La présente invention est relative à des lignées immortalisées de cellules issues du tissu adipeux humain, à leur procédé de préparation et à leurs applica¬ tions en tant que modèle d'étude de la physiopathologie du métabolisme et notamment de l'obésité et du diabète, comme outils pour le développement de médicaments pour le traitement des états pathologiques liés aux troubles du métabolisme tels que l'obésité et le diabète et comme médicaments.

L'obésité et le diabète constituent des pro¬ blèmes de santé majeurs dans le monde occidental et des facteurs de risque importants de mortalité précoce. Les facteurs considérés comme responsables du développement de l'obésité et du diabète ne sont pas encore tous bien connus. Toutefois, il est maintenant bien admis que les défauts de thermogenèse (par exemple des défauts de dis- sipation d'énergie sous forme de chaleur, avec comme con¬ séquence une accumulation de lipides) interviennent dans les mécanismes de l'obésité ; il est également bien admis que le tissu adipeux et notamment le tissu adipeux brun est l'effecteur principal de la thermogenèse facultative chimique.

Le tissu adipeux (brun et blanc) est essen¬ tiellement constitué d'adipocytes (3/4 du nombre total de cellules du tissu adipeux) . Les autres cellules présentes dans le tissu adipeux appartiennent notamment aux cellu- les précurseurs, également dénommées cellules inter¬ stitielles (cellules sans lipides) et comprennent en par¬ ticulier les adipoblastes (cellules mésenchymateuses sans lipides) et les préadipocytes (cellules estérase-positi- ves sans lipides) . Le tissu adipeux blanc (ou WAT pour whi te adi- pose tiss e) est considéré comme un organe distinct du tissu adipeux brun (ou BAT pour brown adipose tissue) ; ces deux tissus adipeux se distinguent, notamment en ce

que leurs cellules précurseurs sont différentes ; la pré¬ sence de protéines mitochondriales découplantes (ou UCP pour uncoupling protein) est spécifique au BAT (tissu adipeux brun) . Pour ce qui concerne plus particulièrement le tissu adipeux brun, la chronologie de la différencia¬ tion cellulaire apparaît être la suivante : cellules interstitielles, adipocytes bruns peu différenciés, adi¬ pocytes bruns matures. Les adipocytes bruns sont caracté¬ risés par la présence de gouttelettes de triglycérides et de nombreuses mitochondries ainsi que par la présence d'une protéine particulière, la protéine découplante, précitée.

La stimulation de la prolifération et de la différenciation du tissu adipeux brun dépend notamment des récepteurs β-adrénergiques. Le récepteur β3-adrénergi- que humain a été caractérisé dans les dépôts adipeux blancs de l'adulte et dans le tissu adipeux brun des nou¬ veaux-nés et des malades atteints de phéochromocytome.

Le BAT est un tissu spécialisé dans la dissi- pation d'énergie, sous forme de chaleur. On le trouve chez la plupart des mammifères nouveau-nés.

Il est le site majeur du stockage et de la mobilisation de l'énergie ; son rôle en tant qu'organe endocrine, autocrine et intracrine a également été éta- bli.

Aussi bien des lignées cellulaires réalisées chez la souris [lignée murine 3T3, lignée F44-2A (Green et al., Cell, 1975, 5., 19-27 et Cell, 1976, 1, 105-113), que des cellules vasculaires stromales du tissu adipeux ont également fait l'objet d'études, dans la mesure où les préadipocytes sont présents dans le compartiment vasculaire-stro al (G. Ailhaud et al., Int. J. Obesity, 1992, 16, (suppl. 2), S17-S21) .

Toutefois, ces différentes lignées ou cellules ne sont pas adaptées à l'étude de la physiopathologie du métabolisme humain. En conséquence, il existe un besoin

pour le contrôle des maladies du métabolisme et notamment de l'obésité et du diabète chez l'homme, tant du point de vue pharmacologique (modèle d'étude pharmacologique des agents lipolytiques) que du point de vue thérapeutique. Or, jusqu'à présent, il a été impossible d'obtenir des lignées de préadipocytes humains, aptes à être maintenus en culture suffisamment longtemps, pour pouvoir d'une part, effectivement servir de modèle à l'étude d'agents lipolytiques et d'autre part être égale- ment aptes à être utilisés en tant qu'agent thérapeutique (en thérapie génique, par exemple) . En effet, les expé¬ riences réalisées sur des adipocytes humains en culture primaire sont dif icilement reproductibles et difficile¬ ment réalisables de manière systématique. La Demanderesse s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des lignées de cellules, issues du tissu adipeux brun ou blanc, utiles à la fois en tant que modèle d'étude des agents lipolytiques et comme agent thérapeutique (surexpression de la protéine découplante, par exemple) et qui ne présentent pas les inconvénients des adipocytes en culture primaire.

La présente invention a pour objet des lignées cellulaires, issues du tissu adipeux, caractérisées :

- en ce qu'elles sont constituées par des pré- adipocytes contenant un fragment d'acide nucléique com¬ prenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogene viral et au moins un promoteur sélectionné dans le groupe qui comprend le promoteur dudit oncogene viral et un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine,

- en ce qu'elles expriment au moins l'une des protéines suivantes : récepteurs βl et β2 adrénergiques, protéine découplante (UCP) , transporteurs du glucose, Glutl et Glut4, lipoprotéine lipase (LPL) et - en ce qu'elles sont aptes à être converties en adipocytes matures, qui produisent des lipides

(graisse) , expriment en outre les récepteurs α2 _A et β3 adrenergiques ainsi que le produit d'expression du gène Ob et présentent un rapport Glut4/Glutl inversé, par rapport aux dits préadipocytes immortalisés. Les marqueurs spécifiques des adipocytes matu¬ res (tissu adipeux brun et tissu adipeux blanc) sont notamment : Glut4, adipsine, LPL, enzyme de la lipolyse (hormone sensitive lipase : HSL) , récepteurs βl-, β2- et β3-adrenergiques et produit de l'expression du gène Ob. Selon un mode de réalisation avantageux, lesdites lignées sont issues du tissu adipeux brun.

