CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a antígenos, proteínas inmunogénicas, y composiciones farmacéuticas que pueden usarse como vacunas en contra de distintas cepas de Escherichia coli productoras de shigatoxinas.

ANTECEDENTES

Distintas cepas de bacterias Escherichia coli productoras de shigatoxinas (STEC) están apareciendo globalmente como patógeno zoonótico, y como una de las principales causas de enfermedades asociadas a consumo de alimentos. STEC es agente etiológico de diarrea aguda, disentería, y síndrome urémico hemolítico (SUH). El ganado bovino es el principal reservorio de STEC, y el consumo de carne contaminada, poco cocinada, es la principal vía de contagio. 0157.Ή7 es el serotipo de STEC más frecuentemente asociado con brotes esporádicos y casos severos, pero existen otros serogrupos de STEC, tales como 026, O103, 0111 y 0113 que también han sido implicados como fuentes de tales brotes. La bacteria coloniza el colon humano y allí sintetiza y libera las shigatoxinas (Stx), el principal factor virulento involucrado en las patologías infecciosas. La presencia de otros factores de virulencia tales como la proteína de membrana externa intimina y su receptor Tir, ambos codificados en el locus de esfacelamiento del enterocito (LEE), son considerados factores de riesgo en el desarrollo de SUH.

El SUH ha tenido una alta incidencia en niños menores de 5 años y representa la consecuencia más severa de una infección con STEC, a menudo asociado con anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia, e insuficiencia renal aguda, que a veces progresa a una falla renal crónica. El tratamiento de SUH es preferentemente de sustento, ya que no existe una terapia específica para STEC. Los antibióticos están contraindicados, ya que promueven la producción y liberación de Stx, aumentando así el riesgo de desarrollar SUH. Por tanto, debido a que los efectos más negativos de una infección por STEC son los resultantes de la actividad de Stx, los esfuerzos en los desarrollos de terapias se han enfocado en obtener compuestos que se unan a la toxina Stx y bloqueen sus efectos. Sin embargo, los tratamientos probados hasta ahora no han tenido éxito o se mantienen aún en etapas de evaluación de su eficacia clínica en humanos.

Los candidatos a vacunas han sido probados en modelos animales con niveles de éxito variables, aunque la falta de un modelo animal que reproduzca precisamente el perfil clínico de la infección es una barrera considerable. Los candidatos a vacuna han considerado versiones recombinantes de Stx, intimina, EspA, proteínas quimera construidas fusionando las subunidades A y B de Stx1 y Stx2, y también la utilización de cepas no virulentas de 0157:1-17.

Hasta ahora, el candidato a vacuna más prometedor probado en humanos está basado en la fusión por unión covalente de un polisacárido específico de E. co/ 0157:H7 y la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (0157-rEPA). Una prueba clínica en Fase II se lleva a cabo para evaluar dicha vacuna. Sin embargo, todos estos esfuerzos se han enfocado principalmente en serogrupos 0157, descuidando serogrupos distintos a 0157, y como resultado, dichas vacunas podrían proporcionar una cobertura incompleta contra STEC.

Además, la caracterización de los antígenos de STEC se ha enfocado en el serogrupo 0157. Se han descrito respuestas inmunes humorales en pacientes infectados con estas bacterias contra el lipopolisacárido (LPS), Stx, y flagelina (FliC - H7). Los antígenos codificados en el locus LEE, aparte de intimina y Tir, incluyen EspA, EspB, y EspD. Mientras que la identificación de estas proteínas podría conducir a una vacuna con una cobertura mejorada, la protección aún estaría limitada principalmente a serogrupos STEC-LEE positivos. Por tanto, es importante identificar antígenos y proteínas inmunogénicas que estén conservadas en una amplia variedad de STECs, independiente del serogrupo, de manera de proporcionar una cobertura más amplia con una vacuna.

El uso de técnicas de inmunoproteómica (2D-PAGE, espectrometría de masas, y Western blot) utilizando suero de pacientes infectados, ha demostrado ser útil para identificar proteínas sintetizadas in vivo, durante períodos de infección, que estimula la respuesta humoral inmune del hospedero.

ARTE PREVIO

En busca de comparar la presente invención con documentos relevantes publicados previamente, se realizó una búsqueda del estado del arte, el resultado de la cual se resumen a continuación.

WO2011080505 describe un método para producción de bacteriófagos, donde dichos bacteriófagos pueden usarse en la producción industrial de vacunas. En particular se indica el uso de E. coli como forma de producción de los fagos, sin embargo, se considera una cepa E. coli "deficiente" de algunos genes.

WO2011080595 describe proteínas de E. coli que pueden ser útiles como portadoras de polisacáridos para generar respuesta inmune. En particular, este documento se enfoca a provocar una respuesta inmune contra ciertos polisacáridos y la función de las proteínas de £. coli es potenciar dicha respuesta inmune.

WO2010068 13 describe una vacuna para prevención de infecciones por clamidias, donde dentro de las opciones de fragmentos inmunogénicos se encuentra OmpT, sin embargo no hay mención a cepas productoras de shigatoxinas.

