Область техники.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное иммунобиологическое средство может применяться для профилактики заболевания, вызванного вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

Уровень техники.

Коронавирусное заболевание 2019 года (COVID-19), вызванное вирусом SARS-CoV- 2, в настоящее время представляет собой глобальную пандемию, которая унесла большое количество жизней, а также нанесла серьезный урон системе общественного здравоохранения и мировой экономике. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, к текущей дате, количество людей, инфицированных SARS-CoV-2 составляет более 274 млн людей, а количество погибших превышает 5,3 млн.

SARS-CoV-2 - одноцепочечный РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Coronaviridae, к линии Beta-CoV В. Данный вирус был впервые обнаружен в конце 2019 г в г.Ухань (Китайская Народная Республика) и за несколько месяцев распространился по всем странам. Репродуктивный индекс SARS-CoV-2 (Basic reproduction number, RO), т.е. количество людей, которые заражаются от одного инфицированного человека, колеблется в разных странах от 3,6 до 6,1 (Ke R, Romero-Severson Е, Sanche S, Hengartner N. Estimating the reproductive number RO of SARS-CoV-2 in the United States and eight European countries and implications for vaccination. J Theor Biol. 2021 May 21;517:110621. doi: 10.1016/j.jtbi.2O21.110621. Epub 2021 Feb 13. PMID: 33587929; PMCID: PMC7880839). Заражение людей SARS-CoV-2 происходит по большей части воздушно-капельным путем, тремя основными способами: путем вдыхания очень мелких респираторных капель и аэрозольных частиц, путем осаждения респираторных капель и частиц на открытых слизистых оболочках рото-носовой полости или глаз, путем прикосновения к слизистым оболочкам руками, которые были загрязнены вируссодержащими респираторными жидкостями (https ://www.cdc .gov/ coronavirus/2019-ncov/ science/science-briefs/ sars-cov-2- transmission.html#print).

После заражения человека SARS-CoV-2, средний инкубационный период инфекции составляет 5,2 дня (Li Q, Guan X, Wu Р, Wang X, Zhou L, Tong Y. et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia. N Engl J Med. 2020), после чего развиваются симптомы заболевания. COVID-19 может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме. Большинство людей переносят заболевание в легкой форме. Однако примерно у 14% зараженных развивается тяжелая форма COVID-19, которая требует госпитализации и кислородной поддержки. Около 5% пациентов требуют лечения в условиях палаты интенсивной терапии (Рекомендации по тактике ведения тяжелой острой респираторной инфекции (ТОРИ) при подозрении на COVID-19: временное руководство. 13 марта 2020, ВОЗ). Для легкой формы заболевания характерны симптомы острого респираторного заболевания, которые проходят в течение нескольких недель. При тяжелой форме COVID-19 могут развиваться осложнения - пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др.

Самым эффективным способом профилактики инфекций является вакцинация. Одними из наиболее перспективных разработок в данной области являются вакцины на основе аденовирусных экспрессионных векторов. Они обладают потенциалом направленной доставки генов к клеткам, что приводит к эффективной трансдукции генов и индукции иммунного ответа. Вакцины на основе аденовирусных экспрессионных векторов позволяют индуцировать высокий уровень экспрессии антигенного белка, что приводит к интенсивному гуморальному и клеточному иммунному ответу и элиминации вируса из организма.

В настоящее время несколько независимых фармацевтических компаний и научных организаций разработали вакцины против SARS-CoV-2 на основе аденовирусных векторов.

Оксфордский университет в сотрудничестве с фармацевтической компанией AstraZeneca разработал векторную вакцину ChAdOxl nCoV-19 (AZDI 222). Активным компонентном данной вакцины является аденовирус шимпанзе ChAdOxl, содержащий кодон-оптимизированную кодирующую последовательность полноразмерного S белка вируса SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) с лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена. (М. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOxl nCoV-19 vaccine (AZDI 222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. The Lancet. Vol. 397, Issue 10269, P99-111, 2021).

Компания CanSino разработала векторную вакцину против COVID-19, в основе которой репликативно-дефектный аденовирус человека 5 серотипа (Ad5), экспрессирующий полноразмерный S гликопротеин SARS-CoV-2. (GenBankYP_009724390) (Feng-Cai Zhu et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type- 5 -vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. The Lancet. Vol. 369, Issue 10249, P479-488, 2020).

В ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России была разработана вакцина Sputnik V против COVID-19, в основе которой лежат два гетерологичных репликативнодефектных аденовируса человека 26 и 5 серотипов (Ad26 и Ad5), экспрессирующих полноразмерный S гликопротеин SARS-CoV-2 (Logunov DY et al. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet. 2021 Feb 20;397(10275):671-681. doi: 10.1016/80140-6736(21)00234-8. Epub 2021 Feb 2. Erratum in: Lancet. 2021 Feb 20;397(10275):670. PMID: 33545094; PMCID. PMC7852454.).

Исследовательские группы Johnson and Johnson и Janssen Pharmaceutical. в сотрудничестве с Медицинским центром Beth Israel Deaconess, с помощью технологии Janssen AdVac® создали несколько кандидатных вакцин. После проведенных исследований безопасности и эффективности была выбрана кандидатная вакцина Ad26.COV2.S (Ad26COVSl). Активным компонентном данной вакцины является рекомбинантный аденовирусный вектор 26 серотипа с делецией Е1 и ЕЗ области, содержащий ген S белка SARS-CoV-2, с мутацией сайта расщепления фурина и с двумя пролин-стабилизирующими мутациями. (J. Sadoff et al. Interim Results of a Phase l-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med, 2021 Jan 13. DOI: 10.1056 / NEJMoa2034201).

Результаты проведенных клинических исследований показали, что все препараты обладают разным профилем безопасности и эффективности (Ling Y et al. Safety and effectiveness of SARS-CoV-2 vaccines: A systematic review and meta-analysis. J Med Virol. 2021 Dec;93(12):6486-6495. doi: 10.1002/jmv.27203. Epub 2021 Jul 26. PMID: 34264528; PMCID: PMC8426880.). Причем, эффективность некоторых препаратов отличается более, чем на 25% (Zhang J et al Boosting with heterologous vaccines effectively improves protective immune responses of the inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(l): 1598-1608. doi: 10.1080/22221751.2021.1957401. PMID: 34278956; PMCID: PMC8381941). Такие отличия связаны в первую очередь с выбором и дизайном экспрессионного вектора, который в итоге влияет на стабильность аденовирусных частиц, способность проникать в клетки человека, уровень экспрессии целевого белка, иммуногенность и пр. Таким образом, актуальным научным направлением является разработка новых аденовирусных экспрессионных векторов для разработки более эффективных вакцин.

