Die Erfindung betrifft Antigene zur Herstellung von Anti¬ körpern gegen Kollagen, ein Verfahren zur Herstellung von solchen Antigenen, Antikörper gegen Kollagen, welche durch Immunisierung mit einem erfindungsgemäßen Antigen erhältlich sind, sowie die Verwendung solcher Antikörper zum Nachweis von Kollagen.

Kollagen stellt ein wichtiges Strukturprctein im Bindegewebe von Haut, Knorpel und Knochen dar. Bekannt sind 11 Typen, die jeweils aus drei Ketten bestehen. Jeder Typ setzt sich aus 1 - 3 verschiedenen Ketten zusammen, die als αl, α2 und 3 bezeichnet werden (E. Miller et al. in Methods in Enzymology 144, Structural and Contractile Proteins, ed. L. Cunningha , Academic Press Inc. 1987, p. 3 - 41) . Eine charakteristische Eigenschaft des reifen Kollagens bestimmter Gewebe, wie ins¬ besondere Knochen oder Knorpel, ist die Quervernetzung von nebeneinander liegenden Fasern durch Hydroxylysylpyridinolin oder Lysylpyridinolin (D. Fujimoto et al., J. Biochem 83 (1978), 863 - 867; D. Eyre et al., Ann. Rev. Biochem 53 (1984) , 717-748 und D. Eyre, Methods in Enzymology 144 (1987) , 115-139) . Diese Quervernetzungen können als bio¬ chemischer Marker für den spezifischen Nachweis von Kollagen genutzt werden (Z. Gunja-S ith et al., Biochem. J. 197 (1981) , 759-762) . Beim Abbau von extrazellulärem Kollagen

gelangen Hydroxylysylpyridinolin- oder Lysylpyridinolin- derivate, welche Peptidseitenketten enthalten oder freie Pyridinolin-Derivate mit Lysyl- oder Hydroxylysylresten, wie in der WO 91/10141 beschrieben, in Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin. Der Nachweis dieser Verbindungen in Körper¬ flüssigkeiten ergibt daher Hinweise auf den Abbau von extra¬ zellulärem Kollagen, wie er z.B. bei der Osteoporose sowie infolge von Tumoren des Knochengewebes auftritt. Zum Nachweis von solchen Hydroxylysyl- oder Lysylpyridinolinen mit Peptid¬ seitenketten wurden in der WO 89/12824 monoklonale Antikörper beschrieben, welche durch Immunisierung mit entsprechenden quervernetzten Kollagenfragmenten erhalten wurden, die aus dem Urin isoliert werden können. Auch bei dem in WO 91/08478 beschriebenen Verfahren erfolgt der Nachweis von Kollagen über einen Antikörper gegen natürliche, d.h. in vivo erzeugte quervernetzte Abbauprodukte von Kollagen.

Ein Nachteil dieser aus natürlichen Quellen isolierten Peptide ist, daß keine sichere Quelle für eine reproduzier¬ bare Herstellung der Antigene oder Bindepartner im Test vor¬ handen ist. Ein weiterer Nachteil der aus natürlichen Quellen isolierten Peptide ist die Gefahr einer Kontamination mit infektiösem Material.

Definierte Antigene können z.B. durch chemische Synthese eines Peptids erhalten werden, welches einem Epitop des Anti- gens entspricht. Werden hierfür kleine Peptide mit einem Molekulargewicht von etwa 700 - 1500 D verwendet, so ist die Bindung an ein Trägermolekül erforderlich, um ein Antigen mit immunogener Wirkung zu erhalten. Durch die Bindung an das Trägermolekül darf dabei die Struktur des Epitops nicht ver¬ ändert werden. Die Kupplung an das Trägermolekül erfolgt da¬ her bislang bevorzugt an den Enden der Peptidkette in

ausreichendem Abstand von dem vermuteten Epitopbereich (Laboratory Technics in Biochemistry and Molecular Biology, Synthetic Polypeptides as Antigens, Editors R.H. Burdon und P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford 1988, Seiten 95-100).

Ein Problem bei der chemischen Synthese eines definierten Antigens, das einem natürlichen Abbauprodukt von querver- netztem Kollagen entspricht, stellt die aus der Querver¬ netzung resultierende Hydroxylysyl- oder Lysylpyridinolin¬ Struktur dar, deren chemische Synthese bislang nicht gelungen ist.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein definiertes Antigen zur Herstellung von Antikörpern gegen Kollagen oder Kolla- genfragmentε, zum Einsatz als spezifischer Bindepartner des Antikörpers gegen Kollagen oder Kollagenfragmente in einem kompetitiven Immunoassay und als Standardmaterial zur Er¬ stellung einer Standard- oder Eichkurve in einem kompetitiven Immunoassay zum Nachweis von Kollagen oder Kollagenfragmenten zur Verfügung zu stellen.

