为了促进免疫组织化学实验室的标准化、检测 免疫组织化学染色 结果的可靠性， 免疫组化过程应该进行有效的质量控制。免疫 组织化 学质量控制是指，采取不断优化的措施和技术 制定实验室制度及常规 工作， 规范和完善实验室的免疫组织化学染色操作流 程与步骤， 保证 免疫组织化学染色质量达到最佳结果， 并可以做出准确的诊断。

在临床病理诊断和形态学研究中，免疫组织化 学染色是一种很重 要的技术和手段。免疫组化技术应用于病理诊 断始于上世纪 70年代， 目前在全球病理界已经得到广泛应用，它已成 为病理医生常规工作中 不可缺少的部分。免疫组化技术拥有特异性、 敏感性强及操作简便等 优点， 使得免疫组化技术在疾病诊断领域得到了广泛 的推广和应用。 免疫组化技术不仅能提高了病理诊断的准确性 ，同时也渗透到了临床 和基础学科， 在探讨疾病的病因学、发病机制及科研工作中 起到了不 可估量的作用。

免疫组化技术具有操作简单， 灵敏度高、 特异性强等优点， 在各 级医院的临床病理诊断、研究等相关学科中得 到广泛应用， 但是由于 实验条件的差别及其他技术因素的影响，使得 免疫组化染色结果差别 很大， 从而影响到病理诊断的结果， 目前提高免疫组化染色技术水平 的需要越来越迫切， 而且任重道远。

质量控制由室内质控 (internal quality control， IQC) 和室间质控 (external quality assurance, EQA) 两部分组成。 IQC 是指实验室内部 自己制定免疫组织化学实验的质控方法和程序 ; EQA是由某个外部 机构或组织，对各个实验室之间的不同免疫组 织化学染色结果进行检 测和评估， 是在实验室之间进行的。 IQC 和 EQA对于实现免疫组织 化学染色的标准化方面起到了非常重要的作用 ，并推动了我国免疫组 织化学在病理诊断中的应用与发展。

对于免疫组织化学染色的内部质控程序来说， 主要的步骤便是对照 标准样品 （即参照物） 的设立。 只有设立阳性对照和阴性对照， 才能 确保免疫组织化学染色过程的准确性、 抗体及相关试剂的有效性，确 认染色结果的真实性， 检测是否存在假阳性或假阴性结果。对照的设 立包括试剂对照、组织对照以及内部对照等。 由于免疫组织化学染色 有可能出现假阳性和假阴性结果，因此每次实 验都必须同时设立阳性 对照和阴性对照， 以达到质控的最佳效果。 目前免疫组织化学常规对 照的设立，是由一张单独的切片上包含有待测 抗体阳性或阴性的组织 组成的。在日常免疫组织化学染色中， 每一种抗体都需设立一张单独 的阳性或阴性组织对照片， 以确认抗体及其他试剂是否有效， 染色过 程是否运行正常。 目前采用的阳性、 阴性对照组织方法， 虽然具有一 定的效果， 但是由于每张组织片都有一定差异， 因此很难为检测组织 提供一个标准含量的参考。且目前市场上没有 利用非生物组织的材料 作为免疫组化质量控制的对照材料。基于此， 本发明提供了一种免疫 组化质量控制参照物及利用该参照物进行质量 控制的方法。该参照物 是一种待测抗原含量稳定的组织切片对照物。 发明内容

为了在免疫组化质控过程中提供稳定的易于获 得的参照物，本发 明提供了提供一种免疫组化质量控制参照物及 利用该参照物进行质 量控制的方法。

为实现上述目的， 本发明提供的技术方案如下：

一种用于免疫组织化学技术质量控质的参照物 ，所述参照物包括 三个对照物： 质量控制的阳性对照物、质量控制的阴性对照 物以及抗 原修复对照物。

所述质量控制的阳性对照物的制备方法为： 将抗原经过葡聚糖材 料处理、 固化、 然后包埋于石蜡中。

所述质量控制的阴性对照物的制备方法为：将 不含有抗原的葡聚 糖材料包埋于石蜡中。

所述抗原修复对照物的制备方法为：将抗原经 过葡聚糖材料处理 并固化， 再经福尔马林浸泡后包埋于石蜡中。

本发明将制备好的质量控制的阳性对照物、 质量控制的阴性对照物以 及抗原修复对照物从石蜡块中取出， 按顺序包埋在同一个石蜡块中， 在切片机上实现切片并黏贴于载玻片上作为免 疫组化质量控质的参 照物。