Несмотря на беспрецедентную скорость разработки вакцин против COVID-19 и развертывание масштабной компании вакцинации, в настоящее время в мире по- прежнему наблюдается нехватка вакцинных препаратов. ВОЗ установила цель по достижению уровня вакцинации как минимум 10% населения в каждой стране мира. Однако в настоящее время из-за нехватки препаратов, в некоторых странах уровень вакцинации населения не превышает 1,5% (https://www.who.int/director- general/speeches/detail/director-general-s-opening-remarks-a t-the-media-briefing-on-covid-19- 9-april-2021).

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых иммунобиологических средств для индукции иммунного ответа против вируса SARS- CoV-2 на основе аденовирусных векторов.

Осуществление изобретения.

Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала иммунобиологических средств для индукции иммунного ответа против вируса SARS- CoV-2 на основе аденовирусных векторов.

Технический результат заключается в создании безопасного иммунобиологического средства, индуцирующего специфический иммунный ответ против коронавируса SARS- CoV-2.

Указанный технический результат достигается тем, что создан экспрессионный вектор, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, на основе аденовируса человека 26 серотипа и имеющий последовательность SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0: 3.

Кроме того, технический результат достигается тем, что создан экспрессионный вектор, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, на основе аденовируса человека 5 серотипа и имеющий последовательность SEQ ID N0:4, или SEQ ID N0:5, или SEQ ID N0:6.

Технический результат также достигается тем, что создан экспрессионный вектор, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, на основе аденовируса человека 5 серотипа и имеющий последовательность SEQ ID N0:7, или SEQ ID N0:8, или SEQ ID N0:9.

Также, технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, содержащее один из разработанных экспрессионных векторов или их комбинацию и фармацевтически приемлемый буферный раствор.

А также, технический результат достигается тем, что разработано применение иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS- CoV-2. При этом применение может отличаться тем, что применяют одно или несколько разработанных иммунобиологических средств внутримышечно, интраназально или одновременно внутримышечно и интраназально.

Кроме того, технический результат заключается в том, что разработан способ индукции иммунного ответа, включающий последовательное или одновременное введение вариантов разработанного иммунобиологического средства в эффективном количестве.

Краткое описание фигур.

На фиг. 1 представлены данные по изменению веса мышей, иммунизированных вариантами разработанного средства и зараженных SARS-CoV-2 В 1.1.1

Ось ординат - изменение веса мышей, % от исходного веса.

Ось абсцисс - время от начала эксперимента, дни. Группа 1 Группа 2 Группа 3

На фиг. 2 представлены данные по выживаемости мышей, иммунизированных вариантами разработанного средства и зараженных SARS-CoV-2 В 1.1.1. Ось ординат - выживаемость мышей, %.

Ось абсцисс - время от начала эксперимента, дни. Группа 1 Группа 2 Группа 3

На фиг. 3 представлены данные по изменению веса мышей, иммунизированных вариантами разработанного средства и зараженных SARS-CoV-2 В.1.351.

Ось ординат - изменение веса мышей, % от исходного веса.

Ось абсцисс - время от начала эксперимента, дни. Группа 1 Группа 2 Группа 3

На фиг. 4 представлены данные по выживаемости мышей, иммунизированных вариантами разработанного средства и зараженных SARS-CoV-2 В.1.351.

Ось ординат - выживаемость мышей, %.

Ось абсцисс - время от начала эксперимента, дни. Группа 1 Группа 2 Группа 3

Реализация изобретения.

Для создания безопасного и эффективного иммунобиологического средства для индукции иммунитета против коронавируса SARS-CoV-2 была выбрана векторная система на основе аденовирусов. Аденовирусные векторы обладают целым рядом преимуществ: они не способны размножаться в клетках человека, проникают как в делящиеся, так и неделящиеся клетки, способны индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ, обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого антигена. Авторами патента было выбрано два серотипа аденовирусов: аденовирус человека 26 серотипа и аденовирус человека 5 серотипа. Данные вирусы генетически сильно различаются, что обеспечивает преодоление трудностей, связанных с наличием у пациентов предсуществующего иммунного ответа к некоторым серотипам аденовирусов. При этом появляется возможность использования изобретения, по которому вариант фармацевтического средства выбирается после оценки иммунного статуса пациента к серотипам аденовирусных векторов.

Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 26 серотипа был получен на основе природного варианта вируса, депонированного в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского. Из генетической последовательности аденовируса были удалены области Е1 и ЕЗ, а открытую рамку считывания 6 (ORF6) заменили на ORF6 аденовируса человека 5 серотипа. Экспрессионную кассету, которая содержит ген целевого антигена, помещали в экспрессионный вектор методом гомологичной рекомбинации.

При этом было создано несколько последовательностей экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа:

SEQ ID N0: 1 - последовательность экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа, содержащая экспрессионную кассету (X) на месте удаленной Е1 области.

SEQ ID N0:2 - последовательность экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа, содержащая экспрессионную кассету (Y) на месте удаленной ЕЗ области.

SEQ ID N0:3 - последовательность экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа, содержащая экспрессионную кассету (X) на месте удаленной Е1 области, а также содержащая экспрессионную кассету (Y) на месте удаленной ЕЗ области.

Созданный экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 26 серотипа является активным веществом разработанного иммунобиологического средства.

Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа был получен на основе природного варианта вируса, депонированного в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского. Из генетической последовательности аденовируса были удалены области Е1 и ЕЗ. Экспрессионную кассету, которая содержит ген целевого антигена, помещали в экспрессионный вектор методом гомологичной рекомбинации.

При этом было создано несколько последовательностей экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа: SEQ ID N0:4 - последовательность экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащая экспрессионную кассету (X) на месте удаленной Е1 области.

SEQ ID N0:5 - последовательность экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащая экспрессионную кассету (Y) на месте удаленной ЕЗ области.

SEQ ID N0:6 - последовательность экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащая экспрессионную кассету (X) на месте удаленной Е1 области, а также содержащая экспрессионную кассету (Y) на месте удаленной ЕЗ области.

Созданный экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа является активным веществом разработанного иммунобиологического средства.

Кроме того, был получен вариант экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа с удаленными Е1 областью и ЕЗ областью, который содержит точечные мутации, обеспечивающие более высокую стабильность вирусных частиц.

При этом было создано несколько последовательностей экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа с точечными мутациями, обеспечивающими более высокую стабильность вирусных частиц:

SEQ ID N0:7 - последовательность экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащая экспрессионную кассету (X) на месте удаленной Е1 области.

SEQ ID N0:8 - последовательность модифицированного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащая экспрессионную кассету (Y) на месте удаленной ЕЗ области.

SEQ ID N0:9 - последовательность модифицированного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащая экспрессионную кассету (X) на месте удаленной Е1 области, а также содержащая экспрессионную кассету (Y) на месте удаленной ЕЗ области.

