Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
IMMUNOMODULATOR PEPTIDE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/130790
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to an isolated peptide consisting of a sequence of 3 to 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO : 1, said peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: a) the sequences of 3 to 39 amino acids comprising at least the residues 6 to 8 of SEQ ID NO : 1; and b) the sequences of 3 to 39 amino acids that are at least 70% identical to said sequence in a).

Inventors:
BENMOUSSA, Khaddouj (3 rue Louis Braille, Ramonville Saint Agne, 31520, FR)
BONNAFE, Elsa (50 rue Plaine Saint Martin, Albi, 81000, FR)
COSTE, Agnès (3 Avenue de Purpan, Blagnac, 31700, FR)
LEPRINCE, Jérôme (164 bis Avenue Gallieni, Mont Saint Aignan, 76130, FR)
PIPY, Bernard (32 rue du Commandeur Cazeneuve, Toulouse, 31400, FR)
TREILHOU, Michel (27 Chemin des Grèzes, LEscure d'Albigeois, 81380, FR)
Application Number:
FR2018/050072
Publication Date:
July 19, 2018
Filing Date:
January 12, 2018
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
INSTITUT NATIONAL UNIVERSITAIRE JEAN-FRANCOIS CHAMPOLLION (Place de Verdun, Albi Cedex 09, 81012, FR)
UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER (118 Route de Narbonne, Toulouse Cedex 9, 31062, FR)
INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (7 rue Watt, Paris Biopark, Paris, 75013, FR)
UNIVERSITE DE ROUEN-NORMANDIE (1 rue Thomas Becket, Mont Saint Aignan, 76821, FR)
International Classes:
C07K5/103; A61P31/04; A61P35/00; C07K5/083; C07K7/06; C07K7/08; C07K14/435
Foreign References:
US20110111424A12011-05-12
Other References:
HARA MASAKAZU ET AL: "The role of hydrophobic amino acids of K-segments in the cryoprotection of lactate dehydrogenase by dehydrins", JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 210, 14 December 2016 (2016-12-14), pages 18 - 23, XP029915325, ISSN: 0176-1617, DOI: 10.1016/J.JPLPH.2016.12.003
BRAVO R V ET AL: "Amino terminal peptides of the ring infected erythrocyte surface antigen of Plasmodium falciparum bind specifically to erythrocytes", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 18, no. 14, 1 January 2000 (2000-01-01), pages 1289 - 1293, XP002416441, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/S0264-410X(99)00405-3
ALINE RIFFLET ET AL: "Identification and characterization of a novel antimicrobial peptide from the venom of the ant Tetramorium bicarinatum", PEPTIDES, vol. 38, no. 2, 1 December 2012 (2012-12-01), AMSTERDAM, NL, pages 363 - 370, XP055420932, ISSN: 0196-9781, DOI: 10.1016/j.peptides.2012.08.018
SAMIRA R. AILI ET AL: "Diversity of peptide toxins from stinging ant venoms", TOXICON, vol. 92, 1 December 2014 (2014-12-01), US, pages 166 - 178, XP055421022, ISSN: 0041-0101, DOI: 10.1016/j.toxicon.2014.10.021
AXEL TOUCHARD ET AL: "The Biochemical Toxin Arsenal from Ant Venoms", TOXINS, vol. 8, no. 1, 20 January 2016 (2016-01-20), pages 30, XP055421019, DOI: 10.3390/toxins8010030
TÉNÉ NATHAN ET AL: "Biochemical and biophysical combined study of bicarinalin, an ant venom antimicrobial peptide", PEPTIDES, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 79, 4 April 2016 (2016-04-04), pages 103 - 113, XP029516443, ISSN: 0196-9781, DOI: 10.1016/J.PEPTIDES.2016.04.001
PEPTIDES, vol. 38, no. 2, December 2012 (2012-12-01), pages 363 - 70
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403
MERRIFIELD ET AL., J. AM. CHEM. SOC, vol. 85, 1964, pages 2149 - 2154
SUKHITHASRI V. ET AL.: "Innate immune récognition of microbial cell wall components and microbial stratégies to evade such récognitions", MICROBIOL RES., vol. 168, no. 7, 25 August 2013 (2013-08-25), pages 396 - 406, XP028551442, DOI: doi:10.1016/j.micres.2013.02.005
KILLICK KE ET AL.: "Receptor-mediated récognition of mycobacterial pathogens", CELL MICROBIOL, vol. 15, no. 9, September 2013 (2013-09-01)
VAUTIER S ET AL.: "C-type lectin receptors and cytokines in fungal immunity", CYTOKINE, vol. 58, no. 1, April 2012 (2012-04-01), pages 89 - 99
DRUMMOND RA ET AL.: "The rôle of Dectin-1 in the host defence against fungal infections", CURR OPIN MICROBIOL, vol. 14, no. 4, August 2011 (2011-08-01), pages 392 - 9, XP028382126, DOI: doi:10.1016/j.mib.2011.07.001
VÂZQUEZ-MENDOZA A. ET AL.: "Parasitic infections: a rôle for C-type lectins receptors", BIOMED RES INT, vol. 2013, 27 January 2013 (2013-01-27), pages 456352
LEFÈVRE L. ET AL.: "The C-type lectin receptors dectin-1, MR, and SIGNR3 contribute both positively and negatively to the macrophage response to Leishmania infantum", IMMUNITY, vol. 38, no. 5, 23 May 2013 (2013-05-23), pages 1038 - 49
DUBE DH. ET AL.: "Glycans in cancer and inflammation--potential for therapeutics and diagnostics", NAT REV DRUG DISCOV, vol. 4, no. 6, June 2005 (2005-06-01), pages 477 - 88, XP002522067, DOI: doi:10.1038/NRD1751
AARNOUDSE CA ET AL.: "Récognition of tumor glycans by antigen-presenting cells", CURR OPIN IMMUNOL, vol. 18, no. 1, February 2006 (2006-02-01), pages 105 - 11, XP025078977, DOI: doi:10.1016/j.coi.2005.11.001
CHIBA S ET AL.: "Récognition of tumor cells by Dectin-1 orchestrâtes innate immune cells for anti-tumor responses", ELIFE, 22 August 2014 (2014-08-22), pages 3
Attorney, Agent or Firm:
GEVERS & ORES (9 rue Saint Antoine du T, Toulouse, 31000, FR)
Download PDF:
Claims:
REVENDICATIONS

1. Peptide isolé consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a),

à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

2. Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 9 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a),

à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

3. Peptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il est capable de se lier à la membrane de macrophages dérivés des monocytes.

4. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de 5 à 15 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 9 de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

5. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué de :

a) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et β) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence a),

à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

6. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il est amidé en C-terminal.

7. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend :

- un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6

et

-un excipient pharmaceutiquement acceptable.

8. Peptide destiné à être utilisé comme médicament caractérisé en ce que le peptide isolé consiste en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a).

9. Peptide pour son utilisation selon la revendication 8 caractérisé en ce que le peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué : a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID

NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence a).

10. Peptide pour son utilisation selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que ledit peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

11. Peptide pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 caractérisé en ce que ledit peptide est amidé en C-terminal.

12. Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 pour son utilisation comme agent pro-inflammatoire.

13. Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 pour son utilisation dans la prévention ou le traitement de maladies causées par un pathogène reconnu par un récepteur lectine de type C, de préférence par un récepteurs au mannose ou dectine 1 .

14. Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une mycose, de préférence une candidose. 15. Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 pour son utilisation dans le traitement du cancer.

Description:
PEPTIDE IMMUNOMODULATEUR

DOMAINE DE L'INVENTION:

La présente invention concerne un peptide isolé, une composition pharmaceutique comprenant ce peptide et l'utilisation de ce peptide ou de cette composition comme médicament, notamment comme anti-infectieux ou anti-cancéreux.

ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE :

Avec l'émergence croissante de pathogènes résistants et la raréfaction des anti- infectieux capables de lutter contre ces infections, la nécessité de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques n'a jamais été aussi urgente.

Une de ces stratégies vise l'activation du système immunitaire avec la mise au point d'agents immunomodulateurs capables notamment de renforcer l'action du système immunitaire contre les pathogènes.

RESUME DE L'INVENTION :

Les inventeurs ont découvert que le peptide P17 et ses dérivés présentaient une activité immunomodulatrice.

Le peptide P17 est un peptide présent dans le venin des fourmis Tetramorium bicarinatum. Ce peptide de 13 acides aminés avait été décrit par Rifflet et al. (Identification and characterization of a novel antimicrobial peptide from the venom of the ant Tetramorium bicarinatum. Peptides. 2012 Dec;38(2):363-70) mais n'avait alors montré aucune propriété intéressante. En particulier, il n'avait montré aucune propriété antibactérienne in vitro.

Les inventeurs ont montré que de manière surprenante P17 et ses dérivés augmentaient la libération de cytokines pro-inflammatoires et favorisaient la sécrétion de radicaux libres oxygénés. L'immuno-modulation générée par P17 et ses dérivés est telle qu'elle permet l'élimination de pathogènes comme la levure C. albicans et la diminution de la prolifération des cellules cancéreuses par des macrophages dérivés de monocytes humains ainsi polarisés

Cette immuno-modulation est médiée par les récepteurs lectine de type C comme le récepteur au mannose ou dectine 1 qui interviennent dans la réponse immunitaire innée contre de nombreux pathogènes. Ces récepteurs reconnaissent des motifs moléculaires, tels que les glucanes, présents sur la surface de nombreux pathogènes et exprimés de manière anormale à la surface des cellules cancéreuses. P17 et ses dérivés sont donc des candidats particulièrement prometteurs pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies telles que les pathologies fongiques, bactériennes, virales ou cancéreuses.

En conséquence la présente invention a pour objet un peptide isolé consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a),

à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 . La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant :

- un peptide selon l'invention

et

-un excipient pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention a aussi pour objet un peptide isolé destiné à être utilisé comme médicament ; le peptide isolé consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Peptides

La présente invention concerne un peptide isolé consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par : a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),

à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

Le pourcentage d'identité d'une séquence d'acide aminé est défini par le pourcentage de résidus d'acides aminés dans une séquence à comparer qui sont identiques à une séquence de référence après alignement des séquences, en introduisant des espaces si nécessaire, de façon à obtenir une identité de séquence maximale. Le pourcentage d'identité est ensuite déterminé selon la formule suivante : Pourcentage d'identité = 100 x [1 - (C/R)], tel que C est le nombre de différences entre la séquence de référence et la séquence à comparer sur toute la longueur de la séquence de référence, (i) chaque acide aminé dans la séquence de référence qui n'a pas d'acide aminé correspondant aligné dans la séquence à comparer, (ii) chaque espace dans la séquence de référence et (iii) chaque acide aminé aligné dans la séquence de référence qui est différent d'un acide aminé dans la séquence à comparer constitue une différence, et R est le nombre d'acides aminés dans la séquence de référence sur toute la longueur de l'alignement avec la séquence à comparer (c'est à dire toute la longueur de la séquence de référence), chaque espace généré dans la séquence de référence étant compté comme un acide aminé. L'alignement de séquences en vue de déterminer le pourcentage d'identité d'une séquence peut être réalisé de différentes façons connues de l'homme du métier, par exemple en utilisant des logiciels publics disponibles comme BLAST (Altschul et al , J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-). Ce logiciel est de préférence utilisé avec des paramètres par défaut.

Selon un mode de réalisation, ledit peptide isolé consiste en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%,

90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),

à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

Les peptides selon l'invention peuvent avoir de 3 à 30, de 3 à 26, ou plus préférablement de 5 à 20 acides aminés ou encore plus préférablement 5 à 15 acides aminés. Par exemple, le peptide isolé peut avoir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés.

Avantageusement, ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 9 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a),

à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

De préférence, les peptides selon l'invention comprennent au moins les résidus 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 ou ont des séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec lesdits peptides comprenant au moins les résidus 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 ,

12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 .

Plus préférablement, les peptides selon l'invention comprennent au moins les résidus 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 .

Les positions des résidus d'acides aminés sont indiquées en référence à la séquence de P17 (SEQ ID NO: 1 ).

Selon un mode de réalisation, les peptides présentent au moins 95% d'identité avec ladite séquence définie ci-dessus.

De préférence, le peptide est capable de se lier à la membrane de macrophages dérivés des monocytes. Il peut déclencher des voies de signalisation responsables de la production de médiateurs cytotoxiques.

De préférence, le peptide est capable d'induire la production de radicaux libres oxygénés et d'IL-1 β par des macrophages dérivés de monocytes. La capacité des peptides à induire la production de radicaux libres oxygénés et d'IL-1 β peut aisément être mesurée par un homme du métier. De tels tests sont notamment décrits dans la partie Matériels et Méthodes décrites ci-dessous.

Avantageusement, le peptide consiste en une séquence de 5 à 15 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 9 de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

Selon un mode de réalisation, le peptide consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué de :

a) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90%, 95% d'identité avec ladite séquence a), à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

Plus préférablement, le peptide consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué de :

a) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90%, 95% d'identité avec ladite séquence a), à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .

Les différentes séquences sont résumées dans le tableau 1 ci-dessous :

Nom SEQ ID NO Séquence d'acides aminés

P17 1 LFKEILEKIKAKL

P17(2-13) 2 FKEILEKIKAKL

P17(3-13) 3 KEILEKIKAKL

P17(4-13) 4 EILEKIKAKL

P17(5-13) 5 ILEKIKAKL

P17(6-13) 6 LEKIKAKL

P17(7-13) 7 EKIKAKL

P17(8-13) 8 KIKAKL

P17(9-13) 9 IKAKL

P17(1 -5) 10 LFKEI

P17(1 -6) 1 1 LFKEIL

P17(1 -7) 12 LFKEILE

P17(1 -8) 13 LFKEILEK

P17(1 -9) 14 LFKEILEKI

P17(1 -10) 15 LFKEILEKIK

P17(1 -1 1 ) 16 LFKEILEKIKA

P17(1 -12) 17 LFKEILEKIKAK Tableau 1 : Séquences d'acides aminés

Avantageusement, les peptides sont des peptides recombinants ou de synthèse. Ainsi, les peptides peuvent être préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notamment par synthèse en phase solide ou liquide ou par expression d'un ADN recombinant dans un système cellulaire approprié (eucaryote ou procaryote). Par exemple, les peptides peuvent être synthétisés en phase solide originellement décrite par Merrifield et al (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-2154) selon la technique Fmoc et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse De préférence, les peptides sont des peptides de synthèse.

De manière générale, l'invention englobe les peptides selon l'invention ayant subi une modification dès lors que ledit peptide conserve ses propriétés immunomodulatrices. L'invention englobe notamment les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de P17 (SEQ ID NO : 1 ) dès lors que ledit peptide dérivé de P17 conserve ses propriétés immunomodulatrices.

Les peptides peuvent être amidés en C-terminal. Les peptides peuvent être acylés en N-terminal. De préférence, les peptides sont amidés en C-terminal. Par « amidé en C terminal », on entend classiquement la présence d'un groupement NH 2 à l'extrémité C terminale du peptide (amide primaire non substitué).

L'invention concerne également les peptides modifiés en C terminal ayant une modification autre que l'amidation en C-terminal décrite ci-dessus dès lors que ledit peptide dérivé de P17 modifié conserve ses propriétés immunomodulatrices. Aussi, l'amide primaire non subsitué (RCONH 2 ) en C-terminal du peptide amidé en C- terminal peut par exemple être remplacé par un amide primaire monosubstitué (RCONHPt ! ) ou un amide primaire di-substitué (RCONR^).

Selon un mode de réalisation, le peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et étant amidé en C-terminal est exclu.

En particulier, l'invention englobe les peptides dérivés de P17 ou d'un peptide tel que défini ci-dessus dans lesquels certains acides aminés ont été substitués par un acide aminé aux propriétés similaires. Par exemple, les acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 peuvent être substitués par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine ; les résidus K3, Κ8, Κ10 et/ou Κ12 peuvent être substitués par un autre acide aminé basique naturel tel R et/ou H ou non naturel tel que l'ornithine, l'homolysine et/ou la para-aminophénylalanine; les résidus E4 et/ou E7 peuvent être substitués par un autre acide aminé acide tel que D ou un acide aminé acide non naturel tel que la paracarboxyphénylalanine.

Le peptide peut par exemple consister en un variant de P17 ou d'un dérivé de P17 tel que décrit ci-dessus dans lequel un ou plusieurs acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 ont été remplacés par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine .

De préférence, les résidus K8, K10 et/ou K12 sont conservés. Plus préférablement, les résidus K3, K8, K10 et/ou K12 sont conservés.

Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ;

ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 5 à 20 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),

à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1

et ledit peptide est amidé en C-terminal.

Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 5 à 20 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),

à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1

et ledit peptide est amidé en C-terminal.

Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué : α) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a)

et ledit peptide est amidé en C-terminal.

Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :

a) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a)

et ledit peptide est amidé en C-terminal.

La présente invention concerne également un multimère de peptides selon l'invention et/ou du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , lesdits peptides étant amidés en C terminal ou non. Par exemple, l'invention peut concerner un dimère ou un trimère. Le multimère peut être un homomère ou un hétéromère.

Polvnucléotides

La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé codant pour un peptide tel que défini ci- dessus ou un peptide P17.

Conformément à l'invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l'ADNc codant pour ledit peptide. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l'usage des codons soit optimal chez l'hôte dans lequel elle est exprimée.

La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant comprenant ledit polynucléotide.

De préférence, ledit vecteur est un vecteur d'expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression du peptide. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d'expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci - dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d'épissage). La présente invention a également pour objet une cellule hôte procaryote ou eucaryote modifiée, comprenant un peptide, un polynucléotide ou un vecteur tels que définis ci-dessus ; la cellule pouvant être modifiée de façon stable ou transitoire. Composition pharmaceutique

La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide tel que défini ci-dessus et un excipient pharmaceutiquement acceptable.

La composition peut également comprendre le peptide P17 et un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Selon un mode de réalisation alternatif, la composition pharmaceutique peut comprendre

- un peptide consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a)

et

-un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Selon un mode de réalisation alternatif, la composition pharmaceutique peut comprendre

- un peptide consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a)

et

-un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Les peptides de la composition pharmaceutique peuvent avoir de 3 à 30, de 3 à 26, ou plus préférablement de 5 à 20 acides aminés ou encore plus préférablement 5 à 15 acides aminés. Par exemple, le peptide isolé peut avoir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés.

La composition peut notamment comprendre un peptide consistant en une séquence de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences d'acides aminés comprenant au moins les résidus 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%,

90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a).

Avantageusement, la composition peut notamment comprendre un peptide consistant en une séquence de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences d'acides aminés comprenant au moins les résidus 1 ,2, 3, 4 ou 5 à 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a).

Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend un peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :

a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90%, 95% d'identité avec ladite séquence a). Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique comprend un peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué : a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et β) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a).

Selon un mode de réalisation, le peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 est exclu de la composition pharmaceutique. Selon un mode de réalisation, le peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et étant amidé en C- terminal est exclu de la composition pharmaceutique.

Selon une variante, ledit peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 . Selon un mode de réalisation de cette variante, le peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et est amidé en C-terminal.

Les peptides peuvent être des peptides recombinants ou de synthèse.

De manière générale, l'invention englobe les peptides selon l'invention ayant subi une modification dès lors que ledit peptide conserve ses propriétés immunomodulatrices. L'invention englobe notamment les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de P17 (SEQ ID NO : 1 ) dès lors que ledit peptide dérivé de P17 conserve ses propriétés immunomodulatrices.

