【발명의 명칭】

재조합 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질을 포함하는 면역증강 조성물

【기술분야】

본 발명은 재조합 람블편모충 결합 면역글로블린 단백질을 포함하는 면역증강조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

람블편모층 (Giardia Iambi i a)은 인간을 포함하는 포유동물에서 장내 흡수불량 및 설사를 야기하는 원생동물 기생충이다. 람블편모층증 (Giardiasis)은 무증상부터 심각한 설사까지 다양한 임상적 발현 방식을 갖는다. 람블편모충 영양형은 조직으로 침투하지 못한다 하더라도, 장내 표피세포의 점막 표면은 람블편모층의 항원 발현에 의해 자극 받을 수 있다ᅳ 따라서， 숙주 면역체계에 의해 인지된 람불편모충의 항원은 람블편모층의 감염 동안 면역 반응의 조절을 이해하기 위해 그 메커니즘이 해명될 필요가 있다. 람불편모층 클론 GS/M-83-H7 및 G1VSP 유래의 변이체 표면 단백질은 람블편모층에 감염된 인간뿐만 아니라 마우스에서 1차 면역반응을 유도하는 항원으로 고려된다. G1VSP는 GIVSP가 in vivo에서 연속적으로 변화하고, 그렇게함으로써 람블편모층이 숙주 면역 반응을 회피하게 만들기 때문에 람블편모층 항원의 변이에 원인이 된다. 또한， α-l 지아르딘 (giardin)은 원형질막 -결합 능력 및 글라이코사미노글라이칸ᅳ결합 능력을 갖는 면역우성 단백질이라는 것이 보고되었다 (Weiland M, Palm J, Griffiths WJ, McCaffery JM & Svard SG, Int JParasitol 2003 ;33: 13411351).

람블편모층의 감염은 대개 자기 제한적이고， 이것은 효과적인 숙주 방어의 존재를 나타낸다. 인터루킨 -6(이하 IL-6라 함)는 람블편모충에 감염된 마우스에서 향상된 수준으로 발견되었다 (Zhou P, Li E, Zhu N, et al . Infect I隱 im 2003； 71： 1566-1568). 람블편모층 감염의 조절은 야생형 마우스 보다 IL— 6가 결핍된 마우스에서 더 느렸고 (Bienz M, Dai WJ, Welle M, Gottstein B & Muller N, Infect Immun 2003； 71： 15691573), 야생형 마우스에서 비만세포 (mast cell)는 중요한 역할을 하였다 (Li E, Zhou P, Petr in Z & Singer SM, Infect I誦 un 2004； 72： 6642-6649) . 또한 람블편모충의 방출에 노출된 상피세포가 람블편모층 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 20을 방출한다는 것이 보고되었다 (Roxstrom-Lindqui st K , Palm D , Reiner D, Ringqvi st E & Svard SG, Trends Paras i tol 2006； 22： 26-31) . 넉아웃 (knock out ) 마우스를 이용하여 in vivo 감염과 함께 마우스에서 람블편모층 감염에 대한 마이크로어레이 분석은 iN0S( induci bl e ni tr i c oxide synthase) 및 기질금속단백질 분해효소 7(matr ix metal loprotease , 顧 P7)이 람블편모층 감염의 조절에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다 (Tako EA , Hassimi MF, Li E & Singer SM, mBio 2013； 6： e00660-13) . 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제 1

본 발명자들은 동정된 재조합 람블편모층 결합 면역글로불린 단백질 (recombinant G . 1 amb 1 i a binding immunoglobul in protein , rGlBiP)이 마우스 수지상 세포의 사이토카인 생산과 수지상 세포의 성숙과 같은 면역반응을 통해 면역 활성화를 크게 향상시킴으로써 면역증진 효과를 나타낼 수 있음을 규명함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서， 본 발명의 목적은 면역증진용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 면역중진용 약제학적 조성물의 제조를 위한 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질 또는 그의 단편의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 면역반웅을 증진시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 수지상 세포를 성숙화하는 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다론 목적은 면역원성을 가지는 에피토프의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질 항원에 대한 항체의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

【기술적 해결방법】

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 ( _a ) 람블편모층 결합 면역글로불린 단백질 (Gi ardi a 1 amb 1 i a binding immunoglobul in protein) 또는 그의 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역증진용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역반응을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 수지상 세포를 성숙화하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "면역증진" 은 초기 면역 반웅을 유도하거나 항원에 대한 기존의 면역 반응을 측정 가능할 정도로 증가시키는 것을 말한다.

본 명세서에서 용어 "재조합 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질 (recombinant G . 1 amb 1 i a binding immunoglobul in protein , rGlBiP) " 은 람블편모층의 결합 면역글로블린 단밸질 (BiP) 상동체 (GL50581_3283) (sequence coverage, 36%： MASCOT score , 1227)를 의미한다. 하나의 특정예에서， 상기 재조합 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질은 1281 bp의 DNA 염기서열을 암호화하는 N-말단 부위 (서열목록 제 1서열의 1 내지 427번째 아미노산)와 753bp의 DNA 염기서열을 암호화하는 C-말단 부위 (서열목록 제 1서열의 428 내지 677번째 아미노산)를 포함하는 단백질 (서열목록 제 1서열)을 의미하며， 재조합 GlBi P 또는 rGlBiP와 동일한 용어로 흔용하여 사용한다. 본 명세서에서 용어 "재조합 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질의 단편" 은 상기 재조합 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질의 일부 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편을 의미한다 . 하나의 특정예에서， 상기 재조합 람블편모충 결합 면역글로블린 단백질의 단편은 N-말단 또는 C-말단을 포함하는 단백질을 의미한다 .

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 람블편모충 결합 면역글로블린 단백질의 단편은 재조합 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질의 C-말단, 즉 서열목톡 제 1서열의 428 내지 677번째 아미노산올 포함한다.

본 발명의 조성물에는 기타 약물 또는 다른 면역 보조제가 포함되어 추가적인 면역 자극 효과를 제공할 수 있다. 추가되는 면역 보조제는 예를 들어 리포풀리사카라이드 (LPS), 프레운트 완전 보조제 (Freund's complete adjuvant), 유지 , 알루미늄염， 크레스틴 (Krestin) , 렌티난 (Lentinan) 및 AHCCCActive Hexose Correlated Compound)를 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다ᅳ

본 발명의 면역증강용 조성물은 다양한 질환에 적용될 수 있으며, 예를 들어， (i) 암 (예컨대, 위암， 폐암， 유방암， 난소암， 간암， 기관지암, 비인두암， 후두암， 췌장암， 방광암， 대장암， 결장암, 자궁경부암， 뇌암, 전립선암， 골암， 피부암， 갑상선암， 부갑상선암 및 요관암); (ii) 바이러스 (예컨대 아데노바이러스, 허르페스바이러스 (예를 들어 HSV-I, HSV- II, CMV 또는 VZV), 폭스바이러스 (예를 들어 천연두 (variola), 백시니아 또는 물사마귀바이러스 (molluscum contagiosum)와 같은 진성두창바이러스 (orthopoxvirus), 피코르나바이러스 (예를 들어 리노바이러스 또는 엔테로바이러스))， 오르토믹소바이러스 (예를 들어 인플루엔자바이러스)， 파라믹소바이러스 (예를 들어 5- 파라인플루엔자바이러스， 유핸성 이하선염 바이러스 (腿 mps virus), 흥역 바이러스 및 호흡기합포체 바이러스), 코로나 바이러스 (예를 들어 SARS), 파포바바이러스 (예를 들어 성기사마귀， 보통사마귀 또는 족저 사마귀를 유발하는 파필로마 바이러스)， 헤파드나바이러스 (예를 들어 B형간염 바이러스)， 플라비바이러스 (예를 들어 C형간염 바이러스 또는 뎅기열바이러스 (Dengue virus)) 또는 레트로바이러스 (예를 들어 HIV와 같은 렌티바이러스))에 의한 감염성 질환; ( ) 박테리아 (예컨대 에스케리치아， 엔테로박터， 살모넬라， 스타필로코커스， 쉬겔라， 리스테리아， 에어로박터, 헬리코박터, 클레브시엘라， 프로테우스， 수도모나스, 나이세리아， 클로스트리듐， 바실러스， 코리네박테리움, 마이코박테리움， 캠필로박터，비브리오， 세라티아， 프로비덴시아， 크로모박테리움， 브루셀라， 예르시니아, 해모필러스 또는 보르데텔라 속)에 의한 감염성 질환; ( iv ) 그 밖의 다른 감염성 질병 (예를 들어 클라미디아와 칸디다증， 국균증， 히스토마플라스마증 및 크립토콕쿠스 뇌막염을 포함하는 진균성 질병 및 말라리아， 뉴머시스터스성 폐렴, 리슈마니아증, 립토스포리디움증， 톡소포자층증 및 트리파소노마 감염올 포함하는 기생층성 질환) ; ( V ) 아토피성 피부염 또는 습진, 호산구증가증， 천식， 알레르기， 알레르기비염 및 오멘 증후군과 같은 Th2-매개된 아토피질환; ( vi ) 알로페시아 그레아타 (alopeci a greata) , 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈， 자가면역 간염， 자가면역 난소염 및 고환염， 자가면역 혈소판감소증, 베체트병， 수포성 유천포창， 심근병증, 복강 스프루우-피부염 ( cel i ac sprue-dermat i t i s) , 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증， Churg- Strauss 증후군， 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한넁 응집소 질환， 크론씨병， 원판성 낭창， 복태성복합한냉글로블린혈증, 섬유근통 -섬유근염， 사구체신염， 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군， 하시모토 갑상선염， 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반중, IgA 신경염， 연소자성 관절염， 편평태선 , 홍반성 루푸스， 메니에르병 , 흔합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역 -매개 당뇨병， 중중근무력증， 심상성 천포창， 악성 빈혈， 결정성 다발동맥염， 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군 류마티스 다발성근통， 다발성 근염과 피부근염， 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담중성 간경변， 건선， 건선성 관절염, 레이노 현상， 라이터 중후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증， 공피증， 강직인간 증후군， 전신성 홍반성 루푸스， 흥반성 루푸스， 다가야스 동맥염， 일시적 동맥염， 거대세포 동맥염， 궤양성 대장염， 포도막염， 백반증 및 베게너 육아종증과 같은 자가면역질환; (vii) 천식, 엔세필리티스 (enceph i l i t i s ) , 염증성 장염， 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 폐혈병성 쇼크중， 폐섬유증， 미분화 척추관절중, 미분화 관절병증， 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증을 포함하는 염증성 질환; 및 (Vii ) 켈로이드 및 다른 형태의 흉터생성 억계 (예를 돌어 만성상처 등의 치유촉진)와 같은 상처 치유와 관련된 질병의 예방 또는 치료에 이용된다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 수지상 세포를 성숙시킨다 .

