De très nombreuses substances sont décrites comme améliorant la réponse immuni- taire à un antigène.

Il y a les sels minéraux insolubles dans l'eau, parmi lesquels l'hydroxyde d'aluminium et le phosphate de calcium sont les plus connus et sont les seuls autorisés à ce jour pour la vaccination humaine. Ils induisent peu de réactions d'intolérance au site d'in- jection mais leur efficacité est par contre médiocre et leur effet de courte durée.

Il y aussi les huiles injectables utilisées comme adjuvants dans les vaccins vétérinai- res. Elles sont très efficaces mais elles induisent parfois des réactions locales. Elles sont mises en oeuvre en mélange avec le milieu antigénique pour former des émulsions fluides injectables.

Lorsque ces émulsions sont du type huile-dans-eau (H/E), la protection de l'ani- mal contre la maladie est assurée rapidement, mais seulement pendant une courte durée, de l'ordre de quelques mois.

Lorsque ces émulsions sont du type eau-dans-huile (E/H), la protection de l'ani- mal contre la maladie n'est assurée qu'au bout de quelques semaines mais elle dure long- temps, jusqu'à une année ou plus. On pense que cette protection à long terme est due à l'en- robage par l'huile, des gouttes de milieu antigénique.

Il y a encore les sels hydrosolubles de cations multivalents associés à un anion or- ganique qui ont été décrits dans les brevets français publiés sous les numéros FR 2 733 151 et FR 2 754 715. Ces sels solubles sont très bien tolérés et assurent une protection rapide, mais de courte durée, lorsqu'ils sont utilisés comme adjuvant unique. Lorsqu'ils sont com- binés à des huiles sous forme d'émulsions ou de micro-émulsions (H/E), ils induisent une protection prolongée de durée cependant inférieure à celle conférée par des vaccins de type (E/H).

Le brevet américain publié sous le numéro 3,925,544 et le brevet belge publié sous le numéro 623,825, divulguent des compositions vaccinales comprenant comme adjuvant,

de 1 à 5 % poids/volume d'alginate de sodium et des ions d'insolubilisation de l'alginate, tels que l'ion calcium, la concentration des ions séquestrés d'insolubilisation de l'alginate, étant inférieure à la concentration nécessaire pour former une quantité de gel insoluble.

Il n'existe pas aujourd'hui de moyens de vaccination permettant à la fois d'assurer très rapidement une protection contre la maladie et de maintenir cette protection pendant longtemps. La demanderesse s'est donc attachée à résoudre ce problème en développant un adjuvant d'immunité qui n'ait pas les inconvénients précités.

C'est pourquoi l'invention a pour objet, une composition comprenant une phase grasse et une quantité non nulle d'un gel organométallique obtenu par complexation d'un polymère anionique ou d'un mélange de polymères anioniques différents, avec un cation métallique multivalent ou un mélange de cations métalliques multivalents différents.

Dans la composition objet de la présente invention, le gel organométallique est sus- ceptible d'être obtenu par mélange d'un volume Vc d'une suspension ou d'une solution contenant le sel de cation multivalent ou un mélange de sels de cations multivalents, avec un volume Vp d'une solution ou d'une suspension contenant le polymère anionique ou un mélange de polymères anioniques en des proportions suffisantes pour provoquer le phéno- mène de gélification conduisant au gel organométallique, avec si nécessaire, agitation du mélange résultant.

La phase grasse constitutive de la composition objet de la présente invention, com- prend généralement un ou plusieurs composés choisis parmi les huiles d'origine minérale, végétale ou animale, les esters alkyliques desdites huiles, les esters alkyliques d'acides gras ou les éthers alkyliques d'acides gras, les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'al- cools gras et de polyols.

Comme exemples d'huile d'origine minérale, il y a les huiles d'origine pétrolière, comme les huiles blanches minérales telles que le MARCOLTM 52. Comme exemples d'huiles d'origine végétale, il y a l'huile d'arachide, l'huile d'olive, l'huile de sésame, l'huile de soja, l'huile de germes de blé, l'huile de pépins de raisin, l'huile de tournesol, l'huile de ricin, l'huile de lin, l'huile de soja, l'huile de maïs, l'huile de coprah, l'huile de palme, l'huile de noix, l'huile de noisette, l'huile de colza ou encore le squalane ou le squalène d'olive.

Comme exemples d'huiles d'origine animale, il y a l'huile de spermaceti, l'huile de suif, le squalane ou le squalène extraits des foies de poissons.

Comme exemples d'esters alkyliques d'huiles, il y a les esters méthylique, éthylique, propyliques linéaire ou ramifié ou butyliques, linéaire ou ramifiés, desdites huiles.

