ZHUKOV DAVID BORISOVICH (RU)
DARMOV ILYA VLADIMIROVICH (RU)
OKHAPKINA VERONIKA YURYEVNA (RU)
ZHUKOV DAVID BORISOVICH (RU)
| ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Препарат для профилактики или терапии онкологических заболеваний, характери- зующийся тем, что в качестве основного компонента содержит возбудитель сифилиса - бледную трепонему. 2. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что в качестве основного компонента содержит нативные или инактивированные корпускулярные антигены, приготовлен- ные из культуральных штаммов бледной трепонемы. 3. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что в качестве основного компонента содержит смесь инактивированных корпускулярных антигенов не менее трех лабора- торных штаммов трепонем. 4. Препарат по п.З, характеризующийся тем, что штаммы относятся, по меньшей ме- ре, к трем антигенным группам возбудителя. 5. Препарат по п.2, характеризующийся тем, что использованы инактивированные корпускулярные антигены штаммов трепонем, сорбированные на гидроокиси алю- миния. 6. Препарат по п.2, предназначенный для терапии онкологических заболеваний, ха- рактеризующийся тем, он содержит смесь инактивированных нагреванием и консер- вированных добавлением фенола микробов культуральных штаммов бледной трепо- немы. 7. Препарат по п.2, предназначенный для профилактики онкологических заболева- ний, характеризующийся тем, он содержит смесь инактивированных нагреванием, адсорбированных на гидроокиси алюминия и консервированных добавлением фено- ла микробов культуральных штаммов бледной трепонемы. 8. Способ получения препарата по любому из пунктов 1 - 7, включающий приготов- ление посевного материала штаммов культуральных трепонем, получение биомассы микробов в жидкой питательной среде, концентрирование полученных микробных суспензий, термоинактивацию концентрированных нативных суспензий, их консер- вацию и очистку. 9. Способ по п.8, характеризующийся тем, что при приготовлении посевного матери- ала микробы культуральных трепонем выращивают в мясо-пептонном бульоне с ку- сочками говяжьей печени в анаэробных условиях при температуре 37±ГС в течение 7-10 сут. 10. Способ по п.8, характеризующийся тем, что для получения биомассы микробов выращивание культуральных трепонем осуществляют в коммерческой жидкой пита- тельной среде «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» с добавлением 10 % коммерческой сыворотки крупного рогатого скота в анаэробных условиях при тем- 5 пературе 37± С в течение 7-10 сут. в шейкере-инкубаторе при частоте оборотов платформы 120±10 оборотов -мин- 1. 11. Способ по п.8, характеризующийся тем, что концентрирование полученной мик- робной суспензии культуральных трепонем осуществляют путем естественного оса- ждения в течение 22-24 ч и частичного декантирования надосадочной жидкости - от 10 60 до 80 % от общего объема культуральной жидкости, с помощью вакуумной систе- мы. 12. Способ по п.8, характеризующийся тем, что термоинактивацию концентрирован- ной нативной суспензии культуральных трепонем осуществляют однократно при температуре 58±2°С в течение 60 мин. 15 13. Способ по п.8, характеризующийся тем, что консервацию термоинактивирован- ных концентрированных суспензий культуральных трепонем осуществляют посред- ством добавления фенола до конечной концентрации 0,5±0,1 %. 14. Способ по п.8, характеризующийся тем, что очистку термоинактивированных концентрированных суспензий культуральных трепонем осуществляют путем филь- 20 трации и последующей отмывки фенолизированным физиологическим раствором хлористого натрия 0,5±0,1 % фенола. 15. Способ по п.14, характеризующийся тем, что отмывку физиологическим раство- ром хлористого натрия с добавлением фенола до конечной концентрации 0,5±0,1 % производят трехкратно. 25 16. Способ по п.8, характеризующийся тем, что из очищенной суспензии готовят корпускулярные антигены не мене трех культуральных штаммов бледной трепонемы, относящихся к разным антигенным группам, с последующим их смешиванием. 17. Способ приготовления препарата по п. 16, характеризующийся тем, что смеши- вают расчетные количества поливалентного корпускулярного антигена и фенолизи- 30 рованного физиологического раствора хлористого натрия с содержанием 0,25±0,02 % фенола таким образом, чтобы конечный препарат для терапии содержал от 0,4 до 0,6 мг/мл микробного антигена в пересчете на сухое вещество. 18. Способ приготовления препарата по п. 16, характеризующийся тем, что смеши- вают расчетные количества поливалентного корпускулярного антигена, фенолизиро- ванного физиологического раствора хлористого натрия с содержанием 0,25±0,02 % фенола и гидроокиси алюминия с содержанием 1,3±0,1 мг/мл ионов алюминия таким образом, чтобы конечный препарат для профилактики содержал от 27,0 до 29,0 мг/мл микробного антигена в пересчете на сухое вещество. 5 19. Способ стимуляции противоопухолевого иммунитета, включающий парентераль- ное введение препарата по п.1 в фармацевтически приемлемом количестве. 20. Способ профилактики или терапии онкологических заболеваний, включающий парентеральное введение препарата по п.1 в фармацевтически приемлемом количе- стве. 10 21. Способ по п.20, характеризующийся тем, что при профилактике онкологического заболевания одновременно с введением препарата по п.1, дополнительно осуществ- ляют введение препарата, где в качестве активно действующего вещества использо- вана коммерческая вакцина бруцеллезная живая сухая в дозе, рекомендованной ин- струкцией по применению препарата. 15 |
ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Область техники
Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и фармакологии и может быть использовано для профилактики и терапии злокаче- ственных новообразований.