Модифицированный экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа является активным веществом разработанного иммунобиологического средства. Кроме того, был разработан способ применения созданных вариантов иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS- CoV-2.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Разработка дизайна экспрессионной кассеты.

На первом этапе работы был разработан дизайн 6 вариантов экспрессионных кассет:

- экспрессионная кассета 1, которая содержит CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1 (SEQ ID N0:10), сигнал полиаденилирования;

- экспрессионная кассета 2, которая содержит CMV промотора, ген S белка вируса SARS-CoV-2 вариант В.1.617. 2 (SEQ ID N0:11), сигнал полиаденилирования;

- экспрессионная кассета 3, которая содержит CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 вариант В 1.1.1.7 (SEQ ID N0:12), сигнал полиаденилирования;

- экспрессионная кассета 4, которая содержит CMV промотор, оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую рецептор-связывающий домен S белка SARS-CoV-2 вариант В.1.617.2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (RBD-G) и с лидерным пептидом (SEQ ID N0:13) и сигнала полиаденилирования;

- экспрессионная кассета 5, которая содержит CMV промотор, нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеокапсидный белок (NP) вируса SARS-CoV-2 вариант В 1.1.1 с лидерным пептидом (SEQ ID N0:14), сигнала полиаденилирования;

- экспрессионная кассета 6, которая содержит CMV промотор, ген S белка вируса SARS-CoV-2 вариант В.1.1.529 (SEQ ID N0:15), сигнала полиаденилирования;

Нуклеотидные последовательности генов белков вируса SARS-CoV-2 (и их модификаций) были синтезированы ЗАО «Евроген» и далее помещены в экспрессионную кассету с помощью стандартных методов генной инженерии.

Пример 2 Получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной Е1 области. Целью данной работы является получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной Е1 области.

На начальном этапе работы была разработана плазмидная конструкция pAd26-Ends, которая содержит два участка, гомологичных геному аденовируса человека 26 серотипа (два плеча гомологии), и ген устойчивости к антибиотику. Одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 26-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1 -области) и последовательность вирусного генома, включающую р1Х белок. Второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после 0RF3 Е4 области до конца генома. Плазмида pAd26-Ends была синтезирована ЗАО Евроген.

На следующем этапе работы аденовирус человека 26-го серотипа, полученный из Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, наращивали в препаративных количествах и использовали для выделения вирусной ДНК. Далее полученную ДНК аденовируса человека 26-го серотипа смешивали с плазмидой pAd26- Ends. В результате гомологичной рекомбинации между pAd26-Ends и вирусной ДНК была получена плазмида pAd26-dlEl-2, несущая геном аденовируса человека 26-го серотипа с делетированной Е1 -областью.

Затем, в полученной плазмиде pAd26-dlEl-2 с использованием стандартных методов клонирования была заменена последовательность, содержащая открытую рамку считывания 6 (ORF6-Ad26), на аналогичную последовательность из генома аденовируса человека 5-го серотипа для того, чтобы аденовирус человека 26-го серотипа был способен эффективно размножаться в культуре клеток НЕК293. В результате была получена плазмида pAd26-dlEl-ORF6-Ad5-2.

Далее с использованием стандартных генно-инженерных методов была получена плазмидная конструкция pBS-E3-Ad26, содержащая ЕЗ область генома аденовируса человека 26 серотипа и два участка гомологичных геному аденовируса человека 26 серотипа (около 1000 п.о. и около 3500 п.о.), один из которых находится перед ЕЗ областью, а другой после ЕЗ области, а также ген устойчивости к антибиотику. В данной плазмидной конструкции с использованием стандартных генно-инженерных методов была удалена ЕЗ-область генома аденовируса (около 3320 п.о. между генами pVIII и U-exon). После этого полученную плазмиду pAd26-dlEl-ORF6-Ad5-2 линеаризовывали и смешивали с плазмидой pBS-dE3-Ad26, у которой удаляли методом гидролиза последовательность, содержащую ген устойчивости к антибиотику и точку начала репликации. В результате гомологичной рекомбинации между pAd26-dlEl-ORF6-Ad5-2 и pBS-dE3-Ad26 была получена плазмида pAd26-only-null-2, несущая геном аденовируса человека 26-го серотипа с делетированными Е1 и ЕЗ областями генома и с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа.

Далее на основе плазмиды pAd26-Ends генно-инженерным методом были получены конструкции, содержащие экспрессионные кассеты (дизайн которых описан в примере 1) и плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа:

1 ) плазмида р Arms-26-S-B .1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 1 );

2) плазмида pArms-26-S-B.1.617. 2 (содержащая экспрессионную кассету 2);

3) плазмида pArms-26-S-B 1.1.1.7 (содержащая экспрессионную кассету 3);

4) плазмида pArms-26-RBD-G-B.1.617.2 (содержащая экспрессионную кассету 4);

5) плазмида pArms-26-NP-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 5);

6) плазмида pArms-26-S-B.1.1.529 (содержащая экспрессионную кассету 6).

Полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26- only-null. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания 0RF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией Е1 и ЕЗ-областей, и содержащие одну из разработанных экспрессионных кассет на месте удаленной Е1 области:

1 ) плазмида pAd26-only-S-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 1 );

2) плазмида pAd26-only-S-B.l .617. 2 (содержащая экспрессионную кассету 2);

3) плазмида pAd26-only-S-Bl .1.1.7 (содержащая экспрессионную кассету 3);

4) плазмида pAd26-only-RBD-G-B.1.617.2 (содержащая экспрессионную кассету 4);

5) плазмида pAd26-only-NP-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 5);

6) плазмида pAd26-only-S-B.1.1.529 (содержащая экспрессионную кассету 6).

Далее полученные плазмиды гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате проведенной работы были получены рекомбинантные аденовирусы человека 26 серотипа, содержащие одну из разработанных экспрессионных кассет на месте удаленной Е1 области:

7) Ad26-S-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 1 ); 8) Ad26-S-B.l .617. 2 (содержащая экспрессионную кассету 2);

9) Ad26-S-B 1.1.1.7 (содержащая экспрессионную кассету 3);

10) Ad26-RBD-G-B.1.617.2 (содержащая экспрессионную кассету 4);

11) Ad26-NP-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 5);

12) Ad26-S-B.1.1.529 (содержащая экспрессионную кассету 6).

Таким образом, был получен экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 26 серотипа, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, имеющий последовательность SEQ ID N0:1 (где буквой X обозначена экспрессионная кассета). Данный экспрессионный вектор является активным компонентом разработанного иммунобиологического средства.

Пример 3 Получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной ЕЗ области.

Целью данной работы является получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной ЕЗ области.