Conformément à ce mode de réalisation avanta¬ geux desdites lignées, le fragment immortalisant est constitué par un fragment de l'oncogene T SV40, codant pour l'antigène T du virus SV40.

Également conformément à ce mode de réalisa¬ tion desdites lignées, le promoteur est sélectionné parmi le promoteur de l'oncogene T SV40 et le promoteur de la vimentine et plus particulièrement le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine compris entre les bases -878 et +93 de la séquence régulatrice de la vimen¬ tine.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le fragment d'acide nucléique du promo- teur de la vimentine comprend les bases -830 à -539 et/ou le fragment -540 à -140, situés en amont du site CAP.

De telles lignées, dénommées PAZ 6, ont été déposées auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 7 février 1995 sous le n° 1-1531.

De telles lignées de préadipocytes humains immortalisés présentent au moins les propriétés suivan¬ tes :

- elles expriment au moins les protéines sui- vantes : récepteurs βl et β2 adrenergiques, protéine découplante, Glutl et Glut4, lipoprotéine lipase ;

- elles sont aptes à être converties en adipo¬ cytes matures :

. qui produisent de la graisse multilobaire, . qui contiennent de nombreuses mitochondries, . qui expriment les récepteurs α2 _A et β3 adrenergiques ainsi que le produit d'expression du gène Ob, et qui présentent un rapport Glut4/Glutl inversé, par rapport auxdits préadipocytes immortalisés. Un fragment d'acide nucléique hybride

(oncogene T de SV 40 associé au promoteur de la vimen¬ tine) a été décrit (Demande de Brevet européen 90402009.6). L'introduction de ce fragment linéaire recombinant dans le noyau de cellules en cultures primai- res telles que cellules musculaires, cellules épithélia- les et cellules endothéliales est suivi d'une intégration et de l'expression de l'antigène grand T, induisant une prolifération cellulaire, conduisant à des lignées cellulaires permanentes. Toutefois, les travaux de l'Art antérieur ne suggèrent pas la possibilité que des cellules de préadi¬ pocytes, issues du tissu adipeux (brun ou blanc) humain puissent effectivement être immortalisées, en gardant toutes leurs caractéristiques (marqueurs et possibilité de différenciation) . En effet, aucune lignée humaine de ce type n'a jamais pu être obtenue, qu'elle soit d'origine pathologique (par exemple cancéreuse) ou expé¬ rimentale. Bien au contraire, de nombreuses tentatives (H. HAUNER et al., J. Clin. Invest., 1989, 84, 1663-1670) d'immortalisâtion ont toutes échouées, ce qui distin¬ guait, jusqu'à présent, les adipocytes humains de nom¬ breux autres types cellulaires.

Or, de manière inattendue, les lignées de pré¬ adipocytes immortalisés, conformes à l'invention, présen- tent effectivement les fonctionnalités des préadipocytes humains : expression des marqueurs des préadipocytes et

maturation en adipocytes dans des conditions appropriées, notamment en présence d'insuline, de glucocorticoïdes et éventuellement d'IGF-I.

En particulier, les préadipocytes immortalisés conformes à l'invention, permettent :

- l'étude des différentes étapes de maturation de la différenciation en adipocytes : apparition des mar¬ queurs spécifiques des adipocytes tels que récepteurs α2 _A et β3 adrenergiques et présence de gouttelettes lipidi- ques,

- l'analyse de l'influence de différentes con¬ ditions de culture sur la différenciation des adipocy¬ tes : insuline, glucocorticoïdes, triiodothyronine, éven¬ tuellement associée à la pioglitazone et ses dérivés, agonistes β-adrénergiques, NPY, mélatonine... ,

- l'analyse du rôle du produit d'expression du gène Ob dans les adipocytes différenciés et matures selon l'invention dans la thermogénèse,

- une étude plus proche de la réalité que ne sont les cellules CH0-RAβ3, pour l'étude des récepteurs intervenant dans les processus de lipolyse, tels que les récepteurs β2 et β3 adrenergiques.

La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de préadipocytes immortalisés, issus de tissus adipeux (bruns ou blancs) humains, carac¬ térisé en ce qu'il comprend la transformation de préadi¬ pocytes issus du tissu adipeux (brun ou blanc) humain par une séquence d'acide nucléique telle que définie ci- dessus. La présente invention a également pour objet un procédé de conversion des préadipocytes conformes à l'invention en adipocytes matures, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture des préadipocytes immortalisés conformes à l'invention, dans un milieu contenant au moins de l'insuline.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit milieu comprend en outre au moins l'un des composés suivants : glucocorticoïde, triiodothyronine (T3), éventuellement associée à de la pioglitazone ou à ses dérivés, agonistes des récepteurs β-adrénergiques, NPY, mélatonine.

De manière avantageuse, les préadipocytes immortalisés conformes à l'invention constituent égale¬ ment un outil pour la sélection de substances intervenant dans l'activation de la lipolyse et/ou de la thermo¬ genèse ; conformément à l'invention, le procédé de sélec¬ tion et d'identification de substances capables de régu¬ ler la lipolyse et/ou la thermogenèse comprend :

- la mise en contact des préadipocytes immor- talisés conformes à l'invention avec au moins une sub¬ stance apte à les transformer en adipocytes,

- la mise en contact des adipocytes matures obtenus avec une substance agissant sur au moins un récepteur tel que les récepteurs α2 _A ou β3 adrenergiques, les récepteurs de l'insuline et de l'IGF, les récepteurs de l'ACTH et les récepteurs du métabolisme du glucose

(Glutl, Glut4) desdits adipocytes matures, en vue de la modulation de la lipolyse et/ou de la thermogenèse et

- la détection de la formation d'un complexe du type ligand-récepteur.

