PEPTIDOS CON CAPACIDAD ANTI-TUMORAL E INMUNOMODULADORA.

Campo de Ia técnica

La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia inmunoterapia del cáncer. En particular con péptidos o combinaciones de ellos, provenientes de Ia región 32-51 de Ia proteína Factor anti-LPS de Limulus, los cuales no unen lipopolisacáridos y presentan propiedades anti-tumorales e inmunomoduladoras útiles para el tratamiento del cáncer y metástasis.

Estado de Ia técnica anterior

Recientemente, se ha publicado el uso de modificadores de Ia respuesta biológica en el tratamiento para el cáncer principalmente en combinación con las terapias ya existentes buscando aumentar el beneficio del tratamiento (US 2004/0101511). Por otra parte, el uso de secuencias CpG las cuales son agonista del Receptor tipo ToII 9 (en inglés Toll-like receptor, abreviado TLR9) se están desarrollando como nuevas drogas para el tratamiento, control y prevención de múltiples indicaciones para cáncer ej: células no pequeñas de cáncer de pulmón, melanoma, carcinoma renal (Klinman D. M., et al, (2004) Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nat Rev Immunol. 4:249-258). La activación del sistema inmune por un agonista del TLR7 se encuentra en ensayo clínico fase I con promisorios resultados como nueva droga para el tratamiento de melanoma y otros tumores (Dudek A. Z., et al (2005) ASCO Annual Meeting). Los anteriormente referidos agonistas de los TLR9 y TLR7 están siendo evaluados también en infecciones virales, dado su capacidad de promover una efectiva respuesta inmune en el hospedero. Además, las denominadas Heat shock protein (Hsp), las cuales se unen al TLR4, han sido desarrolladas y comercializadas como un producto de fusión con Ia oncoproteína E7. Este nuevo enfoque ¡nmunoterapéutico también se conoce como vacunas terapéuticas y tiene amplia perspectiva en Ia terapia de enfermedades relacionadas con el virus del papilloma humano (Chu N. R. et al., (2000) Immunotherapy of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumour by administration of fusión protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin (BCG) hsp65 and HPV16 E7. Clin Exp Immunol 121 :216-225). Los receptores tipo ToII son receptores que se encuentran en células del sistema inmune y reconocen patrones moleculares asociados a patógenos ejemplo:

lipopolisacaridos (en inglés Lipopolysaccharide, abreviado LPS), ácido lipotecoico, secuencias no metiladas CpG, RNA viral de doble y simple cadena. El reconocimiento del patógeno invasor por los TLRs ayuda al sistema inmune a dirigir un tipo de respuesta compartida Th1/Th2 que Ie permite al organismo erradicar eficientemente Ia infección. El uso de agonistas de los TLRs como drogas para el cáncer, se basa en Ia activación del sistema inmune innato y adaptativo. Su principal mecanismo radica en Ia activación de una respuesta tipo Th1 , dada fundamentalmente por Interferones de tipo I (en inglés Interferon, abreviado IFNα.β) e interleucina-12 (IL-12). Esto conduce a una respuesta inmune adaptativa altamente específica y mantenida (Switaj T., JaIiIi A., et al., (2004) CpG Immunostimulatory oligodeoxynucleotide 1826 enhances antitumor effect of interleukin 12 gene-modified tumor vaccine ¡n a melanoma model in mice. Clinical Cáncer Research, VoI. 10:4165-4175). Esta dual activación del sistema inmune se diferencia de muchas otras aproximaciones inmuno-terapéuticas, las cuales son generalmente incapaces de crear un efecto mantenido sobre Ia respuesta inmune adaptativa y por otro lado Ia activación no especifica del sistema inmune innato conlleva a efectos no deseados (Speiser D. E, et al. (2005) Rapad and strong human CD8+T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. The Journal of Clinical Inv. VoI. 115 (3). Las células dendríticas (en inglés Dendritic CeIIs, abreviado DC), son células profesionales presentadoras de antigenos, cuyo principal papel es vincular Ia respuesta inmune innata y adaptativa a través de Ia interacción directa célula-célula y Ia producción de citocinas. Las DC pueden ser de origen mieloide o linfoide atendiendo a Ia expresión de una serie de marcadores de superficie, así como a Ia expresión de diferentes TLRs. Las DC de origen linfoide conocidas como células dendríticas plasmacitoides son las principales productoras de IFNs de tipo I. En virtud de estas características, las células dendríticas han sido manipuladas como un promisorio adyuvante celular para el desarrollo de vacunas terapéuticas contra el cáncer e infecciones virales crónicas (Santini S.M., et al (2003) A new type I IFN- mediated pathway for rapid differentiattion of monocytes into highly active dendritic cells. Stem CeIIs, 21 :357-362). Sin embargo, esta es una técnica altamente costosa y difícil por Io que en Ia actualidad se esta trabajando en encontrar estrategias