WO2010010983 describe la producción de bacterias Gram negativo, que han sido modificadas para expresar proteínas de membrana externa (en vesículas) con epítopes foráneos. En particular, dentro de los epítopes se menciona la familia Omp. Más particularmente, se indica que los epítopes considerados son específicamente antígenos de virus o microorganismos que causan enfermedades infecciosas en humanos (Reivindicación 7). Se menciona específicamente bacterias Escherichia spp. entre otras (reivindicación 8). Finalmente, las vesículas que llevan los antígenos son usadas como vacunas bio-nano particuladas, sin embargo no menciona cepas productoras de shigatoxinas.

Finalmente, en los documentos detectados relacionados con la presente invención, no se encontraron documentos que mencionen específicamente vacunas contra E. coli productora de toxina Shiga (o shigatoxinas), de manera que la presente invención resulta novedosa e inventiva.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Perfiles PME y de Western blot con sueros de pacientes con SUH y pacientes controles. (A). SDS-PAGE de PME. 12% poliacrilamida, tintura de plata. (B, C). Western blot de SDS-PAGE en 12% poliacrilamida con una mezcla de suero de pacientes SUH (B) y controles (C) (dilución 1 :3.500); anticuerpos secundarios antí-lgG humana (dilución 1 :5.000). (M). Escala de tamaño de proteínas, indica los tamaños moleculares de varias proteínas (Línea 1). STEC 026:H11. (Línea 2). STEC O103. (Línea 3). STEC 0113:H21. (Línea 4). STEC 0157:H7. (Línea 5). Cepa comensal E. coli HS. Cabezas de flecha con números correspondientes a las proteínas descritas en la Tabla 1. Figura 2: Perfiles de 2D-PAGE de PME desde HS de STEC y E. coli. Rango de pH 4 - 7. 12% poliacrilamida. Tintura Coomassie blue G-250. Las imágenes muestran las proteíans inmunogénicas identificadas usando MALDI-TOF TOF. (A). STEC 026:H11. (B). STEC O103. (C). STEC 0113.Ή21. (D). STEC 0157:H7. (E). E. coli HS. (F). Diferencia entre perfiles PME de cepas STEC y E. coli HS. Un perfil PME único fue identificado para cepas STEC (puntos más oscuros) superimpuestos al perfil PME de cepa E. coli HS. Algunas de estas proteínas estaban sólo presentes en cepas STEC (recuadros). El análisis fue realizado usando el Software BioNumerics versión 6.6. La barra de escala indica los pesos moleculares en kDa.

Figura 3: Proteínas inmunogénicas identificadas con Western blot de 2D-PAGE. El 2D-PAGE en 12% poliacrilamida (izquierda) y Western blot (derecha) de PME de cepas STEC usando una mezcla de suero de pacientes con SUH (dilución 1 :3.500). Anticuerpos secundarios anti- IgG-humana (dilución 1 :5.000). (A). FliC (STEC 0103). (B). FliC (STEC 0157:H7). (C). FliC (0113:H2). (D). OmpC, OmpF, OmpA, NmpC, OmpT, and Hek (STEC 0113:H2). (E). L- asparraginasa II (STEC 0113.H2). La barra de escala indica los pesos moleculares en kDa. La flecha bajo cada gel o Western blot indica el rango de pH de la separación.

Figura 14: Perfiles de PME de cepas de E. coli BL21(DE3) transformadas y Western blot de proteínas recombinantes con suero de pacientes con SUH y control. (A). SDS-PAGE de PME en 12% poliacrilamida. Tintura Coomassie blue G-250. (B). Western blot de suero SUH (dilución 1:3.500) y anticuerpos secundarios anti- IgG humana (dilución 1:5.000). (C). Western blot de suero SUH (dilución 1 :3.500) y anticuerpos secundarios anti-lgA humana (dilución 1 :2000). (D). Western blot con suero control (dilución 1 :3500) y anticuerpos secundarios anti- IgA humana (dilución 1 :2.000). (E). Western blot de suero control (dilución 1 :3.500) y anticuerpos secundarios anti- IgA humana (dilución 1 :2.000). (M). Escala de tamaño de proteínas. (1). E. coli BL21(DE3)/ pET15C. (2). E. coli BL21(DE3)/ pET15C_OmpT (3). E. coli BL21(DE3)/ pET15C_Cah. Las flechas y números corresponden a las proteínas que se indican en la Tabla 4. ^* formas inmaduras o degradadas de rCah. El peso de los estándares de peso molecular es indicado.

Existen distintas cepas de Escherichia coli que producen shigatoxina (STEC), y constituyen un grupo de patógenos zoonóticos emergentes a nivel mundial, asociados a enfermedades transmitidas por alimentos, y que pueden producir Síndrome Urémico Hemolítico (SUH).

La invención corresponde al uso de proteínas bacterianas, como vacunas, que son reconocidas por suero de pacientes que cursaron con SUH y reconocidas tanto por IgG como IgA en humanos.

En la descripción que se entrega a continuación de la presente invención, se hace referencia a antígenos, proteínas inmunogénicas, Proteínas de Membrana Externa (PME) inmunogénicas asociadas y conservadas en STEC, donde estos términos pueden usarse de manera equivalente para referirse a la misma materia, a menos que se indique lo contrario.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a antígenos, proteínas inmunogénicas, y composiciones farmacéuticas que las comprenden, útiles para usarse como vacunas contra bacterias E. coli productoras de shigatoxinas. En una realización particular, las proteínas inmunogénicas y composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse a un mamífero, ave u otro animal, como también a humanos.