Bisher wurde immer davon ausgegangen, daß es zum Nachweis der Kollagen oder Kollagenabbauprodukte in einer Probe notwendig sei, die Quervernetzungsstrukturen an sich oder sogenannte quervernetzte Peptide, die durch die Quervernetzung der Hydroxylysyl- oder Lysylreste Zustandekommen, nachzuweisen, da diese Hydroxylysyl- oder Lysylpyridinolinstruktur charak¬ teristisch für Kollagen ist. Beispiele für solche Nachweis¬ methoden sind in der WO 89/12824, WO 91/08478, WO 89/04491 und der WO 91/10141 beschrieben.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß es zur Lösung der oben genannten Aufgabe ausreicht, ein definiertes Anti¬ gen, einen Bindepartner oder ein Standardmaterial zu verwen¬ den, das ein synthetisches lineares Peptid enthält, das einer Sequenz des nichthelikalen linearen C- oder N-terminalen Bereiches von Kollagen entspricht. Die Vorteile bei Verwen¬ dung von synthetischen linearen Peptiden zur Verwendung als Bindepartner in Immunoassays, als Standardmaterial oder als Immunogen bei der Antikörper-Herstellung liegen darin, daß diese Peptide, im Gegensatz zu Peptiden aus natürlichen Quellen, in genau definierter Struktur reproduzierbar herge¬ stellt werden können. Zudem zeigt ein Immunoassay, in dem solche kurzen synthetischen Peptide eingesetzt werden, eine geringere Störanfälligkeit.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein kompetitiver Immuno¬ assay zum Nachweis von Kollagen oder Kollagenfragmenten in einer Probe, der dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Binde¬ partner, der ein synthetisches lineares Peptid enthält, das einer Sequenz des nichthelikalen linearen C- oder N-termina¬ len Bereiches von Kollagen entspricht, mit einem Antikörper, der das synthetische lineare Peptid zu binden vermag, und der Probe inkubiert und die Bindung des Antikörpers an den Binde¬ partner in geeigneter Weise bestimmt wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Standard¬ material zur Erstellung einer Standard- oder Eichkurve in einem kompetitiven Immunoassay zum Nachweis von Kollagen oder Kollagenfragmenten, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antigen enthalten ist, das ein synthetisches Peptid, das einer Sequenz des nichthelikalen C- oder N-terminalen Bereichs von Kollagen entspricht, enthält.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Anti¬ gen zur Herstellung von Antikörpern gegen Kollagen oder Kollagenfragmente, das ein synthetisches lineares Peptid, das einer Sequenz des nichthelikalen C- oder N-terminalen Be¬ reichs von Kollagen entspricht, enthält sowie die mit diesem Antigen hergestellten Antikörper.

Als synthetische lineare Peptide sind alle zusammenhängenden Aminosäuresequenzen des nichthelikalen C-oder N-terminalen Bereichs von Kollagen geeignet. Diese Bereiches sind aus Chu et al., Nature 310, 337-340 (1984), Click et al., Biochemistry 9, 4699-4706 (1970), Morgan et al., J. Biol. Chem. 245, 5042-5048 (1970) und Bernard et al., Biochemistry 22, 5213-5223 (1983) bekannt. Bevorzugt werden Peptide aus 5 bis 25 Aminosäuren, besonders bevorzugt aus 8 bis 20 Amino¬ säuren, verwendet. Dabei ist es nicht notwendig, daß die Sequenz den Bereich der Quervernetzung umfaßt. Sie kann aber sehr wohl ebenfalls mit diesem Bereich überlappen. In keinem Fall liegt aber in dem synthetischen Peptid eine Hydroxy¬ lysyl- oder Lysylpyridinolin-Quervernetzung vor. Am geeignet¬ sten haben sich die synthetischen Peptide aus dem C-termi- nalen Bereich von Kollagen erwiesen, da der nichthelikale C-terminale Bereich größer als der nichthelikale N-terminale Bereich von Kollagen ist. In diesem Bereich stehen somit mehr potentielle Epitope als in den N-terminalen Bereich zur Ver¬ fügung. Peptide mit der in SEQ ID NO 1, 2 oder 3 gezeigten Sequenz aus dem C-terminalen Bereich der αl-Kette von Kolla¬ gen sind besonders geeignet.

