die Limitierung der Sub- stratwahl und den störenden Einfluß von Trägermolekülen über- winden.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Fixierung von Substratmolekülen in Gelmatrices, das dadurch gekennzeich- net ist, daß man ein Substrat kovalent mit einem polymerisier- baren monomeren oder oligomeren Baustein eines Gels verknüpft und das entstandene Produkt, d. h. die Gelbausteine, polymeri- siert.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Substrat um ein natürli- ches oder synthetisches (Oligo-) peptid, ein natürliches oder synthetisches (Oligo-) nucleotid oder ein DNA-Fragment.

Die monomeren oder oligomeren Gelbausteine umfassen an sich übliche Monomere oder polymerisierbare Oligomere zur Herstel- lung von Gelen, wie Acrylsäuremonomere und/oder-oligomere und/oder Methacrylsäuremonomere und/oder-oligomere. Es können jedoch, wie vorstehend angegeben, auch alle anderen üblichen Bausteine eingesetzt werden, die zu einem Gel polymerisiert werden können.

Vorzugsweise werden zur Polymerisation Substrat-Gelbausteine mit Gelbausteinen vermischt, die keine Substratkomponenten aufweisen. Vorzugsweise wird das Verhältnis von Substrat-Gel- bausteinen : unmodifizierten Gelbausteinen so gewählt, daß die Menge an Substrat im Gel für den Nachweis der Enzymreaktion ausreicht. Bei der Polymerisation kann es sich um eine an sich übliche Polymerisation, wie zum Beispiel eine Lösungs-oder Massepolymerisation handeln.

Gemäß einer besonders bevorzugten Variante des erfindungsgemä- ßen Verfahrens ist zwischen dem Substrat und dem monomeren oder oligomeren Gelbaustein ein Spacer (ein bifunktionelles Abstandsmolekül) angeordnet, das mit beiden Komponenten kova- lent verbunden ist.

Ein derartiges Konstrukt weist den folgenden Aufbau auf : MONOMER-- (SPACER) optional-SUBSTRAT MONOMER (M) : z. B. Acrylsäure, Methacrylsäure etc.

SPACER (Sp) : s-Aminocarbonsäure (z. B. C2 bis C20), Oligo- nucleotid, Oligopeptid, Polyethylenglycol etc.

SUBSTRAT (Sub) : synthetisches Peptid, Oligonucleotid, kleines organisches Molekül, etc.

Bei dem Spacer kann es sich um in der Peptid-und Nukleo- tidchemie übliche Spacer, wie ein natürliches oder syntheti- sches (Oligo-) peptid oder ein natürliches oder synthetisches (Oligo-) nucleotid handeln.

Erfindungsgemäß wird das gegebenenfalls einen Spacer aufwei- sende Produkt aus mindestens einem Substrat und mindestens ei- nem Gelbaustein zu unmodifizierten Gelmonomeren oder einer Lö- sung von unmodifizierten Gelmonomeren gegeben, gegebenenfalls gemischt und dann polymerisiert. Während der Polymerisation wird dabei die modifizierte, mindestens ein Substrat und ge- gebenenfalls mindestens einen Spacer aufweisende Monomer-oder Oligomereinheit wie die anderen unmodifizierten Gelmonomere in die Gelmatrix eingebaut und damit das Substrat kovalent mit der Gelmatrix verknüpft.

Ferner betrifft die Erfindung ein Gel, das immobilisierte Sub- strate aufweist. Dieses Gel wird vorzugsweise wie vorstehend angegeben hergestellt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Gel um ein Trenngel.

Die Porengröße und die Vernetzung des Gels kann in an sich üb- licher Weise durch entsprechende Polymerisationsbedingungen, wie die Wahl des Lösungsmittels, der Konzentration, der Tempe- ratur, den Einsatz eines Katalysators etc., eingestellt wer- den.

Ein Vorteil der so erzielten örtlichen Fixierung des Substra- tes und damit auch des Produktes im Gel ist, daß eine Diffu- sion des Substrates/Produktes ausgeschlossen wird und somit die hohe Auflösung des Gels erhalten bleibt.

Beispiele Herstellung eines Gels Ein Peptid mit der Sequenz LRRASLG (Kemptide) wurde durch che- mische Synthese nach dem Fmoc-Verfahren (Fields, G. B. und No- ble, R. L., Int. J. Peptide Protein Res. 1990, Bd. 35, S. 161- 214) an einem mit dem Rink-Linker beladenen TENTAGEL-Harz von Rapp Polymere (Tübingen, Deutschland) als fester Phase herge- stellt. Diese Peptidsequenz ist ein Substrat für die katalyti- sche Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) (B. E. Kemp und R. B. Pearson, 1991, Methods in Enzymology, Bd.

200, S. 121-133). Nach Einbau der letzten (N-terminalen) Ami- nosäure L wurde das Peptid mit A, R und A verlängert (Spacer).