Un tel procédé permet donc la sélection de ligands spécifiques des différents récepteurs cités : α2 _A ou β3 adrenergiques, récepteurs de l'insuline et de l'IGF, récepteurs de l'ACTH et récepteurs du métabolisme du glucose (Glutl, Glut4) des adipocytes matures, lesquels ligands agissent en outre sur la modulation de la lipolyse et/ou de la thermogenèse.

La présente invention a également pour objet un modèle d'étude des protéines exprimées par les adipo- cytes, notamment les récepteurs α2 ou β3 adrenergiques,

les récepteurs de l'insuline, de l'IGF, de l'ACTH et les récepteurs du métabolisme du glucose (Glutl, Glut4) humains, caractérisé en ce qu'il est constitué par des adipocytes matures obtenus à partir des préadipocytes immortalisés conformes à l'invention.

Un tel modèle permet l'étude, d'un point de vue pharmacologique, des récepteurs impliqués dans les processus de lipolyse et de thermogenèse, qui lorsqu'ils présentent des anomalies, induisent des états pathologi- ques tels que le diabète et/ou l'obésité. Un tel modèle, particulièrement proche de l'état physiologique humain permet l'identification de ligands, plus affins pour ces récepteurs et ainsi la mise au point de médicaments actifs dans les maladies précitées. La présente invention a également pour objet un modèle d'étude de la régulation des gènes présents dans les adipocytes humains, caractérisé en ce qu'il est constitué par des préadipocytes immortalisés conformes à 1'invention ou des adipocytes matures obtenus à partir desdits préadipocytes immortalisés.

La présente invention a, en outre, pour objet un procédé pour l'étude de l'affinité d'un récepteur exprimé par des adipocytes, pour un ou plusieurs ligands déterminés, lequel procédé comprend : - la mise en contact des préadipocytes immor¬ talisés conformes à l'invention, avec au moins une sub¬ stance apte à les transformer en adipocytes,

- la mise en contact des adipocytes matures obtenus avec les ligands déterminés, et - la détection d'une réaction affine entre lesdits adipocytes et lesdits ligands déterminés.

La présente invention a, également, pour objet des compositions lipolytiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent des adipocytes matures obtenus à partir des préadipocytes immortalisés conformes à l'invention.

La présente invention a, en outre, pour objet des compositions pharmaceutiques destinées à combattre l'obésité, caractérisées en ce qu'elles comprennent des adipocytes bruns matures, obtenus à partir des préadipo- cytes immortalisés conformes à l'invention, éventuelle¬ ment associées à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention a également pour objet des anticorps anti-adipocytes, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié avec des adipocytes matures obtenus conformément au procédé de conversion des préadipocytes immortalisés en adipocytes matures selon l'invention.

De tels anticorps sont particulièrement adap- tés à leur utilisation pour l'immunothérapie de l'obésité, notamment en supprimant les adipocytes en excès.

La présente invention a également pour objet des séquences d'acide nucléique, issues des lignées con- formes à l'invention, caractérisées en ce qu'elles sont aptes à exprimer au moins l'une des protéines suivantes : récepteurs βl et β2 adrenergiques, protéine découplante, Glutl et Glut4, lipoprotéine lipase (LPL) .

La présente invention a, en outre, pour objet un kit ou trousse de détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour une protéine exprimée par un adipocyte, caractérisé en ce qu'il comprend :

- une culture de préadipocytes conformes à l'invention, - des moyens de conversion desdits préadipocy¬ tes en adipocytes matures, et

- un ou plusieurs ligands témoins.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet

de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :

- la figure 1 illustre les produits exprimés par les préadipocytes immortalisés conformes à l'invention,

- la figure 2 montre la différenciation des préadipocytes en culture,

- la figure 3 montre les produits exprimés par les adipocytes obtenus à partir des préadipocytes con- formes à l'invention,

- la figure 4 illustre l'effet d'un certain nombre d'agonistes β sur la lipolyse.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Lignée de préadipocytes bruns humains conforme à l'invention.

1) Isolement de préadipocytes d'origine humaine :

Du tissu adipeux brun est prélevé sur un enfant âgé de 18 mois, atteint d'un néphroblastome.

Les cellules vasculaires stromales sont obte¬ nues à partir de ce tissu par une digestion à la collagé- nase, conformément à la méthode décrite par HAUNER et al. (J. Clin. Invest., 1989, __, 1663-1670).

Le traitement du tissu adipeux brun est réa¬ lisé comme suit :

2 mg/ml de collagénase A (Boehringer) dans un tampon KRBH (Krebs Ringer Bicarbonate) comprenant en outre 20 g de sérum albumine bovine (BSA) /ml sont mis en contact avec ledit tissu ; la digestion est réalisée pen¬ dant 40 min à 37°C sous agitation (bain-marie 100 t/min) .

Une première filtration sur nylon (diamètre des pores : 190 μ ) est réalisée, puis les fragments res¬ tants sont à nouveau digérés pendant 30 min avec la même

solution à base de collagénase et filtrés également sur une membrane de nylon dont le diamètre de pores est de 190 μ .

Les suspensions cellulaires obtenues sont cen- trifugées à 200 g pendant 10 min.

Le culot cellulaire est lavé avec un tampon Krebs Ringer contenant de la sérumalbumine bovine (BSA) , puis avec le milieu de culture ; le culot contient les préadipocytes. Les cellules sont traitées avec une solution de Gey's, afin d'éliminer les hématies.

Les cellules obtenues (préadipocytes) sont ensemencées dans des boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre contenant 2 ml d'un milieu de culture comprenant : DMEM/HAM F12 (1:1 vol/vol) contenant : pénicilline 100 U/ml, streptomycine 0,1 mg/ml, sérum de veau à 7,5 %, sérum de veau de nouveau-né à 2,5 % (Boehringer) .