Comme acides gras appropriés à la préparation des esters cités ci-dessus, il y a plus particulièrement, ceux comportant de 12 à 22 atomes de carbone, tels que par exemple, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide ricinoléique ou l'acide isostéa- rique et avantageusement un acide gras liquide à 20°C.

Comme exemples d'esters d'acides gras, il y a les esters alkyliques d'acides gras, tels que, l'oléate d'éthyle, l'oléate de méthyle, le myristate d'isopropyle ou le palmitate d'octyle, les esters d'acides gras et de polyols ou les éthers d'alcools gras et de polyols, et plus particulièrement, les monoglycérides d'acides gras, les diglycérides d'acides gras, les triglycérides d'acides gras, les esters d'acides gras avec un polyglycérol ou les esters d'aci- des gras et de propylèneglycol, les esters d'acides gras avec un hexol, tel que par exemple le sorbitol ou le mannitol, les esters d'acides gras avec un anhydride d'hexol, comme le sorbi- tane ou le mannitane.

Dans le cadre de la présente invention, la phase grasse peut comprendre un seul des composés cités ci-dessus ou bien un mélange de plusieurs des composés cités ci-dessus.

La composition objet de la présente invention comprend généralement entre environ 5% et 70% en poids, et plus particulièrement entre 15% et 60% en poids de phase grasse.

Parmi les cations métalliques multivalents susceptibles d'être complexés avec le po- lymère anionique ou le mélange de polymères anioniques, il y a plus particulièrement les cations métalliques divalents ou trivalents et tout particulièrement les cations divalents du calcium, du magnésium, du manganèse ou du zinc ou bien les cations trivalents du fer ou de l'aluminium.

Dans la suspension ou la solution de sels de cations, susceptible d'être mise en oeu- vre pour obtenir le gel organométallique, contenu dans la composition objet de la présente invention, la concentration en cations métalliques [C], exprimée en mole par litre de solu- tion ou suspension, est généralement comprise entre environ 10-3 mole par litre et 10 moles par litre, plus particulièrement entre 10-2 mole par litre et 5 moles par litre et tout particu- lièrement entre 0,1 mole par litre et 1 mole par litre.

Ces sels de cations sont pharmaceutiquement acceptables. Il s'agit par exemple d'un hydroxyde, d'un carbonate, d'un citrate, d'un gluconate, d'un glucoheptonate, d'un fructo-

heptonate, d'un lactate, d'un acétate, d'un propionate, d'un salicylate, d'un chlorure ou d'un glycérophosphate.

Comme exemples de sels mis en oeuvre dans la préparation du gel organométallique de la composition objet de la présente invention, il y a l'hydroxyde de calcium, le carbonate de magnésium, le carbonate de manganèse, le gluconate de calcium, le gluconate de man- ganèse, le glycérophosphate de manganèse, le gluconate de zinc, le fructoheptonate de cal- cium, le salicylate d'aluminium ou l'acétate d'aluminium.

Selon un mode particulier de la présente invention, le sel de cation multivalent mis en oeuvre est le glycérophosphate de manganèse ou un mélange de glycérophosphate de manganèse et de gluconate de manganèse.

Parmi les polymères anioniques susceptibles d'être complexés avec les cations mé- talliques multivalents, il y a plus particulièrement les polymères sulfatés, le dextrane, les carraghénates, les polymères carboxyliques, les polyacrylates, les pectines, les alginates, les gommes naturelles, la gomme xanthane ou la gomme de guar.

Selon un mode particulier de la présente invention, le polymère anionique mis en oeuvre est un alginate de sodium.

Dans la suspension ou la solution de polymères anioniques, susceptible d'être mise en oeuvre pour obtenir le gel organométallique, contenu dans la composition objet de la présente invention, la concentration en polymères anioniques [P], exprimée en pourcentage pondéral de la solution ou de la suspension, est généralement comprise entre environ 0,1 % et 10 % en poids, plus particulièrement entre 0,5 % et 5 % en poids et tout particulièrement entre 1 % et 5 % en poids.

Les proportions en suspension ou solution de sel du cation et en solution ou suspen- sion de polymère anionique pour réaliser le mélange conduisant à l'obtention du gel orga- nométallique, sont choisies de sorte que le rapport [P]/ [C], est compris entre 0,01 et 100, plus particulièrement entre 0,1 et 50 et tout particulièrement entre 1 et environ 10.

Les solvants desdites suspensions ou solutions mises en oeuvre pour préparer le gel organométalliques sont généralement des solvants polaires et de préférences miscibles en- tre eux. Il s'agit de préférence d'eau ou d'un mélange hydro-alcoholique pharmaceutique- ment acceptable.