Изобретение касается средства профилактики и терапии онкологических забо- леваний, конкретно, нового антигенного препарата, приготовленного на основе куль- туральных штаммов бледной трепонемы, а также способов его приготовления и при- менения.
К настоящему времени собран большой материал, подтверждающий эффек- тивность применения препаратов на основе иммуностимуляторов микробного проис- хождения при опухолевых заболеваниях с различной локализацией и на разных ста- диях процесса. Хотя подобные средства не проявляют прямого противоопухолевого и антиметастатического действия, они обладают способностью усиливать противо- опухолевый иммунитет путем повышения и/или восстановления эффекторного меха- низма, опосредованного через презентативную функцию макрофагов, регуляцию синтеза интерлейкина-1 (ИЛ-1), фактора некроза опухоли (ФНО), интерлейкина-2 (ИЛ-2), естественных киллеров (ΝΚ-клеток) и др., а также могут модифицировать другие биологические аспекты взаимоотношений организма-носителя и опухоли.
Предшествующий уровень техники
Одним из наиболее ранних примеров использования микробных факторов для терапии опухолей человека являются препараты, полученные на основе простейшего - Trypanosoma cruzi: «Круцин» - в России и «Трипанозома» - во Франции (Клюева, Н. Г. Биотерапия злокачественных опухолей / Н.Г.Клюева // Вестник АМН СССР. - 1946. - N° 2-3. - С. 44-53.; Каллинникова, В.Д. Противоопухолевые свойства жгути- кового простейшего Trypanosoma cruzi. - Тула: Гриф и К., 2004. - 280 с). Однако, не- смотря на многочисленные сообщения о положительных результатах, они не получи- ли широкого признания.
Известно использование в клинической онкологии для лечения рака мочевого пузыря противотуберкулезной вакцины БЦЖ. Однако механизм противоопухолевого действия вакцины так до конца и не изучен. Недостатком является высокая реакто- генность и сенсибилизирующие свойства вакцины при многократном введении (Им- мунология и аллергология / под ред. А.А. Воробьева, А.С. Быкова, А.В. Карауловой. М: Практическая медицина, 2006. -287 с).
Предложено использование для биотерапии рака вакцины на основе цито- плазматических мембран L-форм бактерий, в частности, возбудителя бруцеллеза. При этом низкодифференцированные структурно микробные клетки в конечной L3- форме трансформации рассматриваются как «реликтовые», имеющие высокую сте- пень сходства с клетками злокачественных новообразований, что определяет воз- можность приготовления на их основе вакцинного противоопухолевого препарата ( азпатент Ν°13980, RU2409376, 13.08.2002). Однако приводимые данные о положи- тельных результатах лечения и профилактики касаются только доброкачественных заболеваний, а убедительных сведений о применении данной вакцины у больных со злокачественными новообразованиями не представлено.