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스, 덱스트로스， 수크로스， 솔비를， 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트 , 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 샐를로스， 폴리비닐피를리돈, 셀를로스, 물, 시럽， 메틸 셀를로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제ᅳ 감미제 향미제， 유화제, 현탁제 , 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington 's Pharmaceutical Sciences ( 19th ed . , 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고， 바람직하게는 비경구 투여이고， 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입， 근육 주입, 복강 주입， 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중， 성， 병적 상태， 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 .반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편， 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg (체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 면역원성을 가지는 에피토프의 스크리닝 방법을 제공한다 :

(a) (i) 람블편모층 결합 면역글로불린 단백질 (Giardia Iambi i a binding immunoglobulin protein) 또는 그의 단편과 ( i i ) 에피토프 후보물질로서의 펩타이드를 이용하여 개체를 면역화시키는 단계; 및

(b) 상기 면역화된 개체에서의 면역반응을 측정하는 단계.

본 명세서에서 용어 "에피토프 (epitope)"는 항체와 상호작용하는 항원의 부위를 의미한다. 보다 자세하게는, 에피토프는 면역글로블린 (i誦 unoglobulin) 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 또한, 본 발명의 에피토프는 면역반웅올 증가시킬 수 있는 어떠한 분자 또는 물질을 포함한다. 예를 들어， 본 발명의 에피토프는 펩타이드, 이들 펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 당단백질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질 (Giardia Iambi i a binding immunoglobulin protein) 또는 그의 단편과 에피토프 후보물질로서의 단백질에 의해 면역화시키는 방법은 당업계에 알려진 다양한 면역 투여방법을 포함하며， 바람직하게는 비경구 투여이다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하주입， 근육 주입， 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 개체는 인간을 제외한 동물 (non- human animal)이다. 본 발명에서 이용되는 "인간을 제외한 동물' '은 당업계에서 일반적으로 이용되는 다양한 동물들을 포함하며, 바람직하게는 포유동물이고, 가장 바람직하게는 마우스， 토끼 또는 래트이다. 본 발명에서 면역화된 동물에서의 면역반응 측정은 예를 들어， 상기 선별된 리포좀-포집된 펩타이드를 투여한 대상 동물로부터 혈청을 채취하여 항- 펩타이드 항체 (총 IgG, IgGl 및 IgG2a)의 역가를 측정하는 방법을 통해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 항체의 역가를 측정하는 방법은 EL ISA (Enzyme一 1 inked immunosorbent assay) , 즉면이동분석법 (Lateral flow test) , MIACMagnet ic immunoassay) 및 면역침강법 ( I瞧 unoprecipi tat ion)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, ELISA 분석법이 이용될 수 있다. 특정 펩타이드 서열이 항-펩타이드 항체의 역가를 증가시키는 경우， 상기 특정 펩타이드는 에피토프 또는 펩타이드 백신으로 간주된다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 단백질 항원에 대한 항체의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) ( i ) 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질 (Gi ardia I ambi i a binding immunoglobul in protein) 또는 그의 단편과 ( i i ) 에피토프 후보물질로서의 펩타이드를 이용하여 개체를 면역화시키는 단계;

(b) 상기 면역화된 개체에서의 면역반웅을 측정하여 면역원성을 나타내는 펩타이드 에피토프를 선별하는 단계;

(c) 상기 선별된 펩타이드 에피토프와 분석 대상의 항체를 접촉시키는 단계 ;

(d) 상기 단계 (c)의 결과물과 상기 단백질 항원을 접촉시키는 단계; ( e) 상기 단백질 항원과 상기 분석 대상의 항체의 결합을 분석하는 단계.

본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 개체는 인간을 제외한 동물이며， 이에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

본 발명의 단백질 항원 또는 후보 항체는 검출가능한 표지 (detectable label )로 표지화될 수 있다. 예를 들어， 상기 검출가능한 표지는 화학적 표지 (예컨대， 바이오틴) , 효소 표지 (예컨대， 호스래디쉬 퍼옥시다제 , 알칼린 포스파타제 , 퍼옥시다제， 루시퍼라제 β -갈락토시다제 및 β -글루코시다제)， 방사능 표지 (예컨대, C ¹⁴ , . 1 ¹²⁵ Ρ ³² 및 S ³⁵ ) , 형광 표지 (예컨대， 쿠마린 , 플루오레세인， FITC( f luoresein Isothi ocyanate) , 로다민 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) , Cy-3 , Cy- 5 Texas Red, Alexa Fluor , DAP I ( 4 , 6-d i am i d i ηο-2-pheny 1 i ndo 1 e ) , HEX, TET, Dabsyl 및 FAM)， 발광 표지， 화학발광 (chemi luminescent ) 표지， FRET( f luorescence resonance energy transfer ) 표지 또는 금속 표지 (예컨대 , 금 및 은)이다.

검출 가능하도록 표지화된 단백질 항원 또는 후보 항체를 이용하는 경우， 단백질 항원과 항체 사이의 결합은 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어， 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, BCIP(bromochloroindolylphosphate), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프틀 -AS-B1-포스페이트 (naphtho卜 AS-Bl-phosphate) 및 ECF(enhanced chemi fluorescence)와 같은 발색반웅 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프를， 아미노에틸카바졸， 디아미노벤지딘， D-루시페린， 루시게닌 (비스 -N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약 (10-아세틸 -3，7-디하이드록시페녹사진， Pierce), HYR ( p-pheny 1 ened i am i ne-HC 1 and pyrocatechol ) , TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazol ine sulfonate]), 0PD( ophenyl ened i amine) 및 나프를 /파이로닌와 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 택일적으로， 분석대상 항체의 단백질 항원과의 결합 여부는 상호작용물 (interactants)의 레이블링 없이 분석할 수도 있다. 예를 들어， 마이크로피지오미터 (microphysiometer)를 이용하여 분석대상의 항체가 단백질 항원에 결합하는 지 여부를 분석할 수 있다. 마이크로피지오미터는 LAPS( light-addressable potent iometr ic sensor)를 이용하여 세포가 그의 환경을 산성화하는 속도 (acidifying rate)를 측정할 수 있는 분석 도구이다. 산성화 속도의 변화는， 후보 항체와 단백질 항원 사이의 결합에 대한 지시자 (indicator)로 이용될 수 있다.

단백질 항원에 대한 후보 항체의 결합 능력은 실 -시간 (rea卜 time) 이분자 상호작용 분석 (BIA)를 이용하여 분석할 수 있다. BIA는 상호작용물 (interactants; 예컨대， BIAcore™)의 레이블링 없이 실-시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술이다. 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실 -시간 반응에 대한 지시자 (indicator)로 이용될 수 있다.

【유리한 효과】

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 면역증진용 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 재조합 람블편모층 결합 면역글로블린 단백질은 수지상 세포의 사이토카인 생산 및 수지상 세포의 성숙과 같은 면역반웅을 통해 면역 활성화를 크게 향상시키므로， 면역증진용 제제로서 유용하게 이용될 수 있을뿐만 아니라, 백신의 어쥬번트로서도 이용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 람블편모층 재조합 BiP 및 항 -GlBi p 항체의 형성을 나타낸 도이다. 도 la는 재조합 GlBi P는 히스티딘 태그을 이용하여 대장균에서 발현되었고， 탈론 (Talon) 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제되었고 이후 Coomass i e로 염색된 12% SDS-PAGE를 수행한 것을 나타내었다: ( 1) Coomass i e로 염색된 SDS-PAGE 젤, (2) 항-히스티딘 항체를 이용한 웨스턴 블롯 ( 1 : 5000 희석)， (3) 항-람블편모층을 이용한 웨스턴 블롯 ( 1 : 1000 희석) . 도 lb에서는 정제된 재조합 GlBiP는 병원성이 없는 랫트 복강 내 주사를 이용하여 다중클로날 항체를 제조하기 위해 항원으로서 사용되었고, 2주에 3번 주사 후， 혈청을 면역화된 ¾트로부터 수득하고， 수득된 항체의 역가를 검사하였다. 항 -GlBi P( l ; 2000 회석)을 이용한 람블편모층 추출물의 웨스턴 블롯을 수행하였다. SM은 단백질 사이즈 마커를 나타내고， 면역반응성 재조합 GlBiP 및 천연의 GlBiP는 화살표 및 화살표머리 (arrowhead)로 각각 나타내었다.

도 2는 재조합 GlBi P가 공동자극의 발현 및 MHCI I 분자의 발현을 촉발시킨다는 것을 나타내는 도이다.