Les peptides peuvent être amidés en C-terminal. Les peptides peuvent être acylés en N-terminal. De préférence, les peptides sont amidés en C-terminal. Par « amidé en C terminal » on entend classiquement la présence d'un groupement NH 2 à l'extrémité C terminale du peptide (amide primaire non substitué).

L'invention concerne également les peptides modifié en C terminal ayant une modification autre que l'amidation en C-terminal décrite ci-dessus dès lors que ledit peptide dérivé de P17 modifié conserve ses propriétés immunomodulatrices. Aussi, l'amide primaire non subsitué (RCONH 2 ) en C-terminal du peptide amidé peut par exemple être remplacé par un amide primaire monosubstitué (RCONHPt ! ) ou un amide di-substitué (RCONP^ F^).

Les peptides peuvent être des variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation des peptides précités. Comme indiqué plus haut, les variants peuvent comprendre une substitution des acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine, une substitution des résidus K3, K8, K10 et/ou K12 par un autre acide aminé basique naturel tel R et/ou H ou non naturel tel que l'ornithine, l'homolysine et/ou la para-aminophénylalanine et/ou une substitution des résidus E4 et/ou E7 par un autre acide aminé acide tel que D ou un acide aminé non naturel tel que la paracarboxyphénylalanine.

Le peptide peut par exemple consister en un variant de P17 ou d'un dérivé de P17 tel que décrit ci-dessus dans lequel un ou plusieurs acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 ont été remplacés par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tel que la tertioleucine . De préférence, les résidus K8, K10 et/ou K12 sont conservés. Plus préférablement, les résidus K3, K8, K10 et/ou K12 sont conservés.

La présente invention concerne également un multimère de peptides selon l'invention, et/ou du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , lesdits peptides étant amidés en C terminal ou non. Par exemple, l'invention peut concerner un dimère ou un trimère. Le multimère peut être un homomère ou un hétéromère.

L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut par exemple être un support choisi dans le groupe constitué de l'eau stérile, d'une solution saline, du glucose, du dextrose ou des solutions tamponnées. L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut également être un diluant, un stabilisant, un conservateur, un agent mouillant, un agent émulsifiant, un tampon, un additif améliorant la viscosité. Le PBS peut être exclu des excipients pharmaceutiquement acceptables.

La composition pharmaceutique comprend une dose efficace de peptide permettant d'obtenir un effet prophylactique/thérapeutique. Cette dose est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l'âge, le sexe et le poids du sujet. La composition pharmaceutique est généralement administrée selon les protocoles usuels, à des doses et pendant une durée suffisante pour induire un effet immunomodulateur. L'administration peut être sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale, intra-nasale, par inhalation ou par application transdermique.

La composition pharmaceutique se présente sous une forme galénique adaptée à une administration choisie : solution stérile injectable, poudre, comprimés, gélules, suspension, sirop, suppositoires, qui sont préparés selon les protocoles standards. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un autre agent thérapeutique. L'agent thérapeutique peut être par exemple sélectionné dans le groupe consistant en un antifongique, un anticancéreux, un antiviral, un antiparasitaire et un antibiotique.

Thérapie

Les inventeurs ont montré que P17 et ses dérivés activaient les fonctions cytotoxiques des macrophages dérivés des monocytes humains de sang périphérique. Ainsi, les macrophages polarisés par P17 ou ses dérivés présentent une forte capacité de reconnaissance et de phagocytose des pathogènes, qui expriment sur leur paroi des structures moléculaires conservés (PAMP), et des cellules tumorales, présentant des motifs glycaniques altérés, reconnus par les récepteurs lectines de type C.

Les récepteurs lectines de type C sont impliqués dans la réponse immunitaire innée contre des nombreux pathogènes tels que :

-des bactéries (Sukhithasri V. et al., Innate immune récognition of microbial cell wall components and microbial stratégies to évade such récognitions, Microbiol

Res. 2013 Aug 25;168(7):396-406, Killick KE et al., Receptor-mediated récognition of mycobacterial pathogens, Cell Microbiol. 2013 Sep;15(9)),

-des champignons et les levures (Vautier S et al., C-type lectin receptors and cytokines in fungal immunity, Cytokine. 2012 Apr;58(1 ):89-99 ; Drummond RA et al.,

The rôle of Dectin-1 in the host defence against fungal infections, Curr Opin Microbiol.

201 1 Aug;14(4):392-9),

-des parasites (Vâzquez-Mendoza A. et al., Parasitic infections: a rôle for C- type lectins receptors, Biomed Res Int. 2013;2013:456352 Epub 2013 Jan 27, Lefèvre

L. et al., The C-type lectin receptors dectin-1 , MR, and SIGNR3 contribute both positively and negatively to the macrophage response to Leishmania infantum.

Immunity. 2013 May 23;38(5):1038-49)

-ainsi que contre des cellules tumorales (Dube DH. Et al., Glycans in cancer and inflammation-potential for therapeutics and diagnostics, Nat Rev Drug Discov.

2005 Jun;4(6):477-88, Aarnoudse CA et al., Récognition of tumor glycans by antigen- presenting cells, Curr Opin Immunol. 2006 Feb;18(1 ):105-1 1 , Chiba S et al.

Récognition of tumor cells by Dectin-1 orchestrâtes innate immune cells for anti-tumor responses, Elife. 2014 Aug 22;3). Par conséquent l'invention concerne également un peptide et/ou une composition pharmaceutique comprenant ledit peptide et un excipient pharmaceutiquement acceptable destiné à être utilisé comme médicament, ledit peptide consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a).

L'invention concerne une méthode de traitement chez un sujet à traiter comprenant l'administration audit sujet d'une quantité efficace dudit peptide ou de ladite composition pharmaceutique comprenant ledit peptide isolé et un excipient pharmaceutiquement acceptable.

L'invention concerne aussi l'utilisation dudit peptide ou de ladite composition pharmaceutique comprenant ledit peptide et un excipient pharmaceutiquement acceptable dans la fabrication d'un médicament.

Selon un mode de réalisation, ledit peptide destiné à être utilisé comme médicament consiste en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a).

Ledit peptide peut avoir de 3 à 30, de 3 à 26, ou plus préférablement de 5 à 20 acides aminés ou encore plus préférablement 5 à 15 acides aminés. Par exemple, le peptide isolé peut avoir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés.

Avantageusement, ledit peptide peut consister en une séquence de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par : a) les séquences d'acides aminés comprenant au moins les résidus 1 ,2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a).

Avantageusement, ledit peptide consiste en une séquence de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences d'acides aminés comprenant au moins les résidus 1 ,2, 3, 4 ou 5 à 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a).