alternativas mas practicas y menos costosas (Van Epps H. L. (2005) New hope for tumor vaccines. The Journal of Experimental Medicine, Vol.202:1615). Originalmente descritos por su actividad antiviral, los Interferones de tipo I (IFNα.β), recientemente han mostrado ejercer importantes efectos sobre el sistema inmune, incluyendo Ia promoción de respuestas celular y humoral mediada por su efecto adyuvante sobre las células dendríticas (Bogdan, C. (2000) The function of type I interferons in antimicrobial immunity. Curr, Opin Immunol. 12:419-424). Trabajos recientes muestran una función crítica para los Interferones de tipo I producidos endógenamente, en los procesos de regresión de un sarcoma murino singénico altamente inmunogénico y en proteger al hospedero de Ia formación de tumores primarios carcinogénicos (Gavin P. Dunn, et al. (2005) A critica! function for type I interferons in cáncer immunoediting. Nature Immunology, June 12). Además, el Interferon alpha juega un papel importante en Ia iniciación de Ia respuesta viral de los linfocitos T, vía una activación directa de los linfocitos T CD4 ⁺ y CD8 ⁺ en infecciones virales como Influenza (Fonteneau J. F, et al. (2003) Activation of influenza virus-specific CD ⁺ 4 and CD ⁺ 8 T cells: a new role for plasmacytoid dendritic cells in adaptive immunity. Immunobiology, 101 : 3520-3526) Por su parte, Hoess (WO 95/ 05393) relaciona su invención a sustancias las cuales se unen con gran afinidad al LPS y son de utilidad para Ia prevención o tratamiento de por ejemplo: sepsis mediadas por bacterias Gram-negativas y Gram-positivas y para el tratamiento de infecciones bacterianas en general y por hongos. Dichas sustancias son péptidos que unen LPS conteniendo un dominio de unión para Ia endotóxina (Hoess A., et al, (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor, at 1.5A° resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). Esta revela un lazo o loop en Ia estructura de Ia proteína Factor anti-LPS de Limulus (en inglés Limulus anti-LPS factor, abreviado LALF) Ia cual tiene rasgos similares al polimixin B, por estar cargado positivamente, tener carácter anfipático y contener residuos hidrofóbicos y aromáticos expuestos. Por este mismo principio, argumenta Ia capacidad de Ia región comprendida entre los amino ácidos 31-52 de Ia proteína LALF de unirse y neutralizar los efectos asociados con Ia heparina, ejemplo: anticoagulacion, angiogénesis y Ia inhibición de Ia proliferación de células endoteliales y tumorales. Sin embargo no existe ningún dato experimental que soporte este argumento en Ia mencionada patente, de hecho

las reivindicaciones otorgadas fueron las referentes a un aparato para remover LPS de una solución, dicho aparato comprende los péptidos inmovilizados a un soporte sólido (US 6,384,188).