Die Konzentration von Abbauprodukten von Kollagen ist ein wichtiger diagnostischer Marker für das Ausmaß einer Osteo- lyse. Mit Hilfe der synthetischen linearen Peptide ist es möglich, einen kompetitiven Immunoassay zum Nachweis von

Kollagen oder Kollagenfragmenten durchzuführen. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß diese Peptide sehr gut mit den Kollagenfragmenten, die in natürlichen Proben wie Plasma, Serum oder Urin vorkommen, um Antikörper gegen diese Kolla¬ genfragmente konkurrieren und damit einen kompetitiven Test ermöglichen. Solche Antikörper gegen Kollagen oder Kollagen¬ abbauprodukte sind kommerziell erhältlich, beispielsweise in dem Telopeptide ICTP [ ¹²⁵ ] Radioimmunoassay Kit der Firma Orion Diagnostica, Finnland. Sie können aber ebenfalls er¬ findungsgemäß mittels des synthetischen linearen Peptids her¬ gestellt werden.

Zum Einsatz in einem kompetitiven Immunoassay kann das syn¬ thetische lineare Peptid direkt als Bindepartner, der -an eine Festphase gebunden ist, benutzt werden oder aber gekoppelt an eine zweite Komponente. Die Kopplung an die zweite Komponente erfolgt bevorzugt über die N- und C-terminale Aminosäuren des linearen Peptids. Gegebenenfalls kann zwischen dem Peptid und der zweiten Komponente noch ein Spacer eingefügt werden. Die zweite Komponente kann beispielsweise dazu dienen, das Peptid indirekt an eine Festphase zu koppeln. Beispiele hierfür sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt wird das Peptid an Rinder¬ serumalbumin gekoppelt und das Kopplungsprodukt adsorptiv an eine Festphase zum Beispiel ein Kunststoffröhrchen gebunden. Das Peptid kann auch an Biotin kovalent gebunden werden. Die Anheftung an die Festphase erfolgt dann über die Bindung an Avidin oder Streptavidin, das seinerseits an die Festphase gebunden wurde. Die zweite Komponente kann auch als Träger für mehrerer Peptide dienen, zum Beispiel in einem kompeti¬ tiven turbidimetrischen Inhibierung-Im unoassay (TINIA) , wobei mehrere Peptide an beispielsweise Albumin, Immunglobu- line, ß-Galaktosidase, Polymere wie Polylysin oder Dextran- moleküle wie in der EP-A-0 545 350 beschrieben oder Partikel

wie Latex gekoppelt sind. Vorzugsweise werden 30 bis 40 Peptidmoleküle je Trägermolekül gekoppelt. Das Peptid kann auch an eine Komponente, die eine Markierung darstellt, ge¬ koppelt sein. Beispiele für all diese Testvarianten sind dem Fachmann bekannt.

Bei der Testführung kann der Antikörper gleichzeitig oder sequentiell mit der Probe sowie dem Bindepartner, der das synthetische lineare Peptid enthält, inkubiert werden. An¬ schließend wird in üblicher Weise die Menge des gebundenen oder nichtgebundenen Antikörpers bestimmt. Als kompetitive Testvarianten zur Bestimmung der Menge an gebundenem oder ungebundenem Antikörper können beispielsweise Agglutinations¬ tests, wie TINIA, oder FPIA- (Fluoreszenz-Polarisations- Immunoassay) (W. Dandliker et al., J.Exp. Med. 122 (1965), 1029), EMIT- (Enzyme Multiplied Immunoassay) (Gunzer et al., Kontakte III (1980), 3 - 11) und CEDIA-Prinzipien (Henderson et al., Clinical Chemistry 32 (1986), 1637 - 1641) dienen. Die erfindungsgemäßen Peptide haben sich als besonders geeignet für die Verwendung als definierte Bindepartner zur Kompetition mit der Probe um die Bindung an die Antikörper erwiesen. Besonders bevorzugt sind die synthetischen linearen Peptid mit der in SEQ ID NO 1, 2 oder 3 gezeigten Sequenz.

Nach der Bestimmung des Ausmaßes der Bindung des Antikörpers an den Bindepartner, das ein Maß für die Menge an Antigen in der Probe darstellt, kann die genaue Menge an Antigen in der Probe in üblicher Weise durch Vergleich mit in gleicher Weise behandeltem Standard ermittelt werden.