Una ventaja de la presente invención es que los antígenos, proteínas inmunogénicas, y composiciones farmacéuticas que las comprenden no están limitadas a cepas LEE positivas (Locus de Esfacelamiento del Enterocito), por lo que la protección que confiere una vacuna elaborada en base a los antígenos, proteínas inmunogénicas, y composiciones farmacéuticas que las comprenden de la presente invención es más amplia en cuanto cubre a cepas LEE negativas, que de igual manera producen shigatoxinas.

Así, la presente invención identifica antígenos, y proteínas inmunogénicas que en una realización son Proteínas de Membrana Externa (PME) inmunogénicas asociadas y conservadas en STEC. En otra realización dichas PME inmunogénicas asociadas y conservadas en STEC son usadas como blancos para el desarrollo de terapias que ayuden a disminuir las infecciones relacionadas con este patógeno.

En un primer aspecto, la invención se refiere a antígenos, proteínas inmunogénicas, Proteínas de Membrana Externa (PME) inmunogénicas asociadas y conservadas en STEC.

En una realización específica, las PME inmunogénicas asociadas y conservadas en STEC son obtenidas de cepas STEC particulares, como por ejemplo STEC 026:H11 , 0103 y 0157:H7. Específicamente, estas cepas STEC han sido frecuentemente asociadas con enfermedad en humanos y especialmente con complicaciones de la infección como es el SUH. Adicionalmente, para asegurar cobertura en caso de cepas negativas para LEE, también se incorpora una cepa LEE negativa, que ha sido reportada como causante de SUH, dicha cepa corresponde a 0113:H11. En otra realización particular, para identificar antígenos, y proteínas inmunogénicas que en una realización son Proteínas de Membrana Externa (PME) inmunogénicas asociadas y conservadas en STEC, y evitar la generación de reactividad cruzada contra cepas de E.coli que forman parte de la microbiota comensal (benéfica), se usó la cepa comensal E. coli HS.

En aún otra realización, se usan extractos de PME, pues en bacterias Gram negativo, son estas proteínas las que principalmente interactúan con componentes del hospedero mediando procesos de adhesión, colonización e invasión.

En una realización particular, las proteínas inmunogénicas que en una realización son Proteínas de Membrana Externa (PME) inmunogénicas asociadas y conservadas en STEC son flagelinas (FliC), pertenecientes a cepas STEC. En otra realización las proteínas inmunogénicas son porinas. En aún otra realización, las proteínas inmunogénicas son proteínas asociadas a al menos a un serotipo STEC pero ausentes en E. coli HS.

En una realización más específica, las proteínas inmunogénicas porinas son específicamente OmpC, OmpF y OmpA. En una realización aún más específica, las proteínas OmpC, OmpF y OmpA muestran inmunodominancia para sueros SUH y serorreactividad débil para sueros control. En una realización particular, la proteína inmunogénica es L-asparaginasa II que es serorreactiva para sueros SUH.

En aún otra realización más específica, las proteínas inmunogénicas de la presente invención son EF-Tu, Ag43, Cah, OmpT, Hek y, NmpC, todas asociadas a uno o más serotipos de STEC estudiados y ausentes en E. coli HS.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención OmpT tiene una secuencia aminoacídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:1 , más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención OmpT tiene una secuencia nucleotídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:2, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención Cah tiene una secuencia aminoacídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:3, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención Cah tiene una secuencia nucleotídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:4, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención Ag43 tiene una secuencia aminoacídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:5, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención Ag43 tiene una secuencia nucleotídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:6, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención Hek tiene una secuencia aminoacídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:7, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención Hek tiene una secuencia nucleotídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:8, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención NmpC tiene una secuencia aminoacídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:9, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención NmpC tiene una secuencia nucleotídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO: 10, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención L-asparaginasa II tiene una secuencia aminoacídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO:11 , más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización aún más específica, la proteína inmunogénica considerada en la presente invención L-asparaginasa II tiene una secuencia nucleotídica con un porcentaje de identidad de al menos un 80% con respecto a SEQ ID NO: 12, más preferentemente un 85%, aún más preferentemente un 90%, y aún más preferentemente un 95%, aún más preferentemente un 98%, aún más preferentemente un 99%.

En una realización específica, las proteínas inmunogénicas de la presente invención, son preferentemente reactivas sólo para sueros SUH.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden a antígenos, proteínas inmunogénicas, Proteínas de Membrana Externa (PME) inmunogénicas, asociadas y conservadas en STEC.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la presente invención comprende al menos uno de los antígenos o proteínas antigénicas de la presente invención, al menos un adyuvante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos un preservante.

En una realización más específica, los adyuvantes pueden ser adyuvantes orgánicos, tales como adyuvantes basados en aceites, adyuvantes virosomales; como también adyuvantes inorgánicos, tales como sales de aluminio, entre otros.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la presente invención comprende al menos alrededor de 1 g/ml hasta alrededor de 500 pg/ml de al menos una de las proteínas inmunogénicas de la presente invención para una dosis unitaria. Más preferentemente entre 5 g/ml hasta alrededor de 250 pg/ml

En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende al menos alrededor de 2 g/ml hasta alrededor de 1.000 pg/ml de al menos dos de las proteínas inmunogénicas de la presente invención para una dosis unitaria. Más preferentemente entre 10 Mg/ml hasta alrededor de 500 g/ml

En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende al menos alrededor de 3 Mg/ml hasta alrededor de 1 .500 g/ml de al menos tres de las proteínas inmunogénicas de la presente invención para una dosis unitaria. Más preferentemente entre 15 iglm\ hasta alrededor de 750 g/ml

En otra realización, la composición farmacéutica de la presente invención comprende al menos alrededor de 4 pg/ml hasta alrededor de 2.000 pg/ml de al menos cuatro de las proteínas inmunogénicas de la presente invención para una dosis unitaria. Más preferentemente entre 20 μg/ml hasta alrededor de 1 .000 pg/ml.