Por otra parte, Vallespí (US 6,191 ,114) relaciona su invención al péptido que comprende los aminoácidos 31-52 de Ia proteína LALF, el cual ejerce un efecto antiviral sobre células tipo Hep-2 y MDBK en virtud de Ia inducción de IFN-α y γ; así como relaciona su invención al uso de dicho péptido para el tratamiento de infecciones virales y desordenes relacionados a inmunosupresion. Además, el mismo autor ha demostrado el efecto anti-infectivo de este péptido en modelos animales de sepsis, (Vallespi M. G., et all (2003) A Limulus anti-LPS factor-derived peptide modulates cytokine gene expression and promotes resolution of bacterial acute infection in mice. International Immunopharmacology, 3:247-256). Existe un número de terapias dirigidas al tratamiento del cáncer las que incluyen quimioterapia, radiaciones y terapia génica. Una desventaja de estas terapias es Ia toxicidad asociada a Ia mayoría de los tratamientos. Además, grandes dosis tienen que ser administradas por un largo periodo de tiempo antes de obtener un beneficio terapéutico. Por Io tanto, aun persiste Ia necesidad del desarrollo de nuevas drogas para acometer tratamientos más efectivos. Sobre Ia base del papel crucial que juega el sistema inmune en detectar y dirigir una respuesta eficiente contra el tumor, el diseño de drogas que actúen sobre los mecanismos de defensa del hospedero tanto innato como adaptativo puede convertirse en poderosas herramientas para Ia terapéutica del cáncer. Hasta el momento no se ha descrito sustituciones de amino ácidos específicos en Ia secuencia HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW de Ia proteína LALF, que permita eliminar Ia capacidad de unión al LPS y potenciar el efecto inmunomodulador, además de conferirle efecto anti-tumoral in vivo contra diferentes tumores.

Explicación de Ia invención

La presente invención resuelve el problema antes mencionado, al proporcionar péptidos provenientes de Ia secuencia HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 13) que corresponde a Ia región 32-51 de Ia proteína LALF, en Ia cual se han introducido sustituciones de amino ácidos que garantizan eliminar Ia capacidad de unión al LPS y potencian el efecto antitumoral e inmunomodulador.

Los péptidos análogos derivados de dichas sustituciones las cuales no unen LPS ni heparina y muestran un mayor efecto anti-tumoral e inmunomodulador que el péptido parental presentan las siguientes secuencias:

HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 1) HYRIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 2)

HYRIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 3)

HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 4)

La capacidad de unión a LPS de los péptidos descritos por Hoess y Vallespí tienen como desventaja que su administración en presencia de LPS desvía el patrón de citocinas de un perfil compartido Th1/Th2 a uno predominante Th2, Io cual seria contraindicado en pacientes con cáncer. Estos pacientes generalmente presentan infecciones concomitantes producto de su estado inmunodeprimido, por Io cual no se descarta Ia presencia de partículas de LPS en sangre. La administración de un péptido que pueda inducir un tipo de respuesta predominante Th2 en presencia de Ia endotóxina seria un efecto no deseado que deterioraría aun mas el estado inmunológico del paciente, empeorando Ia respuesta del hospedero contra el tumor. Además, Ia unión al LPS, por parte del péptido reportado por Vallespí, podría minimizar el efecto inmunomodulador descrito para este péptido. Por otro lado, Ia no unión a heparina de los péptidos descritos en esta invención tiene ventajas sobre los descritos anteriormente por Hoess y Vallespí. En pacientes críticos como por ejemplo: cardiopatía isquémica, enfermedad cerebrovascular, enfermedad tromboembólica venosa (trombosis venosa profunda y embolismo pulmonar), isquemia de miembros inferiores, el uso de heparina esta indicado como tratamiento (D. Cabestrero Alonso, et al (2001) Heparinas de bajo peso molecular en pacientes críticos: usos, indicaciones y tipos. Medicina Intensiva, VoI.95:18-26), por Io que Ia administración de un péptido que tenga Ia propiedad de unirse a heparina podría estar contraindicado por bloquear el efecto de dicha droga en ese contexto. La asociación entre cáncer y enfermedades relacionadas a trombo-embolismos es un fenómeno bien conocido y puede contribuir significativamente a Ia morbilidad y mortalidad del paciente con cáncer, como por ejemplo Ia trombosis venosa profunda y embolismo pulmonar. Por las razones antes expuestas es ventajoso disponer de péptidos que no unan heparina y tengan efecto antitumoral e inmunomodulador en el tratamiento del paciente con cáncer, el cual en un gran porciento son sometidos a cirugía y presentan otros trastornos como hipercoagulabilidad, (Castelli R., et al

(2004) The hepatitis and cáncer: Review of clinical triáis and biological properties. Vascular Medicine, Vol.9:1-9).