La densité d'ensemencement est de 20 000 cellules/cm ² . Les cultures sont maintenues à 37°C pendant

16 heures, dans une atmosphère contenant 10 % de C0 ₂ et 90 % d'air.

Après adhésion, les cellules sont lavées dans un tampon PBS et le milieu de culture est renouvelé et est constitué de 2 ml d'un milieu ITT (DMEM/Ham's F12

(1:1, v/v) et glutamax I, contenant 33 μM de biotine,

17 μM de pantothénate, 15 mM d'hépès, 0,2 nM de triiodothyronine (T3), de la pénicilline à 100 U/ml, de la streptomycine à 0,1 mg/ml), du sérum de veau à 7,5 % et du sérum de veau nouveau né à 2,5 %.

Le milieu est changé tous les 2 jours. 2) Tmmortalisation :

Les cellules ainsi obtenues sont transfectées par microinjection avec une construction comprenant la séquence codant pour l'antigène grand T de SV40 sous le contrôle du promoteur de la vimentine (Hu Vim 830-T/t) .

Le plasmide contenant cette séquence est décrit dans la Demande de Brevet européen n° 90402009.6 ; il exprime l'antigène T et l'antigène t du virus SV40 et est obtenu comme suit : Le fragment -830-+93 du promoteur de la vimen¬ tine est clone dans un plasmide pUC18 ; les clones sont obtenus par digestion de la séquence 5' du gène de la vimentine au niveau du site de l'enzyme de restriction PvuII. Le plasmide pUC18 contenant le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine est linéarisé par l'enzyme de restriction Xbal ; on obtient une extrémité 3' cohé- sive, qui est ajustée de manière à obtenir une extrémité franche, puis on lie le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine ainsi obtenu avec le fragment d'ADN de l'antigène T, par ligation de l'extrémité 3' Xbal du pro¬ moteur avec l'extrémité Sfil du fragment SV40.

Les extrémités BamHI 5' et 3' sont liées en présence de T4 ligase. Les séquences codant pour l'antigène T sont ainsi sous le contrôle de la région régulatrice de la vimentine de 830 paires de bases.

Les cellules ainsi transfectées sont cultivées sur le même milieu, sans T3 ; lorsqu'elles atteignent la confluence, elles sont trypsinisees une fois par semaine, de manière à permettre un passage hebdomadaire.

On obtient ainsi la lignée cellulaire de pré¬ adipocytes immortalisés, dénommée PAZ-6.

3) Caractéristiques de la liσnée cellulaire de préadipocytes immortalisés PAZ-6 :

Les préadipocytes bruns immortalisés, dénommés

PAZ-6, peuvent être mis en culture (passage hebdomadaire) pendant plusieurs mois sans perdre leurs caractéristiques morphologiques ou leurs marqueurs moléculaires qui peuvent être identifiés par PCR.

- différenciation en adipocytes matures : A n'importe quel moment, les préadipocytes bruns immortalisés obtenus peuvent être convertis en adi¬ pocytes par traitement avec de l'insuline et de la dexaméthasone ; cette conversion est caractérisée par l'accumulation de graisses multilobaires et par l'expression des marqueurs spécifiques des adipocytes que sont les récepteurs α2 _A et β3 adrenergiques, ainsi que l'expression de la lipoprotéine lipase. Les conditions de la conversion sont les sui¬ vantes : les cellules sont ensemencées à une densité de 10 000 cellules/cm ² et cultivées pendant 3 jours dans un milieu contenant du 6 % de sérum de veau foetal, de manière à obtenir la confluence ; on additionne ensuite aux dites cellules un milieu ITT (milieu DMEM/HAM F12 supplémenté avec de la biotine, du pantothénate, de l'Hépès, de la T3, de la pénicilline et de la streptomycine, tel que défini ci-dessus) , lequel milieu contient, en outre, 0,1 μM de dexaméthasone, 850 nM d'insuline, 1 μM de pioglitazone, 0,25 M d'IBMX (3- isobutyl-1-méthyl-xanthine) pendant 4 jours. Le milieu de culture est changé tous les 2 jours ; la différenciation est obtenue en environ deux semaines comme suit : après 15 à 21 jours dans ces conditions de culture, les cellules sont lavées avec un tampon PBS et remises en culture dans un milieu ne contenant ni insuline, ni dexaméthasone, ni sérum, mais supplémenté avec de la transferrine à 10 μg/ml et de la T3 à 1 nM pendant 24 heures avant d'utiliser ces cellules différenciées.

La vitesse de conversion est accélérée en présence de pioglitazone : en effet, les préadipocytes PAZ-6, en présence d'insuline et de dexaméthasone sont différenciées en adipocytes matures capables d'accumuler des globules de graisse et d'effectuer une lipolyse ;

toutefois, cette différenciation est significativement augmentée en présence de pioglitazone. a. Marqueurs des préadipocytes bruns immorta¬ lisés et des adipocytes matures obtenus à partir de ces préadipocytes : récepteurs βl et β2 adrenergiques, protéine découplante (UCP) , GLUTl et GLUT4 (voir figure 1) ; marqueurs spécifiques des adipocytes matures obtenus : récepteurs Ct2 _A et β3 adrenergiques et lipoprotéine lipase (figure 3) ; en outre, la présence de nombreuses mitochondries confirme que ces cellules sont des adipocytes bruns matures.

- Matériel et méthode mis en oeuvre : Après différenciation, les adipocytes matures sont cultivés 24 à 48 heures dans le milieu ITT supplé¬ menté avec 10 μg/ml de transferrine.

Les conditions opératoires sont les suivan¬ tes :

L'ARN total des cellules PAZ-6 à analyser (préadipocytes immortalisés ou adipocytes matures) est extrait (CATHALA, 1983, DNA, 2, 329-335) et traité pen¬ dant 20 min à 37°C avec 0,3 U de DNase I sans RNase (RQ1 DNase, Promega) par μg d'acide nucléique, dans un milieu comprenant 40 mM de tampon Tris-HCl à pH 7,9, 10 mM de NaCl et 6 mM de MgCl. en présence de 2 U/μl d'inhibiteur de RNase placentaire (RNasin, Promega) . L'ARN est ensuite extrait par un mélange phénol/chloroforme et précipité.