도 3a-3d는 재조합 GlBiP 자극 마우스 수지상 세포에 의한 사이토카인 생산을 나타낸 도이다. 실험결과를 대표적인 3번의 실험의 평균士표준편차로 표현하였다.

도 4는 람블편모층 추출물로 자극받은 마우스 수지상 세포에 의한 사이토카인 생산을 나타낸다. 실험결과를 대표적인 3번의 실험의 평균士표준편차로 표현하였다.

도 5는 재조합 GlBi가 골수세포 유래 수지상 세포에서 사이토카인 생산을 유도한다는 것을 나타낸 도이다. 도 5a에서는 미성숙한 골수세포 유래 수지상 세포를 항 -TLR4 항체 또는 항 -TLR2 항체을 이용하여 1시간 동안 전-배양하였다. 상대적인 동종 IgG가 대조군으로 사용되었다. 상기 세포를 이후 재조합 GlBiP을 이용하여 16시간 동안 공배양하고, 배양 상등액을 TNF- α를 위해 분석하였다. 도 5b는 pFLAG-TU 를 이용하여 형질감염된 HEK293 세포가 추가적인 20시간 동안 재조합 GlBiP를 이용하여 자극 받았았고， 이후 루시퍼레이즈활성을 측정하기 위하여 용해되었다. 대조군으로, 폴라스미드 pFLAG-C V 또는 pFLAG-TLR2가 형질감염 실험에서 포함되었다. 도 5c는 야생형， 동질유전자 TLR4 넉아웃 및 동질유전자 TLR2 0 마우스 유래의 골수세포 유래 수지상 세포 및 TLR2 넉아웃 골수세포 유래 수지상 세포 유래의 골수세포 유래 수지상 세포를 분리시켰고, 이후 재조합 GlBiP로 처리하였다. 세포 배양 상등액을 사이토카인 ( IL-12 , TNF- Q 및 IL-6)의 생산을 분석하기 위하여 수득하였다. 양성 대조군으로, 골수세포 유래 수지상 세포를 LPS로 배양하였다. 실험결과를 대표적인 3번의 실험의 평균土표준편차로 표현하였다.

도 6은 재조합 GlBiP에 의해 유도된 사이토카인 생산이 MyD88- 의존적이라는 것을 나타내는 도이다. 도 6a는 야생형 BALB/c 마우스 및 동질유전자 MyD88 넉아웃 마우스의 대퇴골 및 정강뼈 유래의 골수세포 유래 수지상 세포는 수지상 세포로 분화되었다. 미성숙한 수지상 세포는 16시간 동안 0. 1-10 mg/mL에서 rGlBiP에 대해 지시된 농도에서 및 LPS에 대해 0.5 mg/mL에서 다음 자극을 이용하여 자극받았다. 도 6b는 재조합 GlBiP에 의해 자극받은 THP-1 세포에서 항 -TLR4 항체를 이용한 MyD88의 공동- 면역침강법을 나타낸 도이다. THP-1 세포의 용해물을 2시간 동안 재조합 GlBiP를 이용하여 배양하였고 항 -TLR4 또는 항 -MyD88 항체와 반응시켰고 이후 단백질 G 세파로오스 (Protein G Sepharose) 비드로 침강시켰다 ( i画 unoprecipi tat ion : IP) . 면역침전물에서 단백질을 항 -MyD88 또는 항 -TLR4를 이용하여 웨스턴블롯 (WB)에 의해 분석하였다.

도 7은 수지상 세포에서 재조합 GlBiP에 의해 유도된 사이토카인 생산의 역할을 나타낸 도이다. 도 7a의 억제자는 ERK1-특이적 억제자 (PD98059)이고, 도 7b의 억제자는 p38-특이적인 억제자 (SB202190)이다.

도 8은 재조합 GlBiP로 자극된 재조합 GlBiP에서 NF- κ Β 및 AP-1의 중가된 결합 활성화를 나타낸 도이다. 핵추출을 미성숙한 수지상 세포로부터 제조하였다. 핵 추출물 중 3개의 미생물은 바이오틴 -11UTP- 표지된 NF- κ Β 을리고뉴클레오타이드 (도 8a) 또는 AP-1 올리고뉴클레오타이드 (도 8b)를 이용한 결합 어세이를 위해 이용되었다. 상대적인 양의 비표지된 올리고뉴클레오타이드를 결합의 특이성을 측정하기 위해서 결합 반응에 첨가하였다. 세포를 또한 양성 대조군인 LPS를 이용하여 처리하였다.

도 9는 GlBiP에서 수지상 세포 활성화를 위한 기능적 도메인의 맵핑 (mapping)을 나타낸다. 도 9a는 3개의 재조합 GlBiP 단백질의 계략도 (전장 재조합 GlBiP, 절단된 재조합 GlBiP-N 및 절단된 재조합 GlBiP-C)를 각각 나타낸다. 도 9b는 항 -람블편모층 항체를 이용한 상기 재조합 GlBiP 단백질의 웨스턴 블롯 분석 (1:1,000 dilution)을 나타낸 도이다. 도 9c는 재조합 GlBiP 단백질을 이용하여 자극 받은 마우스 수지상 세포에 의한 사이토카인 생산을 나타낸 도이다. 실험결과를 대표적인 3번의 실험의 평균士표준편차로 표현하였다.

도 10은 재조합 GlBiP에 의해 유도된 수지상 세포 활성화를 통한 T 세포에 의한사이토카인 생산을 나타낸 도이다.

도 11은 람블편모층으로 감염된 마우스 유래의 혈청을 이용한 람블편모충 추출물 및 재조합 GlBiP (전장 재조합 GlBiP = N, 재조합 GlBiP- N = C, 재조합 GlBiP-C = C, 각각 1 mg) 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 도이다 (E, 10 mg).

도 12는 항 -람블편모충 항체로 반응시킨 항원성 분자의 동정을 나타낸 도이다. 도 12a는 항 -람블편모층 항체를 이용한 람블편모층 추출물의 웨스턴 블롯을 나타낸 도이다. 항 -람블편모충 항체를 이용한 람블편모충 추출물의 웨스턴 블롯은 74 kDa 및 30 kDa에서 2 개의 주요한 면역반응성 밴드 및 63 kDa 및 25 kDa에서 부수적인 벤드를 보여주었다. 도 12b는 비바 -스핀 (Viva-spin) 컬럼을 이용한 람블편모충 단백질의 분획을 나타낸 도이다. 상기 비바 -스핀 컬럼은 분자량에 따라 단백질을 분리하는 초미세여과 (ultrafiltration) 장치이다. 웨스턴 블롯 분석은 항 -람블편모층 또는 전면역 혈청을 이용한 상기 분획된 단백질을 이용하여 형성되었다. 별표는 다음 라운드의 크로마토그래피를 위해 선택된 분획물을 나타낸다. 도 12c는 DEAE 세파로오스 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 람블편모층 단백질의 분획을 나타낸다 (1,000 kDa-100 kDa). 0.1 M NaCl-0.5 M NaCl로 용출된 단백질은 항 -람블편모층 항체 또는 전면역 혈청과 반웅하엿다. 별표는 다음 라운드의 크로마토그래피를 위해 선택된 분획물을 나타낸다. 도 12d는 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 람블편모층 단백질의 분획물 (0.2 M NaCl로 용출됨)을 나타낸 도이다. 0.1 M NaCl - 0.5 M NaCl로 용출된 단백질을 항 -람블편모층 항체 또는 전면역 혈청올 이용하여 반응시켰다. 74 kDa의 면역반응성 단백질 밴드 (화살표 머리)를 MALDI-T0F에 의해 분석하였다.

도 13은 재조합 GlBiP로 자극된 마우스 골수세포 유래 수지상 세포에서 사이토카인 생산에 대한 사이토카인 생산에 대한 폴리믹신 (polymyxin) B의 효과를 나타낸다.

【발명을실시를 위한 형태】

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예

실험재료 및 실험 방법

1. 람블편모층 영향형 ( . /aw /a trophozoite)의 배양

람블편모충 GS 유래의 영양형 (ATCC50581, American Type Culture Collection, Mannassas, VA) 균주 유래의 영양체를 TYI-S-33 배지에서 72시간 동안 배양하였다 (2% casein digest, 1% yeast extract, 13 glucose, 0.2% NaCl, 0.2% L-cysteine, 0.02% ascorbic acid, K2HP04 , 0.06% H2P04, 10% calf serum, and 0.05 mg/mL bovine bile, pH 7.1).

2. 항 -람블편모층 영양체 추출물의 제조 및 항 -람블편모층 항체의 형성

람블편모층 GS 영양체를 용해 버퍼 (PBS: 137 mMNaCl , 1.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HP0 ₄ 및 2 mM ¾P0 ₄ , pH 7.3)에서 리서스펜션 (resusupension)을 수행하였고, 음파처리 (sonication)로 용해하였다. 단백질 추출물을 800g 에서 5 분 동안 원심분리를 하여 제조하였다. l( ig 의 추출물을 0.1 ml 의 완전한 프로인트 보조제 (Freund adjuvant)를 이용하여 흔합하였고 (Sigma, St. Louis, M0), 복강내로 무병원체성 마우스 내로 주입하였다 (BALB/c 마우스， 6 주령 암컷). 1 차 면역 후 2 주 및 4 주에서 두 개의 추가적인 예방 주사를 불완전한 프로인트 보≤제와 흔합된 동일한 양의 단백질을 이용하여 수행하였다. 3 차 면역한지 1 주 후， 혈청을 면역화된 마우스로부터 수득하였고 웨스턴 블롯 분석을 이용하였다. 3. 크로마토그래피를 이용한 람블편모층항원 단백질의 분획 차등적 컷오프값 (1,000 kDa초과， 1,000 - 100 kDa, 100 - 10 kDa 및 10 kDa 미만)을 갖는 람블편모충 영양체로부터 제조된 단백질 추출물을 4 개의 비바 스핀 (Viva— spin, Sartor ius-StedimBiotech, Goet t i ngen , Germany)을 이용하여 분획하였다.