La invención también- incluye péptidos, donde dos o más residuos aminoacidicos son sustituidos por alanina y comprenden las secuencias de amino ácidos: HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8)

HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9) HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10) HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 11) HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12) y cualquier variante homologa o mimética de los péptidos anteriores, que haya sido obtenida por vía sintética o recombinante, así como cualquier péptido de fusión que los contenga. Se entiende por variante homologa a cualquier péptido que no tenga capacidad de unión al LPS o heparina y mantenga un efecto anti-tumoral e inmunomodulador. igualmente se entiende por variante mimética a cualquier molécula de origen químico (no proteico) cuya estructura no tenga capacidad de unión al LPS o heparina y mantenga un efecto anti-tumoral e inmunomodulador. En una realización preferida de Ia invención, Ia composición farmacéutica contiene uno o más de los péptidos y compuestos químicos o sus sales farmacéuticamente aceptables, así como excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En otra realización preferida, Ia composición farmacéutica contiene adicionalmente un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno bacteriano, viral y de cáncer.

Igualmente los péptidos de Ia invención pueden emplearse combinados con los tratamientos convencionales contra el cáncer, como por ejemplo quimioterapia, cirugía, radiación, etc.

También es parte de Ia presente invención el uso de los péptidos y los compuestos químicos para Ia preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o Ia prevención de desordenes inmunológicos, en los cuales se necesite desarrollar una efectiva respuesta inmune tipo Th1 ; tratamiento y/o prevención del cáncer, así como para desarrollar una efectiva respuesta inmune ante infecciones de origen bacteriano y viral.

Los péptidos descritos se definieron por su capacidad de no unir el LPS, ya que Ia secuencia original HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW está previamente descrita como

dominio consenso óptimo para Ia unión al LPS (Hoess et al., (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti- LPS factor, at 1.5A° resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). Asimismo, los péptidos descritos en esta invención potencian el efecto ¡nmunomodulador dado por Ia expresión de IFN-α, comparado al péptido de Ia proteína LALF que comprende los amino ácidos 31-52, el cual Vallespí en su invención (US 6,191 ,114) refiere como un péptido anti-viral e inmunomodulador.

Igualmente, los péptidos descritos en esta invención pueden ser administrados a pacientes que están inmunosuprimidos y necesitan una activación de Ia capacidad de respuesta del sistema inmune ej; pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), pacientes sometidos a cirugías complejas. De igual forma los datos experimentales in vivo demuestran Ia efectividad de los péptidos análogos en tumores ya implantados en ratones, provenientes de células murinas de melanoma B16; células epiteliales de pulmón malignizadas derivadas de ratones C57BL/6 y células 3LL-D122 provenientes de cáncer de pulmón de ratón. En otra materialización Ia administración de los péptidos puede ser usada para reducir eventos de metástasis.

Otros resultados de Ia presente invención indican que los péptidos descritos tienen efecto antiproliferativo sobre líneas tumorales de diferentes orígenes histológico, demostrando un efecto citotóxico directo sobre las células cancerígena.

En principio, los péptidos descritos pueden ser utilizados solos o en combinación con las terapias actuales para el tratamiento del cáncer, como ejemplo: cirugía, radiación, quimioterapia. Igualmente, los péptidos descritos en esta invención administrados profilácticamente conlleva a una rápida respuesta inmune innata contra el tumor, con un subsiguiente desarrollo de una respuesta inmune adaptativa antigeno especifica, enfatizando su uso en vacunas profilácticas o terapéuticas contra cáncer.

Breve descripción de las figuras: Figura 1: Efecto de los péptidos sobre Ia capacidad de unir lipopolisacárido bacteriano (LPS). Figura 1A, estos experimentos se realizaron por triplicado, se muestran las curvas de inhibición de un experimento. Los porcientos de inhibición mostrados en Ia figura 1 B son Ia media de tres experimentos independientes.

Figura 2: Efecto de los péptidos sobre Ia capacidad de unir el compuesto aniónico heparina. Se muestra Ia media de tres experimentos independientes. Figura 3: Efecto de los péptidos sobre Ia producción de IFNα.γ e IL-12 en células mononucleares humanas. Se realizaron tres experimentos con donantes diferentes. Se muestran los resultados de un donante.

Figura 4: Efecto antitumoral de los péptidos en el modelo de tumor TC-1. Figura 5: Efecto antitumoral del péptido L-2 en el modelo melanoma. Figura 6: Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en esquema de administración profiláctico en el modelo de tumor TC-L Figura 7: Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en un esquema de doble reto con las células tumorales TC-1.