Известно о применении в комплексной терапии онкологических больных ра- ком тела матки и легкого живой туляремийной вакцины (RU 2092186 С1 10.10.1997). Недостатком данного способа является то, что введение живой культуры патогенного микроорганизма в условиях закономерно возникающих у онкологических больных нарушений иммунитета, при одновременном использовании цитостатических препа- ратов, способствует реализации присущих вакцине осложнений и побочных эффек- тов, связанных с накоплением и размножением в организме туляремийного микроба: сенсибилизации, высокой реактогенности, развитию инфекционного процесса. Дан- ные осложнения в некоторых случаях требуют проведения антибактериальной тера- пии. Кроме того, исходя из патогенеза туляремии, иммуностимуляции подвергаются, преимущественно, специфические гуморальные звенья иммунной системы, которым принадлежит лишь вспомогательное значение в противоопухолевом иммунитете.
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является иммуно- стимулирующий препарат (вакцина), который представляет собой культуру штамма бактерий Corynebacterium krestovnicova-troitskaya. Данная вакцина не обладает спе- цифическим лечебным воздействием на рост опухолей, а влияет на них опосредован- но через стимуляцию иммунной системы (гуморальной и клеточной) путем восста- новления естественной резистентности к опухолевому процессу (RU 2027755 С1 27.01.1995). Культура штамма накапливается на плотной питательной среде, суспен- дируется и полученная взвесь используется для введения онкологическим больным. Недостатком данного метода терапии является то, что используется культура живых бактерий, выделенных от человека; в отношении данного штамма нет достаточного объема убедительных данных о его безопасности. Кроме того, представленная в па- тенте схема приготовления вакцины нетехнологична, невоспроизводима и не позво- ляет получить стандартный по свойствам препарат.
В заявляемом изобретении предложено использование культуральных блед- ных трепонем в качестве основы для разработки средства профилактики и терапии опухолей.
Возбудитель сифилиса (бледная трепонема) был выделен в 1905 году (Schaudin et Hoffman), относится к виду Treponema pallidum. За длительный период его изучения путем заражения восприимчивых лабораторных животных (приматы, кролики) были получены и охарактеризованы несколько штаммов тканевых патоген- ных для человека бледных трепонем (Никольса, Будапештский, 1 Иркутский, VIII и XII ЦКВИ и другие), последующее сохранение штаммов проводилось путем регу- лярных перевивок на лабораторных животных. Многочисленные попытки выращи- вания бледной трепонемы на питательных средах в анаэробных условиях привели к получению таких штаммов культуральных бледных трепонем, как «ставропольские», «казанские», Рейтера, Труффи, Мульцера («Мюнхенский») и др. Наибольшее коли- чество культуральных штаммов бледных трепонем в нашей стране выделили В.М. Аристовский и P.P. Гельтцер [Овчинников, Н.М. Экспериментальный сифилис / Н.М.Овчинников. - М.: Медгиз, 1955. - 387 с]. «Казанский» (V) и «ставропольские» (VII, VIII, IX) штаммы наряду со штаммом Рейтера в настоящее время применяют для приготовления антигенов для серодиагностики. Установлено, что культуральные трепонемы отличаются от тканевых по своим морфологическим, биохимическим и патогенным свойствам. Однако особенно значимо то, что антигенные свойства их очень близки к патогенным вариантам возбудителя сифилиса. При этом ни один из штаммов культуральных трепонем не обладает патогенностью для человека. Кроме того, их можно выращивать в лабораторных условиях в необходимых количествах на искусственных питательных средах и сохранять в течение продолжительного перио- да времени путем регулярных пересевов.
Известные из уровня техники публикации в своем большинстве описывают использование антигенных препаратов, приготовленных из культуральных трепонем, для серодиагностики сифилиса. В частности из уровня техники известен способ при- готовления ультраозвученного антигена из культуральных штаммов трепонем, на основе которого готовят диагностикум для постановки реакции связывания компле- з мента. Биомассу бледных трепонем выращивают на искусственной тиогликолевой среде из полного набора штаммов трех антигенных групп с последующей дезинте- грацией клеток ультразвуком, центрифугированием, отделением неразрушенных трепонем, центрифугированием надосадочной жидкости, выделением осадка стенок трепонем и супернатанта. (Патент РФ 2141339 «Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем». Пожарская В. О. Опубл. 20.11.99 г. Бюл. 32).