本发明还提供了一种免疫组化质量控制的方法 ， 该方法是利用包 埋有待测目标抗原的材料模拟常规石蜡组织切 片，在切片机上切成薄 片黏贴于载玻片上与待检测组织一同进行免疫 组化染色，达到质量控 制的目的； 所述包埋有待测目标抗原的材料即上述的参照 物。

所述的包埋有待测目标抗原的材料，是指利用 葡聚糖与待测目标 抗原混合后经过固化形成的固体颗粒。

所述的待测目标抗原， 是指与病理组织中待检测抗原相同的蛋白 或者具有相同的抗原决定簇的蛋白质。

所述质量控制的阴性对照，是指没有包埋目标 抗原的材料经过常 规石蜡切片制作， 贴于载玻片上与待检测组织一同染色；

所述质量控制的阳性对照，是指包埋了目标抗 原的材料经过常规 石蜡切片制作， 但是不经过福尔马林固定， 使得目标抗原的抗原决定 簇不被封闭；

所述抗原修复对照，是指是包埋了目标抗原的 材料经过常规石蜡 切片制作，并经过福尔马林固定，使得目标抗 原的抗原决定簇被封闭。

本发明方法利用体外获得的与组织中待检测抗 原具有相同的蛋 白或具有相同的抗原决定簇的蛋白质作为对照 物，包埋于多糖材料中 并经过固化形成固体颗粒， 经过脱水、 透明、 浸蜡和包埋等程序制作 成石蜡块， 在组织切片机实现切片并与待测组织贴于同一 张载玻片 上， 与待测组织一同进行免疫组化染色。

本发明方法设计了三个对照（即参照物）用于 免疫组化的质量控 制， 包括阴性对照、 阳性对照和抗原修复对照， 通过参照物染色的结 果直接判断染色的成功与否， 以及染色失败后的原因。 具体如下： ( 1 ) 阴性对照片呈现阴性结果， 阳性对照片呈现阳性结果， 抗 原修复对照呈现阳性结果。说明染色过程成功 ， 染色结果可以用于病 理诊断。

(2 ) 阴性对照呈现阴性结果， 阳性对照呈现阳性结果， 抗原修 复对照呈现阴性结果。说明染色过程失败，而 且失败原因是抗原修复， 被封闭的抗原决定簇没有暴露出来，应当选择 新的修复方法或提高修 复强度。

(3 ) 阴性对照、 阳性对照、 抗原修复对照都为阴性结果， 说明 染色过程失败， 失败的原因可能是实验试剂或操作过程的失误 。

(4) 阴性对照、 阳性对照和抗原修复对照都呈现阳性。 说明染 色过程失败， 即产生了非特异性染色。

本发明的显著优点： 本发明提供的参照物为非生物组织材料，该 材料稳定性高， 为免疫组化技术的质量控制提供了一个可靠的 参照 物。传统的质控方法是提供阳性肿瘤参照片， 但是肿瘤组织的来源有 限， 不同组织的染色结果差异较大， 无法为免疫组化过程提供一个稳 定的质控参考标志物。本发明提供的参照物成 本低廉， 具有长久的稳 定性。通过该方法制备的参照片， 其标志物浓度一致， 同时还具有来 源可靠、 稳定、 质控信号一致的特点。 附图说明