La synthèse de l'ADNc est effectuée avec 100 U de transcriptase inverse de MLV (Gibco BRL) avec 200 ng d'ARN DNasé dans 10 μl de tampon de transcriptase inverse (50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl. et 10 mM DTT) contenant 0,4 mM de chaque dNTP, 10 μM d'hexanucléotides aléatoires (Pharmacia, France) et 2 U/μl d'inhibiteur de RNase placentaire. Pour les gènes sans introns, un contrôle sans transcriptase inverse a

été effectué pour vérifier que l'amplification ne résulte pas d'ADN génomique résiduel.

Les échantillons sont ensuite supplémentés avec 4 μl de tampon lOxPCR (tampon lxPCR : 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 9,0 à 25°C, 0,1 % Triton X-100 et 1,5 mM MgCl.) , 0,5 μl de chaque dNTP 25 mM, 10 μl de DMSO à 50 % (pour les récepteurs βl, β2, β3, α2 et l'adipsine), 0,5 μl d'oligonucléotides sens et antisens à 25 mM cha¬ cun, 1 U de Taq-ADN polymérase (Promega) et de l'eau jusqu'à 40 μl.

Les ADNc sont dénaturés pendant 2 minutes à

94°C et amplifiés avec 29 cycles de températures (94°C,

15 s ; 60°C, 30 s ; 72°C, 30 s) suivis par 3 minutes d'extension finale à 72°C dans un thermocycleur (GeneAmpPCR System 9600, Perkin-Elmer Cetus) .

Les séquences des oligonucléotides sens et antisens et la taille des produits d'amplification sont les suivantes :

- RA-βl : séquences oligonucléotidiques :

5'-TCGTGTGCACCGTGTGGGCC-3' (SEQ ID NO: 1 et 5'-AGGAAACGGCGCTCGCAGCTGTCG-3' (SEQIDNO: 2) ; taille du produit amplifié : 265 pb ;

- RA-β2 : séquences oligonucléotidiques :

5 ' -GCCTGCTGACCAAGAATAAGGCC-3 ' ( SEQ ID NO: 3) et 5 ' -CCCATCCTGCTCCACCT-3 ' ( SEQ ID NO:4) ; taille du produit amplifié : 329 pb ;

- RA-β3 : séquences oligonucléotidiques :

5'-ATGGCTCCGTGGCCTCAC-3' (SEQ ID NO: 5) et 5'-CCCAACGGCCAGTGGCCAGTCAGCG-3' (SEQIDNO:6) ; taille du produit amplifié : 316 pb (KRIEF, J. Clin. Invest., 1993, 9_1, 344-349).

- UCP : séquences oligonucléotidiques :

5'-TAGGTATAAAGGTGTCCTGG-3' (SEQ ID NO: 7) et 5 ' -CACTTTTGTACTGTCCTGGTGG-3 ' (SEQIDNO:8) ; taille du produit amplifié : 590 pb (CASSARD et al., J. Cell Biochem. , 1990, __, 255-264) .

Selon le type d'amplification on obtient deux produits :

U = 29 cycles PCR U' = 39 cycles PCR.

- β-actine : séquences oligonucléotidiques :

5 ' -GAGACCTTCAACACCCC-3 ' (SEQ ID NO: 9) et

5 ' -GTGGTGGTGAAGCTGTAG-3 ' (SEQEDNO: 10) ; taille du produit amplifié : 236 pb (FEVE et al., J. Biol. Chem., 1992, __7, 15909-15915) ;

- α2-A : séquences oligonucléotidiques :

5'-CGAGCGAGCCAGGTGAAGCC-3' (SEQ ID NO: 11) et 5'-GCCAGCGGAAACCTCACACG-3 ' (SEQIDNO: 12) ; taille du produit amplifié : 403 pb (KOBILKA et al., Science, 1987, 238, 650-656) ;

- GLUT1 : séquences oligonucléotidiques : 5'-TGCTGGCTGTGGGAGGA-3' (SEQ ID NO: 13) et

5 ' -GAGGATGCCGACGACGAT-3 ' (SEQIDNO: 14) ; taille du produit amplifié : 470 pb (MUECKLER et al., Science, 1985, 221, 941-945) ;

- GLUT4 : séquences oligonucléotidiques :

5'-TCCTGCTGCCCTTCTGTC-3' (SEQ ID NO: 15) et

5'-GGCCTACCCCTGCTGTCT-3' (SEQIDNO: 16) ; taille du produit amplifié : 309 pb (FUKUMOTO

6 al., J. Biol. Che ., 1989, 264, 7776-7779) ; - adipsine :

séquences oligonucléotidiques :

5'-CGGCTGGGGCATAGTCA-3' (SEQ ED NO: 17) et 5'-GCACGCCCCCGCACACC-3' (SEQIDNO: 18) ; taille du produit amplifié : 200 pb (WHITE et al., J. Biol. Chem., 1992, 231, 9210-921) ;

- lipase (hormono-sensible) (HSL) : séquences oligonucléotidiques : 5'-GGGGCTGAGTTTGAGCG-3' (SEQ ID NO: 19) et

5'-GCTCCTCACTGTCCTGTCC-3' (SEQIDNO: 20) ; taille du produit amplifié : 286 pb (LANGIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, __, 4897-4901) ;

- lipase (lipoprotéine) : séquences oligonucléotidiques : 5'-CCTGCTCGTGCTGACTCTG-3' (SEQ ID NO: 21) et 5'-GGGCTCCAAGGCTGTATC-3' (SEQEDNO: 22) ; taille du produit amplifié : 473 pb (WION KL. et al., Science, 1987, _1_, 1638-1641).