1,000-100 kDa 의 컷오프값을 갖는 비바 스핀 멤브레인 (membrane)을 통과했던 단백질을 DEAE 세파로오스 빠른 유속 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden) 이은 교환 칼럼 (volume 15x1 cm)을 이용하여 결합 버퍼 (20mM Tris-HCl, pH8.5)로 평형을 맞춘 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 연속적으로 분획화하였다. 컬럼에 결합한 단백질을 0.1M 에서 0.5 M 까지 NaCl 의 농도를 중가시키면서 용출하였다. 각각의 분획물을 상술한 항 -람블편모충 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

각각의 분획물을 항-람블편모충을 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 0.2M NaCl 을 이용하여 용출된 단백질 분획물을 20m MTris-HCl, pH 8.5 을 이용하여 평형을 맞춘 40 ml Sephacryl S-200 고해상도 컬럼 (GE Healthcare Bio-Sciences AB) (volume 50 x 1 cm)에 적용하였다.

각각의 분획물의 단백질 농도를 브래드포드 어세이에 의해 측정하였다 (Biorad, Hercules, CA). 각각의 정제단계로부터 수득된 분획물을 SDSPAGE 에 의해 분리하였고 폴리비닐리덴 풀로라이드 (polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인 (Mi 11 ipore, Billerica, MA)에 옮겼다. 멤브레인을 블로킹 (blocking) 용액 (1:1,000 dilution, PBS with 5% skim milk, and 0.05% Tween 20)에서 폴리클로날 마우스 항 -람블편모충 항체를 이용하여 배양하였고, 알칼라인 포스파테이즈 (alkaline phosphatase, AP)-결합 랫트 항—마우스 IgG(Sigma) (1:1000 회석)를 처리하였다. 면역반웅성 단백질을 나이트로- 블루 테트라졸리움 (nitro-blue tetrazolium, NBT)/5-브로모 -4-클로로 -3- 인돌일포스페이트 (BCIP) 시스템 (Promega, Madison, WI)을 이용하여 가시화하였다.

4. 람블편모층의 면역반웅성 단백질의 MALDI-T0F분석

용출된 젤 여과 크로마토그래피 분획물에서 74 kDa 의 면역반웅성 단백질을 절개하고 트립신을 이용하여 젤 내에서 분해 (in-gel digestion) 처리하였다 (Sigma). 소화된 생성물을 MALDI-TOF MS 뿐만 아니라, 4 중극 TOFCquadrupole TOF, Q-TOP)에 의해 분석하였다. 이온 스펙트럼 생성물을 정보-의존적 인식 (information-dependent acquisition, IDA) 모드에서 수집하였고， Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOP MS을 이용하여 분석하였다. Q-T0P 액체 크로마토그래피 -이중 질량분석기 (LC-MS/MS) 데이터 세트를 위해 이중 질량분석 스펙트럼을 본 발명의 마스코트 인하우스 데이터베이스 연구 엔진 (GiardiaDB)에 제출하였다. 100 ppm 및 0.2 Da 의 질량스펙트럼의 분자량 오차범위는 각각 전구체 이온 및 토막 이온을 위해 이용되었다. 37 초과의 마스코트 이온 스코어를 단백질 동정을 위한 기준으로 이용하였다.

5. 재조합 GlBiP단백질의 형성

bip0RFGL50581_3283 를 포함하는 A2,034-bp 의 DNA 단편을 2 개의 프라이머, 즉， 프라이머 rBiP_F(5' -CCGGAATTCGATGACGTCTAGTCGCGTTAA-3 ' ： 밑줄친 옆기는 EcoRI 위치를 나타냄) 및 프라이머 rBiP_R(5' - CCGCICGAGGAGCTCATCTTTCTCTGCAT-3 ' ： 밑줄친 염기는 Xhol위치를 나타냄)을 이용하여 중폭하였고， 이후 pET21b (+) 발현 백터 (Novagen, Darmstadt, Germany) 내로 클로닝을 하였다.

또한, bip 0RF 를 포함하는 DNA 단편을 2 부분으로 분해하였다. bip 의 5' -부위 (1,280 bp)를 상기 프라이머， 즉, 재조합 BiP-F(5' - CCGGAATTCGGGTGCGAAGGATCATGATGT-3 ' ： 밑줄친 염기는 부위를 나타냄) 및 재조합 BiP-NR (5' -CCGCTCGAGGCTAAGGATGGAGGCCTGCA-3 ' ： 밑줄친 염기는 Xhol 부위를 나타냄)를 이용한 PCR 에 의해 람블편모층의 게놈 DNA 로부터 증폭하였다. bip 의 3' 지역 (754 bp)을 또 다른 세트의 프라이머， 즉, rBiP-CF (5' -CCGGAATTCGGGTGCGAAGGATCATGATGT-3 ' ： EcoRI 부위를 나타냄) 및 재조합 ^11^을 이용하여 중폭하였다. 수득한 bip DNA 단편을 절단된 재조합 GlBiP 폴리펩타이드를 위한 과발현 플라스미드, 즉, pETBiP-N 및 pETBiP-C 를 생성하기 위하여 pET21b(Novagen) 내로 클로닝을 하였다. 상기 재조합 GlBiP 를 1 mM 의 IPTG(isopropyl thio-β -D-galactoside)를 첨가함으로써 E.coUl BL2UDE3)에서 과발현하였고， 매뉴얼에 따라 Talon 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (Clonetech, Mountain View, CA) .

6. 재조합 GlBiP 활성을 측정하기 이전의 폴리믹신 (polymyxin) B 를 이용한 엔도톡신의 제거

재조합 GlBiP 에 의해 유도된 수지상 세포의 성숙은 제조된 단백질에서 오염을 일트키는 엔도톡신에 기인하는 것이 아니라는 것을 확인하기 위하여 폴리믹신 B(Sigma)(PmB)로 수지상 세포의 전처리를 수행하였다. 수지상 세포를 500 ng/mL LPS 또는 100 ng/mL 재조합 GlBiP 를 이용한 반응 전에 1 g/niL PmB 로 상온에서 1 시간 동안 전배양하였다. 16 시간 후， 골수세포 유래 수지상 세포의 상등액에서 TNF-α , IL-12 및 IL-6 수준을 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 이후 실험에서 , 재조합 GlBiP의 박테리아 LPS 오염을 배제하기 위해 세포를 F½B(1 ug/mL)를 이용하여 1 시간 동안 전배양하였다. 또한， Limulus ½ebocyte Lysate LPS Detection Kit(Lonza, Basel, Swi tzer land)에 의해 측정하였을 때， LPS 오염이 1.5 EU/mL(l EU = 100 pg) 미만이었다는 것을 확인하기 위하여 재조합 GlBiP 단백질을 정제하였다. LPS 로 오염된 단백질 샘플을 Detoxi-GelTM 엔도톡신 제거 젤 (Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 추가로 정제하였다.

7. 폴리클로날항 -GlBiP의 제조

무병원균 랫트 내로 복강내 주사를 통해 폴리클로날 항체를 생산하기 위한 항체로 정제된 재조합 GlBiP 를 이용하였다 (CrjBgi : CD[S.D.]IGS, 6- weeks-old, females). 2 주 간격으로 3 번의 주사 후, 혈청을 면역화된 ¾트로부터 수득하였고 수득된 항체의 티터 (titer)를 시험하였다. 백 나노그램의 재조합 GlBiP 를 12% SDS-PAGE 에 의해 분리하였고 나이트로셀를로오스 멤브레인에 옮겼다. 멤브레인을 항 -람블편모층 항체 (1:1,000 희석) 또는 항 -GlBiP 항체 (1:2,000 회석)， 이어서 AP-결합된 랫트 항-마우스 IgG 를 이용하여 배양하였다. 면역반웅성 단백질을 상술한 바와 같이 검출하였다.

8. 실험용마우스

BALB/c 마우스를 OrientBio(Seoul, Korea) 및 TLR2 넉아웃 (K0)(TLR2/), TLR4 K0 TLR4/)로부터 수득하였고， 골수성 분화 인자 88(MyD88) 넉아웃 (MyD88/) 마우스를 아키라 박사 (S. Akira)에 의해 제공된 BALB/c 마우스로부터 수득하였다 (Department of Host Defense, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University.' Japan) . 동물들은 연구기관의 지침 및 한국의 법정준비소요액에 따라 인도적인 보살핌을 받았다.

9. 수지상 세포의 분리 및 배양

골수세포 유래 수지상 세포를 BALB/c 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 제조하였고 적혈구 용출 버퍼에서 리서스펜션을 수행하였다 (150 mM NH4C1 , 10 mM KHC03, and 1 mM EDTA, pH 7.4). 원심분리 후， 세포를 100 U/mL 의 페니실린 /스트렙토마이신 (GIBC0, Karsruhe, Germany)으로 보층된 골수세포 유래 수지상 세포 (BMDC) 내로 분화시켰고 , 10% FBS, 50 μΜ 의 메르캅토에탄올 (mercaptoethanol), 0.1 mM의 비필수 아미노산 (Sigma), 1 mM HEPES 버퍼 및 20 ng/mL 의 과립대식세포집락자극인자 (granulocyte- macrophages colony-stimulating factor (GM-CSF: JW CreaGene , Seongnam , Korea))를 2 일 마다 RPMI1640 배지에서 보층하였고 37 ^° C, 5% C0 ₂ 존재 하에서 배양하였다. 6 또는 7 일간의 배양일 동안， 미성숙한 골수세포 유래 수지상 세포를 추가실험을 위해 수득하였다.