图 1为载玻片对照片正确染色结果示意图；

图 2为免疫组化过程抗原修复不彻底对照片染色� �果示意图； 图 3为免疫组化过程抗染色失败结果示意图；

图 4为免疫组化过程抗染色失败结果示意图。 具体实施方式

本发明中阴性对照材料的制备步骤如下： 称取 0.2g脱脂奶粉， 溶 解于 10mL双蒸水中，充分搅拌溶解。再称取 0.2g葡聚糖加入到上述溶 液中， 搅拌后加入 2(^L冰乙酸， 不断搅拌使葡聚糖彻底溶解， 4°C放 置除去葡聚糖溶液中的气泡。用一次性注射针 头将葡聚糖溶液打到氢 氧化钠溶液中固化， 形成白色固体颗粒。获得的固体颗粒进行与病 理 组织同样的程序，经过梯度酒精脱水（脱水的 步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时）， 用二甲苯透明， 石蜡浸泡， 最后石蜡包埋制作成石蜡标本。按照与病理组 织一样的程序切片和贴 片。

本发明中阳性对照材料的制备步骤如下： 量取 10mL双蒸水， 加入 终浓度为 0.1 g/L到 10mg/L浓度范围的抗原蛋白并充分溶解。称取 0.2g 脱脂奶粉， 溶解于上述抗原溶液中， 充分搅拌溶解。 再称取 0.2g葡聚 糖加入到上述溶液中，搅拌后加入 2(^L冰乙酸，不断搅拌使葡聚糖彻 底溶解， 4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。 用一次性注射针头将葡 聚糖溶液打到氢氧化钠溶液中固化， 形成白色固体颗粒。获得的固体 颗粒经过梯度酒精脱水经过梯度酒精脱水（脱 水的步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时），二甲苯透明，石蜡浸泡， 石蜡包埋制作成石蜡标本。

本发明中抗原修复对照材料的制备步骤如下： 量取 10mL双蒸水， 加入终浓度 0.1 g/L到 10mg/L浓度范围的抗原蛋白并充分溶解。 称取 0.2g脱脂奶粉， 溶解于上述抗原溶液中， 充分搅拌溶解。 再称取 0.2g 葡聚糖加入到上述溶液中，搅拌后加入 2(^L冰乙酸，不断搅拌使葡聚 糖彻底溶解， 4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。 用一次性注射针头 将葡聚糖溶液打到氢氧化钠溶液中固化， 形成白色固体颗粒。获得的 固体颗粒经过福尔马林 （35-40%甲醛和 10-15%甲醇水溶液） 固定， 梯度酒精脱水经过梯度酒精脱水 （脱水的步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时）， 二甲苯透明， 石蜡浸泡， 石 蜡包埋制作成石蜡标本。

下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做 进一步说明，但是 不能以此限制本发明的范围。以下所用生化试 剂除特别标明外均购自 生工生物工程（上海）有限公司， 抗体和临床组织石蜡切片为申请人 (福州迈新生物技术开发有限公司）提供， 操作步骤若无说明均为常 规操作步骤。

实施例 1、 阴性对照材料的制备

称取 0.2g脱脂奶粉， 溶解于 10mL双蒸水中， 充分搅拌溶解。再称 取 0.2g葡聚糖加入到上述溶液中， 搅拌后加入 2(^L冰乙酸， 不断搅拌 使葡聚糖彻底溶解， 4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。 用一次性注 射针头将葡聚糖溶液打到氢氧化钠溶液中固化 ， 形成白色固体颗粒。 获得的固体颗粒进行与病理组织同样的程序， 经过梯度酒精脱水（脱 水的步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时）， 用二甲苯透明， 石蜡浸泡， 最后石蜡包埋制作成石蜡标本。 按照与病 理组织一样的程序切片和贴片。

实施例 2、 阳性对照材料的制备

量取 10mL双蒸水， 加入终浓度为 O.l g/L的抗原蛋白并充分溶解。 称取 0.2g脱脂奶粉， 溶解于上述抗原溶液中， 充分搅拌溶解。 再称取 0.2g葡聚糖加入到上述溶液中， 搅拌后加入 2(^L冰乙酸， 不断搅拌使 葡聚糖彻底溶解， 4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。 用一次性注射 针头将葡聚糖溶液打到氢氧化钠溶液中固化， 形成白色固体颗粒。获 得的固体颗粒经过梯度酒精脱水经过梯度酒精 脱水 （脱水的步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时）， 二甲苯透 明， 石蜡浸泡， 石蜡包埋制作成石蜡标本。