Figura 8: Capacidad anti-metástasis del péptido análogo L-2. Figura 9: Efecto del péptido análogo L-2 sobre Ia proliferación de células TC-1 , H- 125 y L929. EXPOSICIóN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIóN / EJEMPLOS

Ejemplo 1. Síntesis de péptidos.

Los péptidos de Ia invención son sintetizados usando un procedimiento en fase sólida. El péptido crudo es extraído con una solución de ácido acético al 30%, liofolizado y posteriormente purificado por RP-HPLC. La masa molecular de los péptidos purificados son verificadas usando un espectómetro de masa JEOL JMS- HX110HF con un FAB gun. La preparación resultante es no antigénica, no pirogénica y farmacéuticamente aceptable para su administración en animales y humanos. Las sustituciones se realizaron puntualmente introduciendo el amino ácido alanina en cada una de las posiciones de Ia secuencia original HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW.

Ejemplo 2: Selección de péptidos análogos que no presentan capacidad de unión al lipopolisacárido (LPS).

Este ensayo consiste en un sistema de competencia de tipo ELISA (Hardy E., et al (1994) Enhanced ELISA sensitivity using TCA for efficient coating of biologically active LPS or Lipid A to the solid phase. J. Immunol. Meth. VoI.176:111 -116). Placas de poliestireno (Costar.USA) se recubrieron con LPS de E.coli 0111 :B4 (1 μg/mL) con el empleo de ácido tricloroacético (TCA) al 0.2%. Las placas se incubaron toda

Ia noche a 37 ⁰ C y luego se lavaron 10 veces con tampón fosfato salino (PBS 1X) con tween-20 al 0.1% (solución de lavado). La unión de los péptidos análogos al LPS fijado en Ia superficie sólida se evaluó por competencia directa con el péptido LALF ₃₂ -5 ₁ marcado con biotina (LALF ₃₂ - ₅ i-biotina) a una concentración de 0.2 μM, para Ia que se obtenía un 90% de Ia unión máxima al LPS. Para estimar las curvas de inhibición, se utilizaron diferentes concentraciones de los péptidos análogos desde 10 μM hasta 0.01 μM y como control del experimento se realizo Ia curva del LALF ₃₂ - ₅₁ . El LALF3 _2- 5i-b¡ot¡na, en presencia de los péptidos análogos, se incubo durante 2 h a 37 ⁰ C y luego las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado. El LALF _32-5 i-biotina unido al LPS se detecto por incubación durante 45 min a 37 ⁰ C con estreptavidina conjugada a peroxidasa (estreptavidina-peroxidasa) en dilución 1 :2000. Las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado y se añadió entonces Ia solución de sustrato (tampón citrato-fosfato 0.05 M pH 5.5, 1 tableta de 3,3 ,5,5- tetrametilbenzidine, peróxido de hidrogeno al 0.025%). Se incubo por 15 minutos adicionales y se detuvo Ia reacción por adición de ácido sulfúrico 2 M. La absorbancia a 450 nm se cuantifico utilizando un lector de placas (Sensident Sean). Existe una correlación entre los valores de densidad óptica y Ia capacidad de unión al LPS de los péptidos análogos. Péptidos análogos con mayor capacidad de unión al LPS presentan curvas de inhibición con valores de D.O menor respecto a Ia curva de inhibición del LALF _32- Si.

Péptidos análogos con menor capacidad de unión al LPS presentan curvas de inhibición con valores de D.O mayor respecto a Ia curva de inhibición del LALF _32- Si. Los resultados de este ejemplo plasmados en Ia figura 1A, demostraron que los péptidos denominados L-2, L-8, L-12 y L-20 pierden Ia capacidad de unión al LPS, sin embargo los péptidos L-9 y L-19 evidencian una capacidad de unión al LPS similar al LALF _32-S i. Por su parte el análogo L-3 muestra una mayor capacidad de unión al LPS.

En Ia figura 1 B se presentan los porcientos de inhibición de los péptidos análogos, a una concentración fija de 0.5 μM, en cuanto a Ia capacidad de desplazar Ia unión del LALF _32-5 i-biotina (0.2 μM) al LPS fijado a superficie sólida.