Selon un mode de réalisation, le peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :

a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90%, 95% d'identité avec ladite séquence a). Selon un mode de réalisation préféré, ledit peptide destiné à être utilisé comme médicament a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué : a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a).

Selon un mode réalisation préféré, ledit peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 . Selon un mode de réalisation préféré, le peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et est amidé en C-terminal.

Selon un mode de réalisation alternatif, le peptide n'a pas la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 . Selon un mode de réalisation alternatif, le peptide n'est pas le peptide qui a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et qui est amidé en C- terminal.

Les peptides peuvent être des peptides recombinants ou de synthèse.

De manière générale, l'invention englobe les peptides selon l'invention ayant subi une modification dès lors que ledit peptide conserve ses propriétés immunomodulatrices. L'invention englobe notamment les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de P17 (SEQ ID NO : 1 ) dès lors que ledit peptide dérivé de P17 conserve ses propriétés immunomodulatrices.

Les peptides peuvent être amidés en C-terminal. Les peptides peuvent être acylés en N-terminal. De préférence, les peptides sont amidés en C-terminal. Par « amidé en C terminal » on entend classiquement la présence d'un groupement NH 2 à l'extrémité C terminale du peptide (amide primaire non substitué).

L'invention concerne également les peptides modifiés en C terminale ayant une modification autre que l'amidation en C-terminal décrite ci-dessus dès lors que ledit peptide dérivé de P17 modifié conserve ses propriétés immunomodulatrices. Aussi, l'amide primaire non subsitué (RCONH 2 ) en C-terminal du peptide amidé peut par exemple être remplacé par un amide primaire monosubstitué (RCONHRi) ou un amide di-substitué (RCONRi R 2 ).

Les peptides peuvent être des variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation des peptides précités. Comme indiqué plus haut, les variants peuvent comprendre une substitution des acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine, une substitution des résidus K3, K8, K10 et/ou K12 par un autre acide aminé basique naturel tel R et/ou H ou non naturel tel que l'ornithine, l'homolysine et/ou la para-aminophénylalanine et/ou une substitution des résidus E4 et/ou E7 par un autre acide aminé acide tel que D ou un acide aminé non naturel tel que la paracarboxyphénylalanine.

Le peptide peut par exemple consister en un variant de P17 ou d'un dérivé de P17 tel que décrit ci-dessus dans lequel un ou plusieurs acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 ont été remplacés par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine . De préférence, les résidus K8, K10 et/ou K12 sont conservés. Plus préférablement, les résidus K3, K8, K10 et/ou K12 sont conservés.

Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 5 à 20 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),

et ledit peptide est amidé en C-terminal.

Plus préférablement, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :

a) les séquences de 5 à 20 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et

b) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),

et ledit peptide est amidé en C-terminal.

Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :

a) SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%,

90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a)

et ledit peptide est amidé en C-terminal.

Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :

a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et

β) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a)

et ledit peptide est amidé en C-terminal. La présente invention concerne également un multimère de peptides selon l'invention, et/ou du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , lesdits peptides étant amidés en C terminal ou non. Par exemple, l'invention peut concerner un dimère ou un trimère. Le multimère peut être un homomère ou un hétéromère. Les inventeurs ont montré que P17 et ses dérivés entraînaient la production de cytokines pro-inflammatoires. Par conséquent, l'invention a aussi pour objet ledit peptide ou ladite composition pharmaceutique pour leur utilisation comme agent proinflammatoire.

Les inventeurs ont montré que les macrophages polarisés par P17 présentaient une surexpression des récepteurs lectines de type C. Ces récepteurs sont impliqués dans la réponse immunitaire contre de nombreux pathogènes.

Par conséquent, l'invention concerne ledit peptide ou/et ladite composition pharmaceutique pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une maladie causée par un pathogène reconnu par les récepteurs lectines de type C, de préférence par des récepteurs au mannose ou dectine 1 . Les pathogènes peuvent être :

-une bactérie ; par exemple une bactérie sélectionnée dans le groupe consistant en Streptococcus pneumoniae, Klebellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans et Mycobacterium tuberculis,

-un champignon, par exemple Candida albicans,

-un parasite ; par exemple des parasite sélectionné dans le groupe constitué de Leish mania donovani, Pneumocystis carinii et Trypanosoma cruzi.

L'invention concerne donc une méthode pour la prévention ou le traitement d'une maladie causée par un pathogène reconnu par un récepteur lectine de type C chez un sujet à traiter comprenant l'administration audit sujet d'une quantité efficace dudit peptide ou de ladite composition pharmaceutique comprenant ledit peptide isolé et un excipient pharmaceutiquement acceptable.

La maladie causée par un pathogène reconnu par un récepteur lectine de type C est de préférence une mycose, plus préférablement une candidose.

Les récepteurs lectines de type C sont également impliqués dans la réponse immunitaire contre les cellules tumorales. Par conséquent, ledit peptide peut être pour une utilisation comme anti-cancéreux ; dans le traitement du cancer.

L'invention concerne donc également une méthode pour la prévention ou le traitement d'un cancer chez un sujet à traiter comprenant l'administration audit sujet d'une quantité efficace dudit peptide ou de ladite composition pharmaceutique comprenant ledit peptide isolé et un excipient pharmaceutiquement acceptable.

L'invention sera en outre illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, ces exemples et figures ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.

FIGURES

La figure 1 montre l'élimination de C. albicans par des macrophages dérivés de monocytes humains traités ou non par le P17 in vitro.

La figure 2 montre la capacité de liaison et de phagocytose de C. albicans par des macrophages dérivés de monocytes humains traités ou non par le P17.

La figure 3 montre l'effet de P17 sur la production de radicaux libres oxygénés (RLO) et des cytokines,, telles que NL-Ι β, le TNFa, l'IL-10 et l'IL-12, par des macrophages dérivés de monocytes humains en réponse à une stimulation par C. albicans.

La figure 4 montre l'effet de P17 sur l'expression protéique des récepteurs lectine de type C.

La figure 5 montre l'effet de P17 sur l'expression des gènes marqueurs de la différenciation classique et alternative des macrophages.

La figure 6 montre l'effet de P17 sur l'expression des gènes codant PPAR-γ et sa cible SRB1 , et sur l'expression des récepteurs membranaires Dectine-1 et MR en présence du GW9662, un antagoniste irréversible de PPAR-γ dans des macrophages dérivés de monocytes humains.

La figure 7 montre l'effet de P17 sur l'expression des gènes codant des enzymes du métabolisme de l'acide arachidonique dans des macrophages dérivés de monocytes humains.

La figure 8 montre l'effet de P17 sur la sécrétion de LTB4 par des macrophages dérivés de monocytes humains.