实施例 3、 抗原修复对照材料的制备

量取 10mL双蒸水， 加入终浓度为 lmg/L的抗原蛋白并充分溶解。 称取 0.2g脱脂奶粉， 溶解于上述抗原溶液中， 充分搅拌溶解。 再称取 0.2g葡聚糖加入到上述溶液中， 搅拌后加入 2(^L冰乙酸， 不断搅拌使 葡聚糖彻底溶解， 4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。 用一次性注射 针头将葡聚糖溶液打到氢氧化钠溶液中固化， 形成白色固体颗粒。获 得的固体颗粒经过福尔马林 （35-40%甲醛和 10-15%甲醇水溶液） 固 定，梯度酒精脱水经过梯度酒精脱水（脱水的 步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时）， 二甲苯透明， 石蜡浸泡， 石 蜡包埋制作成石蜡标本。

实施例 4、 质量控质参照物的制作

获得的阴性对照、 阳性对照和抗原修复对照材料， 从石蜡块中取 出， 按顺序包埋在同一个石蜡块中， 经过组织切片机切片贴于载玻片 上， 作为免疫组化质控参照物。 实施例 5、 阳性对照材料的制备

量取 10mL双蒸水， 加入终浓度为 10mg/L的抗原蛋白并充分溶解。 称取 0.2g脱脂奶粉， 溶解于上述抗原溶液中， 充分搅拌溶解。 再称取 0.2g葡聚糖加入到上述溶液中， 搅拌后加入 2(^L冰乙酸， 不断搅拌使 葡聚糖彻底溶解， 4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。 用一次性注射 针头将葡聚糖溶液打到氢氧化钠溶液中固化， 形成白色固体颗粒。获 得的固体颗粒经过梯度酒精脱水经过梯度酒精 脱水 （脱水的步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时）， 二甲苯透 明， 石蜡浸泡， 石蜡包埋制作成石蜡标本。

实施例 6、 阳性对照材料的制备

量取 10mL双蒸水， 加入终浓度为 lmg/L的抗原蛋白并充分溶解。 称取 0.2g脱脂奶粉， 溶解于上述抗原溶液中， 充分搅拌溶解。 再称取 0.2g葡聚糖加入到上述溶液中， 搅拌后加入 2(^L冰乙酸， 不断搅拌使 葡聚糖彻底溶解， 4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。 用一次性注射 针头将葡聚糖溶液打到氢氧化钠溶液中固化， 形成白色固体颗粒。获 得的固体颗粒经过梯度酒精脱水经过梯度酒精 脱水 （脱水的步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时）， 二甲苯透 明， 石蜡浸泡， 石蜡包埋制作成石蜡标本。

实施例 7、 抗原修复对照材料的制备

量取 10mL双蒸水， 加入终浓度为 O.^g/L的抗原蛋白并充分溶解。 称取 0.2g脱脂奶粉， 溶解于上述抗原溶液中， 充分搅拌溶解。 再称取 0.2g葡聚糖加入到上述溶液中， 搅拌后加入 2(^L冰乙酸， 不断搅拌使 葡聚糖彻底溶解， 4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。 用一次性注射 针头将葡聚糖溶液打到氢氧化钠溶液中固化， 形成白色固体颗粒。获 得的固体颗粒经过福尔马林 （35-40%甲醛和 10-15%甲醇水溶液） 固 定，梯度酒精脱水经过梯度酒精脱水（脱水的 步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时）， 二甲苯透明， 石蜡浸泡， 石 蜡包埋制作成石蜡标本。

实施例 8、 抗原修复对照材料的制备

量取 10mL双蒸水，加入终浓度为 10mg/L的抗原蛋白并充分溶解。 称取 0.2g脱脂奶粉， 溶解于上述抗原溶液中， 充分搅拌溶解。 再称取 0.2g葡聚糖加入到上述溶液中， 搅拌后加入 2(^L冰乙酸， 不断搅拌使 葡聚糖彻底溶解， 4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。 用一次性注射 针头将葡聚糖溶液打到氢氧化钠溶液中固化， 形成白色固体颗粒。获 得的固体颗粒经过福尔马林 （35-40%甲醛和 10-15%甲醇水溶液） 固 定，梯度酒精脱水经过梯度酒精脱水（脱水的 步骤： 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度的乙醇分别脱水 2小时）， 二甲苯透明， 石蜡浸泡， 石 蜡包埋制作成石蜡标本。