% de inhibición = {1- (( [D.O] _mues tra - [D.O] _mln ) / ( [D.O] _max - [D.O] „,,„))} ^χ 100 [D.O] muestra: Valor de densidad óptica en presencia de una concentración fija de los péptidos análogos;

[D.O] _min : fondo del ELISA;

[D.O] _m aχ: Valor de densidad óptica en ausencia de los péptidos análogos.

Tabla 1. Secuencia de los péptidos utilizados en los ejemplos

Como resultado de estos análisis realizamos mutaciones dobles, triples y en cuatro amino ácidos, partiendo de los péptidos que no unen LPS: HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8) HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9) HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10) HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 11) HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12)

Ejemplo 3: Evaluación de Ia unión a heparina de los péptidos análogos L-2, L-8, L-12 y L-20.

Este ensayo consiste en un sistema de competencia de tipo ELISA, similar al descrito anteriormente. El péptido LALF _32- 5i-biotina en PBS 1X se fijo a placas de poliestireno (Costar, USA) y se incubo toda Ia noche a 4 ⁰ C. Los péptidos análogos L-

2, L-8, L-12 y L-20 a una molaridad de 2 μM se mezclaron con 250 unidades de heparina (Heparina sódica, 5000 U/mL, Liorad) en PBS+0.1% de albúmina bovina

(BSA). Posteriormente, fueron añadidos a Ia placa de ELISA conteniendo 0.02 μM del péptido LALF ₃₂ - ₅ i-biotina unido a superficie sólida. Pasado 1 h de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado, y el péptido LALF _32-5 i-biotina fijado a superficie sólida se detecto por incubación durante

45 min. a 37 ⁰ C con estreptavidina conjugada a peroxidasa (estreptavidina- peroxidasa) en dilución 1 :2000. Seguidamente, las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado y se añadió entonces Ia solución de sustrato. Se incubo por 15

min. adicionales y se detuvo Ia reacción por adición de ácido sulfúrico 2 M. La no unión a heparina de los péptidos análogos correlaciona con Ia disminución de Ia densidad óptica, ya que estos no son capaces de desplazar Ia unión del péptido LALF ₃ 2-5i-biotina fijado a superficie sólida a Ia heparina. Paralelamente se incluye como control en el ensayo el LALF ₃₂ - ₅ 1 no marcado en un exceso molar de 100X. La unión a heparina del péptido LALF _32- 5i no marcado se demuestra por el aumento de los valores de densidad óptica, ya que el exceso de péptido frío compite por Ia unión a Ia heparina. Como se puede observar en Ia figura 2, los resultados indican que los péptidos L-2, L-8, L-12 y L-20 descritos en esta invención no se unen a Ia heparina.

Ejemplo 4: Efecto de los péptidos análogos L-2, L-8, L-12 y L-20 sobre Ia expresión de IFN-α, IFN-γ e I L-12 en células mononucleares humanas.

Para este ensayo se realizó el aislamiento de células mononucleares humanas por gradiente de Ficoll-Hypaque a partir de un concentrado leucocitario "Buffy Coat" de un donante. Un total de 5x10 ⁶ células se sembraron en placas de 24 pozos en medio RPMI 1640+10% de suero fetal bovino. Luego se añadió cada péptido a una concentración de 40 μg/mL en un volumen de 0.1 mL en medio RPMI y el cultivo celular se mantuvo durante 18 horas a 37 ⁰ C y 5% de CO ₂ . La extracción de RNA total se realizo por el método de TriReagent. Posteriormente Ia expresión de los genes para IFN-α, IFN-γ e I L-12 se determino por Ia técnica de reacción de trascripción reversa y amplificación por PCR (Kit de RT-PCR Perkin Elmer). Los resultados son mostrados como niveles relativos de RNA mensajero normalizados con el gen de Ia β-actina. Los resultados obtenidos en este ensayo demostraron que los péptidos L-2, L-8, L-12 y L-20 descritos en esta invención son capaces de inducir Ia expresión de los genes para IFN-γ e I L-12, figura 3A. Los péptidos análogos L-2, L-8 y L-12 son particularmente mas efectivos en Ia inducción del gen para IFN-α que el péptido LALF _32-S i, figura 3B. Este ejemplo demuestra que sustituciones de amino ácidos en Ia secuencia original 32-51 de Ia proteína LALF elimina Ia capacidad de unión al LPS y potencia el efecto inmunomodulador.