Для этого были использованы плазмидные конструкции pAd26-dlEl-ORF6-Ad5-2 и pBS-E3-Ad26, полученные в примере 2. В плазмидной конструкции pBS-E3-Ad26 с использованием стандартных методов клонирования была заменена последовательность, содержащая ЕЗ область генома аденовируса человека 26 серотипа (около 3320 п.о. между генами pVIII и U-exon), на экспрессионную кассету кассету 5 (дизайн которой описан в примере 1), в результате была получена конструкция pBS-dE3-Ad26-NP-B.1.1.1.

После этого полученную в примере 2 плазмиду pAd26-dlEl-ORF6-Ad5-2 линеаризовывали и смешивали с плазмидой pBS-dE3-Ad26-NP-B.1.1.1, у которой удаляли методом гидролиза последовательность, содержащую ген устойчивости к антибиотику и точку начала репликации.

В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с делецией Е1 и ЕЗ -областей, с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа, содержащая на месте удаленной области ЕЗ экспрессионную кассету 5.

Далее полученную плазмиду гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате проведенной работы был получен рекомбинантный аденовирус человека 26 серотипа, содержащий экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области: Ad26-E3-NP-B.1.1.1.

Таким образом, был получен экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 26 серотипа, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, имеющий последовательность SEQ ID N0:2 (где буквой Y обозначена экспрессионная кассета). Данный экспрессионный вектор является активным компонентом разработанного иммунобиологического средства.

Пример 4. Получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа, содержащего две экспрессионные кассеты на месте удаленных Е1 и ЕЗ областей.

Целью данной работы является получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 26 серотипа, содержащего две экспрессионные кассеты на месте удаленных Е1 и ЕЗ областей.

После этого, плазмиду pAd26-only-S-B.1.1.1 (полученную в примере 2) линеаризовывали и смешивали с плазмидой pBS-dE3-Ad26-NP-B.1.1.1 (полученной в примере 3), у которой удаляли методом гидролиза последовательность, содержащую ген устойчивости к антибиотику и точку начала репликации.

В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с делецией Е1 и ЕЗ -областей, с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа, содержащая экспрессионную кассету 1 на месте удаленной Е1 области и содержащая экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области.

Далее полученную плазмиду гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате проведенной работы был получен рекомбинантный аденовирус человека 26 серотипа, содержащий экспрессионную кассету 1 на месте удаленной Е1 области и содержащий экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области: Ad26-S-B.l.l.l-NP-B.1.1.1.

Таким образом, был получен экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 26 серотипа, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, имеющий последовательность SEQ ID N0:3 (где буквой X и Y обозначены экспрессионные кассеты). Данный экспрессионный вектор является активным компонентом разработанного иммунобиологического средства.

Пример 5 Получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной Е1 области.

Целью данной работы является получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной Е1 области.

На начальном этапе работы была разработана плазмидная конструкция pAd5-Ends, которая содержит два участка, гомологичных геному аденовируса человека 5 серотипа (два плеча гомологии), и ген устойчивости к антибиотику. Одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 5-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1 -области) и последовательность вирусного генома, включающую р1Х белок. Второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4 области до конца генома. Плазмида pAd5-Ends была синтезирована ЗАО Евроген.

На следующем этапе работы аденовирус человека 5-го серотипа, полученный из Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, наращивали в препаративных количествах и использовали для выделения вирусной ДНК. Далее полученную ДНК аденовируса человека 5-го серотипа смешивали с плазмидой pAd5-Ends. В результате гомологичной рекомбинации между pAd5-Ends и вирусной ДНК была получена плазмида pAd5-dlEl, несущая геном аденовируса человека 5-го серотипа с делегированной Е1 -областью.

Далее с использованием стандартных генно-инженерных методов была получена плазмидная конструкция pBS-E3-Ad5, содержащая ЕЗ область генома аденовируса человека 5 серотипа и два участка гомологичных геному аденовируса человека 5 серотипа (около 1800 п.о. и около 1100 п.о.), один из которых находится перед ЕЗ областью и заканчивается на середине белка ЕЗ области 12,5К, а другой участок находится после ЕЗ области, а также ген устойчивости к антибиотику. В данной плазмидной конструкции с использованием стандартных генно-инженерных методов была удалена ЕЗ -область генома аденовируса (примерно 2685 п.о. от конца гена 12,5К до начала последовательности U- ехоп) для увеличения пакующей емкости вектора. В результате была получена плазмида pBS-dE3-Ad5. После этого полученную плазмиду pAd5-dlEl линеаризовывали и смешивали с плазмидой pBS-dE3-Ad5, у которой удаляли методом гидролиза последовательность, содержащую ген устойчивости к антибиотику и точку начала репликации. В результате гомологичной рекомбинации между pAd5-dlEl и pBS-dE3-Ad5 была получена плазмида pAd5-too-null, несущая геном аденовируса человека 5-го серотипа с делегированными Е1 и ЕЗ областями генома.

Далее на основе плазмиды pAd5-Ends генно-инженерным методом были получены конструкции, содержащие экспрессионные кассеты (дизайн которых описан в примере 1) и плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа:

1) плазмида pArms-5-S-B.LLl (содержащая экспрессионную кассету 1);

2) плазмида pArms-5-S-B.L617. 2 (содержащая экспрессионную кассету 2);

3) плазмида pArms-5-S-Bl.LL7 (содержащая экспрессионную кассету 3);

4) плазмида pArms-5-RBD-G-B. L617.2 (содержащая экспрессионную кассету 4);

5) плазмида pArms-5-NP-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 5);

6) плазмида pArms-5-S-B.1.1.529 (содержащая экспрессионную кассету 6).

Полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too- null. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с делецией Е1 и ЕЗ -областей, и содержащие одну из разработанных экспрессионных кассет на месте удаленной Е1 области:

1 ) плазмида pAd5-too-S-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 1 );

2) плазмида pAd5-too-S-B. L617. 2 (содержащая экспрессионную кассету 2);

3) плазмида pAd5-too-S-B 1.1.1.7 (содержащая экспрессионную кассету 3);

4) плазмида pAd5-too-RBD-G-B.L617.2 (содержащая экспрессионную кассету 4);

5) плазмида pAd5-too-NP-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 5);

6) плазмида pAd5-too-S-B.1.1.529 (содержащая экспрессионную кассету 6).

Далее полученные плазмиды гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате проведенной работы были получены рекомбинантные аденовирусы человека 5 серотипа, с делецией Е1 и ЕЗ- областей, содержащие одну из разработанных экспрессионных кассет на месте удаленной Е1 области:

1) Ad5-S-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 1);

2 ) Ad5 - S-B.1.617. 2 (содержащая экспрессионную кассету 2) ;

3) Ad5-S-Bl .1.1.7 (содержащая экспрессионную кассету 3);

4) Ad5-RBD-G-B.1.617.2 (содержащая экспрессионную кассету 4);

5) Ad5-NP-B.1.1.1 (содержащая экспрессионную кассету 5);

6) Ad5-S-B.1.1.529 (содержащая экспрессионную кассету 6).