En cuanto a las cantidades de cada proteína inmunogénica presente en cada composición farmacéutica, se debe entender que los rangos indicados previamente indican los mínimos y máximos para una determinada formulación, pero también se considera dentro de la invención todos los subrangos comprendidos entre dichos mínimos y máximos. Por ejemplo, se consideran subrangos con incrementos o decrementos de 50 pg/ml, incrementos o decrementos de 25 g/ml, incrementos o decrementos de 10 pg/ml, incrementos o decrementos de 5 pg/ml, incrementos o decrementos de 2,5 pg/ml, incrementos o decrementos de 1 g/ml, o incrementos o decrementos de 0, 1 g/ml.

En particular, las proteínas inmunogénicas preferidas para usar en la composición farmacéutica de la presente invención son Cah, OmpT, Hek, NmpC, EF-Tu y L-asparaginasa II.

A continuación se proporcionan distintos ejemplos realizados para ilustrar el funcionamiento de la presente invención, sin embargo, no deben entenderse como limitantes del alcance de la presente invención, que viene dado por el pliego de reivindicaciones. EJEMPLOS

EJEMPLO 1 : Diferencias entre perfiles de proteínas de membrana externa de STEC y cepas HS de E. coli.

Múltiples bandas de proteínas se observaron cuando se analizó PME usando SDS-PAGE, algunas de las cuales aparentemente sólo estaban presentes en cepas STEC (Figura 1A). Sin embargo, no fue posible discriminar todas las bandas, haciendo difícil identificar cada proteína. Por lo tanto, realizamos un 2D-PAGE para discriminar de mejor manera entre PME de peso molecular similar, asegurando una identificación definitiva. Debido a que la literatura sugiere que la mayoría de PMEs de £. coli son identificadas mejor a un pH de entre 4 a 7, las proteínas fueron separadas en este rango de pH en geles de 2D, teñidos con azul Coomassie G-250, fotografiadas y analizadas usando el software Bionumerics 2D, con un promedio de 47 puntos detectados por cada cepa (Figuras 2A-E). El software también permitió realizar un perfil global de PME para las cepas STEC analizadas, donde fueron superimpuestos los perfiles de cepas HS £. coli comensales para identificar proteínas únicas asociadas a cepas STEC (Figura 2F).

EJEMPLO 2: Proteínas inmunogénicas de membrana externa asociadas a STEC.

Las PME separadas por SDS-PAGE y 2D-PAGE se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sometieron a un ensayo de Western blot usando una mezcla de suero de pacientes con SUH (suero SUH) y una mezcla de suero de pacientes control (suero control), todos obtenidos durante fase de convalecencia. Un ensayo ELISA mostró que las concentraciones de IgG e IgA no difirieron significativamente entre los sueros. El suero SUH fue reconocido por varios de los PME, mientras que el suero control fue reconocido solo por una minoría de los PME o mostró reactividad muy débil (Figuras 1 B y 1C respectivamente). Interesantemente, algunas de las proteínas asociadas a STEC (esto es, aquellas presentes sólo en cepas STEC), fueron reconocidas por el suero SUH y no por suero control, mientras que otras fueron reactivas a ambos sueros. Las proteínas asociadas a STEC que resultaron seroreactivas al suero SUH fueron extraídas de los geles SDS-PAGE y 2D-PAGE para identificación por MALDI-TOF TOF. Otras proteínas con pesos moleculares entre 32 y 37 kDa también se extrajeron, a pesar de encontrarse en todos los perfiles de PME, si eran fuertemente seroreactivas con el suero SUH. La Tabla 1 lista las proteínas inmunogénicas analizadas usando MALDI-TOF/TOF.

Un total de doce proteínas inmunogénicas fueron identificadas, de las cuales algunas estaban presentes en múltiples perfiles PME STEC. Las porinas OmpC, OmpF, y OmpA, ubicuas en £ coli, fueron reconocidas tanto por el suero SUH como el suero control, aunque la seroreactividad fue más débil en el último grupo. La proteína L-asparaginasa II fue observada sólo en los perfiles O103 y 0113:H21 STEC; sin embargo, su peso molecular y punto isoeléctrico coinciden con la proteína OmpA presente en otras cepas estudiadas, enmascarando posiblemente su presencia. Estudios recientes realizados en nuestro laboratorio usando anticuerpos anti-L-asparaginasa II sugieren que esta proteína está presente en todos los perfiles PME. Sin embargo, es notable que esta proteína fuese seroreactiva solo con suero SUH. Por otro lado, varios antígenos flagelares (FliC) fueron fuertemente reconocidos tanto por suero SUH como suero control. Interesantemente, las proteínas Ag43 (a43), OmpT, Hek, NmpC, y EF-Tu, que estaban presentes en perfiles PME de las cepas STEC pero no en cepas comensales HS de E. coli, fueron reconocidas solo por suero SUH (Figuras 1 B, 1 C y 3), y por tanto fueron clasificadas como proteínas ¡nmunogénicas asociadas a STEC.