Als Standard können Kollagenabbauprodukte isoliert aus natür¬ lichem Material verwendet werden. Diese zeichnen sich jedoch naturgemäß durch eine bestimmte Schwankung aus. Geeigneter

erwiesen hat sich als Standardmaterial ein Antigen, das das erfindungsgemäße synthetische lineare Peptid enthält. Das Antigen des Standards kann dabei lediglich aus diesem Peptid bestehen oder aber aus diesem Peptid, das an einen geeigneten Träger gekoppelt ist, der beispielsweise zur besseren Wasser¬ löslichkeit des Peptids dient. Zur Herstellung des Standard¬ materials aus Peptid und Träger wird das lineare Peptid, das einer Sequenz des nichthelikalen C- oder N-terminalen Be¬ reichs von Kollagen entspricht, synthetisiert und über seine N- oder C-terminale Aminosäure durch geeignete Kopplungs¬ methoden an das Trägermolekül gebunden. Es können ein oder mehrere Peptide pro Trägermolekül gebunden werden. Gegebenen¬ falls kann die Kopplung über einen Spacer erfolgen. Für be¬ stimmte Zwecke, wie beispielsweise für Agglutinationstests, kann es von Vorteil sein, mehrere erfindungsgemäße Peptide unterschiedlicher Sequenz an ein Trägermolekül zu binden, vor allem falls polyklonale Antikörper im Test eingesetzt werden, die nicht mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antigens herge¬ stellt wurden und damit meist mehrere Epitope erkennen.

Als Antikörper in dem kompetitiven Immunoassay können die be¬ reits bekannten Antikörper gegen Kollagenabbauprodukte ver¬ wendet werden. Geeignet sind auch Antikörper, die mit Hilfe eines Antigens, das das erfindungsgemäße lineare synthetische Peptid enthält, gewonnen wurden.

Zur Immunisierung müssen die linearen synthetischen Peptide, die einer oder mehrerer Sequenzen des nichthelikalen C- oder N-terminalen Bereichs von Kollagen entsprechen, an ein ge¬ eignetes Trägerprotein, wie zum Beispiel Keyhole Limpet Hemo- cyanine, Rinderserumalbumin oder Edestin gebunden werden.

Zur Herstellung dieser Antigene oder Immunogene werden zu¬ nächst die linearen Peptide in üblicher Weise chemisch synthetisiert. Anschließend erfolgt die Kopplung der syn¬ thetischen Peptide über die Nrterminale Aminogruppe mittels Maleinimidohexansäure-N-hydroxysucciminidester an die oben genannten Trägerproteine. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß zur Herstellung von Antikörpern, die für die kompetitive Testführung geeignet sind, synthetische lineare Peptide mit der in SEQ ID NO 1, 2 oder 3 gezeigten Sequenz besonders geeignet sind.

Mit den erfindungsgemäßen Antigenen, die ein synthetisches lineares Peptid enthalten, das einer Sequenz des nicht¬ helikalen C- oder N-terminalen Bereichs von Kollagen ent¬ spricht, ist es möglich, Antikörper zu erhalten, welche nicht nur das erfindungsgemäße Peptid sondern auch die in Körper¬ flüssigkeiten vorkommenden Abbauprodukte von Kollagen er¬ kennen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen Kollagen oder Kollagen¬ fragmente durch Immunisierung mit einem erfindungsgemäßen Antigen und Isolierung des gewünschten Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren. Vor¬ zugsweise erfolgt die Isolierung des gewünschten Antikörpers über Immunadsorption an einem an ein Trägerprotein, vorzugs¬ weise Sepharose, gekoppelten Peptid der in SEQ ID NO 1, 2 oder 3 gezeigten Sequenz.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Kollagen oder Kollagenfragmente durch Immunisierung mit einem erfindungs¬ gemäßen Antigen, Immortalisierung der Milzzellen der immuni-

sierten Tiere, Klonierung derjenigen immortalisierten Milz¬ zellen, welche den gewünschten Antikörper produzieren und Isolierung des Antikörpers aus den klonierten Zellen oder dem Kulturüberstand dieser Zellen..

Die Immunisierung erfolgt in den hierfür üblicherweise ver¬ wendeten Tieren, vorzugsweise werden Mäuse oder Kaninchen verwendet.

Die Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere erfolgt nach dem Fachmann geläufigen Verfahren, wie z.B. der Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495 - 497) oder durch Transformation mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV-Transformation) . Zum Nachweis derjenigen immortalisier¬ ten Zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, wird eine Probe des Kulturüberstands in einem üblichen Immunoassay mit dem zur Immunisierung verwendeten erfindungsgemäßen Anti¬ gen inkubiert und untersucht, ob ein Antikörper an dieses Antigen bindet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die nach dem er¬ findungsgemäßen Verfahren erhältlichen polyklonalen und mono- klonalen Antikörper.