Les séquences nucléotidiques subséquentes ont toutes été déterminées en employant le programme d'analyse élémentaire Oligo 4.0 (National Biosciences, Plymouth, MN 5547, USA).

En RT-PCR, les mêmes ARN messagers sont iden¬ tifiés dans le clone et dans la lignée.

- Résultats : La figure 1 illustre les produits exprimés par les préadipocytes immortalisés conformes à 1'invention (lignée PAZ-6) : ces préadipocytes expriment les récep¬ teurs adrenergiques βl (265 pb) , β2 (329 pb) et α2 _A (403 pb) , UCP (protéine découplante) (U et U' : 590 pb) , HSL (Hormone Sensitive Lipase) (H) (286 pb) , adipsine (Ad) (200 pb), GLUT1 (Gl) (470 pb) , GLUT4 (G4) (309 pb) et β-actine (Ac) (336 pb) . Chaque trace correspond à 200 ng d'ARN total initial, à partir duquel l'ADNc a été amplifié comme suit : RT-PCR de 29 cycles (sauf U' , PCR

de 39 cycles) effectuée avec (+) ou sans (-) reverse transcriptase.

M correspond à l'échelle de marqueur 123 pb.

La figure 2 montre la différenciation des pré- adipocytes en culture après confluence dans un milieu ITT supplémenté en T3, insuline et dexaméthasone, pendant 3 semaines.

La figure 3 montre les marqueurs exprimés par les adipocytes et notamment les récepteurs β3 (β3, 316 pb) et α2 _A adrenergiques et la LPL ; en outre les niveaux d'expression d'adipsine, de HSL, LPL et GLUT4 sont plus importants que ceux des préadipocytes.

En outre, ces cellules différenciées expriment encore l'UCP (figure 3) . L'ARNm de l'UCP est également présent par hybridation Northern .

2 semaines après la conversion en adipocytes, les cellules sont mises en culture dans un milieu dépourvu d'insuline et de dexaméthasone, ce qui dans les autres types cellulaires précédemment utilisés entraînait une diminution de l'expression du récepteur adrenergique β3, alors que ce n'est pas le cas pour ce qui concerne les cellules PAZ-6 selon l'invention.

La RT-PCR est réalisée dans les mêmes condi¬ tions que celles de la figure 1 (Ub=U' ) . 5 μl sur 50 μl total ont été déposé sur gel. L'image du gel est en néga¬ tif. Les mêmes fragments sont amplifiés.

Comme illustré ci-dessus, le RA-β3 est exprimé lorsque les préadipocytes bruns humains sont convertis en adipocytes après traitement avec l'insuline, la dexaméthasone et la pioglitazone.

Cette expression est également observée au niveau ARΝm à l'aide d'une amplification PCR modérée (29 cycles) et au niveau du récepteur à l'aide des essais de liaison en présence d'antagonistes βl et β2 (voir b.).

b. mise en évidence des récepteurs adrenergi¬ ques B (RA-β) .

* rl t-prmi na i on des s i e.-: de l i a i son an 1 i p:anr- ^{^} lignée cifin lairft PA7ι-6. - Méthode :

Les cellules sont lavées avec un tampon PBS, incubées pendant 5 minutes à 37°C avec une solution de trypsine/EDTA à 2 % et remises en suspension dans un milieu DMEM supplémenté avec du sérum de cheval à 10 %

(v/v) .

Après centrifugation à 450 x g pendant 5 minutes à 4°C, le culot cellulaire est lavé 2 fois avec un tampon PBS, puis les cellules sont remises en suspension dans du tampon PBS.

Pour les essais de liaison, 100 μl de suspension cellulaire sont incubés (1) en présence de 500 pM d'I-CYP, et en présence ou en l'absence de bupranolol 50 μM (pour définir les liaisons non- spécifiques) ou (2) en présence de ICI 118551 et/ou de CGP 20712A (chacun à 0,1 mM) .

L'essai de liaison proprement dit est effectué pendant 90 min à 25°C, dans un volume final de 250 ml de PBS supplémenté avec 50 mg/ml de sérum albumine bovine et de désipramine 1 mM.

La réaction est stoppée à l'aide d'une filtration rapide à travers un filtre en fibre de verre

Whatman GF/C, préalablement immergé dans une solution de

PBS contenant de la polyéthylèneimine à 0,3 %, pendant 30 min (pour réduire les liaisons non-spécifiques) .

Les concentrations en protéine sont déterminées selon la méthode de M. Bradford (Anal. Biochem., 1976, 72, 248-256).

La sérum albumine bovine est utilisée comme standard et les suspensions cellulaires sont

homogénéisées avec un homogénéiseur polytron pendant 5 secondes au maximum, avant la réaction.

- Résultats :

Dans la lignée non différenciée PAZ-6, environ 30 fmol de sites de liaison au I-CYP, dans les membranes isolées sont complètement bloqués par 50 μM de bupranolol

(la quantité de sites au I-CYP est donc d'environ 70 fmol), en présence de 500 pM de I-CYP et de 0,05 mM de bupranolol (qui bloque tous les sites de liaison β- spécifiques : βl-, β2 et β3 RA) , comme illustré au Tableau

I ci-après.

En présence de 100 nM d' CI 118551 (antagoniste spécifique des Raβ2) , les sites de liaison au I-CYP sont diminués de 46 %. La présence de sites RA-βl est vérifiée en utilisant du CGP 20712A, antagoniste spécifique des RA- βl, à une concentration de 10 nM. Dans ces conditions, 58 % des sites de liaison au I-CYP sont inhibés. Les deux antagonistes, utilisés simultanément, entraînent une diminution (inhibition) du nombre de sites de liaison de 86 %.

Ceci indique que les sites de liaison au ICYP dans les cellules PAZ-6 non différenciées sont pour la plupart des sites βl- et β2-adrenergiques, en quantités équimolaires.