10. 세포 표면 표현형의 유세포 분석 (Flow cytometric analysis) 미성숙한 골수세포 유래 수지상 세포를 16 시간 동안 재조합 GlBiP(0.1 to 5 μ g/mL) 또는 람블편모층 추출물 (50 yg/mL)로 처리하였다. 이후, 세포를 수득하였고， PBS 로 세척하고 라이브 /데드 고정가능 사멸세포 염색 키트 live/dead f ixable dead cell stain kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 죽은 (염색된) 세포의 퍼센트 비율을 측정하기 위해서 얼음 위에서 20 분 동안 염색하였다. 이후， 세포를 PBS 로 세 번 세척하고 페리디닌 클로로필 (PerCP)-Cy 5.5-결합 항-마우스 I-A/I-E(MHC class II) 알로피코시아닌 (allophycocyanin, APC)-결합 항 -CD80 및 피코에리트린 (phycoerythrin, PE)-결합 항 -CD86 및 APC-eFk r780-결합 항- CDllc를 이용하여 얼음 상에서 20분 동안 염색하였다. 세포를 PBS로 세 번 세척하고 500 yL 의 FACS(f luorescence-activated cell sorter)에서 리서스펜션을 수행하였다 (PBS, 1% BSA, and 0.1% sodium azide). 형광을 유세포 분석기로 측정하고, 실험데이터를 FlowJo 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

11. 사이토카인 농도의 측정

미성숙한 마우스 수지상 세포를 48 웰 배양 플레이트에서 분주하고 람블편모층 추출물 (50yg/mL), 재조합 GlBiP (0.1-10 yg/mL) 또는 LPS(0.5 yg/mL)를 이용하여 16시간 동안 배양하였다. 상등액을 TNF- α , IL-12, IL- 6 및 IL-4를 검출하기 위해 샌드위치 ELISA에 의해 매뉴얼 (BD Biosciences, Franklin Lakes' NJ)에 따라 분석하였다.

12. 항체 블로킹 실험

쥐의 골수세포 유래 수지상 세포를 재조합 GlBiP 로 처리된 5 yg/mL 의 마우스 TLR4 단일클론 항체 (BioLegend, San Diego, CA), 마우스 TLR2 단일클론 항체 (BioLegend) 또는 동종 대조군 IgG 항체 (BioLegend)를 이용하여 RPMI 1640 무혈청 배지에서 1 시간 동안 전배양하였다. 자극을 이용하여 16시간 후， 상등액을 ELISA을 위해 수득하였다. 13. NF-κΒ리포터 어세이

형질감염 하루 전에， HEK293 세포를 12 웰 배양 플레이트 상에서 1 x 10 ⁵ 세포로 폴레이팅을 수행하였다. 분주된 세포를 0.5ug 의 NF- KB 루시퍼레이즈 플라스미드 [pGUL8p-luc+](27), 5ng 의 pCHllO(Promega) 및 O.lug 의 pFLAG-TLR2(28) 또는 pFLAG-TLR4(28)를 이용하여 일시적으로 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)에 의해 형질감염시켰다. 대조군으로， pFLAG-CMVl(Invitrogen)을 pFLAG-TLR2 또는 pFLAG-TLR4 대신에 형질감염시켰다. 형질감염한지 24 시간 후， 세포를 PBS 없이 재조합 GlBiP(lyg/mL) 또는 LPS (0.5pg/mL)를 이용하여 6 시간 동안 자극시켰다. 루시퍼레이즈 활성을 Dual-Lucif erase Reporter Assay System(Promega)를 이용하여 매뉴얼에 따라 측정하였다.

14. 세포주의 배양

인간 배아 신장 세포， HEK 293 (CRL- 1573； American Type Culture Collection)를 4.5 g/L 포도당, 10% 열로 불활성화된 소태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 100 U/mL 페니실린， 100 ug/mL 스트렙토마이신 및 10 ug/mL 블라스티시딘 (blasticidin S, InvivoGen, San Diego, CA)로 보충된 DMEM 에서 배양하였다. 인간 단핵세포주， THP-KTIB-202; American Type Culture Collection)를 37 ^° C， 5% CO2건조 대기， RPMI-1640(Sigma) 조건에서 배양하였다. 15. 공동면역침강법 (Coimmunoprecipitation)

재조합 GlBiP 로 배양된 THP-1 세포를 용해 완충액 (10 mM TrisHCl , ρΗ 7.4, 5 mM EDTA, 130 mM NaCl, 1% Triton X— 100， 1% 4-amidino-phenyl- methylsul fonyl fluoride, and 1% protease inhibitor)에서 파괴하고, 4 ^° C에서 하룻밤 동안 항 -TLR4 단일항체 Absor 항 -MyD88 단일클로날 항체 (Cell Signaling, Beverly, MA)를 이용하여 배양하고， 이후 단백질 G 아가로오스 비드를 이용하여 4 ^° C 에서 4 시간 동안 침전시켰다. 침전된 단백질을 이후 항 -TLR4 또는 항 -MyD88 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다 (Cell Signaling). 16. 재조합 GlBiP로 처리된 수지상 세포에서 MAPK경로의 억제

MAP 의 관련성을 연구하기 위해서, 미성숙한 수지상 세포를 무혈청 RPMI 1640 배지에서 억제자를 이용하여 16 시간 동안 전처리하였다. 약제학적 성분을 Calbiochem( Darmstadt, Germany)으로부터 구입하였다. 모든 억제자들을 DMS0 에서 용해시켰다. 억제자들을 다음 농도에서 이용하였다: 0.1-1 의 SB 202190(선택적 p38 억제자) 또는 PD98059(선택적 ERK1/2 억제자) 및 0.2-2 JNK 억제자 11(선택적 JNK 억제자). 억제자를 이용한 모든 실험에서， 시험된 농도는 배양 부피의 1%를 초과하지 않았고 수지상 세포의 생존능력에 영향을 주지 않았다.

17. 핵 추출물의 제조 및 젤 이동성 분석 (elect rophoretic mobility gel shift assay, EMSA)

24 웰 배양 플레이트로 분주된 마우스 골수세포 유래 수지상 세포를 다양한 시간 (3-60 분)으로 재조합 GlBiP 를 이용하여 자극하고, 이후 핵 추출물을 위해 처리하였다. 요약해서 , 세포를 100 용해 완층액 [10 mM HEPES, 10 mMKCl , 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, and 1 mM dithiothreitol (DTT)]에서 15 분 동안 얼음 상에서 용해하고 12.5 의 10% Nonidet P-40 을 세포에 첨가하였다. 4 ^° C, 20,000g 에서 8 분 동안 원심분리 후， 핵 펠렛을 25 의 얼음처럼 찬 핵 추출물 버퍼에서 리서스펜션하고 간헐적인 교반으로 15 분 동안 얼음에서 유지하였다. 이후 샘플을 4 ^° C 얼음에서 5 분 동안 원심분리하고, 결합 어세이까지 상등액을 -70 ^° C 에 저장하였다. 바이오틴ᅳ 표지된 프로브 (100 mM Tris, 500 mM KCl 및 10 mM DTT, pH 7.5)를 이용하여 결합 어세이를 핵 추출물 결합 버퍼 (100 mMTris, 500 mMKCl 및 10 mM DTT, pH 7.5)에서 수행하였다. 센스 가닥 올리고뉴클레이타이드의 서열은 다음과 같다: NF-κΒᅳ 5' -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 ' (Pr omega) 및 AP-1, 5' - CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3 ' (Pr omega) . 단백질 -DNA 복합체를 0.5xTr is/Boric acid/EDTA (TBE) 버퍼에서 4 ^° C, 6% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하고， 나일론 멤브레인에 옮겼다. UV-가교결합된 멤브레인을 스트랩토아비딘-서양고추넁이 퍼옥시데이즈 결합 (Pierce)를 이용하여 처리하고， 이후 DNA 밴드를 검출하기 위하여 Light-Shift Chemi luminescent EMSA 키트 (Pierce)를 이용하여 X_레이 필름에 노출시켰다. 또한， 핵 추출물을 다양한 시간 동안 0.5 /ml LPS 로 자극된 골수세포 유래 수지상 세포로부터 제조하고, 결합 어세이 동안 양성 대조군으로 이용하였다.

18. 혼합된 림프구 반웅

미접촉 (naive) T-세포를 BALB/c 마우스 비장으로부터 제조하였다. 비장세포를 적혈구 완층액에서 용해하였다. CD4+ T 세포를 autoMACSCmagnet i c-act ivated cell sorting) 분리기에서 CD4(L3T4) MicroBeads(Miltenyi Biotec, Auburn , CA)를 이용하여 분리하였다. 1 yg/mL 의 재조합 GlBiP 로 처리된 수지상 세포를 24 시간 동안 CD4+ T 세포를 이용하여 1:10 의 수지상 세포: T 세포 비율에서 공동 배양하였다. 공동 배양 중 3 일째에, 상등액을 IL-2 생산을 위하여 ELISA 에 의하여 수집하고 분석하였다 (Centrell DA & Smith KA, Science 1984； 224： 1312- 1316). 또한， 상등액을 Thl 분극 (polarization)를 검사하기 위하여 IFN- γ로 분석하였다 (Bradley LM, Dal ton DK SCroft M, J I睡 unol 1996； 157： 1350-1358) . . 19. 마우스 감염 어세이

람블편모층 (균주 GS ATCC50581)를 상술한 바와 같이 감염을 위하여 이용하고 배양하였다. BALB/c 마우스를 PBS(phosphate-buffered saline)의 람블편모층 영양체에서 5 X 105G로 위관영양법에 의해 감염시켰다. 2주 및 4 주 간격으로, 혈청을 감염된 마우스로부터 수득하고 람블편모충 또는 재조합 GlBiP 단백질의 용해물을 웨스턴 블롯 분석을 위해 이용하였다.