EJEMPLO 3: Análisis bioinformático de proteínas ¡nmunogénicas.

Se realizó un análisis bioinformático usando PSORTb para predecir la ubicación subcelular de las proteínas ¡nmunogénicas, donde se indicó que EF-Tu y L-asparaginasa II son citoplasmáticas y proteína periplasmática, respectivamente. Todas las otras proteínas fueron localizadas en la membrana externa de la superficie bacteriana.

EJEMPLO 4: Presencia de ompT, ag43, y can en cepas STEC versus comensales E. coli.

Dado que OmpT está presente en las cuatro cepas STEC analizadas, y aparentemente cah está conservada en este patógeno, se usó un análisis PCR para determinar los genes ompT, ag43, y cah en cepas STEC y comensales de E. coli a partir de heces humanas. Interesantemente, ompT y cah estuvieron presentes en 98% y 64% respectivamente de los aislados STEC, comparado con sólo 36% y 9% de aislados de comensales. Un test exacto de dos colas de Fisher con un nivel de significancia de 95% determinó que la frecuencia de detección de gen para ompT (p<0,0001 ) y cah (p<0,001) fueron significativamente mayores en STEC al compararse con aislados de comensales. La frecuencia de detección de ag43 fue significativamente mayor (p<0,01 ) en aislados humanos distintos de 0157 al compararse con aislados comensales (Tabla 3). Estos datos claramente demuestran que omT y cah están altamente conservados en cepas STEC y preferentemente ausentes en cepas comensales de E. coli.

EJEMPLO 5: Proteínas recombinantes rOmpT y rCah son reactivas en suero de 6 paciente SUH para IgG e IgA.

Se usaron técnicas recombinantes para obtener la proteína OmpT (rOmpT), de manera de confirmar la identidad sugerida por el análisis MALDI-TOF/TOF como también su inmunogenicidad. Más aún, debido a que el gen cah es conservado en STEC, las técnicas recombinantes fueron usadas para obtener la proteína Cah (rCah), de manera de determinar su probable seroreactividad en sueros SUH y control. Las proteínas fueron producidas en £ coli BL21 (DE3) y fueron parcialmente purificadas usando extracción PME. Interesantemente, el perfil PME para la cepa que expresa cah mostró 3 bandas diferentes, que no se observan si se obtiene de la misma cepa con el plásmido vacío. Una de estas bandas tenía el peso esperado de Cah (92 kDa), mientras que las otras dos podrían representar formas inmaduras o degradadas de Cah, de acuerdo al MALDI-TOF/TOF (Figura 4A y Tabla 4). El ensayo por Western blot determinó que rOmpT es reconocida por IgG e IgA en sueros SUH y control, aunque la seroreactividad es débil en el último grupo. Interesantemente, rCah es reconocida por IgG e IgA solamente de suero SUH, y por tanto, se incluyó Cah como una proteína inmunogénica asociada a STEC en la presente invención (Figuras 4B-E). Estos resultados indican que OmpT y Cah son sintetizadas in vivo durante infecciones STEC en humanos y generan una fuerte respuesta inmune humoral.

Tabla 1

Proteínas inmuno énicas identificadas con MALDI-TOF/TOF

Asparaginasa II 34000

^A Los números se corresponden con proteínas que se muestran en Figura 1. Probabilidad de asignar erróneamente la identidad de proteína. ^C EI punto isoeléctrico y peso molecular teórico fueron determinados usando las herramientas ExPASy del Proteomics Server UniProt Knowledgebase (http://us.expasy.org/). ^D La predicción realizada usando el programa PSORTb v3.0 (http://www.psort.org/psortb/index.html). OM: Membrana externa, pl: Punto isoeléctrico. Mw: Peso molecular.

Tabla 2

Presencia de ag43 y cah en cepas STEC y avirulentas de E. coli de acuerdo al análisis de secuencia genómica

%

N° Acceso Tamaño Identidad/

Cepa Gen Porcentaje ^B

GenBank (AA) Similarida

d ^A

STEC

0157:1-17 str. EDL933 AAG55356.1 cah 1005 - -

AAG55766.1 cah 1005 100 / 100 5574

026:H11 str. 11368 BAI24655.1 cah 1005 100 / 100 5568

^A EMBOSS 6.3.1 : (http://mobyle.pasteur.fr/cg¡-bin/portal.py?#forms::matcher ). ^B Algoritmo BLASTN (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome). *indica un gen con una deleción. AA: amino ácidos

Tabla 3

Frecuencia detección para ag43, Cah, y OmpT en 181 aislados de E. coli de distintos orígenes, determinado usando PCR

Número

No. (%) de aislados positivos para

Origen aislado de

cada gen

aislados

ag43 cah ompT

Comensal £ coli de heces 4 (36)

11 3 (27) 1 (9)

humanas

STEC 0157:H7 de humanos 48 1 (2) 48 (98) ^D 48 (100)°

STEC 026:1-111 de humanos 28 28 (100) ^D 28 (100)° 28 (100)°

Other non-0157 de humanos 49 32 (65) ^A 16 (33) 49 (100)°

Totales no 0157 77 60 (78) ^B 44 (57) ^B 77 (100)°

125

STEC de humanos 125 61 (49) 92 (74) ^D

(100)°

STEC de animales 45 26 (58) 17 (38) 41 (91) ^c STEC totales de aislados 170 87 (51) 109 (64) ^c 166 (98) ^D

^A P < 0,05. ^B P < 0,01. ^U P < 0,001. ^U P < 0,0001. Test exacto de dos colas de Fisher (comparado con aislados comensales).