Также известно использование антигенов клеточных стенок (КСТ) культу- ральных бледных трепонем в качестве иммуногена для получения контрольной сы- воротки для диагностики сифилиса в реакции связывания комплемента (Патент РФ 2185856 «Способ получения контрольной сыворотки для диагностики сифилиса». Пожарская В. О., Гуртовой Е.А., Ермолов А.В. Опубл. 27.07.2002 Бюл. 21,). Способ осуществляется путем интратестикулярного заражения кроликов весом 3,0-3,5 кг па- тогенным штаммом Никольса, через 7-8 суток после заражения животных дважды с интервалом 7-8 суток иммунизируют внутривенно клеточными структурами культу- ральных бледных трепонем (КСТ-антигеном) из культуральных бледных трепонем с последующим обескровливанием животных через 30 сут после заражения. Способ позволяет повысить средние титры антикардиолипиновых антител в РСК с разведе- ния 1 :15 до 1 :40 в крови обескровленных животных.
Таким образом, из уровня техники не выявлено источников информации, в ко- торых было бы представлено использование культуральных бледных трепонем в ка- честве основы для создания средств для профилактики и терапии онкологических заболеваний.
Раскрытие изобретения
Задача изобретения заключается в разработке эффективного и безопасного иммуностимулирующего препарата для профилактики и терапии злокачественных новообразований на основе культуральных бледных трепонем.
Техническим результатом является расширение спектра иммуностимулирую- щих средств, обладающих иммуностимулирующим действием и противоопухолевой активностью.
Заявляемый препарат характеризуется биотехнологичностью, эффективно- стью и стандартностью свойств (с получением готовых препаратов, соответствую- щих требуемым показателям качества). При этом биотехнологичность является важ- ным требованием, которое предъявляется к штаммам, пригодным для конструирова- ния вакцинных препаратов, обеспечивающем возможность получения достаточных RU2016/000427 объемов микробной массы и длительного поддержания в стабильном состоянии в ла- бораторных условиях.
Поставленная задача решается тем, что иммуностимулирующий препарат для профилактики или терапии онкологических заболеваний в качестве основы содержит возбудитель сифилиса - бледную трепонему. В различных вариантах использования изобретения в качестве основы могут быть использованы нативные или инактивиро- ванные корпускулярные антигены, приготовленные из культуральных штаммов бледной трепонемы. Наилучший результат достигается при использовании смеси инактивированных корпускулярных антигенов не менее трех лабораторных штаммов трепонем, при этом штаммы могут быть взяты в равных пропорциях, что не является обязательным. Наилучшим является вариант, при котором используемые штаммы относятся не менее, чем к трем антигенным группам возбудителя. При этом резуль- тат будет достигаться и при варианте использования изобретения с одним или двумя штаммами, в т.ч. взятыми из одной антигенной группы. Возможен вариант использо- вания препарата, в котором в качестве основы использованы инактивированные кор- пускулярные антигены штаммов трепонем, сорбированные на гидроокиси алюминия.
Препарат, предназначенный для терапии онкологических заболеваний, может содержать смесь инактивированных нагреванием и консервированных добавлением фенола микробов культуральных штаммов бледной трепонемы (например, 1 мл пре- парата содержит 0,5±0,1 мг микробного антигена в пересчете на сухое вещество и 2,5±0,2 мг фенола). Препарат, предназначенный для профилактики онкологических заболеваний или для стимуляции противоопухолевого иммунитета, может содержать смесь инактивированных нагреванием, адсорбированных на гидроокиси алюминия и консервированных добавлением фенола микробов культуральных штаммов бледной трепонемы (например, 1 мл препарата содержит 28,0±1,0 мг корпускулярного мик- робного антигена в пересчете на сухое вещество, 2,5±0,2 мг фенола и 1,3±0,1 мг ионов алюминия).
Поставленная задача решается тем, что способ получения заявляемого препа- рата включает приготовление посевного материала штаммов культуральных трепо- нем, получение биомассы микробов в жидкой питательной среде, концентрирование полученных микробных суспензий, термоинактивацию концентрированных натив- ных суспензий, их консервацию и очистку. В случае использования нескольких штаммов бледной трепонемы - смешение полученных из них антигенов.