20. 통계분석

실험결과를 대표적인 3 번의 실험의 평균士표준편차로 표현하였다. 실험데이터를 Student' s t-test(SYSTAT program, SIGMAPL0T version 9； Systat Software Inc. , Chicago, IL, USA)를 이용하여 쌍으로 비교에 의하여 분석하였다. P-값이 으 05 미만이면， 편차를 유의하게 고려하였다. 0.01 미만의 P 값을 갖는 실험데이터는 2 개의 별표로 나타내고 0.01 및 0.05 사이의 P-값을 갖는 실험데이터를 하나의 별표로 나타내었다ᅳ [실험 결과]

1. 람블편모층의 항원 단백질로서 결합 면역글로블린 단백질 (binding immunoglobul in protein, BiP)의 동정

본 발명자들은 람블편모층의 항원 분자를 동정하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 람블편모충 추출물을 항원으로서 이용하여 다중클로날 항체 (항 -람블편모층 항체 )를 제조하였다. 제조된 항체와 람블편모층 추출물의 면역블로팅은 74 및 30 kDa의 두 개의 주요한 면역반웅성 밴드와 , 62 및 25 kDa 의 두 개의 부수적인 면역 반웅성 단백질을 각각 보여주었다 (도 12a) . 이후, 람블편모충 추출물을 3 가지의 절차를 이용하여 분획하고， 본 발명자들은 74 kDa 의 단백질이 항-람블편모층의 강한 면역을 나타낸다는 것을 동정하였다. 1000 kDa 초과 및 1000-100 kDa 의 컷오프 (cut-of f )값을 갖는 세포막을 이용하여 비바 스핀 (Viva spi n) 원심분리를 통해 수득된 웨스턴 블롯 (Western blot )의 분석은 74 kDa 의 면역반응성 단백질이라는 것을 밝혀내었다 (도 12b) .

대조적으로， 상기 면역반응성 밴드는 면역반응전 혈청 분획물의 웨스턴 블롯 분석에서 존재하지 않았다. 100-10 kDa 의 컷오프값을 갖는 세포막을 이용하여 비바 스핀 원심분리를 통해서 수득된 분획물은 15 kDa의 면역반응성 단백질의 면역 반응성 밴드를 나타냈다 . 74 kDa 를 포함하는 상기 두 벤드 중에서 본 발명자들은 이후의 분획과정을 위해 1 , 000-100 kDa 의 컷오프값을 갖는 세포막을 통해서 비바 스핀 원심분리로부터 수득된 분획물을 선별하였다. 상기 분획물의 DEAE 세파로오스 ( sepharose) 양이온 교환 크로마토그래피는 74 kDa 의 면역반웅성 단백질을 포함하는 두 가지 분획물을 야기하였고， 상기 단백질들을 0.2 또는 0.3 M NaCl 를 이용하여 용출하였다 (도 12c) . 0.2 M NaCl 에 의해 용출된 단밸질은 20 mM Tr i s-HCl , pH 8. 5 을 이용하여 평형을 이룬 젤 여과 컬럼 상에 층진되었고 이후 0.2 M NaCl 을 이용하여 용출되었을 때， 용출된 단백질 (분획물 번호 #22 내지 #30)은 람블편모층 항체에 대한 면역반웅을 입증하였다 (도 12d) .

74 kDa 의 단백질 밴드를 잘라내어， LC-MS/MS 로 분석하였다. 단백질의 LC-MS/MS 분석을 이용한 데이터베이스 분석은 상기 단백질이 람블편모층의 결합 면역글로블린 단밸질 (Bi P) 상동체 (GL50581_3283) ( sequence coverage , 36%： MASCOT score , 1227)였다는 것을 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 Bip 가 이후 실험에서 람블편모충에서 검출한 74 kDa 의 면역반웅성 단백질에 해당하는 지를 조사하였다.

2. 람블편모충의 74 kDa인 면역성 단백질로서 GlBiP의 확인

GlBiP 가 항—람블편모층 항체와 반응한 74 kDa 의 단백질인지를 결정하기 위하여, 람블편모층의 Bip 를 대장균 (£. α?//)에서 재조합 단백질로서 발현시켰고， 수득된 람블편모층의 BiP 를 정제하였다. 정제된 재조합 GlBiP 를 본 발명자들이 항-람블편모충은 분획 실험을 통해서 동정하기 위해 사용했던 항-람블편모충이 항 -람블편모층 항체와 반응한다는 사실이 발견되었다 (도 la). 이후 상기 정제된 재조합 GlBiP 를 래트에서 특이적인 다중클로날 항체를 제조하기 위한 항체로서 사용하고， 수득된 항- GlBiP 항체의 특이성을 람블편모층 영향형 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 즉， 람블편모층의 타고난 BiP 가 명백히 74 kDa 의 면역반응성 밴드로 검출되었다 (도 lb). 3. 재조합 GlBiP 에 의한 수지상 세포 성숙 및 염증전 사이토카인 분비의 유도

수지상 세포는 병원균을 인지하고 결과적으로 적절한 T 세포를 활성화시키는 국소 림프절로 이동하는 전문적인 항원제공 세포 (antigen- presenting cells, APC)이다. 본 발명자들은 GlBiP 가 수지상 세포의 성숙을 유도할 수 있는지를 검사하였다. GlBiP의 면역촉진성 활성을 측정하기 위한 어세이를 수행하기 전에， 본 발명자들은 LPS 에 대해 대립하는 화합물인 PmB 를 이용하여 마우스 골수유래 수지상 세포 (bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)를 전처리하였고, 0.1 μ g/mL 재조합 GlBiP 의 존재하에서 24 시간 동안 세포를 배양하였다 (도 13). 재조합 rGlBiP 의 결함을 갖는 수지상 세포에서 TNF-α의 수준은 ΡηιΒ 치료에 의한 영향을 받지 않은 반면， TNF- CL의 생산은 LPS 로 처리된 수지상 세포에서 PmB 에 의해 급격하게 영향을 받았다. 따라서， 수지상 세포는 이후 실험에서 LPS 의 면역학적 활성을 억제하기 위하여 LPS 로 처리된 수지상 세포에서 1 μ g/mL에서 PmB로 전처리되었다 ,

이후 실험에서, 본 발명자들은 수지상 세포 활성에 대한 3 개의 마커， 즉 CD80, CD86 및 MHC 클래스 II 의 발현을 조사하였다 (도 2). 골수세포 유래 수지상 세포를 0.1 내지 5 pg/mL 범위의 다양한 재조합 GlBiP 의 존재하에서 24 시간 동안 배양하고， 이후 상기 표면 마커의 발현에 대해 분석하였다. 표면 마커 MHCII 를 발현하는 세포의 퍼센트 비율은 소량 (0.1 μ g/mL) 및 다량 (5 μ g/mL)의 재조합 GlBiP 로서 급격하게 증가하지 않았다 (51% 내지 68%). 따라서， 골수세포 유래 수지상 세포를 하기 실험에서 0. 1 ii g/mL 의 재조합 GlBiP 를 이용하여 처리하였다. MHC 클래스 I I 의 발현을 보여주는 세포의 퍼센트 비율은 재조합 GlBiP 로 처리한 반웅에서 28% 내지 65%까지 증가하였다. 재조합 GlBiP 을 이용한 자극에서， 공동자극 (cost inml atory) 분자, 즉 CD86 및 CD80 를 발현하는 세포는 또한 각각 21% 내지 59% 및 25% 내지 61¾>로 증가하였다. 수지상 세포 활성화에 대한 양성 조절로서, LPS(0.5 y g/mL)가 골수세포 유래 수지상 세포를 자극시키기 위해 이용되었고, 골수세포 유래 수지상 세포에서 MHC 클래스 1 1 (53%)와 두 개의 공동자극 마커， CD86(59« 및 CD80 (49«를 향상시킨다는 것을 발견하였다. 상기 결과는 람블편모층 BiP 가 LPS 만큼 효율적으로 수지상 세포의 활성화를 유도하였음을 보여준다.