Abschließend wurde die terminale Aminogruppe des Peptids durch eine Carboxamidbindung mit Acrylsäure (Monomer für ein Po- lyacrylamid-Gel) verknüpft, wobei die gleiche chemische Reak- tion benutzt wurde wie zum Verknüpfen der Aminosäurebausteine mit dem Peptid. Das Produkt wurde dann in an sich üblicher Weise durch Behandlung mit Trifluoressigsäure vom Träger und den Schutzgruppen an den Aminosäureseitenketten befreit und durch Fällung sowie präparative HPLC gereinigt. Das M-Sp-Sub- Produkt ist somit Acryl-A-R-A-L-R-R-A-S-L-G-NH2.

Als Referenzsubstrat wurde die gleiche Spacer-Peptid-Sequenz mit einem Acetylrest anstelle des Acrylrestes hergestellt.

Identität und Reinheit der Produkte wurde durch analytische HPLC [C18-Kieselgel-Säule ET 250/8/4 NUCLEOSIL 300-7 C1g von Macherey-Nagel (Düren, Deutschland), Gradient von Acetonitril mit 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser mit 0.1% Trifluoressig- säure wie in Figur 1A (Acryl-Peptid) und Figur 2A (Acetyl-Pep- tid) angegeben] und MALDI-Massenspektroskopie des HPLC-Haupt- peaks [Shimadzu-MALDI III, Sinapinsäure als Matrix, wie in Fi- gur 1B (Acryl-Peptid) und Figur 2B (Acetyl-Peptid) wiedergege- ben] bestimmt. MW Acryl-Peptid = 1419 theor. ; MW Acetyl-Peptid = 1407 theor.

Die analytischen Daten belegen, daß die Zielverbindungen in hoher Reinheit nach bekannten Peptidsynthesemethoden in ein- deutiger Weise hergestellt werden können.

SDS-Polyacrylamidflachgele bestehend aus jeweils einem 10% Trenngel und einem 3% Sammelgel wurden nach der Vorschrift von Laemmli (Nature 1970, Bd. 227, S. 680-685) angefertigt. Die Substratkonstrukte wurden den Lösungen für die Trenngele in einer Konzentration von 40 pg/ml vor der Polymerisation zuge- setzt.

Trennung von Proteinproben Als Proteinproben wurden eingesetzt : -die katalytische Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinki- nase (PKA) ; 2,4 mg/ml.

-ein Proteinextrakt von der murinen embryonalen Stammzellli- nie CCE (129/Sv/Ev derived) wurde nach der Vorschrift von Hipskind et al. (Hipskind, R. A., Baccarini, M. und Nordheim, A., Molecular and Cellular Biology 1994, Bd. 14, Nr. 9, S.

6219-6231) hergestellt und hatte einen Proteingehalt von 2,8 mg/ml.

Jeweils die nachstehend angegebenen Proteinmengen wurden in Auftragspuffer nach Laemmli gemischt und elektrophoretisch ge- trennt. Die Behandlung der Gele nach der Elektrophorese folgte der Vorschrift von Kameshita und Fujisawa (Anal. Biochem., 1989, Bd. 183, S. 139-143). Das [y-32P] ATP hatte eine spezifi- sche Aktivität von 185 TBq/mmol.

Die Figur 3 zeigt drei Gelautoradiogramme A (ohne Peptidsubstrat) B (mit Acryl-Peptidsubstrat) C (mit Acetyl-Peptidsubstrat).

In den Spuren wurden die folgenden Proben aufgetragen : Spur 1 : Molekulargewichtsmarker (nicht radioaktiv !) Spur 2 : PKA 100 pg Spur 3 : PKA 50 pg Spur 4 : PKA 25 pg Spur 5 : PKA 12,5 pg Spur 6 : PKA 6,25 pg Spur 7 : PKA 3,13 pg Spur 8 : PKA 1,56 pg Spur 9 : leer Spur 10 : CCE 14,55 pg Spur 11 : CCE 7,28 ig Spur 12 : CCE 3,64 ig Spur 13 : CCE 1,28 ig Nur im Gel B wird dort eine Bande auf dem Autoradiogramm de- tektiert, wo in den Spuren 2 bis 8 die katalytische Unterein- heit der cAMP-abhängigen Proteinkinase mit einem Molekularge- wicht von 42000 Dalton erwartet wird. Die Intensität der Bande nimmt mit der abnehmenden Menge an aufgetragenem Enzym ab. Ei- ne Vielzahl an Banden wird in den Spuren 9 bis 12 aller drei Gele detektiert wo der CCE-Zellextrakt aufgetragen wurde. Hier wird also überwiegend Autophosphorylierung beobachtet, wozu kein zusätzliches Substrat notwendig ist. Wiederum nimmt die Intensität der Banden mit der abnehmenden Menge an aufge- tragenen Protein ab. Jedoch nur im Gel B mit dem einpo- lymerisierten Acryl-Peptid, in der Höhe der PKA, nimmt die In- tensität der Bande nicht so schnell ab wie in den anderen Ban- den. Mehr Substrat kann hier phosphoryliert werden, weil zu- sätzliches Peptid-Substrat vorhanden ist.