Diese polyklonalen und monoklonalen Antikörper reagieren nicht nur mit dem zur Immunisierung verwendeten erfindungs¬ gemäßen Hapten, sondern gut mit Kollagen, sowie mit den in Körperflüssigkeiten gefundenen natürlichen Abbauprodukten von Kollagen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können daher in den oben beschriebenen Nachweisverfahren zur Bestimmung von Kollagen oder Ko1lagenfragmenten verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwen¬ dung eines erfindungsgemäßen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers zur Bestimmung der Osteolyse durch Inkubation des Antikörpers mit einer Gewebeprobe und Bestimmung des an den Antikörper bindenden Kollagenabbauproduktes.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele in Verbin¬ dung mit den Sequenzprotokollen näher erläutert.

SEQ ID NO 1 zeigt die Sequenz eines erfindungsgemäßen

Peptids aus 9 Aminosäuren, wobei Xaa eine beliebige Aminosäure bedeutet.

SEQ ID NO 2 zeigt die Sequenz eines erfindungsgemäßen

Peptids aus 16 Aminosäuren.

SEQ ID NO 3 zeigt die Sequenz eines erfindungsgemäßen

Peptids aus 10 Aminosäuren.

Beispiel 1

Peptidsynthesen

Die eine Teilsequenz der Aminosäurensequenz von Kollagen aufweisenden Peptide der in den Sequenzprotokollen SEQ ID NO 2 und 3 gezeigten Sequenzen werden mittels Fluorenyl- methyloxycarbonyl(Fmoc)-Festphasenpeptidsynthese an einem a) Labortec SP 640 Peptide Synthesizer bzw. b) Zinsser Analytic SMPS 350 Peptidsynthesizer hergestellt.

Herstellung von Acetyl-Ser-Ala-Gly-Phe-Asp-Phe-Ser-Phe- Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Gln-Glu-Lys-Amid (SEQ ID NO 2)

In der angegebenen Reihenfolge werden jeweils 4,0 Äquivalente von folgenden Fmoc-Aminosäurederivaten ein¬ gesetzt:

Lys mit tert. Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe

Glu mit tert. Butylester-Schutzgruppe

Gin ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Pro ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Pro ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Gin • ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Pro ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Leu ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Phe ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Ser mit tert. Butylether-Schutzgruppe

Phe ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Asp mit tert. Butylester-Schutzgruppe

Phe ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Gly ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Ala ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Ser mit tert. Butylether-Schutzgruppe

Acetyl Essigsäureanhydrid

Die Aminosäuren oder Aminosäurederivate werden in N- Methylpyrrolidon gelöst.

Das Peptid wird an 3 g 4-(2* ,4\'-Dimethoxyphenyl-Fmoc- aminomethyl)-phenoxy-Harz (Tetrahedron Letters 28 (1987), 2107) mit einer Beladung von 0,87 mmol/g syn¬ thetisiert (JACS 95 (1973), 1328). Die Kupplungs-

reaktionen werden bezüglich Fmoc-Aminosäurederivat mit 4,4 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und 4,8 Äqui¬ valenten N-Hydroxybenzotriazol in Dimethylformamid als Reaktionsmedium während 60 Minuten durchgeführt. Der Kupplungserfolg wird mittels Kaiser-Test (Anal. Biochem. 34 (1970) , 595) an dem mit Isopropanol gewaschenen Syn¬ theseharz kontrolliert. Sofern sich hierbei ein noch nicht vollständiger Umsatz ergibt, wird durch Nach¬ kuppeln gemäß den oben angegebenen Bedingungen, der Um¬ satz vervollständigt. Nach jedem Syntheseschritt wird die Fmoc-Gruppe mittels 20%-igem Piperidin in Dimethyl¬ formamid in 20 Minuten abgespalten. Die Harzbeladung wird mittels UV-Adsorbtion der freigesetzten Fulven- Gruppe nach jeder Piperidinbehandlung ermittelt. Nach der Synthese beträgt die Beladung noch 0,68 mmol/g.

Die Freisetzung des Peptids vom Syntheseharz und die Ab¬ spaltung der säurelabilen Schutzgruppen erfolgt mit 80 ml Trifluoressigsäure, 5 ml Ethandithiol , 2,5 g Phenol, 2,5 ml m-Kresol und 5 ml Wasser in 60 Minuten bei Raumtemperatur.