Les figures 9A-C représentent la concentration en calcium intracellulaire induite par P17 par rapport à des contrôles négatifs (A), en présence de toxine pertussique (B) et en désensibilisant avec du fMLP (peptide N-Formylméthionine-leucyl-phénylalanine) (C).

La figure 10 montre l'effet du BAPTA (chélateur de calcium) sur l'effet antimicrobien de P17, la libération de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) et d'IL-1 β.

La figure 1 1 montre l'effet de l'administration de P17 in vivo sur le poids corporel de souris présentant une candidose gastro-intestinale induite par C. albicans. La figure 12 montre l'effet de l'administration de P17 in vivo sur la colonisation gastrointestinale 6 jours post infection.

Les figures 13A-E montrent l'effet de l'administration de P17 chez des souris infectées sur la capacité de leurs macrophages péritonéaux à (A-B) éliminer et phagocyter Candida albicans, (C) à produire des ROS, et (D-E) à libérer l'IL-β et l'IL-12.

La figure 14 schématise le mode d'action de P17.

La figure 15 montre le nombre de cellules de lymphome T (EL4) en co-culture avec des macrophages traités ou non par P17.

La figure 16 montre la capacité de production de ROS des macrophages traités ou non par P17 en réponse aux cellules tumorales EL4.

La figure 17 montre l'effet de différents fragments de P17 sur la libération de ROS par des macrophages dérivés de monocytes humains en réponse à C. albicans.

La figure 18 montre l'effet de différents fragments de P17 sur l'élimination de Candida albicans par des macrophages dérivés de monocytes humains.

La figure 19 montre l'effet de l'amidation C terminale de P17 sur la production de ROS par des macrophages en réponse à C. albicans.

EXEMPLES

Matériel et Méthodes:

Peptide antimicrobien P17

A moins qu'il ne soit précisé autrement, le peptide P17 utilisé dans les figures et les exemples ci-après est amidé en C terminal (présence d'un groupe NH 2 à son extrémité C terminale). Sa séquence a été caractérisée par séquençage de novo en utilisant la spectrométrie de masse et la dégradation d'Edman (Rifflet et al. 2012). Le peptide P17 a été synthétisé sur un synthétiseur de peptide automatisé Liberty (CEM, Saclay, France) à une pureté supérieure à 99%. L'authenticité et l'identité moléculaire des peptides synthétiques ont été contrôlées par MALDI-TOF-MS.

Etude de l'élimination de C. albicans par les macrophages dérivés de monocytes humains

Les macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités ou non avec le peptide P17 ou des fragments de celui-ci puis incubés à 37°C pendant 24h. Ces cellules ont été incubées pendant 40 min à 37°C avec C. albicans (à un ratio de 0.3 levures par macrophage) et les levures non liées sont éliminées par lavages. Ces macrophages sont alors incubés à 37 °C pendant 4 h. Après incubation, le milieu a été enlevé et les cellules ont été lysées. Les unités formant des colonies (CFU) de C. albicans ont été déterminées sur boites de Sabouraud après étalement et mise en culture pendant 48h à 37 °C. Etude de la liaison et de la phagocytose de C. albicans par les macrophages dérivés de monocytes humains

Pour l'analyse de la liaison et de la phagocytose de C. albicans, les macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités ou non avec le peptide P17 puis incubés à 37°C pendant 24h. Les macrophages dérivés des monocytes humains ont été mis en présence avec des levures marquées GFP (ratio 1/6) puis incubés à 4°C pendant 20 minutes afin d'évaluer la liaison. La phagocytose a été évaluée après 1 h d'incubation à 37°C. La quantité de C. albicans liée ou ingérée par les macrophages dérivés des monocytes humains a été déterminée par mesure de la fluorescence en utilisant un fluorimètre (EnvisionPerkin Elmer).

Etude de la production de ROS par les macrophages dérivés de monocytes humains en réponse à C. albicans

Pour l'analyse de la production de ROS, les macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités ou non avec le peptide P17, P17 non amidé ou avec les fragments de P17 suivants P17(1 -5), P17(1 -7), P17(1 -9), P17(1 -1 1 ), P17(3-13), P17(5-13), P17(7-13) et P17(9-13) ; les fragments P17(1 -5), P17(1 -7), P17(1 -9), P17(1 -1 1 ) n'étant pas amidés en C-terminal et les fragments P17(3-13), P17(5-13), P17(7-13) et P17(9-13) étant amidés en C-terminal. Puis les macrophages dérivés de monocytes humains ainsi traités ont été incubés à 37°C pendant 24h. La production de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) a été mesurée par chimioluminescence en présence de 5-amino-2,3-dihydro-1 ,4-phthalazinedione (luminol) (Envision; Perkin Elmer). La génération de chimioluminescence a été mesurée en continu pendant 1 h30 après incubation des cellules avec le luminol (66 μΜ) en présence ou non de C. albicans (ratio levures par macrophage : 3:1 ).

Etude de la production de ROS par des macrophages murins en réponse à des cellules tumorales murines de lymphome T (EL4).

Pour l'analyse de la production de ROS, des macrophages péritonéaux murins ont été traités ou non avec le peptide P17 puis incubés à 37°C pendant 24h. La production de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) a été mesurée par chimioluminescence en présence de 5-amino-2,3-dihydro-1 ,4-phthalazinedione (luminol) (Envision; Perkin Elmer). La génération de chimioluminescence a été mesurée en continu pendant 1 h30 après incubation des cellules avec le luminol (66 μΜ) en présence ou non de cellules tumorales de lymphome T EL4.

Etude de la production d'IL-1 β, TNFa, IL-10 et IL-12 par les macrophages dérivés de monocytes humains en réponse à C. albicans

Les macrophages dérivés de monocytes humains ont été stimulés avec le peptide P17 pendant 24h, puis ces macrophages activés par le peptide P17 ont été stimulés avec C. albicans à un ratio levures pour macrophage de 3:1 pendant 8 h. La production d'IL-Ιβ, de TNFa, d'IL-10 et d'IL-12 dans les surnageants cellulaires a été déterminée par ELISA (OptiEIA BD Biosciences).

Evaluation de l'expression protéique des récepteurs lectine de type C

Pour l'analyse du niveau protéique des récepteurs lectine de type C, les macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités ou non avec le peptide P17 (200 μg/ml) puis incubés à 37°C pendant 24h.Les cellules collectées ont été centrifugées à 1 500 rpm pendant 10 min et les culots cellulaires ont été mis en suspension dans du PBS supplémenté avec 1 % de sérum fœtal de veau (FCS). Les cellules ont été marquées avec des anticorps couplés à différents fluorochromes dirigés contre le récepteur Dectine-1 (mAb; R&D FAB1859C-100, 1 /40), DC-SIGN (mAb; BD Biosciences 551 265, 1 /20 ) CD16 (mAb; PNIM 0814, 1/20), CD36 (mAb; BD Biociences 550 956, 1/40) et le récepteur mannose (ligand spécifique de MR (récepteur mannose) conjugué FITC (Sigma A7790, 1 mg/ml1 /100)),. L'analyse a été réalisée par cytométrie en flux (Becton Dickinson FACScalibur) sur une population de 10,000 cellules.