Таким образом, был получен экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, имеющий последовательность SEQ ID N0:4 (где буквой X обозначена экспрессионная кассета). Данный экспрессионный вектор является активным компонентом разработанного иммунобиологического средства.

Пример 6 Получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной ЕЗ области.

Целью данной работы является получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной ЕЗ области.

Для этого были использованы плазмидные конструкции pAd5-too-null и pBS-E3-Ad5, полученные в примере 5. В плазмидной конструкции pBS-E3-Ad5 с использованием стандартных методов клонирования была заменена последовательность, содержащая ЕЗ область генома аденовируса человека 5 серотипа, на экспрессионную кассету кассету 5 (дизайн которой описан в примере 1), в результате была получена конструкция pBS-dE3- Ad5-NP-B.1.1.1.

После этого полученную в примере 5 плазмиду pAd5-too-null линеаризовывали и смешивали с плазмидой pBS-dE3-Ad5-NP-B.1.1.1, у которой удаляли методом гидролиза последовательность, содержащую ген устойчивости к антибиотику и точку начала репликации. В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с делецией Е1 и ЕЗ -областей, содержащая на месте удаленной области ЕЗ экспрессионную кассету 5. Далее полученную плазмиду гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате проведенной работы был получен рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области: Ad5-E3-NP-B.LLL

Таким образом, был получен экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, имеющий последовательность SEQ ID N0:5 (где буквой Y обозначена экспрессионная кассета). Данный экспрессионный вектор является активным компонентом разработанного иммунобиологического средства.

Пример 7. Получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего две экспрессионные кассеты на месте удаленной Е1 и ЕЗ областей.

Целью данной работы является получение экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего две экспрессионные кассеты на месте удаленной Е1 и ЕЗ областей.

Для этого плазмиду pAd5-too-S-B.LLl (полученную в примере 5) линеаризовывали и смешивали с плазмидой pBS-dE3-Ad5-NP-B.l.Ll (полученной в примере 6), у которой удаляли методом гидролиза последовательность, содержащую ген устойчивости к антибиотику и точку начала репликации.

В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с делецией Е1 и ЕЗ -областей, содержащая экспрессионную кассету 1 на месте удаленной Е1 области и содержащая экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области.

Далее полученную плазмиду гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате проведенной работы был получен рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессионную кассету 1 на месте удаленной Е1 области и содержащий экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области: Ad5-S-B.1.1.1 -NP-B.1.1.1. Таким образом, был получен экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, имеющий последовательность SEQ ID N0:6 (где буквой X и Y обозначены экспрессионные кассеты). Данный экспрессионный вектор является активным компонентом разработанного иммунобиологического средства.

Пример 8 Получение модифицированного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной Е1 области.

Целью данной работы является получение модифицированного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной Е1 области

На начальном этапе работы была разработана плазмидная конструкция, содержащая модифицированную точечными мутациями часть плеча гомологии генома аденовируса человека 5 серотипа. Данная конструкция была синтезирована в ЗАО «Евроген». Затем на основе данной конструкции и плазмиды pAd5-Ends (полученной в примере 5) с использованием стандартных генно-инженерных методов была получена плазмидная конструкция pAd5-mut, включающая участок нуклеотидной последовательности аденовируса человека 5 серотипа с точечными мутациями, увеличивающими стабильность вирусных частиц; два участка, гомологичных геному аденовируса человека 5 серотипа (два плеча гомологии); ген устойчивости к антибиотику. Затем, с использованием стандартных генно-инженерных методов на основе плазмиды pAd5-mut была получена плазмида pAd5-mut-S-B.1.1.1, содержащая экспрессионную кассету 1.

Полученную плазмиду pAd5-mut-S-B.1.1.1 линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии и смешивали с плазмидой pAd5-too-S-B.1.1.1. В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида pAd5-mut-S-B.1.1.1, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с точечными мутациями, увеличивающими стабильность вирусных частиц, с делецией Е1 и ЕЗ- областей, и содержащая экспрессионную кассету 1 на месте удаленной Е1 области.

Далее полученную плазмиду гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате проведенной работы был получен рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, с точечными мутациями, увеличивающими стабильность вирусных частиц, с делецией Е1 и ЕЗ -областей, содержащий экспрессионную кассету 1 на месте удаленной Е1 области: Ad5-mut-S-B.l.Ll

Таким образом, был получен модифицированный экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS- CoV-2, имеющий последовательность SEQ ID N0:7 (где буквой X обозначена экспрессионная кассета). Данный экспрессионный вектор является активным компонентом разработанного иммунобиологического средства.

Пример 9 Получение модифицированного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной ЕЗ области.

Целью данной работы является получение модифицированного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной ЕЗ области.

На начальном этапе работы плазмидную конструкцию pAd5-mut (полученную в примере 8), линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии и смешивали с плазмидой pAd5-E3-NP-B.1.1.1. В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида pAd5-mut-E3-NP-B.1.1.1, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с точечными мутациями, увеличивающими стабильность вирусных частиц, с делецией Е1 и ЕЗ -областей, и содержащая экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области.

Далее полученную плазмиду гидролизовали специфическими эндонуклеазами ¹ рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате проведенной работы был получен рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, с точечными мутациями, увеличивающими стабильность вирусных частиц, с делецией Е1 и ЕЗ -областей, содержащий экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области: Ad5 -mut-ЕЗ -NP- В.1.1.1

Таким образом, был получен модифицированный экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS- CoV-2, имеющий последовательность SEQ ID N0:8 (где буквой Y обозначена экспрессионная кассета). Данный экспрессионный вектор является активным компонентом разработанного иммунобиологического средства.

Пример 10. Получение модифицированного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего две экспрессионные кассеты на месте удаленных Е1 и ЕЗ областей.

Целью данной работы является получение модифицированного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 5 серотипа, содержащего две экспрессионные кассеты на месте удаленных Е1 и ЕЗ областей.

Полученную ранее плазмиду pAd5-mut-S-B.1.1.1 линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии и смешивали с плазмидой: pAd5 -mut-ЕЗ -NF- В.1.1.1. В результате гомологичной рекомбинации была получена плазмида pAd5-mut-S- B.1.1.1-NP-B.1.1.1, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с точечными мутациями, увеличивающими стабильность вирусных частиц, с делецией Е1 и ЕЗ -областей, и содержащая экспрессионную кассету 1 на месте удаленной Е1 области и экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области.