Die Reaktionslösung wird anschließend im Vakuum ein¬ geengt. Der Rückstand wird in Diisopropylether auf¬ genommen, 1/2 - 2 Stunden kräftig gerührt und dann abfiltriert. Das Material wird dann mittels einer Gel- permeationschromatographie an Sephadex G15 vorgereinigt, wobei als Elutionsmittel 0,5 %-ige Essigsäure verwendet wird. Das erhaltene Rohmaterial wird anschließend ab¬ filtriert und mittels einer präparativen HPLC an Nucleo- sil RP18 (Säule 40 mm x 250 mm 300 A, 5 μm) über einen

Gradienten von 100 % Puffer A (Wasser, 0,1 % Trifluor- essigsäure) zu 100 % Puffer B (60 % Acetonitril, 40 % Wasser, 0,1 % Trifluoressigsäure) in 120 Minuten iso¬ liert. Die Identität des eluierten Materials wird mittels Fast-Atom-Bombardment-Massenspektormetrie (FAB- MS) geprüft.

Herstellung von Ala-Gly-Phe-Asp-Phe-Ser-Phe-Leu-Pro-Gln (SEQ lύ NO 3)

Das Peptid wurde an 30 mg 4-(2\' ,4\'-Dimethoxyphenyl-Fmoc- aminomethyl)phenoxy-Harz SA 5030 der Firma Advanced Chemtech mit einer Beladung von 0,47 mmol/g hergestellt. Von folgenden Fmoc-Aminosäure-Derivaten wurden zweimal je 140 μMol zusammen mit je 140 μMol 1-Hydroxybenzo- triazol in Dimethylformamid DMF und 10 μMol ^~ N,N-Diiso- propylcarbodiimid in DMF an das aufzubauende festphasen- gebundene Peptid angekoppelt:

Glu mit Trityl-Schutzgruppe

Ser mit tert. Butyl-Schutzgruppe

Asp mit tert. Butyl-Schutzgruppe

Pro I

Leu I

Phe > jeweils ohne Seitenketten-Schutzgruppe

Gly

Ala

Die KupplungsZeiten betrugen 30 und 40 Minuten. Die Abspalt¬ zeit betrug 20 Minuten und wurde mit einer Lösung von 50% Piperidin im DMF durchgeführt. Die Waschschritte wurden mit DMF achtmal nach jedem Reaktionsschritt durchgeführt. Die Freisetzung des Peptids erfolgte durch Behandlung des vom Lösungsmittel abfiltrierten und mit Dichlormethan und Metha¬ nol gewaschenen Harz mit 1 ml einer Lösung von 90% Trifluor- essigsäure, 3% Thioanisol, 3 % Ethandithiol und 3 % Thio- kresol innerhalb von 20 Minuten und 140 Minuten. Das Produkt wurde durch Zugabe vom 15 ml kaltem Diisopropylether zum ver¬ einigten Filtrat ausgefällt und durch Filtration isoliert. Der Rückstand wurde in 50%iger Essigsäure gelöst und lyo- philisiert. Es wurden 8 mg weißes Lyophilisat einer Reinheit von 79% laut HPLC erhalten. Die Identität wurde mittels FAB- Massenspektroskopie bestätigt.

Beispiel 2

Aktivierung von Peptiden

Das gemäß Beispiel la) hergestellte Peptid wird durch Acy- lierung mit Maleinimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimid (MHS) aktiviert. Dazu wird 0,1 mmol des Peptids in 20 ml 0,1 mol/1 Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 gelöst, mit einer Lösung von 0,1 mmol MHS in 6 ml Dioxan versetzt und 20 min. bei 20 ^β C ge¬ rührt. Anschließend wird der pH-Wert mit Eisessig auf pH 4 eingestellt und das Reaktionsgemisch sofort lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 5 ml Wasser gelöst und über präpara- tive HPLC an einer Waters Delta-Pak ^® C18-Säule (100 Ä, 15 μm 50 x 300 mm) über einen Elutionsgradienten von 100 % A (Wasser 0,1 % Trifluoressigsäure) zu 100 % B (99,9 % Acetoni- tril 0,1 % Trifluoressigsäure) aufgereinigt.

Beispiel 3

Herstellung von Immunogenen durch Kopplung von aktivierten Peptiden an Trägerproteine

Beschrieben wird die Kopplung von aktivierten Peptiden an Keyhole Limpet Hemocyanine (KLH) , Rinderserumalbumin (RSA) und ß-Galaktosidase (ßGal) . Zur Kopplung der nach Beispiel 2 mit MHS aktivierten Peptide ist es erforderlich, daß das Trägerprotein freie SH-Gruppen trägt. ßGal weist diese natür¬ licherweise bereits auf, erfordert also keine weitere Vor¬ behandlung. Bei KLH und RSA werden die NH ₂ -Gruppen der e-Aminoseitenkette von Lysinresten durch Behandlung mit N- Succinimidyl-S-acetylthiopropionat (SATP) derivatisiert und dadurch in SH-Gruppen umgewandelt.