활성화된 수지상 세포는 사이토카인을 분비하고, 상기 사이토카인은 면역반응에서 중요한 역할을 한다 (Moser M & Murphy KM, Nat I國 unol 2000； 1 : 199-205) . 마우스 골수세포 유래 수지상 세포는 다양한 농도의 재조합 GlBiP 을 이용하여 자극받았고 (0. 1-10 μ g/mL) , 이후 IL— 12， TNF- α , IL-6 및 IL-4 분비에 대해 분석되었다 (도 3) . 재조합 GlBiP 는 대조군 세포 보다 높은 수준의 TNF- α , IL-12 및 IL-6 를 분비하였다. 특히， 재조합 GlBiP 에 결함이 있는 수지상 세포는 용량 의존적 방법으로 매우 다량의 IL- 12(70 , 900 pg/mL)를 분비하였다. 상당한 양의 TNF- a 및 IL-6 가 또한 GlBiP 가 처리된 수지상 세포에 의해 분비되었다 (70 , 900 pg/mL) . 상당한 양의 TNF- ci 및 IL-6 가 또한 재조합 GlBiP 이 처리된 수지상 세포에 의해 각각 분비되었다 ( 1， 098 및 2， 322 pg/mL) . 그러나, TNF- a 및 IL-6의 수준은 고농도의 재조합 GlBiP에서 감소하였다. 1 1-4(79 pg/mL)는 재조합 GlBiP가 처리된 수지상 세포에서 거의 검출되지 않았다. 예상대로, 유의한 양의 IL- 12， TNF- a , 및 IL-6 가 LPS 가 처리된 수지상 세포에 의해 분비되었다. 람블편모층에 대한 반응에서 생산된 사이토카인 프로과일은 람블편모층에 의해 유도된 수지상 세포 활성화가 Th-1 유형 면역 반웅을 유도한다는 가능성을 향상시켰다. 4. 람블편모충 추출물에 의한 마우스 골수유래 수지상 세포 (bone marrow-derived dendri t ic eel Is , BDDC)의 성숙 본 발명자들은 람블편모층 추출물이 골수세포 유래 수지상 세포의 성숙을 유도할 수 있다는 것을 조사하였다 (도 4) . 마우스 골수세포 유래 수지상 세포를 50 u g/mL 에서 람블편모충와 경쟁시켰을 때， MHC I I 표면 마커 발현하는 세포의 퍼센트 비율은 40% 내지 58%까지 증가하였다. 람블편모충 추출물을 이용한 자극의 경우， 공동자극성 분자， 즉 CD86 및 CD80 를 발현하는 세포는 각각 40% 내지 92% 및 70% 내지 92%까지 증가하였다. 또한， 람블편모층 추출물로 자극 받은 세포는 람블편모충이 수지상 세포 활성화를 유도한다는 것을 나타내는, 유의한 수준의 TNF- Q ( 129 pg/mL) 및 IL-12 (7 , 980 pg/mL)를 분비하였다 (도 4) .

5. 수지상 세포에 의해 GlBiP-유도된 사이토카인 생산에서 TLR4 의 역할

본 발명자들은 람블편모층의 BiP 단백질이 인지하는 방법 및 상기 인지방법이 수지상 세포의 활성화 및 사이토카인 생산을 야기하는 방법를 연구하였다. 특히， 본 발명자들은 수지상 세포에 의해 재조합 GlBiP 로 유도된 사이토카인 생산에서 두 가지 Tol l 유사 수용기 (Tol l -l ike receptors , TLR)의 역할을 조사하였다 (도 5a) . 골수세포 유래 수지상 세포는 재조합 GlBiP 를 이용한 자극 전에 TLR2 또는 TLR4 에 특이적인 항체로 처리되었다. 대조군으로서， 골수세포 유래 수지상 세포의 또 다른 세트는 TLR 항체 대신에 아이소타입 ( isotype) 대조군 IgG 로 처리되었고， 이후 동일한 방법으로 재조합 GlBiP 를 이용하여 자극 받았다. 상기 재조합 GlBiP 가 손상된 수지상 세포는 TNF- α의 생산을 위해 분석되었다. TLR2 항체로 처리된 수지상 세포에서, 재조합 GlBiP 로 활성화된 수지상 세포는 아이소타입 IgG(2, 554 pg/mL; p= 0.852 , Student t-test )을 이용하여 전처리된 활성화된 수지상 세포와 유사한 수준의 TNF- a를 분비하였다. 대조적으로， TLR4 항체로 전처리된 세포는 아이소타입 IgG 로 처리된 단백백혈구와 비교해서 TNF- ci 생산에서 유의한 감소를 나타내었다 (482 g/mL) .

마우스 수지상 세포에서, 재조합 GlBiP 로 유도된 사이토카인 생산에서 TLR4 의 기능을 연구하기 위하여， 본 발명자들은 또한 HEK 293 세포를 이용한 in vitro시스템를 재구성하였고, 상기 시스템에서 TLR2 또는 TLR 4 가 공통된 어댑터 단백질 (adaptor protein) , 즉 MyD88 과 함께 발현되었다 (Medzhi tov R , Preston-Hur lbur t P , Kopp E , et al , Mol Cel l 1998； 2： 253-258. ) . 대조군으로서， HEK 293 세포의 또 다른 세트는 p ^' FLAG- TLR2 또는 pFLAG-TLR4 를 위한 공백터, pFLAG-CMVl 을 이용하여 형질감염되었다. 리포터 유전자를 이용한 사이토카인 생산을 모니터하기 위하여， 상기 시스템은 형질 감염 효율을 이용하여 노말화된 NF- κ Β에 대한 루시퍼레이즈 리포터를 포함한다. 사이토카인 생산을 유도하기 위한 재조합 람블편모충의 능력은 TLR4 를ᅳ발현하는 HEK 293 세포, TLR2을 발현하는 HEK 293 세포, 및 대조군 HEK 293 세포의 루시퍼레이즈 활성을 측정함으로써 모니터링 되었다 (도 5b) . LPS 또는 재조합 GlBiP 을 이용한 배양의 경우， pFLAG-CMV를 운반하는 HEK 293는 각각 57또는 26으로， 상대적으로 감소된 루시퍼레이즈 활성을 나타내었다. TLR2 를 발현하는 HEK293 세포는 재조합 GlBiP 가 아니라， 오직 LPS 와 반웅하여 루시퍼레이즈 활성에서 적절한 증가를 보여주었다 (루시퍼레이즈 활성에 상대적으로 80 내지 196) ) . 대조적으로， 재조합 GlBiP 또는 LPS 로 자극되는 경우ᅳ TLR4 를 발현하는 HEK 293 세포는 루시퍼레이즈 활성에서 유의한 증가를 보여주었다 (루시퍼레이즈 활성에 상대적으로 각각 771 및 636) .

다음 세트의 실험에서, 본 발명자들은 TLR4 넉아웃 마우스 모델을 이용한 수지상 세포에 의하여 재조합 GlBiP 에 의해 유도된 사이토카인 생산에서 TLR4 의 역할을 확인하였다 (도 5c) . TLR4-/- 마우스의 골수세포 유래 수지상 세포는 재조합 GlBi P 에 의해 유도된 IL-12 분비에서 급격한 감소 ( 12 pg/mL)를 나타낸 반면에， TLR2-/- 마우스의 골수세포 유래 수지상 세포는 재조합 GlBiP 에 대한 반웅에서 야생형 골수세포 유래 수지상 세포 (24 , 350 pg/mL)에 대한 IL-12 와 유사한 수준 (23 , 671 pg/mL)을 분비하였다. 재조합 GlBiP 를 이용한 골수세포 유래 수지상 세포의 자극의 경우， 야생형 세포 및 TLR2 결핍 마우스 유래의 세포는 향상된 TNF- a 생산을 입증한 (각각 719 및 682 pg/mL) 반면에， TLR-4 결핍 세포는 TNF- α를 생산하지 못하였다 (6 pg/mL) . 동일한 방법으로， 수지상 세포에 의한 재조합 GlBiP-처리 유도된 IL-6 생산은 야생형 및 TLR2-/- 마우스에서 수득되었다 (각각 6 , 792 및 7 , 139 pg/mL) . 대조적으로， TLR4-/- 마우스 유래의 세포는 예상대로 재조합 Gl BiP 에 의해 유도된 IL-6 분부의 일부 감소를 4 , 082 pg/mL 로서 나타낸 반면에 , LPS 및 TNF- α를 이용한 야생형 골수세포 유래 수지상 세포의 시험은 TNF- ci의 감소된 생산을 야기하였다 (각각 5，300 및 90 pg/mL) . TLR4-/- 마우스 유래의 골수세포 유래 수지상 세포는 LPS 에 대한 반응에서 IL-6 를 분비할 능력을 상실하였다 (87 pg/mL) . 상기 데이터는 명확히 TLR4 가 람블편모층 Bip 에 대한 반응을 위해 요구된다는 것을 나타낸다.

6. 수지상 세포 유래의 재조합 GlBiP 에 의해 유도된 사이토카인 생산에서 MyD88의 역할

MyD88 은 표면 TLR 과 세포내 신호전달 구성성분 사이의 신호전달을 매개하는 일종의 어댑터 (adaptor )이다 (Suzuki N , Suzuki S & Yeh WC , Trends I隱 unol 2002； 23： 503-506) . 그러나, 일부 TLR 리간드는 세포내 신호전달 구성요소， 예컨대 TRIF 를 MyD88 의 관여 없이 활성화시킨다. 본 발명자들은 MyD88 가 재조합 GlBiP BiP 에 의해 유도된 사이토카인과 관련이 있는 지를 MyD88 을 이용하여 조사하였다 (도 6a) . MyD88 로부터 제조된 골수세포 유래 수지상 세포는 LPS 를 이용하여 시험하였을 때， 종래 보고된 바외 같이 (Takeuchi 0, Takeda K, Hoshino , et al , Int I画 unol 2000 ; 12 : 113117) , IL-12 , TNF- α 또는 IL-6 를 생산하지 못하였다. 재조합 GlBiP 로 처리되었을 경우, MyD88 은 TLR4/BiP 상호작용과 관련된 본질적인 신호전달 구성요소라는 것을 시사한다. 또한, MyD88 및 TLR4 간의 상호작용은 재조합 GlBiP 로 처리된 수지상 세포에서 TLR4 와 MyD88 의 물리적 결합을 측정함으로씨 모니터링 되었다 (도 6b) . 재조합 GlBiP 를 이용하여 처리된 수지상 세포 유래의 용해물을 항 -TLR4 또는 항 -MyD88 항체를 이용한 면역침강법을 수행하였다. 침강된 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 비처리된 세포와 비교하여 2 내지 3 배 더 많은 MyD88 가 재조합 GlBiP-처리된 세포로부터 수득한 항 -TLR4 항체와 공동 -침강된다는 것을 나타내었다. 항- MyD88 항체는 비처리된 세포 보다 재조합 GlBiP 로 자극 받은 세포의 두배만큼 침강되었다. 상기 결과는 TLR4 또는 MyD88 간의 결합이 재조합 GlBiP에 노출된 수지상 세포에서 증가되었다는 것을 입증하는 것이다. 7. 수지상 세포 유래의 재조합 GlBiP 에 의해 유도된 사이토카인 생산에서 MAPK의 역할