Transcription inverse et PCR en temps réel

Des macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités avec P17 (200 μg ml) pendant 8h. La préparation d'ADN a été réalisée en utilisant un kit (EZ-10 Spin Column Total RNA Minipreps Super Kit de Bio Basic) et en suivant les instructions du fabricant. La synthèse d'ADNc a été réalisée selon les instructions du fabricant (Thermo électron). Une RT-qPCR a été réalisée sur un système LightCycler 480 en utilisant le LightCycler SYBR Green I Master (Roche Diagnostics). Les amorces (Eurogentec) ont été réalisées avec le logiciel Primer 3. De l'ARNm de GAPDH a été utilisé comme témoin. Des échantillons dilués en série d'ADNc poolé ont été utilisés comme standard externe dans chaque série pour la quantification.

Les séquences des amorces sont données dans le tableau ci-dessous.

Tableau : Séquences des amorces humaines utilisées en analyse qPCR

Gène

Séquence 5' - 3'

Alox5 antisens ACT-G G A- AAC- ACG -GC A- AAA- AC (SEQ ID NO : 18) sens I I I -CTC-AAA-GTC-GGC-GAA-GT (SEQ ID NO : 19)

Itgam (CD1 1 b) antisens TTG-CAT-CCA-TCT-CAA-ATC-CA (SEQ ID NO : 20)

sens CTC-CCA-AAG-TGC-TGG-GAT-TA (SEQ ID NO : 21 )

Fcgr3 (CD 16) antisens TAC-AGC-GTG-CTT-GAG-AAG-GA (SEQ ID NO :22)

Sens GCA-CCT-GTA-CTC-TCC-ACT-GT(SEQ ID NO : 23)

Fcgr2 (CD32) antisens CCA-AAG-GCT-GTG-CTG-AAA-CT (SEQ ID NO : 24)

Sens TAC-TCC-CCG-CTG-TCA-TTG-TT (SEQ ID NO : 25)

Cd36 antisens TGA-TAG-GTG-CAG-CAA-AGC-AC (SEQ ID NO : 26)

Sens TGT-AAC-CCA-GGA-CGC-TGA-GG (SEQ ID NO : 27)

Clec7a (Dectin-1 ) antisens CCA-AGC-ATA-GGA-TTC-CCA-AAA (SEQ ID NO : 28)

Sens AAA-AGG-ATC-GTG-TGC-TGC-ATC (SEQ ID NO : 29)

Ptgs2 (COX-2) antisens TGA-GCA-TCT-ACG-GTT-TGC-TG (SEQ ID NO : 30)

Sens TGC-TTG-TCT-GGA-ACA-ACT-GC (SEQ ID NO : 31 )

Pla2g4a (cPLA2) antisens GCC-TTG-GTG-AGT-GAT-TCA-GCT (SEQ ID NO : 32)

Sens AG A-TTC- AAG -CCC- AG C- ATG - AAG (SEQ ID NO : 33)

Cd209 (DC-SIGN) antisens GGG-CAT-GGA-GGC-TCC-AC (SEQ ID NO : 34)

CAA-CTT-AGA-AAC-AGC-CAA-ATG-GAA (SEQ ID NO : Sens 35)

Alox5ap (FLAP) antisens ACC-CGC-TCA-AAG-GCA-ATG-G (SEQ ID NO : 36)

sens CAC-GAA-AGC-AGG-ACC-CAG-A (SEQ ID NO : 37)

Gapdh antisens AGG-TCG-GAG-TCA-ACG-GAT-TT (SEQ ID NO : 38)

Sens ATC-TCG-CTC-CTG-GAA-GAT-GG (SEQ ID NO : 39)

111 b antisens CAG-CCA-ATC-TTC-ATT-GCT-CA (SEQ ID NO : 40)

Sens AGG-CAG-AGA-GGG-AAG-GAG-AG (SEQ ID NO : 41 )

II6 antisens TAC-CCC-CAG-GAG-AAG-ATT-GT (SEQ ID NO : 42)

Sens I I I -TCT-GCC-AGT-GCC-TCT-TT (SEQ ID NO : 43)

1112 antisens TGG-GTG-GGT-CAG-GTT-TGA-TG (SEQ ID NO : 44)

Sens GCC-CAG-CTG-CTG-AGG-AGA-GT (SEQ ID NO : 45)

1110 antisens TGC-AAA-ACC-AAA-CCA-CAA-GA (SEQ ID NO : 46)

Sens TCT-CGG-AGA-TCT-CGA-AGC-AT (SEQ ID NO : 47)

111 ra antisens TGG-GAA-TCT-CAG-ATG-GGA-AG (SEQ ID NO : 48)

Sens CTG-TGT-CCC-CCA-GAA-CTT-GT (SEQ ID NO : 49)

Tgfbl antisens ACT-G AG-GGG-AAG-GGA-CAA-CT (SEQ ID NO : 50)

Sens TCG-GTA-CCA-GGT-GAG-GGT-AG (SEQ ID NO : 51 ) p47 pnox

antisens CCT-CAT-TGT-CCA-GTG-TGG-TG (SEQ ID NO : 52) Sens TCT-TCC-GTC-TCG-TCA-GGA-CT (SEQ ID NO : 53)

Lta4h antisens ACT-GCT-TGG-AGG-ACC-AGA-GA (SEQ ID NO : 54)

Sens GGA-AAG-CAT-TAG-CAG-GCA-AG (SEQ ID NO : 55)

Mrc-1 (MR) antisens GGC-GGT-GAC-CTC-ACA-AGT-AT (SEQ ID NO : 56)

Sens ACG -AAG -CC A- 1 I I -GGT-AAA-CG (SEQ ID NO : 57)

Ptges (PGES) antisens CAT-GTG-AGT-CCC-TGT-GAT-GG (SEQ ID NO : 58)

Sens GAC-TGC-AGC-AAA-GAC-ATC-CA (SEQ ID NO : 59)

Pparg antisens GCT-GTG-CAG-GAG-ATC-ACA-GA (SEQ ID NO : 60)

Sens GGG-CTC-CAT-AAA-GTC-ACC-AA(SEQ ID NO : 61 )