实施例 9、 具体应用

分别取一块乳腺癌病理组织蜡块和本专利技术 制作的蜡块（即含 参照物的蜡块）。然后按照公认的标准的程序 各组织取一片进行切片、 载玻片贴片。 烤片， 68°C， 20分钟， 公认的二甲苯脱蜡， 梯度酒精脱 水 （二甲苯 I 20min=>二甲苯 II 20min=> 100%酒精 10min=> 100%酒精 10min=>95%酒精 5min=>80%酒精 5min=>70%酒精 5min)， 阻断灭活内 源性过氧化物酶： 3%H ₂ 0 ₂ 37°C孵育 10min， PBS冲洗 3 X 5min; 取出 后进行抗原修复： 置 0.01M枸橼酸缓冲液 （PH6.0) 中用煮沸 （95°C， 15-20min), 自然冷却 20min以上， 再用冷水冲洗缸子， 加快冷却至室 温， PBS冲洗 3 X 5min。 正常羊血清工作液封闭， 37°C 10min， 倾去勿 洗。滴加抗 ER的一抗 4 °C冰箱孵育过夜， PBS冲洗 3 X 5min _; 滴加生物 素标记二抗， 37°C孵育 30min， PBS冲洗 3 X 5min; 滴加辣根过氧化物 酶标记的链霉素卵白素工作液， 37°C孵育 30min， PBS冲洗 3 X 5min; DAB/H ₂ 0 ₂ 反应染色， 自来水充分冲洗后， 苏木素复染， 常规脱水， 透明， 干燥， 封片。

在进行病理组织结果判断之前， 首先确定试剂及其整个处理中试 剂的有效性及处理过程是否正确。 根据对照片的结果进行判断。 （具 体判定方法为： 图 1-4中的圆形斑点中， 深色斑点为阳性， 无色斑点 为阴性）： 图 1 是载玻片对照片正确染色结果示意图本专利技 术制备的对 照质控片染色结果若如图 1所示， 即阴性对照片呈现阴性结果， 阳性 对照片呈现阳性结果， 抗原修复对照呈现阳性结果。则说明染色过程 成功， 染色结果可以用于病理诊断。 图 2 是免疫组化过程抗原修复不彻底对照片染色结 果示意图，本 专利技术制备的对照质控片染色结果若如图 2所示， 即阴性对照呈现 阴性结果， 阳性对照呈现阳性结果， 抗原修复对照呈现阴性结果。则 说明染色过程失败， 而且失败原因是抗原修复， 被封闭的抗原决定簇 没有完全暴露出来， 应当选择新的修复方法或提高修复强度。病理 片 的染色结果可信度有一定程度的下降。 图 3 是免疫组化过程抗染色失败结果示意图，本专 利技术制备的 对照质控片染色结果若如图 3所示， 即阴性对照、 阳性对照、 抗原修 复对照都为阴性结果， 说明染色过程失败， 失败的原因可能是试剂或 操作过程的失误。 病理染色结果不可信， 应重新进行染色操作。 图 4 是免疫组化过程抗染色失败结果示意图，本专 利技术制备的 对照质控片染色结果若如图 4所示， 即阴性对照、 阳性对照和抗原修 复对照都呈现阳性。 说明染色过程失败， 即产生了非特异性染色。病 理染色结果不可信， 应重新进行染色操作。

如图 1所示， 即阴性对照斑点呈现阴性结果， 阳性对照斑点呈现 阳性结果， 抗原修复对照斑点呈现阳性结果， 染色过程成功， 则病理 切片可用于进一步的诊断。 在显微镜下观察， 如果呈现棕色结果，则 病理切片为阳性结果， 如果无棕色颜色出现， 则病理切片的诊断结果 为阴性。