Ejemplo 5: Efecto antitumoral de los péptidos análogos L-2, L-8, L-12 y L-20 en el modelo de tumor TC-1.

En estos ensayos se utilizaron ratones C57BL/6 de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos, (n=10 animales por grupo experimental). Para Ia implantación del tumor en este modelo, se usaron las células TC-1 derivadas de células epiteliales de pulmón de C57BL/6 malignizadas, las cuales fueron resuspendidas en solución salina (PBS). Una cantidad de 50 000 células en un volumen de 200 μL fue inoculada a los ratones por vía subcutánea en Ia pata posterior derecha. La 1 ^ra administración de los péptidos se realizo subcutánea en el flanco derecho una vez que los tumores alcanzaron 100 mm ³ de volumen, Ia 2 ^da inyección se realizo 10 días después. En este ensayo se evaluó una dosis de 4 mg de péptido por Kg de peso (80 μg/ratón). Los parámetros evaluados para medir el efecto antitumoral de los péptidos de interés fue Ia sobrevida de los animales y Ia masa tumoral, como se puede observar en las figura 4A y figura 4B. Los péptidos análogos L-2, L-8, L-12 y L-20 fueron efectivos en cuanto a Ia capacidad de inhibir Ia progresión del tumor y aumentar Ia sobrevida de los ratones, respectivamente. Estos resultados evidencian Ia eficacia antitumoral de los péptidos análogos en un modelo de tumor sólido. El análisis estadístico para determinar diferencias significativas entre los grupos se realizo por el método de Log Rank. Los resultados evidencian que los péptidos análogos L-2, L-8, L-12 y L-20 aumentan significativamente ( p< 0.05) Ia sobrevida de los animales en comparación al péptido LALF ₃₂ - ₅₁ . Estos resultados demuestran que sustituciones de amino ácidos en Ia secuencia original 32-51 de Ia proteína LALF pueden aumentar significativamente Ia capacidad anti-tumoral.

Ejemplo 6: Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en el modelo de melanoma. En estos ensayos se utilizaron ratones C57BL/6 de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos, (n=10 animales por grupo experimental). Para Ia implantación del tumor en este modelo, se usaron las células MB16-F10 las cuales fueron resuspendidas en solución salina (PBS). Una cantidad de 15 000 células en un volumen de 200 μL fue inoculada a los ratones por vía subcutánea en Ia pata posterior derecha. Pasado 4 días de Ia inoculación de las células tumorales se administro el péptido L-2, Ia segunda inyección se realizo 7 días después de Ia 1ra inyección y 14 días posteriores se realizo Ia tercera inyección. En este ensayo se evaluó una dosis de 4 mg de péptido por Kg de peso. Los parámetros evaluados

para medir el efecto antitumoral del péptido de interés fue el tiempo de prendimiento del tumor y Ia sobrevida de los animales. Como se puede observar en Ia figura 5A, el péptido análogo L-2 retardó significativamente el prendimiento del tumor ( ^* p< 0.05, método de Log Rank). El análisis de sobrevida realizado por el método de Log Rank, demostró que el péptldo L-2 aumentó significativamente ( ^* p< 0.05) Ia sobrevida de los animales, siendo más efectivo que el péptido LALF _32-S i figura 5B. Estos resultados evidencian Ia eficacia antitumoral del péptido L-2 no solo para células epiteliales de pulmón sino también para células tumorales de otras localizaciones y tipos histológicos como Ia de melanoma.

Ejemplo 7: Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en esquema de tratamiento profiláctico en el modelo de tumor TC-1.