Diese Experimente belegen eindeutig, daß das M-Sp-Sub Produkt im Gel festgehalten wird und als Substrat vom Enzym umgesetzt werden kann.

Prinzipiell kann dieses Verfahren auf eine Vielzahl anderer Enzymaktivitäten angewandt werden, zum Beispiel für -Polynucleotid-Kinasen : das Substrat wäre hier ein syntheti- sches oder natürliches DNA-Fragment oder Oligonucleotid ; der Aktivitätsnachweis gelänge wiederum durch Einbau von radio- aktiv-markiertem Phosphat aus [Y-32p] ATP.

-Proteasen : das Substrat wäre hier ein synthetisches Peptid ; der Aktivitätsnachweis gelänge z. B. durch Fluoreszenzdetek- tion, wenn das Peptidsubstrat mit zwei sich löschenden Fluo- rophoren versehen ist, die durch die Spaltung des Peptids voneinander getrennt werden (M. Meldal und I. Svendsen, 1995, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, Bd. 1995, S. 1591- 1596).

-Phosphatasen : das Substrat wäre hier ein z. B. radioaktiv phosphoryliertes Peptid ; der Aktivitätsnachweis gelänge durch die Abspaltung der Markierung und Detektion einer Ra- dioktivitätsabnahme am Ort des Enzyms.

Viele weitere Beispiele sind konstruierbar, in denen das im Gel kovalent gebundene Substrat durch die Enzymreaktion entwe- der detektierbar markiert oder eine vorhandene Markierung zer- stört wird.

Kinasetests im Gel nach 2D-Elektophorese 1. Dimension : Isoelektrische Fokussierung Zur Durchführung der Kinasetests im Gel wurden membranange- reicherte Zellextrakte auf 18 cm langen IPG-Streifen (pH 3-10) in der ersten Dimension mit 300kVh isoelektrisch fokussiert und anschließend mit DTT-haltiger Äquilibrierlösung für die Auftrennung nach der Größe in der zweiten Dimension vorbe- reitet (15 min).

Als Substrate wurden einpolymerisiert : EGF-Rezeptorkinase-Substrat : Acryl-AEGSAYEEV-COOH PKC-Substrat : Acryl-RRRRRKGSFRRKA-COOH PKA-Substrat : Acryl-ARALRRASLG-NH2 Es wurden jeweils ca. 1 nmol Substrat (= ca. 1-2 mg) je Gel (20 ml Volumen) eingesetzt.

Nach dem Gießen der Gele auf Gelbondfolie wurden die Gele ge- wässert und anschließend mit SDS-Laufpuffer äquilibriert (pH 8,6). Vor der Durchführung der SDS-PAGE wurde der Sammelgelbe- reich mit Sammelgelpuffer äquilibriert (pH 6,8). Die Waschvor- gänge sollen unpolymerisierte Acrylamidreste entfernen. Die IPG-Streifen wurden auf die peptidhaltigen Gele aufgelegt. Die Gelelektrophorese wurde ca. 6 h horizontal durchgeführt.

Renaturierungsvorgang (nach Kameshita u. Fujisava, Anal. Bio- chem., 1989, Bd. 183, S. 139-143 abgewandelt) 1. Auswaschen von SDS mit 20% Iso- propanol in 50 mM Tris, pH 8,0 2 x 30 min 2. Aquilibrieren mit 50 mM Tris, pH 8,0,5 mM DTT 1 h, RT 3. Denaturieren mit 6 M Guanidin-HCl in 50 mM Tris, pH 8,0,5 mM DTT 1 h, RT (2 Wechsel) 4. Renaturieren mit 50 mM Tris, pH 8,0, 5 mM DTT, 0,04% Tween 20 16 h, 4°C (5 Wechsel) 5. Aquilibrieren mit Kinasetestpuffer 50 mM MOPS, pH 6,9,0,4 mM EGTA, 2 mM DTT, 20mM MgCl2,100 mM NaCl 30 min, 30°C 6. Kinasetest mit frischem Kinasetest- puffer 150 ml mit 25 uM ATP und 1,8 mCi [y32P-ATP] 45 min, 30°C 7. Stop der Reaktion und Waschen mit 5% TCA und 1% Na-Pyrophosphat ca. 20 h bzw. bis we- nig Aktivität in der Waschlösung 8. Gele färben, trocknen und Phospho- Imaging ca. 10 Tage Die Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt. Die Kontrolle ent- hält kein Substrat. Streifen rechts : auf jedes Gel wurden rechts von den IPG-Streifen zur Überprüfung des Renaturie- rungsvorgangs ca. 2 ug PKA aufgetragen. Das Enzym war aktiv, phosphorylierte die beiden basischen Peptide gut und zeigte wenig Autophosphorylierung (Kontrolle ohne Substrat) und wurde von dem EGF-Rezeptor-Kinase-Substrat eher gehemmt.

Konkordanzliste : control Kontrolle PKC substrate PKC-Substrat EGF receptor kinase substrate EGF-Rezeptor-Kinase- Substrat PKA substrate PKA-Substrat