Selon un aspect particulier de la présente invention, le gel organométallique est sus- ceptible d'être obtenu par mélange d'une suspension ou d'une solution aqueuse contenant le

sel de cation multivalent ou un mélange de sels de cations multivalents, avec une solution ou une suspension aqueuse contenant le polymère anionique ou le mélange de polymères anioniques, avec si nécessaire, agitation du mélange résultant.

Selon un autre aspect particulier de la présente invention, le gel organométallique est susceptible d'être obtenu par mélange d'une suspension ou d'une solution aqueuse contenant un sel de cation multivalent, avec une solution ou une suspension aqueuse conte- nant un polymère anionique, avec si nécessaire, agitation du mélange résultant.

La composition telle que définie précédemment, est de préférence sous forme d'une émulsion et en particulier sous forme d'une émulsion dont la phase continue est la phase grasse et la phase dispersée le complexe gélifié polymère anionique-cation métallique multivalent.

La composition telle que définie précédemment, peut comprendre aussi un ou plu- sieurs tensioactifs pharmaceutiquement acceptables.

Parmi les agents tensioactifs mis en oeuvre dans la composition objet de la présente invention, il y a les tensioactifs non ioniques, par exemple, les esters de polyglycérols, les esters de sucres comme les esters de sorbitan de mannitane ou de saccharose, les esters de sucres éthoxylés, les alcools gras alcoxylés, les acides gras éthoxylés, les monoglycérides et les diglycerides modifiés par réaction avec l'acide acétique ou l'acide lactique ; les mono glycérides, les diglycérides ou les triglycérides éthoxylés, les éthers de sucres, tels que les éthers de glucose, les éthers de xylose ou les éthers de lactitol.

Les tensioactifs mis en oeuvre sont plus particulièrement choisis de façon à ce que le HLB du mélange de tensioactifs soit compris entre 4 et 12 et de préférence, entre 5 et 8.

La composition telle que définie ci-dessus, comprend généralement entre environ 0,5% et 10% en poids et de préférence entre 1% et 5% en poids de tensioactifs.

L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation de l'émulsion telle que dé- finie précédemment, comprenant les étapes suivantes : (a) la préparation d'une suspension ou d'une solution aqueuse contenant au moins un sel insoluble de cation multivalent, au moins un polymère anionique hydrosoluble et éventuellement au moins un agent tensioactif hydrophile ; (b) l'émulsification de la suspension préparée à l'étape a), avec une phase huileuse contenant éventuellement un agent tensioactif lipophile ;

(c) si nécessaire la solubilisation du sel insoluble de cation multivalent par modifi- cation de pH de l'émulsion ; (d) éventuellement l'ajout d'un excès de cation multivalent ; et (e) la neutralisation de l'émulsion finale obtenue.

L'étape (a) du procédé consiste généralement en un mélange d'un volume Vc d'une suspension ou d'une solution de sel du cation avec un volume Vp d'une solution ou d'une suspension de polymère anionique, dans un rapport volumique Vc/Vp généralement com- pris entre 1/100 et 1/1 de préférence entre 1/50 et 1/10, soit en versant la suspension ou la solution de sel de cation dans la solution ou la suspension de polymère anionique avec, si nécessaire, agitation du mélange résultant, soit en versant la suspension ou la solution de polymère anionique dans la solution ou la suspension de sel de cation avec, si nécessaire, agitation du mélange résultant.

On met de préférence en oeuvre dans l'étape (a), un ou plusieurs sels choisis parmi l'hydroxyde de calcium, le carbonate de magnésium, le carbonate de manganèse, le gluco- nate de calcium, le gluconate de manganèse, le glycérophosphate de manganèse, le gluco- nate de zinc, le fructoheptonate de calcium, le salicylate d'aluminium ou l'acétate d'alumi- nium.

Selon une variante particulière du procédé tel que défini précédemment, l'émulsion obtenue à l'étape (e) est dissoute dans un solvant de la phase grasse pour obtenir une sus- pension de gel organométallique et la suspension résultante est soumise à une centrifuga- tion pour isoler ledit gel. Cette variante est mise en oeuvre pour préparer une composition à faible teneur en huile.

Selon un autre aspect de la présente invention, celle-ci a pour objet, l'utilisation de la composition telle que définie précédemment, comme phase adjuvante d'une composition vaccinale.

L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'un vaccin comprenant l'adjonction comme adjuvant d'immunité, d'une quantité efficace de la composition telle que définie précédemment.

La composition telle définie précédemment peut être utilisée en combinaison avec des adjuvants huileux classiques, connus de l'homme du métier.