MAP 는 병원성 미생물에 대한 세포 반웅을 촉발하는 특성규명이 잘된 신호전달 카이네이즈이다. 진핵세포에서 3 개의 잘 알려진 MAPK 서브 패밀리， 즉 ERKl/2, p38 및 JNK 이다. 상기 카이네이즈는 다양한 세포외적 자극， 예컨대 물리적 스트레스, 염증성 사이토카인， 성장 호르몬 및 박테리아 성분들에 대한 반응에서 독립적으로 또는 동시에 활성화된다. 본 발명자들은 마우스 수지상 세포에서 람블편모층 BiP 에 의해 유도된 사이토카인 생산에서 MAPK의 역할을 조사하였다. PD98059에 의한 ERK1/2의 불활성화 (ERK1/2 의 선택적 억제자)는 마우스 수지상 세포에서 재조합 GlBiP 와 반응하여 IL-12 및 TNF-α의 생산을 비처리된 세포에서 각각 14% 및 36%의 수준까지 감소시켰다 (도 7a). 이후 본 발명자는 재조합 GlBiP 처리에 대한 반웅에서 ERKl/2 MAPK의 활성화 상태를 조사하였다.

재조합 GlBiP의 노출은 자극 10분 후 최대 활성화를 갖는 ERK1/2의 인산화를 야기하였다. ERK1/2 의 인산화는 또한 LPS 로 처리된 수지상 세포에서 최대 활성화가 자극 8 분 후에 관찬되었을 때 발생하였다. p38 MAPK 의 억제자인 SB202190 을 이용한 수지상 세포의 전처리는 재조합 GlBiP 에 대한 반웅에서 비처리된 세포에서 측정된 수준의 12% and 32%까지 각각 IL-12 및 TNF- Q의 생산의 감소를 야기하였다 (도 7b). 재조합 GlBiP 에 대한 마우스 수지상 세포의 노출은 자극의 8 분 및 10 분 사이의 최대활성화를 갖는 p38 인산화를 야기하였다ᅳ 마우스 수지상 세포의 LPS 처리는 또한 p38 MAPK의 인산화를 유도하였다.

p38 및 ERKl/2 MAPK 와 대조적으로， JNK 의 분명한 활성화는 재조합 GlBiP 를 이용한 마우스 수지상 세포의 배양의 경우 검출되지 않았다. JNK 억제자 및 JNK 억제자 II 를 이용한 마우스 수지상 세포의 전처리는 재조합 GlBiP 와 반웅하여 IL-12 and TNF-α에서 약간의 감소, 즉 24-28%의 감소를 야기하였다. 상기 결과는 MAPK 가 수지상 세포 성숙에서 어떤 역할을 한다는 것을 나타내었다. 3 개의 MAPK 중에서， p38 및 ERKl/2 MAPK 는 재조합 GlBiP에 의해 유도된 면역 반응에 대한 JNK 보다 더 많이 기여하였다. 8. GlBiP 에 의해 활성화된 수지상 세포에서 NF-κΒ 및 AP-1 의 증가된 결합활성

본 발명자들은 두 개의 전사인자， AP-1 및 NF-κΒ 가 람블편모층 BiP 자극에 대해 유사한 결합 부위에 결합하는 지를 EMAS 를 이용하여 조사하였다. 핵 추출물을 재조합 GlBiP 로 처리된 마우스 골수세포 유래 수지상 세포로부터 제조하였고， 이후 NF-κΒ 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 함께 배양하였다 (도 8a). 이것은 표지된 DNA 단편이 더 느리게 이동하게 만들지만, 이 효과는 초과한 비표지된 NF- KB 결합 부위를 결합 반응에 첨가하였을 때 사라졌다. NF- KB 결합 활성은 예상대로 LPS 로 자극된 수지상 세포의 핵 추출물에서 관찰되었다. 재조합 GlBiP 로 자극 받은 골수세포 유래 수지상 세포의 핵 추출물은， 또한 AP-1 결합 부위를 포함하는 표지된 올리고뉴클레오타이드와 함게 배양되었다 (도 8b). 마찬가지로， 상기 핵 추출물은 느리게 움직이는 AP-1 DNA 단편을 생산하였고， 이 상호작용은 특이적인 상호작용을 나타내는 AP-1 결할 부위의 첨가에 의해 방해받았다. LPS 로 처리된 수지상 세포로부터 제조된 핵 추출물은 또한 증가된 AP-1 결합 활성을 나타내었다.

9. GlBiP의 Hsp70도메인에 의한수지상 세포 활성화의 유도

GlBiP 은 2 개의 추정상의 도메인， 즉， 액틴 결합 도메인 (N 말단 부위) 및 열층격 단백질 (C 말단 부위)을 각각 포함한다. 전장 재조합 GlBiP 뿐만 아니라， 두 개의 절단된 재조합 GlBiP 단백질， 재조합 GlBiP-N 도메인 및 재조합 GlBiP-C 도메인이 대장균에서 발현되었다 (도 9a). 상기 재조합 GlBiP 단백질을 재조합 GlBiP 의 동정을 위해 이용된 항—람블편모층 항체로 배양하였을 때, rGlBiP-N 도메인 및 rGlBiP-C 도메인이 대장균에서 발현되었다 (도 9a). 상기 재조합 Gi P 단백질을 항 -람블편모충 항체를 이용하여 배양하였을 때 (도 12 및 1)， 전장 rGlBiP 및 rGlBiP-콜로니는 면역반응성 단백질을 나타낸 반면에 그것들은 면역전 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석에서 존재하지 않았다 (도 9b). 또 다른 절단된 재조합 GlBiP, 재조합 GlBiP-N 도메인은 전면역 혈청 또는 항 -람블편모층 항체와 반응하지 않았다. 상기 절단된 재조합 GlBiP 단백질은 마우스 골수세포 유래 수지상 세포를 자극하기 위하여 이용되었다 (도 9c) . Hsp70 도메인을 갖는 조합 GlBiP 는 자극 받은 수지상 세포로부터 TNF- α 및 IL-12 를 유도하는데 효율적이었다. 반면에， 액틴 결합 도메인을 갖는 재조합 GlBiP 는 마우스 골수세포 유래 수지상 세포로부터 사이토카인 생산을 자극하지 않았다.

10. 재조합 GlBiP 단백질에 의한 수지상 세포 활성화를 통하여 T 세포에 의한사이토카인 생산의 유도

마우스 지라세포 (spl enocyte)로부터 수득된 CD4+ T 세포가 재조합 GlBiP 또는 재조합 GlBiP-C 도메인을 이용하여 처리된 마우스 수지상 세포를 이용하여 공동 배양되었을 때, 이들은 IL-2(각각 174 pg/mL or 2 , 364 pg/mL)을 분비하였다 (도 10 의 A) . 반면에， 재조합 GlBiP-N 도메인으로 처리된 마우스 수지상 세포와 공배양된 CD4+ T 세포는 IL-2 를 방출하지 않았다 (2 pg/mL) . IL-2 는 재조합 GlBiP 가 손송된 수지상 세포는. IL-2 를 생산하지 않았기 때문에 CD4+ T 세포로부터 수득되었지만, 마우스 수지상 세포로부터 수득되지 않았다. 또한， 오직 전장 재조합 GlBiP 또는 재조합 GlBiP-C 도메인과 함께 배양된 T—세포로부터 수득된 배양액은 상당한 양의 IFN- Y 분비를 입증하였다 (2 , 921 pg/mLor 52 , 469 pg/mL) (도 10 의 B) . 동일한 방법으로， 대부분의 는 재조합 GlBiP 로 자극된 수지상 세포만이 T 세포 없이 낮은 수준의 IFN- Y를 생산하였기 때문에 , T 세포로부터 나온다 (68 pg/mL) . 상기 결과는 GlBiP 가 DC 활성화를 통해서 T 세포에 의한 사이토카인 생산을 유도할 수 있고 C-말단의 Hsp70 도메인은 이 과정에서 중요하다는 것을 나타낸다. 11. 마우스의 람블편모충 감염에 의한 GlBiP 의 Hsp70 도메인에 대한 항체 형성의 촉진

람블편모층 영양형의 마우스내로의 구강 감염 후， 이들의 혈청을 람블편모층 추출물 또는 재조합 GlBiP 단백질을 이용하여 웨스턴 블록에 의해 분석하였다 (도 11 ) . 4개의 면역반응성 단백질이 항 -람블편모층 항체를 이용한 웨스턴 블롯에서 분자량 74， 58 , 55 및 30 kDa 에서 관찰되었다 (도 12a) . 74 kDa 의 면역반웅성 단백질은 GlBiP 로 추정되었다. 상기 혈청을 3 개의 재조합 GlBiP 와 반응시켰다. 전면역 혈청을 이용한 웨스턴 블롯에서 명백한 면역반웅성 단백질이 전혀 존재하지 않는 반면에， 감염된 마우스로부터 수득된 혈청을 이용한 반웅은 Hsp70 도메인을 수반하는 절단된 재조합 GlBiP-C 도메인뿐만 아니라， 전장 재조합 GlBiP 단백질에 대한 면역반응성을 입증하였다. 대조적으로, 재조합 GlBiP-N 도메인은 상기 혈청에 대한 어떠한 면역반응성을 나타내지 않았다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.