Далее полученную плазмиду гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате проведенной работы был получен рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, с точечными мутациями, увеличивающими стабильность вирусных частиц, с делецией Е1 и ЕЗ -областей, содержащий экспрессионную кассету 1 на месте удаленной Е1 области и экспрессионную кассету 5 на месте удаленной ЕЗ области: Ad5-mut-S-B.l.l.l-NP-B.1.1.1

Таким образом, был получен модифицированный экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, предназначенный для получения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS- CoV-2, имеющий последовательность SEQ ID N0:9 (где буквой X и Y обозначены экспрессионные кассеты). Данный экспрессионный вектор является активным компонентом разработанного иммунобиологического средства. Пример И. Проверка иммуногенности вариантов разработанного иммунобиологического средства, содержащего аденовирусный экспрессионный вектор с экспрессионной кассетой на месте удаленной ЕЗ области.

Целью данного эксперимента является оценка способности различных вариантов разработанного иммунобиологического средства, содержащего экспрессионный вектор на основе аденовирусов человека 26 и 5 серотипов, с кассетой на месте удаленной ЕЗ области, индуцировать гуморальный иммунный ответ у мышей.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18- 20г. Все животные были разделены на 4 группы по 8 животных, которым внутримышечно вводили варианты разработанного средства в жидкой форме в дозе 10 ¹¹ вирусных частиц/200мкл.

Были получены следующие группы животных:

1) Ad26-E3-NP-B.1.1.1, 10 ^и вч/200мкл;

2) Ad5-E3-NP-B.1.1.1 , 10 ¹¹ вч/200мкл;

3) Ad5-mut-E3-NP-B.1.1.1, 10 ^и вч/200мкл;

4) Фосфатно-солевой буферный раствор, 200 мкл

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1) Антиген адсорбировали на лунках 96-лун очного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С. В качестве антигена был выбран рекомбинантный нуклеокапсидный белок (NP) вируса SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1.

2) Далее уменьшения неспецифических реакций проводили инкубирование с 5 % молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером. 7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Титр IgG антител к NP вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таким образом, результаты эксперимента показывают, что все разработанные средства, содержащие экспрессионный вектор на основе аденовирусов человека 26 и 5 серотипов с кассетой на месте удаленной ЕЗ области, способны индуцировать гуморальный иммунный ответ у мышей.

Пример 12. Проверка иммуногенности вариантов разработанного иммунобиологического средства, содержащего аденовирусный экспрессионный вектор с экспрессионными кассетами на месте удаленной Е1 области и на месте удаленной ЕЗ области. Целью данного эксперимента является оценка способности различных вариантов разработанного иммунобиологического средства, содержащего экспрессионный вектор на основе аденовирусов человека 26 и 5 серотипов, с экспрессионными кассетами на месте удаленной Е1 области и на месте удаленной ЕЗ области, индуцировать гуморальный иммунный ответ у мышей.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18- 20г. Все животные были разделены на 4 группы по 5 животных, которым внутримышечно вводили варианты разработанного средства в жидкой форме в дозе 10 ¹¹ вирусных частиц/200мкл.

Были получены следующие группы животных:

1) Ad26-S-B.l.l.l-NP-B.1.1.1, 10“вч/200мкл;

2) Ad5-S-B.l.l.l-NP-B.1.1.1, 10 ¹¹ вч/200мкл;

3) Ad5-mut-S-B.l.l.l-NP-B.1.1.1, 10 ¹¹ вч/200мкл;

4) Фосфатно-солевой буферный раствор, 200 мкл

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С. На одном планшете адсорбировали рекомбинантный нуклеокапсидный белок (NP) вируса SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1, на другом планшете адсорбировали рекомбинантный RBD вируса SARS-CoV-2 вариант В 1.1.1.

2) Далее для уменьшения неспецифических реакций проводили инкубирование с 5 % молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером. 10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Титр IgG антител к антигенам вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таким образом, результаты эксперимента показывают, что все разработанные средства, содержащие экспрессионный вектор на основе аденовирусов человека 26 и 5 серотипов с кассетой на месте удаленных Е1 области и ЕЗ области, способны индуцировать гуморальный иммунный ответ у мышей.

Пример 13. Проверка иммуногенности вариантов разработанного иммунобиологического средств на основе аденовирусного экспрессионного вектора, содержащего ген RBD

Целью данного эксперимента является оценка способности различных вариантов разработанного иммунобиологического средства, содержащего экспрессионный вектор на основе аденовирусов человека 26 и 5 серотипов, с экспрессионной кассетой 4 (которая содержит CMV промотор, оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую рецептор-связывающий домен S белка SARS-CoV-2 вариант В.1.617.2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (RBD-G) (SEQ ID N0:13) и сигнала полиаденилирования) индуцировать гуморальный иммунный ответ у мышей.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18- 20г. Все животные были разделены на 3 группы по 8 животных, которым внутримышечно вводили варианты разработанного средства в жидкой форме в дозе 10 ¹¹ вирусных частиц/200мкл.

Были получены следующие группы животных:

1) Ad26-RBD-G-B.1.617.2, 10 ^й вч/200мкл;

2) Ad5-RBD-G-B.1.617.2, 10 ¹¹ вч/200мкл;

3) Фосфатно-солевой буферный раствор, 200 мкл

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу: ) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С. В качестве антигена был выбран рекомбинантный RBD вируса SARS-CoV-2 вариант В.1.617.2. ) Далее уменьшения неспецифических реакций проводили инкубирование с 5 % молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа. ) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. ) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета. ) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С. ) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером. ) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена. ) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С. ) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером. 0) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Титр IgG антител к RBD вируса SARS-CoV-2 В.1.617.2 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таким образом, результаты эксперимента показывают, что все разработанные средства, содержащие экспрессионный вектор на основе аденовирусов человека 26 и 5 серотипов с экспрессионной кассетой 4 (которая содержит CMV промотор, оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую рецептор- связывающий домен S белка SARS-CoV-2 вариант В.1.617.2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (RBD-G) (SEQ ID N0:13) и сигнала полиаденилирования), способны индуцировать гуморальный иммунный ответ у мышей.

Пример 14. Токсичность разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при внутривенном и внутримышечном введении.

В данном исследовании оценивали острую токсичность различных вариантов разработанного иммунобиологического средства.

В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.

Расчет дозы средства проводили исходя из иммунизирующей дозы (10 ⁸ в.ч.), полученной в предварительном эксперименте на чувствительном виде животных - сирийских хомячках. Расчет доз для мышей проводили исходя из массы тела. Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 10 ⁸ в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.