Lorsque le vaccin préparé est de type émulsion E/H, on mélange la composition ob- jet de la présente invention avec la phase antigénique puis on émulsionne le tout.

Selon un dernier aspect de la présente invention celle a pour objet une composition comprenant au moins un antigène ou au moins un générateur in vivo d'un composé com- prenant une séquence d'acides aminés et une quantité non nulle d'une composition telle que définie précédemment.

Par antigène ou au moins un générateur in vivo d'un composé comprenant une sé- quence d'acides aminés, on désigne soit des micro-organismes tués, tels que les virus, les bactéries ou les parasites, soit des fractions purifiées de ces micro-organismes, soit des micro-organismes vivants dont le pouvoir pathogène a été atténué. A titre d'exemples de vi- rus pouvant constituer un antigène selon la présente invention, il y a le virus de la rage, les herpès virus, tels que le virus de la maladie d'Aujeszky, les orthomixovirus tels que In- fluenzae, les picornavirus tels que le virus de la fièvre aphteuse ou les rétrovirus tels que les VIH. A titre de micro-organisme du type bactérien pouvant constituer un antigène selon la présente invention, on peut citer E. Coli, et ceux des genres Pasteurella, Furonculosis, Vibriosis, Staphylococcus et Streptococcus. A titre d'exemples de parasites, il y a ceux des genres Trypanosoma, Plasmodium et Leishmania. On peut aussi citer les virus recombi- nants notamment les virus non enveloppés, tels que les adénovirus, le virus de la vaccine, le virus Canarypox, les herpès virus ou les baculovirus. On désigne aussi un vecteur re- combinant viral non enveloppé vivant, dont le génome contient, insérée de préférence dans une partie non essentielle pour la réplication du virus enveloppé correspondant, une sé- quence codant pour une sous-unité antigénique induisant une synthèse d'anticorps et/ou un effet protecteur contre le susdit virus enveloppé ou micro-organisme pathogène ; ces sous- unités antigéniques peuvent être par exemple, une protéine, une glycoprotéine, un peptide ou une fraction peptidique et/ou protectrice contre une infection par un micro-organisme vivant tel un virus enveloppé, une bactérie ou un parasite. Le gène exogène inséré dans le micro-organisme peut être, par exemple, issu d'un virus Aujeszky ou HIV.

On peut citer notamment un plasmide recombinant constitué d'une séquence de nu- cléotides, dans laquelle est insérée une séquence nucléotidique exogène, provenant d'un micro-organisme ou d'un virus pathogène. Cette dernière séquence nucléotidique a pour but de permettre l'expression d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés, ce com- posé ayant lui-même pour but de déclencher une réaction immune dans un organisme hôte.

Par générateur"in vivo"d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés, on désigne tout un produit biologique capable d'exprimer ledit composé dans l'organisme hôte dans lequel on a introduit ledit générateur in vivo. Le composé comprenant la sé- quence d'acides aminés, peut être une protéine, un peptide ou une glycoprotéine. Ces géné- rateurs in vivo sont généralement obtenus par des procédés issus du génie génétique. Plus particulièrement, ils peuvent consister en des micro-organismes vivants, généralement un virus, jouant le rôle de vecteur recombinant, dans lequel est insérée une séquence nucléoti- dique, notamment un gène exogène. Ces composés sont connus en tant que tels et utilisés notamment comme vaccin sous unitaire recombinant. A cet égard, on peut se référer à l'ar- ticle de M. ELOIT et al., Journal of virology (1990) 71,2925-2431 et aux demandes inter- nationales de brevet publiées sous les numéros WO-A-91/00107 et WO-A-94/16681. Les générateurs in vivo selon l'invention peuvent aussi consister en un plasmide recombinant comprenant une séquence nucléotidique exogène, capable d'exprimer dans un organisme hôte un composé comprenant une séquence d'acides aminés. De tels plasmides recombi- nants et leur mode d'administration dans un organisme hôte ont été décrits en 1990, par LIN et al., Circulation 82 : 2217,2221 ; COX et al., J. of VIROL, Sept. 1993,67,9,5664- 5667 et dans la demande internationale publiée sous le numéro WO 95/25542. Selon la na- ture de la séquence nucléotidique comprise dans le générateur in vivo, le composé compre- nant la séquence d'acides aminés qui est exprimé au sein de l'organisme hôte, peut : (i) être un antigène, et permettre le déclenchement d'une réaction immune, (ii) avoir une action curative vis-à-vis d'une maladie, essentiellement une maladie d'ordre fonctionnel, qui s'est déclenchée chez l'organisme hôte. Dans ce cas, le générateur in vivo permet un traitement de l'hôte, du type thérapie génique.