Tnfa antisens TCC-TTC-AGA-CAC-CCT-CAA-CC (SEQ ID NO : 62)

Sens AGG-CCC-CAG- 1 I I -GAA-TTC-TT (SEQ ID NO : 63) Détermination de la concentration intracellulaire en calcium

La concentration intracellulaire en calcium a été mesurée en utlisant une sonde fluorescente Fluo 3-AM (Molecular Probe). Des macrophages dérivés de monocytes humain (1 .5 χ 10 5 ) ont été incubés avec 1 1 .5 χ 10 "6 M de Fluo 3-AM pendant 30 min à 37 °C. Le niveau de Ca2+ intracytosolique a été enregistré toutes les 0.5 s pendant une période totale de 3 min après l'ajout de P17 (200 μg/ml). Dans des expériences de désensibilisation, une seconde injection de peptide bactérien N-Formylméthionine- leucyl-phénylalanine (fMLP) ou de P17 a été réalisé à la fin de l'enregistrement de la fluorescence et le niveau de Ca2+ intracytosolique enregistré pendant 3 min de plus. Dans certaines expériences des macrophages dérivés de monocytes humains ont été pré-incubés avec U73122 (2μΜ) or du HBSS sans calcium pendant 10 min avant l'ajout de P17. La fluorescence a été quantifiée en utilisant l'approche basée sur la fluorimétrie Envision (Perkin Elmer).

Modèle expérimental murin de candidose gastrointestinale

Pour les expériences in vivo, une infection gastrointestinale avec la souche C. albicans 98/26135 a été établie par gavage avec 50 x10 6 de C. albicans par souris (n=8 par groupe). Aucun antibiotique ou traitement immunosuppresseur n'a été utilisé pour faciliter l'infection des muqueuses de la cavité buccale et du tractus gastrointestinal. Les souris ont été traitées par voie intrapéritonéale (i.p.) avec le peptide P17 (10 μg par souris) ou avec une solution saline pour les groupes témoins, 1 jour avant l'infection avec C. albicans, 1 jour après l'infection et puis tous les 2 jours (5 injections). Le poids corporel de chaque souris a été enregistré quotidiennement. Au 8ème jour après le traitement (7 jours après l'infection), toutes les souris ont été euthanasiées par asphyxie au C0 2 .

L'œsophage, l'estomac, le caecum et le foie ont été enlevés de manière aseptisée pour évaluer la colonisation par C. albicans. Les macrophages péritonéaux des souris ont été prélevés et leurs capacités ex vivo à éliminer et phagocyter Candida albicans ont été déterminées. La production de ROS, d'IL-β et d'IL-12 par ces macrophages en réponse à Candida albicans ont aussi été évaluées.

Quantification du nombre de cellules tumorales de lymphome T (EL4) en présence de macrophages murins Les macrophages péritonéaux murins ont été traités ou non avec le peptide P17 puis incubés à 37°C pendant 24h. Ces macrophagesont été incubées pendant 40 min à 37°C avec les cellules de lymphome T luminescente (EL4-luc) et les cellules non liées sont éliminées par lavages. Ces macrophages sont alors incubés à 37 °C pendant 4 h. Après incubation, le nombre de cellules de lymphome T (EL4-luc) est évalué par chimiluminescence.

Résultats:

La figure 1 montre que la présence de P17 augmente considérablement la capacité des macrophages humains à éliminer C. albicans in vitro.

Ces résultats ont été confirmés in vivo sur des souris infectées par C. albicans. En effet, des souris présentant une candidose gastrointestinale traitées par P17 présentaient une perte de poids moindre par rapport à des souris non traitées (figure 1 1 De façon consistante, la colonisation gastrointestinale par Candida albicans était significativement plus faible chez les souris traitées par P17 par rapport à des souris non traitées (figure 12).

Les inventeurs ont cherché à connaître le mécanisme sous-jacent à l'action du P17. Les macrophages dérivés de monocytes humains traités par le P17 présentent à la fois une plus grande capacité à reconnaître et phagocyter C. albicans (figures 2). De plus, P17 induit une plus forte production de ROS en réponse à une stimulation par C. albicans et de cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-Ι β et le TNFa (figure 3). L'augmentation de la production de ces médiateurs cytotoxiques par le peptide P17 est associées à la surexpression des récepteurs lectine de type C à la surface des macrophages dérivés de monocytes humains (figure 4).

P17 améliore la réponse anti-tumorale des macrophages.

Comme le montre la figure 15, en présence des macrophages polarisés par P17 le nombre de cellules tumorales EL4 diminue significativement. Ces résultats révèlent que les macrophages polarisés par P17 présentent une activité cytotoxique importante vis-à-vis des cellules tumorales par rapport à des macrophages non traités.

Cette induction de l'activité cytotoxique des macrophages par P17 vis-à-vis des cellules tumorales est corrélée à une production de ROS augmentée (figure 16). Effets des fragments de P17 sur la production des espèces réactives de l'oxygène (ROS)et sur l'élimination de Candida albicans par des macrophagesLa capacité d'induire la libération de ROS en réponse à C. albicans des macrophages traités par différents fragments de P17 a été testée.

Les résultats obtenus avec les peptides dont il manque l'extrémité C-terminale (P17(1 -5), P17(1 -7), P17(1 -9), P17(1 -1 1 )) montre l'importance de cette extrémité dans l'activation des fonctions cytotoxiques des macrophages par P17 (figures 17- 18). En effet, le traitement des macrophages avec ces fragments n'induit ni la production de ROS, ni l'élimination de Candida albicans.

Les peptides P17(1 -5), P17(1 -7), P17(1 -9), P17(1 -1 1 ) testés n'étaient pas amidés en C terminal contrairement à P17.La différence de libération de ROS entre P17 amidé et P17 non amidé a donc été testée afin de déterminer l'influence de l'amidation C- terminale sur les propriétés pro-inflammatoires de P17. Ces résultats montrent que l'amidation C terminale de P17 est essentielle à son activité pro-inflammatoire (figure 19).

La libération de ROS induite par des fragments dont la partie N-terminale a été délétée (P17(3-13), P17(5-13), P17(7-13), P17(9-13) a également été testée. Seuls les fragments P17(3-13) et P17(5-13) conservent leur activité (figure 17). Ces résultats montrent le rôle prépondérant des acides aminés centraux dans l'activité immunomodulatrice de P17.

Les effets des différents fragments sur l'élimination de C. albicans par les macrophages ont été également été testés. Les résultats sont identiques à ceux obtenus pour la libération de ROS. Les fragments sans partie C-terminale sont inactifs alors que les fragments P17(3-13) et P17(5-13) présentent une activité proche de celle de P17.