В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства:

10 ⁸ в.ч. - близкая к эффективной дозе (ЭД) для мышей;

10 ⁹ в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 20 раз;

Ю ¹⁰ в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;

10 ¹ 'в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;

Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:

1) Ad26-S-B.1.1.1, 1 * 10 ⁸ в.ч., 20 мышей;

2) Ad26-S-B.1.1.1, 1*10 ⁹ в.ч., 20 мышей;

3) Ad26-S-B.1.1.1, 1*Ю ¹⁰ в.ч., 20 мышей;

4) Ad26-S-B.1.1.1, 1*10" в.ч., 20 мышей;

5) Ad26-S-B.1.617. 2, 1*10 ⁸ в.ч., 20 мышей;

6) Ad26-S-B.1.617. 2, 1*10 ⁹ в.ч., 20 мышей;

7) Ad26-S-B.1.617. 2, 1*Ю ^|О в.ч., 20 мышей;

8) Ad26-S-B.1.617. 2, 1*10" в.ч., 20 мышей;

9) Ad26-S-B1.1.1.7, 1*10 ⁸ в.ч., 20 мышей;

10) Ad26-S-B1.1.1.7, 1*10 ⁹ в.ч., 20 мышей;

11) Ad26-S-B1.1.1.7, 1*Ю ¹⁰ в.ч., 20 мышей;

12) Ad26-S-B1.1.1.7, 1*10" в.ч., 20 мышей;

13) Ad5-S-B.1.1.1, 1 * 10 ⁸ в.ч. , 20 мышей;

14) Ad5-S-B.1.1.1, 1 * 10 ⁹ в.ч., 20 мышей;

15) Ad5-S-B.1.1.1, 1*Ю ¹⁰ в.ч., 20 мышей;

16) Ad5-S-B.1.1.1, 1 * 10 ¹¹ в.ч., 20 мышей; 24) Ad5-S-B1.1.1.7, 1*10 ^и в.ч., 20 мышей;

25) Ad5-mut-S-B.1.1.1, 1 * 10 ⁸ в.ч., 20 мышей;

26) Ad5-mut-S-B.1.1.1, 1 * 10 ⁹ в.ч., 20 мышей;

27) Ad5-mut- мышей;

28) Ad5-mut-S-B.1.1.1, 1 * 10 ¹¹ в.ч., 20 мышей;

29) плацебо (буферный раствор), 20 мышей.

Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.

Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.

На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.

Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.

При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Статистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.

Таким образом, экспериментальные данные показывают, что разработанные иммунобиологические средства не обладают токсичностью.

Пример 15. Проверка иммуногенности вариантов разработанного иммунобиологического средства, содержащего аденовирусный экспрессионный вектор с экспрессионной кассетой на месте удаленной Е1 области

Цель данного эксперимента заключалась в оценке иммуногенных свойств вариантов разработанного иммунобиологического средства на основе аденовируса человека 5 или 26 серотипов, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной Е1 области.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на 11 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили варианты разработанного средства в жидкой форме в дозе 5*10 ¹⁰ вирусных частиц/200мкл.

Были получены следующие группы животных:

1) Ad26-S-B.1.1.1,

2) Ad26-S-B.1.617.2,

3) Ad26- S-Bl.1.1.7,

4) Ad26-null

5) Ad5-S-B.1.1.1,

6) Ad5-S-B.1.617.2,

7) Ad5-S-B1.1.1.7,

8) Ad5-null

9) Ad5-mut-S-B.1.1.1,

10) Ad5-mut-null

11) буферный раствор

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу: 1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С. В качестве антигена для групп 1, 4, 5, 8, 9, 10,11 был выбран рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 вариант В 1.1.1, для групп 2, 4, 6, 8, 11 - рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 вариант В.1.617.2, для групп 3, 4, 7, 8, 11 - рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 вариант В.1.351

2) Далее для уменьшения неспецифических реакций проводили инкубирование с 5 % молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблицах 4-6.

Таблица 4 - Титр антител к S белку SARS-CoV-2 В.1.1.1 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 5 - Титр антител к S белку SARS-CoV-2 1.617. 2 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 6 - Титр антител к S белку SARS-CoV-2 В.1.351 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таким образом, результаты эксперимента показывают, что все варианты разработанного иммунобиологического средства на основе аденовируса человека 5 или 26 серотипов, содержащего экспрессионную кассету на месте удаленной Е1 области индуцируют развитие гуморального иммунного ответа.

Пример 16. Определение эффективности интраназальной иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответа.

Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при интраназальном введении.

В эксперименте использованы мыши линии С57/В16, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:

1) Однократное интраназальное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5* 1О ¹⁰ вч/200 мкл.

2) Однократное интраназальное введение Ad5-S-B1.1.1.7 5* 10 ¹⁰ вч/200 мкл.

3) Однократное интраназальное введение Ad5-mut-S-B1.1.1.7, 5*1О ¹⁰ вч/200 мкл.

4) Однократное интраназальное введение Ad26-S-Bl .1.1.7, 5* 10 ^{1 1} вч/200 мкл.

5) Однократное интраназальное введение Ad5-S-B1.1.1.7), 5*10 ^и вч/200 мкл.

6) Однократное интраназальное введение Ad5-mut-S-B1.1.1.7), 5* 10 ^{1 1} вч/200 мкл.

7) Однократное интраназальное введение буферного раствора (отрицательный контроль).

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1) Антиген (рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 вариант В.1.351) адсорбировали на лунках 96-лун очного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером. 7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Как видно из полученных результатов интраназальная иммунизация животных разработанным средством приводила к повышению титра антител к S белку вируса SARS- CoV-2 вариант В.1.351. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 путем его интраназального введения. Пример 17. Оценка иммуногенности разработанного средства при совместной внутримышечной и интраназальной иммунизации.

Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при совместном интраназальном введении и внутримышечном введении.

В эксперименте использованы мыши линии С57/В16, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:

1) Интраназальное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*1О ¹⁰ вч/ 200 мкл и одновременно внутримышечное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5* 10 ¹⁰ вч/ 200 мкл.

2) Интраназальное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*10 ¹⁰ вч/200 мкл

3) Внутримышечное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*1О ¹⁰ вч/200 мкл.

4) Интраназальное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*10 ¹⁰ вч/200 мкл и одновременно внутримышечное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*10 ¹⁰ вч/200 мкл.

5) Интраназальное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*1О ¹⁰ вч/200 мкл.

6) Внутримышечное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5* 10 ¹⁰ вч/200 мкл.

7) Интраназальное введение Ad5-S-B1.1.1.7) 5*1О ¹⁰ вч/200 мкл и одновременно внутримышечное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*1О ¹⁰ вч/200 мкл.

8) Интраназальное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*10 ¹⁰ вч/200 мкл и одновременно внутримышечное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*1О ¹⁰ вч/200 мкл.

9) Интраназальное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*10 ^и вч/200 мкл и одновременно внутримышечное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*10 ¹¹ вч/200 мкл.

10) Интраназальное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*10 ¹¹ вч/200 мкл

И) Внутримышечное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*10 ^и вч/200 мкл.

12) Интраназальное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*10 ^и вч/200 мкл и одновременно внутримышечное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*10 ¹¹ вч/200 мкл.

13) Интраназальное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*10 ^и вч/200 мкл.

14) Внутримышечное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*10 ¹¹ вч/200 мкл.