Tabla4

Proteínas recombinantes identificadas usando MALDI-TOF TOF

^A Los números corresponden a las proteínas en la Figura 4. ^B Probabilidad de asignar erróneamente la identidad de la proteína

Discusión

La presente invención fue realizada con extractos de PME, ya que en bacterias Gram negativas estas proteínas juegan un importante rol en la interacción con componentes del hospedero, a través de adhesión, colonización, e invasión. Se ha reportado que la exposición a PME enterobacterianas estimula la respuesta inmune humoral en pacientes infectados, haciéndolos candidatos apropiados para vacunas contra patógenos Gram negativos.

Las proteínas inmunogénicas de la presente invención pueden clasificarse en tres grupos, a saber flagelinas (FliC) de cepas STEC que son reconocidas fuertemente tanto en sueros SUH como sueros de control; un segundo grupo de porinas OmpC, OmpF, and OmpA, que muestran inmunodominancia en sueros SUH y una reactividad débil en sueros de control; y el tercer grupo que incluye la proteína L-asparaginasa II, también presente en los perfiles PME, pero interesantemente presenta reactividad sólo en suero SUH. Este tercer grupo incluye las proteínas Ag43, Cah, OmpT, Hek, NmpC, y EF-Tu, asociadas usualmente a uno o más serotipos de STEC pero ausentes de E. coli HS.

Además, en la presente invención se desarrolló una proteína recombinante rOmpT, donde a través de Western blot usando sueros SUH y sueros de control, se pudo determinar que rOmpT es reconocido por IgG e IgA de ambos sueros, aunque la respuesta es débil en el suero control. Dicho resultado contradice la observación inicial de que OmpT no es reconocido por suero control. Sin desear verse limitado por teorías científicas, se postula que esta reactividad se derive de una reacción no específica debido a la abundancia de la proteína recombinante. Además, estos resultados permiten indica que tanto OmpT como Cah son proteínas sintetizadas in vivo durante las infecciones STEC en humanos y generan una fuerte respuesta inmune humoral.

Finalmente, cabe destacar que las proteínas Ag43, Cah, OmpT, Hek, NmpC, EF-Tu, y L- asparaginasa II no han sido caracterizadas hasta esta invención como inmunogénicas en cuadros de STEC. Por tanto, la presente invención representa la primera divulgación de estos nuevos antígenos para el patotipo. La evidencia de que los genes cah y ompT están conservados en STEC pero no en £ coli comensales fecales sugiere que tanto Cah como OmpT pueden conferir protección contra un amplio rango de serogrupos STEC y una reactividad cruzada mínima con la microbiota comensal. Debido a que STEC colonizan la mucosa, la respuesta humoral con IgA es un requisito para eliminar al patógeno. La reactividad de Cah y OmpT para IgA desde suero SUH, junto con los otros resultados que se muestran en la presente invención, permite identificar a los antígenos de esta invención como inmunógenos ideales para vacunas contra STEC.

Métodos utilizados en la realización de los ejemplos anteriores

A continuación se describen distintos métodos usados durante las distintas etapas de desarrollo de la presente invención.

EJEMPLO 6: Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento, y plásmidos

Las cepas bacterianas y plásmidos usados en la presente invención se indican en la Tabla 5. Las cepas STEC corresponden a aislados clínicos que fueron caracterizados por PCR e identificados por el Instituto de Salud Pública de Chile y el Laboratorio de Enteropatógenos, del Programa de Microbiología y Micología, de la Escuela de Medicina de la Universidad de Chile. La cepa comensal de E. coli usada fue HS. Se aislaron un total de 170 STEC y 11 £. coli comensales de heces humanas (negativos por PCR para factores de virulencia de patotipos conocidos de diarrea), descritos en la Tabla 5, que fueron usados para la detección de frecuencia de genes ompT, ag43, y cah.

Tabla 5

Cepas y plásmidos

Serogrupo-

Cepa Origen del aislado Referencia

Serotipo

Serogrupo-

Cepa Origen del aislado Referencia

Serotipo

E. coli (Studier F, Moffatt B. Use of BL21 (DE3) bacteriophage T7 RNA

polymerase to direct selective high level expression of cloned genes. Journal of molecular biology. 986; 189: 113-30)

Las cepas E. coli se crecieron en medio Luria Bertani (LB, Triptona 10 g/L, NaCI 10 g/L y extracto de levadura 5 g/L) a 37° C por 18 h sin agitación. Se agregó agar bacteriológico en una concentración final de 1 ,5% (p/v) de manera de preparar el medio sólido. El medio de cultivo fue suplementado con ampicilina (100 pg/mL) y 1 mM of isopropil β-ϋ-1- tiogalactopiranosido (IPTG). Para realizar la complementacion alfa, se agregó al medio de cultivo ampicilina (100 pg/mL), IPTG (50 g/mL), y X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indoll-p-D- galactopiranosido) (50 pg/mL).