A titre d'exemple, une telle action curative peut consister en une synthèse par le gé- nérateur in vivo de cytokines, comme les interleukines, notamment l'interleukine 2. Celles- ci permettent le déclenchement ou le renforcement d'une réaction immune visant à l'élimi- nation sélective des cellules cancéreuses.

Une composition selon l'invention comprend une concentration en antigène qui dé- pend de la nature de cet antigène et de la nature du sujet traité. Il est toutefois particulière- ment remarquable qu'un adjuvant selon l'invention, permette de diminuer notablement la dose habituelle d'antigène requise. La concentration adéquate d'antigène peut être détermi- née de manière classique par l'homme du métier. Généralement, cette dose est de l'ordre de

0,1 yg/cm3 à 1 g/cm3 plus généralement comprise entre 1 Rg/cm3 et 100 mg/cm3. La concentration dudit générateur in vivo dans la composition selon l'invention dépend, là en- core, notamment de la nature dudit générateur et de l'hôte dans lequel il est administré.

Cette concentration peut être aisément déterminée par l'homme du métier, sur la base d'ex- périence de routine. A titre indicatif, on peut toutefois préciser que lorsque le générateur in vivo est un micro-organisme recombinant, sa concentration dans la composition selon l'in- vention peut être comprise entre 102 et 10l5 microorganismes/cm3, de préférence entre 105 et 10'2 microorganismes/cm3. Lorsque le générateur in vivo est un plasmide recombinant, sa concentration dans la composition selon l'invention peut être comprise entre 0,01 g/dm3 et 100 g/dm3. Le vaccin tel que défini précédemment, est préparé en mélangeant la phase adjuvante et la phase antigénique, en ajoutant éventuellement de l'eau ou un milieu diluant pharmaceutiquement acceptable. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.

Exemple 1 On prépare une solution à 1% d'alginate de sodium haute viscosité et haute teneur en acide guluronique (SATIALGINETM SG800).

On prépare une suspension aqueuse 500 millimolaire d'un sel insoluble d'un sel in- soluble dans l'eau, l'hydroxyde de calcium.

On mélange 1 ml de la suspension et 20g de la solution d'alginate de sodium. Le mélange obtenu est dispersé au moyen d'un agitateur rapide dans 100 g d'une huile blanche minérale (MARCOLTM 52) contenant 1% en poids d'un agent tensioactif lipophile, le mo- nooléate de sorbitan ou MONTANETM 80, de nombre HLB égal à environ 4,3.

On obtient une émulsion qui est acidifiée par quelques gouttes d'acide acétique concentré. Cette émulsion est à phase huile continue ; sa phase dispersée est constituée d'un complexe gélifié stable d'alginate de calcium.

Cette émulsion d'alginate de calcium constitue un adjuvant d'immunité, qui peut être émulsionné avec un milieu antigénique pour former un vaccin de type E/H, stable, à efficacité améliorée. Ce nouvel adjuvant d'immunité peut éventuellement être mélangé à un autre adjuvant huileux tel que ceux de la famille des MONTANIDETM ISA, commercia- lisés par la société Seppic avant fabrication du vaccin final.

Exemple 2 On prépare une solution à 3.5% d'alginate de sodium basse viscosité et haute teneur en acide guluronique (SATIALGINETM S80).

On prépare une suspension aqueuse 500 millimolaire d'un sel insoluble, le carbo- nate de manganèse.

On mélange 1 ml de la suspension et 20g de la solution d'alginate de sodium. Le mélange obtenu est dispersé dans 100 g de MARCOLTM 52 contenant 2% en poids de MONTANETM 80, au moyen d'un agitateur rapide tournant à 3000 tours/mn pendant 3 minutes.

On obtient une émulsion qui est acidifiée par quelques gouttes d'acide acétique concentré pour solubiliser le carbonate de manganèse.

On obtient ainsi un adjuvant d'immunité qui est une émulsion est à phase huile continue et dont la phase dispersée est constituée d'un complexe gélifié stable d'alginate de manganèse.

Exemple 3 On réalise une solution à 3.5% d'alginate de sodium basse viscosité et haute teneur en acide guluronique (SATIALGINETM S80).

On prépare une suspension 500 millimolaire d'un sel peu soluble, le glycérophos- phate de manganèse.

On mélange 1 ml de la suspension, 20 ml de la solution d'alginate et 1,05 g (5%) d'un agent tensioactif hydrophile, d'oléate de sorbitan polyéthoxylé (indice d'OE = 80), le MONTANOXTM 80 de nombre HLB égal à 15. Le mélange obtenu est dispersé dans 100 g de MARCOLTM 52, contenant 5% en poids de MONTANT 80, au moyen d'un agitateur rapide tournant à 3000 tours/mn pendant 3 minutes. Le nombre HLB du système tensioac- tif mis en oeuvre (MONTANOXTM 80 + MONTANETM 80) est de 6.