15) Интраназальное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*10 ¹¹ вч/200 мкл и одновременно внутримышечное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*10 ^п вч/200 мкл.

16) Интраназальное введение Ad26-S-B1.1.1.7, 5*10" вч/200 мкл и одновременно внутримышечное введение Ad5-S-B1.1.1.7, 5*10 ^и вч/200 мкл.

17) Интраназальное введение буферного раствора и одновременно внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).

18) Интраназальное введение буферного раствора (отрицательный контроль).

19) Внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль). Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1) Антиген (рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 вариант В.1.351) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

2) Далее для уменьшения неспецифического сигнала в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37° С на протяжении часа.

3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Титр IgG антител к RBD SARS-CoV-2 вариант В.1.351 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Как видно из полученных результатов совместная интраназальная и внутримышечная иммунизация животных разработанным средством приводила к более мощному гуморальному иммунному ответу, по сравнению с иммунизацией только одним способом. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем совместного и одновременного внутримышечного и интраназального введения. Пример 19. Оценка иммуногенности разработанного иммунобиологического средства против различных вариантов SARS-CoV-2

Целю данного исследования является оценка способности вариантов иммунобиологического средства, полученных на основе различных последовательностей S белка SARS-CoV-2 индуцировать иммунный ответ против различных вариантов вируса SARS-CoV-2.

В эксперименте использованы мыши линии С57/В16, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:

1) Двукратная иммунизация с интервалом в 21 день иммунобиологическим средством Ad26-S-B.1.1.1

2) Двукратная иммунизация с интервалом в 21 день иммунобиологическим средством Ad26-S-B.1.617. 2

3) Двукратная иммунизация с интервалом в 21 день иммунобиологическим средством Ad5-S-B.1.1.1

4) Двукратная иммунизация с интервалом в 21 день иммунобиологическим средством Ad5-S-B.1.617. 2

5) Двукратная иммунизация с интервалом в 21 день иммунобиологическим Ad5-mut-S-B.1.1.1

6) Двукратная иммунизация с интервалом в 21 день буферным раствором (контроль).

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Далее определяли титр антител в каждом образце сыворотки крови и к SARS-CoV-2 вариант В 1.1.1, и SARS-CoV-2 вариант В.1.617.2 .

Титр антител определяли методом иммуноферм ентного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1. Антиген (рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1 (Wuhan) или рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 вариант В.1.617.2 (India)) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

2. Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа. 3. Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений

4. Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5. Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

6. После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

7. Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8. Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

9. После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером

10. Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Титр IgG антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Полученные результаты показывают, что введение животным разработанных иммунобиологических средств приводит к наиболее сильному иммунному ответу против того варианта вируса, который был взят за основу при разработке средства. Чем сильнее генетически отличаются антигены, используемые для создания иммунобиологического средства, тем меньше титр перекрестно реагирующих антител.

Пример 20. Оценка протективных свойств разработанных иммунобиологических средств против SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1 .

Для оценки протективных свойств разработанных иммунобиологических средств были выбраны hACE-2 трансгенные мыши, которые чувствительны к коронавирусу SARS-CoV-2. Для эксперимента были выбраны мыши весом 18-20г, самки, которые были разделены на несколько групп по 10 животных.

Группа 1. Мыши, иммунизированные иммунобиологическим средством Ad26-S- В.1.1.1 внутримышечно, в дозе 1О ¹⁰ в.ч./мышь и затем через 21 день иммунизированные иммунобиологическим средством Ad5-S-B.1.1.1 внутримышечно, в дозе 1О ¹⁰ в.ч./мышь.

Группа 2. Мыши, иммунизированные иммунобиологическим средством Ad26-S- В 1.1.1.7 внутримышечно, в дозе 1О ¹⁰ в.ч./мышь и затем через 21 день иммунизированные иммунобиологическим средством Ad5-S-B1.1.1.7 внутримышечно, в дозе 1О ¹⁰ в.ч./мышь.

Группа 3. йКонтрольные животные, которые были двукратно с интервалом 21 день иммунизированы буферным раствором.

Через 21 день после последней иммунизации данные животные были заражены коронавирусом SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1 интраназально 10 ⁵ ТСГО50/мышь.

В ходе эксперимента оценивали изменения веса и выживаемость животных. Полученные результаты представлены на фиг 1, 2.

Как видно из представленных данных, двукратная иммунизация мышей вариантами разработанного иммунобиологического средства Ad26-S-B.1.1.1/Ad5-S-B.1.1.1 полностью защищает животных от гибели, вызванной заражением SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1. Кроме того, было показано, что двукратная иммунизация мышей вариантами разработанного иммунобиологического средства Ad26-S-B.1.1.1.7/Ad5-S-B.1.1.1.7 также полностью защищает животных от гибели, вызванной заражением SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1.

Пример 21. Оценка протективных свойств разработанных иммунобиологических средств против SARS-CoV-2 вариант В.1.351. Для оценки протективных свойств разработанных иммунобиологических средств были выбраны ЬАСЕ-2 трансгенные мыши, которые чувствительны к коронавирусу SARS-CoV-2. Для эксперимента были выбраны мыши весом 18-20г, самки, которые были разделены на несколько групп по 10 животных.

Группа 1. Мыши, иммунизированные иммунобиологическим средством Ad26-S- В.1.1.1 внутримышечно, в дозе 1О ¹⁰ в.ч./мышь и затем через 21 день иммунизированные иммунобиологическим средством Ad5-S-B.1.1.1 внутримышечно, в дозе 1О ¹⁰ в.ч./мышь.

Группа 2. Мыши, иммунизированные иммунобиологическим средством Ad26-S- В1.1.1.7 внутримышечно, в дозе 1О ¹⁰ в.ч./мышь и затем через 21 день иммунизированные иммунобиологическим средством Ad5-S-B1.1.1.7 внутримышечно, в дозе 1О ¹⁰ в.ч./мышь.

Группа 3. Контрольные животные, которые были двукратно с интервалом 21 день иммунизированы буферным раствором.

Через 21 день после последней иммунизации данные животные были заражены коронавирусом SARS-CoV-2 вариант В.1.351 интраназально 1О ⁵ ТСГО5О/мышь.

В ходе эксперимента оценивали изменения веса и выживаемость животных. Полученные результаты представлены на фиг. 3, 4.

Как видно из представленных данных, двукратная иммунизация мышей вариантами разработанного иммунобиологического средства Ad26-S-B.l.l.l/Ad5-S-B.1.1.1 полностью защищает животных от гибели, вызванной заражением SARS-CoV-2 вариант В.1.351. Кроме того, было показано, что двукратная иммунизация мышей вариантами разработанного иммунобиологического средства Ad26-S-B.1.1.1.7/Ad5-S-B.1.1.1.7 также полностью защищает животных от гибели, вызванной заражением SARS-CoV-2 вариант В.1.351.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают эффективность иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и промышленную применимость.