Los extractos de PME fueron obtenidos como se indica en Rivas et al., 2008 (Rivas L, Fegan N, Dykes G. "Expression and putative roles in attachment of outer membrane proteins of Escherichia coli 0157 from planktonic and sessile culture." Foodborne pathogens and disease. 2008;5(2): 155-64) con pequeñas modificaciones que se indican brevemente: se realizó centrifugación a 25.500 x g por 60 y 40 minutos. La concentración de proteína en la fracción de membrana externa se midió usando el reactivo "Bradford protein assay dye reagent" (Bio-Rad) y albúmina sérica bovina estándar (BSA) de acuerdo a recomendaciones del fabricante. Los extractos de PME se almacenaron a -80° C hasta usarse.

EJEMPLO 7: Electroforesis en gel denaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE).

Muestras de 8 pg de PME de cada cepa se separaron usando gel de poliacrilamida al 12% con sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) de acuerdo al método descrito por Laemmli (Laemmli U. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature. 1970; 227:680-685.), usando un SE 600 Ruby Standard Dual Cool Vertical Unit (Amersham Biosciences). Estándares de Precisión Plus Protein™ Kaleidoscope™ (Bio-Rad) se usaron como marcadores de peso molecular. Las proteínas se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) o con el Kit Silver Stain Plus (Bio-Rad).

EJEMPLO 8: Electroforesis en dos dimensiones (2D-PAGE).

Tiras preformadas IPG (13 cm, pH 4-7, lineales, GE Healthcare) se rehidrataron en 250 pL de solución de rehidratación DeStreak (GE Healthcare) con un tampón IPG pH 4-7 (1%) (GE Healthcare), DTT (10 mM) y 200 pg de PME, por 16 h a temperatura ambiente de acuerdo a recomendaciones del fabricante. Las tiras rehidratadas fueron sujetas a isoelectroenfoque (IEF) usando un Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System (GE Healthcare) a 20° C con un límite de corriente de 50 μΑ/tira de acuerdo al siguiente protocolo: 200 V/1 h, 500 V/1 h, 1000 V gradiente/1 h, 8000 V gradiente/3:30 h y finalmente 8000 V hasta alcanzar el enfoque 20 kVh. Luego del IEF, las tiras se equilibraron por 15 min en 3 mL de tampón I [Tris-HCI 50 mM pH 8.8, urea 6 M, glicerol 30% (w/v), SDS 2% (w/v) y DTT 10 mg/mL (w/v)] y luego en 3mL de tampón II por 15 minutos. El tampón II difiere del I en que contiene iodoacetamida (25 mg/mL) en lugar de DTT. Luego, las tiras fueron aplicadas directamente a geles de poliacrilamida al 12%. La segunda dimensión de SDS- PAGE vertical se realizó usando SE 600 Ruby Standard Dual Cool Vertical Unit (Amersham Biosciences) de acuerdo a instrucciones del fabricante. Luego de la separación en la segunda dimensión, los geles se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) y se fotografiaron, y las imágenes fueron analizadas usando el software BioNumerics 2D versión 6.6 (Applied-Maths). Los estándares Precisión Plus Protein™ Kaleidoscope™ (Bio-Rad) se usaron como marcadores de peso molecular.

EJEMPLO 9: Concentraciones en suero de IgG e IgA.

Una mezcla se creó del suero de 10 pacientes pediátricos en fase de convalecencia, que presentaban diarrea prodromal dentro de 20 días previos al diagnóstico de SUH (suero SUH), colectados desde 1990 a 1993 y desde 1999 a 2003. Como control, una mezcla fue creada de suero de 3 pacientes sin historia de SUH ni episodios de diarrea asociada a STEC. Los sueros fueron obtenidos desde varios centros de salud en Santiago, con el consentimiento informado de los pacientes. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Medicina de la Universidad de Chile. En la Tabla 6 se muestran características relevantes de cada paciente que donó suero usado en esta invención. Además, las concentraciones de IgG e IgA fueron determinadas en las mezclas usando ELISA con el kit Protein Detector ELISA (Kirkegaard & Perry Laboratories) de acuerdo a instrucciones del fabricante.

Tabla 6

Sueros usados en esta invención

F: Femenino; M: Masculino; m: meses; N.R.: No registrado; N.A.: No aglutinante

EJEMPLO 10: Transferencia e inmunodetección de proteínas

Las PME separadas por SDS-PAGE y 2D-PAGE se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore) por 60 min a 100 V/4° C usando el sistema Mini Trans-Blot Cell (Bio- Rad) de acuerdo a instrucciones del fabricante.

Luego de que la transferencia se completó, los sitios de unión no específicos disponibles en la membrana se saturaron usando una solución de bloqueo (Salina en tampón Tris 1X (TBS- 1X), 0,03% Tween-20 y 1% BSA) por 1 h a temperatura ambiente. Luego, las membranas se enjuagaron 5 minutos 3 veces con solución TBS-T (TBS 1X, 0,3% Tween-20). Luego las membranas fueron incubadas con agitación por 1 h en una solución de bloqueo que contenía las mezclas de sueros SUH o de control, diluidos 1 :3500. Luego de 2 enjuagues con solución TBS-T por 10 minutos cada vez, las membranas se incubaron con solución de bloque que contenía IgG anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina diluida 1 :5000 por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las imágenes fueron reveladas usando un kit con sustrato cromogénico de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) (Invitrogen), y la reacción se detuvo con agua destilada.