On obtient une émulsion qui est acidifiée par quelques gouttes d'acide acétique concentré pour solubiliser le glycérophosphate de manganèse et former le complexe d'alginate de manganèse puis qui est neutralisée à pH égal à 5,5 avec de la soude. L'adju- vant ainsi obtenu, est une émulsion dont la phase continue est la phase huile et dont la phase dispersée est constituée d'un complexe gélifié stable d'alginate de manganèse.

L'efficacité de cet adjuvant, est évaluée chez des souris femelles de souche OF1 pe- sant 20 grammes, auxquelles on injecte par voie sous cutanée 100 jul de vaccins contenant de l'ovalbumine grade V (OVA), comme antigène (toutes les préparations ont été ajustées pour que la dose d'antigène administrée par animal soit constante et égale à 1 tig par injec- tion). Le schéma de vaccination comprend un rappel 28 jours après la première injection.

Un premier groupe de souris reçoit une dose d'OVA seule sans adjuvant (témoin 1), Un second groupe de souris, reçoit un vaccin (A) de type E/H (préparation A), cons- titué d'une partie d'adjuvant huileux standard (MONTANIETM ISA 564, commercialisé par la société SEPPIC) et d'une partie d'OVA dans du sérum physiologique (composition selon l'état de la technique).

Un troisième groupe de souris, reçoit une préparation (B) constituée de trois parties de vaccin (A) pour 1 partie d'adjuvant contenant un complexe d'alginate de manganèse préparé comme décrit ci-dessus, (composition selon l'invention) Un quatrième groupe de souris reçoit une préparation (C) constituée d'une partie de vaccin (A) pour une partie d'adjuvant contenant un complexe d'alginate de manganèse préparé comme décrit ci-dessus (composition selon l'invention).

Les taux d'anticorps IgGl et IgG2 sont mesurés à J = 28 jours, juste avant le rappel à J = 56 jours et à J = 90 jours. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant. Vaccin IgGl IgG2a J28 J56 J90 J28 J56 J90 témoin1 100 1 000 100 100 1 000 100 Préparation (A) 2 400 32 000 64 000 100 1 000 2 400 Préparation (B) 12 800 12 800 96 000 1 600 8 000 12 800 Préparation (C) 64 000 64 000 96 000 2 400 16 000 24 000 Tableau 1

Les résultats font apparaître que l'ajout du complexe d'alginate de manganèse aug- mente nettement l'efficacité du vaccin E/H standard (A) à court terme (28 jours), aussi bien dans la réponse humorale (IgGI), que dans la réponse cellulaire (IgG2a). Un effet similaire est observé après le rappel, à 56 jours et à 90 jours.

Exemple 4 On prépare un adjuvant d'immunité constitué d'un complexe d'alginate de manga- nèse émulsionné dans de l'huile minérale comme à l'exemple 3.

On mélange une partie de cet adjuvant avec une partie de solution d'ovalbumine dans du sérum physiologique, pour obtenir une préparation intermédiaire (I).

On prépare une émulsion placebo (P) constituée d'une partie d'adjuvant standard MONTANIDETMISA 564 et d'une partie de sérum physiologique.

L'efficacité de cet adjuvant, est évaluée chez des souris femelles de souche OF1 pe- sant 20 grammes, auxquelles on injecte par voie sous cutanée 100/il de vaccins contenant de l'ovalbumine grade V (OVA), comme antigène (toutes les préparations ont été ajustées pour que la dose d'antigène administrée par animal soit constante et égale à 1 lig par injec- tion). Le schéma de vaccination comprend un rappel 28 jours après la première injection.

Un premier groupe de souris reçoit une dose d'OVA seule sans adjuvant (témoin 1), Un second groupe de souris, reçoit un vaccin (A) de type E/H (préparation A), cons- titué d'une partie de MONTANIDETMISA 564 et d'une partie d'OVA dans du sérum phy- siologique (composition selon l'état de la technique), Un troisième groupe de souris, reçoit une préparation (D) constituée de trois parties de placébo (P) pour une partie de préparation (I) (composition selon l'invention), Un quatrième groupe de souris reçoit une préparation (E) constituée d'une partie de placébo (P) pour une partie de préparation (I) (composition selon l'invention).