Man erhält somit ein Trägerprotein das eine gegenüber dem nativen Zustand erhöhte Anzahl von SH-Gruppen aufweist. Hier¬ für wird zu einer Lösung aus 1,39 g KLH in 500 ml 0,1 mol/1 Kaliumphosphatpuffer pH 8,5 innerhalb von 20 min. 113,51 mg SATP (in 10 ml Dioxan gelöst) zugetropft. Nach 30 min. Rühren bei 20°C wird der pH-Wert der Reaktionslösung mit 0,1 mol/1 Natronlauge auf pH 8,5 nachgestellt und weitere 24 Stunden gerührt. Die Lösung wird anschließend mit Hilfe einer Amicon- zelle (Membran YM10) auf 100 ml aufkonzentriert, 3 x 24 Stunden gegen je 3 1 0,1 mol/1 Kaliumphosphatpuffer pH 8,5/ 0,05 mol/1 Natriumchlorid dialysiert und anschließend lyo- philisiert.

Zur Abspaltung der S-Acetylschutzgruppe werden 481 mg des KLH-SATP Lyophilisats in 20 ml 0,1 mol/1 Kaliumphosphatpuffer pH 8,5/0,05 mol/1 Natriumchlorid gelöst, mit 0,5 ml frisch zubereiteter 1 mol/1 Hydroxylaminiösung versetzt und 90 min. bei 20°C gerührt.

7,23 mol des aus Beispiel 2 erhaltenen aktivierten Peptids in 4 ml Wasser werden zu dem derivatisierten Trägerprotein ge¬ geben und 20 Stunden bei 20 ^β C gerührt. Anschließend wird die trübe Lösung 2 x gegen 1 1 0,1 mol/1 Kaliumphosphatpuffer pH 8,5/0,05 mol/1 Natriumchlorid dialysiert. Das Dialysat wird zentrifugiert, der klare überstand abdekantiert und lyophili- siert.

Beispiel 4

Herstellung polyklonaler Anitkörper gegen lineare Kollagen¬ fragmente

Je 5 Schafe wurden in an sich bekannter Weise mit dem Immuno¬ gen aus Beispiel 3 immunisiert. Die Immunogene enthielten das Peptid mit der in SEQ ID NO 2 genannten Sequenz, das den Aminosäuren Nr. 892 bis 907 in der Sequenz der α-Kette von Kollagen Typ I entspricht. Als Trägerprotein diente KLH bzw. ß-Galaktosidase. Die Tiere wurden in monatlichen Abständen mit den Immunogenen in kompletten Freundschen Adjuvans immunisiert. Die Dosis betrug 500 μg je Tier und Immuni¬ sierung. Vier Monate nach Erstimmunisierung wurden Blutproben entnommen und die erhaltenen Antikörper auf Reaktion mit Kollagenfragmenten geprüft.

ELISA zum Nachweis der Reaktion der Antiseren mit Kollagen¬ fragmenten

Folgendes Material und Reagenzien wurden verwendet:

Mikrotiterplatten Maxisorp F96, Firma Nunc

Beschichtungspuffer: 50 mM Natriumcarbonat pH 9,6

0,1 % NaN ₃

Inkubationspuffer: 10 mM Natriunphosphat pH 7,4

0,1 % Tween 20

0,9 % NaCl

1 % Rinderserumalbumin

Substratlösung: ABTS*, Boehringer Mannhein GmbH, Katalog Nr. 857424.

Zur Verstärkung des Signals wurde der Lösung 2 mg/ml Vanillin zugesetzt.

Waschlösung: 0,1 % Tween 20 0,9 % NaCl

Die Vertiefungen der Titerplatten wurden mit je 100 μl einer Lösung gefüllt, die 10 μg/ml Kollagenfragmente in Beschich¬ tungspuffer enthielt. Die Kollagenfragmente wurden ent¬ sprechend den Angaben in EP-A-0 505 210 durch Protease- Verdauung von humanem Kollagen aus Knochen hergestellt. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln wurde dreimal mit Waschlösung gewaschen.

Die Antiseren wurden mit Inkubationspuffer 1 : 4000 verdünnt und je 100 μl in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte eine Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. An¬ schließend wurden die Vertiefungen dreimal mit Waschlösung gewaschen.

Ein Konjugat aus Meerettich-Peroxidase mit Kaninchen-Anti¬ körpern gegen den Fc-Teil von Schaf-IgG wird im Inkubations¬ puffer bis zur Konzentration von 12,5 mU/ml verdünnt und die Näpfe der Mikrotiterplatte mit je 100 μl davon beschickt. Nach einer Stunde Inkubation unter Schütteln bei Raumtempera¬ tur werden die Titerplatten dreimal mit Waschlösung ge¬ waschen:

100 μl Substratlösung werden hinzugefügt und inkubiert, bis eine Farbentwicklung deutlich wird (10 - 60 Minuten) . Die Extinktion wird als Differenzmessung bei 405 und 492 nm er¬ faßt.