La seroreactividad de las proteínas recombinantes rOmpT y rCah se evaluó usando anticuerpos secundarios IgG e IgA anti-humano (Invitrogen) conjugados con fosfatasa alcalina y diluidos 1 :5000.

EJEMPLO 11 : Identificación de proteínas inmunogénicas usando espectrometría de masa

Las proteínas reconocidas por anticuerpos del suero SUH pero no del suero control, o que estuvieron presentes sólo en cepas STEC, se cortaron de los geles SDS-PAGE y 2D-PAGE teñidos con "Coomassie Brilliant Blue G-250." Otras proteínas que demostraron inmunodominancia también fueron obtenidas desde los geles. Estas proteínas se enviaron a análisis por Espectrometría de Masa en University of Texas Medical Branch en Galveston (Galveston, Texas, United States) para su identificación por espectrometría de masa MALDI- TOF/TOF. Cada fragmento de huella de péptido se envió al servidor MASCOT (http://www.matrixscience.com) para identificar la proteína comparándola con los fragmentos de otras proteínas presentes en dicha base de datos. Las identidades de las proteínas recombinantes rOmpT y rCah también se confirmaron por MALDI-TOF/TOF.

EJEMPLO 12: Análisis bioinformático de las proteínas inmunogénicas identificadas.

La localización subcelular fue predicha usando pSORTb versión 3.0 (http://psort.org/). Los puntos isoeléctricos teóricos y pesos moleculares se determinaron usando el Servidor ExPASy Proteomics Server UniProt Knowledgebase (http://us.expasy.org/). El algoritmo BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) también fue usado para evaluar la distribución de los genes codificantes para cada proteína en otras cepas £ coli y en otras especies de bacterias.

Detección de frecuencia de genes para ompT, ag43, y cah.

EJEMPLO 13: Reacción de polimerasa en cadena (PCR) se usó para determinar la presencia de genes.

Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen final de 25 pL que contenía DNA templado, 0,4 μΜ de cada partidor, 5 pL de tampón 5X GoTaq DNA-polymerase, 0,2 μΜ de cada dNTP (Fermentas), y 1 ,25 U de GoTaq® DNA Polymerase (Promega). Las condiciones de PCR fueron específicas para cada amplificación. La temperatura de hibridación se determinó como función de la temperatura de fusión del partidor, y la duración de la etapa de extensión como una función del largo del fragmento de DNA, generalmente 1 min/kilobase.

Debido a que la principal diferencia entre ag43 y cah es una deleción de 270 pb en la región de codificación del dominio alfa de Cah, los partidores se diseñaron para flanquear esta región, y obtener dos amplificaciones con dos distintos pesos moleculares (Tabla 7). La frecuencia de datos obtenidos fue sometida a un test exacto de dos colas de Fisher con un nivel de significancia de 95%.

Tabla 7

Partidores usados en la invención

* La porción subrayada indica los sitios de corte para las enzimas de restricción Ndel y Xhol. bp: pares de bases

EJEMPLO 14: Generación de proteínas recombinantes rOmpT y rCah.

Las secuencias codificantes de OmpT y Cah fueron amplificadas desde la cepa de referencia de E. coli 0157:H7 EDL933, usando los partidores descritos en la Tabla 7, con sitios de reconocimiento para enzimas de restricción Nde\ y Xho\ en los terminales 5' y 3' respectivamente. Los productos de PCR fueron ligados al vector pTZ57R/T (Fermentas) de acuerdo a las instrucciones del fabricante para construir los vectores pTZ57R/T_OmpT y pTZ57R/T_Cah. Estos vectores se usaron para transformar en el laboratorio la cepa de E. coli DH5a, y los clones se seleccionaron de acuerdo a la resistencia a ampicilina y complementación alfa. La secuenciación se realizó para confirmar clonamiento correcto de las secuencias codificantes (Macrogen).

El DNA de plásmidos se extrajo desde cepas transformadas DH5a E. coli y se digirieron con enzimas de restricción Nde\ y Xho\. Los productos fueron analizados en geles de agarosa al 1 %, y se purificó OmpT y Cah. Las secuencias fueron ligadas al vector de expresión pET15C (descrito en Caballero V, et al. Expression of Shigella flexneri gluQ-rs gene is linked to dksA and controlled by a transcriptional terminator. BMC Microbiology. 2012; 12:226), permitiendo la producción de proteínas recombinantes bajo el control del promotor del Fago T7 y con una cola de histidina en el C-terminal de cada proteína, para construir los vectores pET15C_OmpT ypET15C_Cah. Estos vectores se usaron para transformar las cepas E. coli DH5a y E. coli BL21 (DE3). Como control, ambas cepas también fueron transformadas con un vector pET15C vacío. Los clones fueron seleccionados de acuerdo a resistencia a ampicilina y confirmados por PCR. Las cepas transformadas de E. coli BL21 (DE3) se cultivaron en medio LB suplementado con 100 pg/mL de ampicilina por 10 h a 37° C con agitación, y luego la síntesis de proteínas recombinantes fue inducida por 4 h, suplementando el medio de cultivo con 1 mM de IPTG. Las proteínas recombinantes fueron parcialmente purificadas usando extracción PME, de acuerdo al protocolo antes descrito.

APLICACIÓN INDUSTRIAL

La presente invención es aplicable en la industria farmacéutica, particularmente en la fabricación de vacunas contra E. coli productora de shigatoxina y otras E.coli patógenas con las cuales la presente formulación podría también proteger.