Les taux d'anticorps IgG1 et IgG2 sont mesurés à J = 28 jours, juste avant le rappel à J = 56 jours et à J = 90 jours. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant. Vaccin IgGl IgG2a J28 J56 J90 J28 J56 J90 témoin110010001001001000100 Préparation (A) 2 400 32 000 64 000 100 1 000 1 000 Préparation (D) 12 800 128 000 128 000 200 6 000 12 800 Préparation (E) 12 800 128 000 128 000 200 9 600 12 800

l ableau Z Les résultats présentés dans le tableau 2 font apparaître une nette amélioration de l'efficacité du vaccin contenant un complexe d'alginate de manganèse à court terme (J = 28 jours) et après rappel. Les taux d'anticorps IgGl ne sont pas significativement différents de ceux obtenus avec la méthode de préparation du vaccin de l'exemple 3. Ceci démontre que les adjuvants selon l'invention sont efficaces, quelle que soit leur méthode de mise en oeu- vre, (l'addition à un vaccin huileux standard comme dans l'exemple 3 ou bien l'addition à un milieu antigénique puis addition à un adjuvant huileux standard comme dans l'exemple 4).

Exemple 5 On dilue à moitié le complexe d'alginate de manganèse émulsionné obtenu à l'exemple 3 dans un solvant organique (éther ou alcool isopropylique). Une partie de l'huile minérale de l'émulsion est dissoute et les billes de complexe d'alginate sont isolées par centrifugation. Le résidu de solvant est évaporé et on obtient un adjuvant d'immunité enrichi en complexe contenant seulement environ 5% d'huile minérale résiduelle.

L'efficacité de cet adjuvant, est évaluée chez des souris femelles de souche OF1 pe- sant 20 grammes, auxquelles on injecte par voie sous cutanée 100 AI de vaccins contenant de l'ovalbumine grade V (OVA), comme antigène (toutes les préparations ont été ajustées pour que la dose d'antigène administrée par animal soit constante et égale à 1 jug par injec- tion). Le schéma de vaccination comprend un rappel 28 jours après la première injection.

Un premier groupe de souris reçoit une dose d'OVA seule sans adjuvant (témoin 1), Un second groupe de souris, reçoit un vaccin contenant comme adjuvant, du glycé- rophosphate de manganèse de façon à ce que la concentration en cation Mn ++ soit la même que celle de la préparation F et contenant la même quantité d'OVA que la préparation F. (témoin 2) (composition selon l'état de la technique), Un troisième groupe de souris, reçoit une préparation (F) constituée du mélange de l'adjuvant, enrichi en complexe d'alginate de manganèse avec une solution antigénique d'OVA pour former une préparation vaccinale (F) contenant 10 gg/ml d'albun-ùne.

Les taux d'anticorps IgGl et IgG2 sont mesurés à J = 28 jours, juste avant le rappel à J = 56 jours et à J = 90 jours. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant. Vaccin IgGl IgG2a J28 J56 J90 J28 J56 J90 témoin 110010001001001000100 témoin 2 12 800 38 000 10 000 100 1 000 1 000 Préparation (F) 2 000 12 000 20 000 100 1 000 2 000 Tableau 3 L'effet retard de l'adjuvant,"complexe d'alginate de manganèse", par rapport au témoin 2, cation non complexé, est clairement mis en évidence par les dosages d'anticorps.

Exemple 6 On prépare 100 g d'une solution contenant 3,5 g d'alginate de sodium, 1,13 g de glycérophosphate de manganèse et 5,7 mg d'OVA. 60 g du mélange obtenu sont dispersés, au moyen d'un agitateur rapide tournant à 3000 tours/mn, dans 100 g de MARCOLTM 52 contenant 5% en poids, d'un mélange de monooléate de mannitane et d'acide oléïque poly- éthoxylé, en proportion telle que le nombre HLB du mélange est égal à 6.

On obtient une émulsion qui est acidifiée par quelques gouttes d'acide acétique concentré pour solubiliser le glycérophosphate de manganèse et former le complexe d'alginate de manganèse.

L'émulsion est ensuite portée à pH = 5.5 par ajout de triéthanolamine. On obtient un vaccin (G) constitué de l'antigène OVA et d'un adjuvant huileux composé d'une huile et d'un complexe d'alginate de manganèse.

L'efficacité de cet adjuvant, est évaluée chez des souris femelles de souche OF1 pe- sant 20 grammes, auxquelles on injecte par voie sous cutanée 100 AI de vaccins contenant de l'ovalbumine grade V (OVA), comme antigène (toutes les préparations ont été ajustées pour que la dose d'antigène administrée par animal soit constante et égale à 1 jUg par injec- tion). Le schéma de vaccination comprend un rappel 28 jours après la première injection.