Die Seren der meisten Tiere zeigten eine starke Reaktion mit den Kollagenfragmenten auf der Festphase. Das Serum eines nicht immunisierten Tieres zeigte unter gleichen Bedingungen nur ein schwaches Meßsignal. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Beispiel 5

Bestimmung von Kollagen, sowie dessen Abbauprodukten in Körperflüssigkeiten über einen kompetitiven Test

Die Vertiefungen einer 96-er Mikrotiterplatte werden gemäß EP-A 0 344 578 mit Streptavidin (100 μl einer Lösung von 1 μg/ml in PBS) bei 4°C über Nacht beschichtet und noch freie unspezifische Bindungsstellen durch Inkubation mit 300μl BSA (Rinderserumalbumin, 10 mg/ml) für 2 Stunden bei Raumtempe¬ ratur blockiert.

Das Decapeptid mit der in SEQ ID NO 3 gezeigten Sequenz, das gemäß Beispiel lb) hergestellt wurde, wird aminoterminal mit D-Biotinyl-e-amidocapronsäure-N-succinimidester (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 1008960) .gemäß Angaben des Herstellers biotinyliert. Das biotinylierte Peptid wird in PBS, 0,05% Tween 20, 1% BSA in einer Konzentration von lOng/ml gelöst und durch 1-stündige Inkubation von lOOμl je Vertiefung an die mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte gebunden. Anschließend wird ungebundenes Peptid durch dreimaliges Waschen mit PBS, 0,05% Tween 20 entfernt.

Jeweils 150 μl der zu untersuchenden Probe (Serum, Plasma oder ein Standard) werden mit 150 μl des erfindungsgemäßen Antikörpers nach Beispiel 4 für 2 Stunden bei 37"C (oder über Nacht bei 4°C) inkubiert. Jeweils lOOμl dieses Ansatzes werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte zu dem ge¬ bundenen Decapeptid gegeben und 60 Minuten bei 37 ^β C inku¬ biert. Dabei kann nur der nach der Inkubation mit der Probe noch nicht gebundene Antikörperüberschuß des Antiserums an das immobilisierte Decapeptid binden.

Nach dreimaligem Waschen mit PBS/0,05% Tween 20 wird ge¬ bundener Antikörper durch anschließende Inkubation mit einem Anti-Kaninchen-IgG-POD Konjugat (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog Nr. 1238 850) und ABTS* (1 mg/ml) nachgewiesen.

Mit dem erfindungsgemäßen Text (MTP Kompetitiver Test) wurden 164 Patienten-Seren vermessen. Die Ergebnisse wurden zu Daten, welche mit einem Radioimmunoassay (RIA) ermittelt wurden, in Bezug gesetzt. Dieser RIA ICTP (Telopeptide ICTP [ ^{1 5} J] von Orion Diagnostica, Finnland) basiert auf

quervernetzten Kollagenfragmenten, welche durch enzymatischen Verdau und biochemische Verfahren hergestellt und isoliert werden. Aus Figur 1 geht nun hervor, daß das erfindungsgemäße Verfahren Meßwerte erbringt, die gut mit den RIA-Werten korrelieren, das heißt, das erfindungsgemäße Verfahren liefert klinisch relevante Daten. Es wurde ein Korrelationskoeffizient von 0,959 ermittelt.

SBQÜENZHÖ1Ü-KDLL

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZ αJÄRAKrERISTIKΑ:

(A) IÄNGE: 9 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOFOI GIE: linear

(ii) ART DES M3IEKÜIS: Peptid

(xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 1:

Xaa Fhe Asp Ehe Ser Phe Leu Pro Xaa 1 5

(2) INFΌRMAΠO ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZ OJÄRAKEE ISTIKA:

(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOIDGIE: linear

(ii) ART DES MDIEKÜIS: Peptid

(Xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 2:

Ser Ala Gly Fhe Asp Fhe Ser Phe leu Pro Gin Pro Pro Gin Glu Lys 1 5 10 15

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZ CHÄRAKIERISTIKA:

(A) IÄNGE: 13 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOFOIßGIE: linear

(ii) ART DES MOIEKÜIS: Peptid

(xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 3:

Cys Gly Ser Ala Gly Phe Asp Fhe Ser Phe Leu Pro Gin 1 5 10