Après différenciation de la lignée PAZ-6, on détermine la présence d'environ 20 fmol de sites de liai¬ son au I-CYP, dans les mêmes conditions que celles expo¬ sées ci-dessus. En présence de l'antagoniste spécifique des RA-β2, ICI 118551, le nombre de sites de liaison est réduit de 34 %. En présence de l'antagoniste spécifique des RA-βl, CGP 20712A, une diminution de 35 % est obser¬ vée. Les deux antagonistes, utilisés simultanément, diminuent le nombre de sites de liaison de 64 %.

Ce résultat indique la présence de sites βl- et β2-adrenergiques en quantités équimolaires ainsi que la présence de sites β3, qui constituent au moins 36 % du nombre total de sites de liaison au I-CYP. TABLEAU I

ISO = isoprénaline.

* arniïïinlat-.inn d'AMPπ dans __ lignéfi £_____

___j _______.

Dans la mesure où il n'existe pas d'antagoniste spécifique des RA-β3, une preuve directe de la présence de RA-β3 ne peut pas être obtenue à partir de la détermination des sites de liaison au I-CYP. Toute¬ fois, il existe un agoniste partiel, spécifique des RA-β3

(CGP12177A) , qui antagonise les RA-βl et β2 ; en consé¬ quence, une accumulation d'AMPc, après stimulation avec le CGP12177A, donnera une preuve directe de la présence de RA-β3.

- Méthode :

La méthode utilisée pour déterminer les taux intracellulaires d'AMPc est la suivante : les cellules sont lavées une fois dans du PBS et incubées en 1'absence ou en présence de 10 mM d'isoprénaline ou de CGP 12177A, pendant 15 min à 37°C, dans un tampon comprenant du PBS, de 1'IBMX 0,5 mM et de l'acide ascorbique 0,5 mM. Le tampon d'incubation est éliminé et les cellules sont lysées dans NaOH 1 M pendant au moins 20 min à 37°C. Le lysat est neutralisé avec de l'acide

acétique 1 M et centrifugé dans une microcentrifugeuse, à vitesse maximale, pendant 5 min.

Le surnageant est utilisé pour la détermination de l'AMPc (kit AMPc-^H Amersham) . - Résultats :

La stimulation des cellules PAZ-6 non- différenciées, par de 1'isoprotérénol (10 μM) , active tous les récepteurs adrenergiques β, entraînant une augmentation des taux d'AMPc d'un facteur 21. CGP 12177A (antagoniste βl et β2 et agoniste partiel β3) n'entraîne aucune stimulation significative de l'adénylyl cyclase, ce qui confirme l'absence de récepteurs adrenergiques β3 fonctionnels dans ces cellules PAZ-6 non-différenciées .

La stimulation de la lignée cellulaire PAZ-6 différenciée avec de 1'isoprotérénol (10 μM) active tous les RA-β (augmentation du taux d'AMPc/taux basai, d'un facteur 15), tandis que la stimulation avec du CGP 12177A entraîne seulement une stimulation de 20 % (augmentation du taux d'AMPc d'un facteur 2,4), suggérant la présence d'un nombre significatif de récepteurs adrenergiques β3 couplés à l'adénylyl cyclase) .

Cette stimulation partielle peut s'expliquer par la présence de RA-βl et -β2, qui ne sont pas stimulés par le CGP 12177A et par les propriétés agonistes partielles de ce composé. Ce résultat est compatible avec la conclusion ci-dessus qui précise que les sites de liaison au I-CYP, qui ne peuvent pas être bloqués par les antagonistes des RA-βl et -β2 mais peuvent être bloqués par le bupranolol, représentent des sites de liaison aux RA-β3.

c. Essai de lipolyse (sur la lignée PAZ-6) :

- Méthode :

Le test de lipolyse consiste à mesurer la quantité de glycérol généré par les adipocytes matures traités par des ligands lipolytiques.

Des monocouches d'adipocytes matures (différenciés) en plaques de culture (6 puits) sont lavées et préincubées une nuit dans du DMEM/Ham's F12 (1:1, v/v) comprenant 1 % de BSA sans acide gras. Les cellules sont ensuite incubées dans un tampon Krebs- Ringer phosphate (pH 7,4) comprenant 2 % de BSA sans acide gras, 4,5 g/1 de glucose, 50 μg/ml de Na ₂ S ₂ 0 ₅ et les ligands β-adrénergiques, dans un volume de 500 μl, pen¬ dant 2 heures à 37°C. Le taux de glycérol est mesuré sur 100 μl de milieu d'incubation en suivant la réduction du NAD en NADH à 340 nm en présence de 10 μg/ml de glycérol déshy- drogénase (issu d'Enterobacter aerogenes, Boehringer Mannheim) dans le tampon de réaction suivant : K.C0./NaHC0 ₃ 125 mM pH 10, NAD 3,5 mM et (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 330 mM.

- Résultats :

Les résultats sont reportés à la figure 4 qui illustre les résultats obtenus pour différents agonistes β : forskoline 10 ^"4 M (colonne a), isoprotérénol 10 ^"5 M (colonne b) , norépinéphrine 10 ^"s M (colonne c) , mélange norépinéphrine 10 ^"S M + phentolamine à 20 μg/ml (colonne d) , épinéphrine 10 ^"s M (colonne e) , mélange épinéphrine 10 ^"s M + phentolamine à 20 μg/ml (colonne f) , CGP 12177A 10 ^"s M (colonne g), CL 316,43 10 ^"5 M (colonne h), ICI 201651 10 ^"S M (colonne i) , exprimés en nmol/puits/2 heures par rapport au taux basai.