En estos ensayos se utilizaron ratones C57BL/6 de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos, (n=10 animales por grupo experimental). Para Ia implantación del tumor en este modelo, se usaron las células TC-1 , las cuales fueron resuspendidas en solución salina (PBS). Los ratones recibieron una primera inyección del péptido L-2 (4 mg de péptido por Kg de peso), pasado 7 días recibieron una segunda inyección utilizando Ia misma dosis; pasado 14 días de Ia primera inyección de péptido, los animales se inocularon con 50 000 células TC-1 en un volumen de 200 μL de PBS por vía subcutánea en Ia pata posterior derecha. Los parámetros evaluados para medir el efecto antitumoral del péptido de interés fue el tiempo de prendimiento del tumor, figura 6A y Ia sobrevida de los animales, figura 6B. Los resultados obtenidos en este ensayo demostraron que el péptido L-2 de esta invención es efectivo en cuanto a prevenir el desarrollo del tumor y aumentar Ia sobrevida de los animales. Estos resultados evidencian que el péptido de esta invención tiene un efecto profiláctico, previniendo Ia aparición del tumor. Ejemplo 8: Efecto antitumoral del péptido análogo L-2 en esquema de doble reto. Para este ensayo los animales que no tuvieron prendimiento del tumor en el esquema anterior (n=6 animales), se retaron por segunda vez con 50 000 células TC-1 en un volumen de 200 μL de PBS por vía subcutánea en Ia pata posterior izquierda (día 49 a partir del primer reto). Como control de este experimento se inocularon Ia misma cantidad de células tumorales en ratones "naive" del mismo lote

(para garantizar homogeneidad de los ratones y edad) mantenidos en iguales condiciones pero que nunca recibieron el péptido, (n=10 animales). Los parámetros evaluados para medir el efecto antitumoral del péptido L-2 fue el tiempo de prendimiento del tumor y Ia sobrevida de los animales. Los resultados obtenidos en este ensayo demuestran que el péptido L-2 es capaz de proteger a los ratones de un segundo reto con las células tumorales, en cuanto al retardo en Ia aparición del tumor (figura 7A) y en el aumento de Ia sobrevida, figura 7B. Este resultado evidencia que el péptido de esta invención es capaz de proporcionar una mantenida respuesta anti-tumoral a un segundo golpe con las células tumorales, Io que evidencia el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa antigeno específica.

Ejemplo 9: Efecto antitumoral del péptido análogo L-2, en el modelo de metástasis de Carcinoma de Lewis.

En estos ensayos se utilizaron ratones C57BL/6 de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos, (n=8 animales/grupo experimental). En los animales se inocularon en Ia almohadilla plantar posterior derecha 250 000 células 3LLD122 de cáncer de pulmón de ratón. Pasado 7 días se inyecto por vía subcutánea una dosis de péptido L-2 de 4 mg por Kg de peso. Cuando los tumores alcanzaron 8 mm de diámetro se elimino el tumor primario mediante escisión quirúrgica de Ia pata portadora. Los ratones se sacrificaron 21 días después de este procedimiento. Los pulmones se pesaron como parámetro indicador de Ia cantidad de metástasis presentes en los mismos. Los resultados mostrados en Ia figura 8 indican que el péptido análogo L-2 de esta invención es capaz de reducir los eventos de metástasis.

Ejemplo 10: Efecto del péptido análogo L-2 sobre el crecimiento de células tumorales.

Para este ensayo las células TC-1 , H-125 (células no pequeñas de cáncer de pulmón humano) y L929 (fibroblastos murino), se sembraron en placas de 96 pocilios (Costar) a una densidad de 2 x 10 ⁴ células/ml en medio Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado con Suero Fetal Bovino (Gibco). Al cabo de 24 horas, los péptidos fueron adicionados al medio de cultivo en un rango de dosis entre 9 μM y 300 μM. La incubación fue realizada por espacio de 72 horas en presencia de CO ₂ al

5% y al termino de Ia misma se revelo con violeta cristal. Las placas se lavaron extensamente con agua corriente y finalmente se realizo Ia lectura de Ia placa a una absorbancia de 562 nm. Los resultados son mostrados en Ia figura 9. Para este ensayo se empleó como control positivo un péptido proapotótico con un demostrado efecto antiproliferativo in vitro (Perea, S., et al (2004) Antitumor Effect of a Novel Proapoptotic Peptide that Impairs the Phosphorylation by the Protein Kinase 2 Cáncer Research 64: 7127-7129). Los resultados obtenidos en este ensayo demostraron que el péptido L-2 produce un efecto antiproliferación, de manera dependiente de Ia dosis, sobre las células TC-1 y H-125. Sin embargo ningún efecto se observó con el péptido de esta invención en Ia línea celular L929 de fibroblastos murino. Este resultado demuestra que el péptido de esta invención tiene efecto citotóxico selectivo sobre células tumorales in vitro.