Un premier groupe de souris reçoit une dose d'OVA seule sans adjuvant (témoin 1), Un second groupe de souris, reçoit un vaccin (A) de type E/H (préparation A), cons- titué d'une partie de MONTANIDETMISA 564 et d'une partie d'OVA dans du sérum phy- siologique (composition selon l'état de la technique), Un troisième groupe de souris, reçoit le vaccin (G) (composition selon l'invention), Un quatrième groupe de souris reçoit une préparation (H) constituée d'une partie du placébo (P) préparé à l'exemple 4, et d'une partie de vaccin (G) (composition selon l'inven- tion).

Les taux d'anticorps IgGl et IgG2 sont mesurés à J = 28 jours, juste avant le rappel à J = 56 jours et à J = 180 jours. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant. Vaccin IgGl IgG2a J28 J56 J180 J28 J56 J180 témoin1 100 1000 100 100 1000 100 Préparation (A) 240032000800010010001000 Préparation (G) 4800 32000 4800 100 2000 2000 Préparation (H) 12 800 128 000 12 800 3 200 8 000 4 800 Tableau 4

Le vaccin G contenant le complexe émulsionné comme adjuvant, est plus efficace que le vaccin standard A à court terme et d'efficacité voisine à plus long terme.

Le vaccin H contenant un mélange de deux adjuvants, est nettement plus performant que les deux vaccins à un seul adjuvant, aussi bien à court terme qu'après 56 jours. Une syner- gie est donc observée Exemple 7 On reprend le complexe d'alginate de manganèse émulsionné obtenu à l'exemple 3 et on le dilue à moitié dans un solvant organique (éther ou alcool isopropylique). Une par- tie de l'huile minérale de l'émulsion est dissoute et les billes de complexe d'alginate peu- vent être isolées par centrifugation.

Le résidu de solvant est évaporé et on obtient un adjuvant d'immunité enrichi en complexe contenant seulement environ 5% d'huile minérale résiduelle.

L'efficacité de cet adjuvant, est évaluée chez des souris femelles de souche OF1 pe- sant 20 grammes, auxquelles on injecte par voie sous cutanée 100 t41 de vaccins contenant un antigène parasitaire de larves de Trichinella spiralis (toutes les préparations ont été ajus- tées pour que la dose d'antigène administrée par animal soit constante et égale à 5 jug par injection). Le schéma de vaccination comprend un rappel 28 jours après la première injec- tion.

Un premier groupe de souris, reçoit un vaccin de type E/H, constitué d'une partie de MONTANMETM ISA 763 et d'une partie d'antigène parasitaire de larves de Trichinella spiralis dans du sérum physiologique, (témoin 4), Un second groupe de souris, reçoit un vaccin contenant comme adjuvant, du glycé- rophosphate de manganèse de façon à ce que la concentration en cation Mn ++ soit la même que celle de la préparation J et contenant la même quantité d'antigène parasitaire de larves de Trichinella spiralis que la préparation J. (témoin 5), Un troisième groupe de souris, reçoit une préparation (J) contenant 50jHg/ml d'an- tigène constituée du mélange de l'adjuvant, enrichi en complexe d'alginate de manganèse avec la solution antigènique d'antigène parasitaire de larves de Trichinella spiralis (compo- sition selon l'invention).

Les taux d'anticorps IgGl et IgG2 sont mesurés à J = 14 jours, J = 42 jours et J = 90 jours. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant. Vaccin IgGl IgG2a J14 J42 J90 J14 J42 J90 témoin 4 1 000 100 000 64 000 30 10 000 5 000 témoin5 1 000 64 000 10 000 50 1 000 1 000 Préparation (J) 1 000 100 000 64 000 200 20 000 2 000

Tableau 5 Les résultats font apparaître que le vaccin selon l'invention est aussi performant à court terme, que le vaccin contenant le sel soluble et qu'il est plus performant que le vaccin de type E/H. A long terme il est presque aussi performant que le vaccin huileux E/H et plus performant que le vaccin à sel soluble.

Exemple 8 Les vaccins contenant les différents adjuvants décrits dans les exemples 1 à 6 sont injectés par voie sous-cutanée à des souris de souche OF1 (volume injecté : 100 AI). L'in- tensité des réactions locales au point d'injection est notée après sept jours, sur une échelle numérique allant de 0 (pas de réaction) à 5 (très forte réaction avec nécrose du tissus), au bout de 7 jours. Les résultats consignés dans le tableau suivant, font apparaître que les vac- cins contenant les adjuvants selon l'invention sont bien tolérés, les réactions locales n'excé- dant pas celle du témoin A Adjuvant A B C D E F G H Score 1,6 1,3 1,6 1,0 1,6 1,5 0,8 1,5