Les résultats, illustrés à la figure 4, montrent une lipolyse induite par un agent stimulant directement l'adénylyl cyclase (forskoline) , par des agonistes des RA-βl et RA-β2 (isoprotérénol,

norépinéphrine et épinéphrine) , en présence ou non d'un antagoniste α2 adrenergique (phentolamine) . On observe également une lipolyse induite par les agonistes spécifiques du RA-β3 (antagoniste RA-βl et RA-β2, comme le CGP 12777A, le CL 316,43 et l'ICI 20651). Ces observations suggèrent que la plupart de la lipolyse induite par 1'isoprotérénol dans les adipocytes humains différenciés PAZ-6, est contrôlée par les récepteurs adrenergiques β3. d. F ^y pression d_ gène û__ danS cel IUIPR

PΑZ-fi rlif p PnriPPS.

Les cellules PAZ-6 différenciées expriment l'équivalent humain du produit du gène Ob murin.

Lorsqu'elle est injectée, la leptine (protéine Ob) diminue apparemment l'appétit et par voie de conséquence l'obésité chez les souris Ob, dans lesquelles le gène correspondant est muté. Chez l'Homme, aucune mutation du gène Ob n'a été observée et la concentration de la protéine Ob est significativement augmentée chez les sujets obèses.

L'apparition simultanée du RA-β3 et du produit du gène Ob dans les adipocytes matures et différenciés

PAZ-6, suggère l'existence d'un lien entre ces deux protéines. En particulier, le traitement d'adipocytes de rat avec l'agoniste β3 CL 316,43, semble réduire de manière importante les taux d'ARNm codant pour la protéine Ob.

Le fait que le gène Ob soit exprimé dans les adipocytes PAZ-6 est tout à fait surprenant. En effet, jusqu'à présent la protéine Ob a été essentiellement considérée comme jouant un rôle dans la régulation de la satiété. Sa mise en évidence dans les adipocytes bruns suggère qu'elle joue un rôle dans la thermogénèse.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve¬ nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATIONS GENERALES:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

- CNRS

(B) RUE: 3 rue Michel Ange (C) VILLE: PARIS

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 75794 CEDEX 16

(A) NOM: STROSBERG Arthur Donny (B) RUE: 66 rue de Javel

(C) VILLE: PARIS

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 75015 (A) NOM: ZELBERFARB Vladimir

(B) RUE: 14 rue Le Perdriel

(C) VILLE: VILLEBON SUR YVETTE

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 91140

(ϋ) TITRE DE L' ENVENΗON: LIGNEES IMMORTALISEES DE CELLULES ISSUES DU TISSU ADIPEUX HUMAIN, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 22

(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:

(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk

(B) ORDINATEUR: EBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)

(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE: (A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 9504922 (B) DATE DE DEPOT: 25-APR-1995

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 20 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :

TCGTGTGCAC CGTGTGGGCC 20

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 24 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 2: AGGAAACGGC GCTCGCAGCT GTCG 24

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc ≈ "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 3 :

GCCTGCTGAC CAAGAATAAG GCC 23

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 17 paires de bases (B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 4:

CCCATCCTGC TCCACCT 17

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 18 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique

(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO. 5: ATGGCTCCGT GGCCTCAC 18

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONΠGURATION: linéaire (ϋ) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CCCAACGGCC AGTGGCCAGT CAGCG 25

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 7:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

TAGGTATAAA GGTGTCCTGG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 22 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

CACTTTTGTA CTGTCCTGGT GG 22

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 17 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

GAGACCTTC A AC ACCCC 17

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 18 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GTGGTGGTGA AGCTGTAG 18

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11 :

CGAGCGAGCC AGGTGAAGCC 20

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 12:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

GCCAGCGGAA ACCTCACACG 20

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 17 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique

(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: TGCTGGCTGT GGGAGGA 17

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: GAGGATGCCG ACGACGAT 18

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 15:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 15:

TCCTGCTGCC CTTCTGTC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 18 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 16:

GGCCT ACCCC TGCTGTCT 18

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 17 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 17:

CGGCTGGGGC ATAGTCA 17

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 18: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 17 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: hnéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc ≈ "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: GCACGCCCCC GCACACC 17

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 19:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 17 paires de bases (B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 19:

GGGGCTGAGT TTGAGCG 17

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 19 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique

(A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: GCTCCTCACT GTCCTGTCC 19

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION, linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 21: CCTGCTCGTG CTGACTCTG 19

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 22:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 22: GGGCTCC AAG GCTGT ATC 18

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MICRO-ORGANISMES

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28 rue du Docteur Roux , 75724 PARIS CEDEX 1 5

•p4l* N' o"Ofiri «

7 février 1995 1-1 531

S. INDICATIONS SUPP-.M.MTΛIMS ' "• 'ampllr «u* al *_CMMI'«). Un* toulll* •_?•'«• ••! Joint* pour la tult* ι)« M

"En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet européen est demandé, un échantillon du micro¬ organisme déposé ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet européen ou jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant, (règle 28. ) de la CBE)".

C. -TATS O.βlβN.S POUR USQUf-S IIS INDICATIONS SONT DONN-IS > (il to* ift.k_-*n. A* ••A4 pot MAftiot peur t t-o-u-t l la*.< l luuii** - M.*.lI-|ΛA-*.(l)

EUROPE CANADA ETATS-UNIS JAPON

D. INDICATIONS FOURNI. S.PAA-IUNT • (t ne rompu» tu* il i-inulnl

Itt intf _l cillβ _Λ t t _Λ vmi _t ft e _l -*β'»t ••'•AI _t iumι«*i url»rl*urom*Λ» iu hruu mitrnollonil ι («p*clΛ«r >• n-tvr* ainirtl* «M ^ι n«- ctliβni p. *ι.. • Ni « »r«r« iu i«pβl >)

I. r~J (., pι«ι*nι* I _t uill _t < t\t >κ«ι •'« >« ««m»».* inurA.uontl* lorι«v« (•"«•cl I M «Ml»' <• »«rι» r p«ι !'»•*><• r*<«»l«-r ⁾

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