Возможны различные варианты осуществления перечисленных этапов спосо- ба. При этом в одном из вариантов при приготовлении посевного материала микробы культуральных трепонем выращивают в мясо-пептонном бульоне с кусочками говя- жьей печени в анаэробных условиях при температуре (37±1)°С в течение 7-10 сут; для получения биомассы микробов выращивание культуральных трепонем осу- 5 ществляют в коммерческой жидкой питательной среде «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» с добавлением 10 % коммерческой сыворотки крупного рогатого скота, либо в искусственной тиогликолевой среде (например, изготовленной по па- тенту на изобретение РФ N°2141339) в анаэробных условиях при температуре (37±1)°С в течение 7-10 сут. в шейкере-инкубаторе при частоте оборотов платформы
10 120±10 оборотов-мин-1; концентрирование полученной микробной суспензии куль- туральных трепонем можно осуществлять путем естественного осаждения в течение 22-24 ч и частичного декантирования надосадочной жидкости (от 60 до 80 % от об- щего объема культуральной жидкости), например, с помощью вакуумной системы; термоинактивацию концентрированной нативной суспензии культуральных трепо-
15 нем осуществляют однократно при температуре (58±2)"С в течение 60 мин.; консер- вацию термоинактивированных концентрированных суспензий культуральных тре- понем осуществляют посредством добавления фенола до конечной концентрации 0,5±0,1 %; очистку осуществляют, например, путем фильтрации и последующей от- мывки физиологическим раствором хлористого натрия с добавлением фенола до ко-
20 нечной концентрации 0,5±0,1 %, которую производят трехкратно.
Из очищенной суспензии готовят корпускулярные антигены культуральных трепонем с требуемой концентрацией (например, не менее 25 ед. экстинции, что со- ответствует 35 мг-мл "1 микробного антигена в пересчете на сухое вещество). В част- ном варианте осуществления изобретения готовят корпускулярные антигены не мене
25 трех культуральных штаммов трепонем, относящихся к разным антигенным группам, с последующим их смешиванием (отдельные штаммы трепонем смешивают, напри- мер, в равных пропорциях в разных комбинациях таким образом, чтобы в конечном поливалентном препарате были представлены, по крайней мере, по одному штамму, относящемуся к одной из трех антигенных групп.) При приготовлении препарата
30 смешивают расчетные количества корпускулярного антигена и фенолизированного физиологического раствора хлористого натрия (0,25±0,02 % фенола) таким образом, чтобы конечный препарат для терапии содержал требуемое количество микробного антигена (например, 0,5±0,1 мг-мл '1 ) в пересчете на сухое вещество. В другом вари- анте осуществления способа смешивают расчетные количества поливалентного кор- пускулярного антигена, фенолизированного физиологического раствора хлористого натрия (0,25±0,02 % фенола) и гидроокиси алюминия (1,3±0,1 мг«мл -1 ионов алюми- ния) таким образом, чтобы конечный препарат для профилактики содержал требуе- мое количество микробного антигена (например, 28,0±1,0 мг-мл "1 ) в пересчете на сухое вещество.
Поставленная задача решается тем, что способ модуляции противоопухолево- го иммунитета включает парентеральное введение заявляемого препарата по п.1 (например, в виде подкожной инъекции) в фармацевтически приемлемом количестве. Способ профилактики или терапии онкологических заболеваний также включает па- рентеральное введение препарата в фармацевтически приемлемом количестве. При этом при профилактике онкологического заболевания одновременно с введением за- являемого препарата возможно дополнительное введение препарата, где в качестве активно действующего вещества использована коммерческая вакцина бруцеллезная живая сухая в дозе, рекомендованной инструкцией по применению препарата.
В примерах осуществления изобретения на моделях различных опухолей для лечения онкологического заболевания препарат вводили подкожно в дозе 0,125 мг антигена в пересчете на сухое вещество пятикратно с интервалом между первыми четырьмя инъекциями 1 сутки, 14 суток - между четвертой и пятой, для профилакти- ки онкологического заболевания вводили сорбированный на гидроокиси алюминия препарат в дозе 7,0 мг антигена в пересчете на сухое вещество однократно подкож- но.
Проведенный анализ научной информации, патентной литературы и ресурсов сети Интернет, выявил, что наиболее полный набор штаммов культуральных блед- ных трепонем имеется в наличии в филиале НПО «Микроген» «Аллерген» (г. Став- рополь), где они используются при производстве трепонемного ультраозвученного диагностикума для реакции связывания комплемента.
В качестве питательных сред для выращивания культуральных бледных тре- понем могут быть использованы любые известные из уровня техники составы. Для поддержания культур обычно используют традиционный мясо-пептонный бульон с добавлением кусочков вареной печени. Для накопления биомассы может использо- ваться коммерческий «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» (HiMedia La- boratories Pvt. Ltd., Индия), а также искусственная тиогликолевая среда, представлен- ная в материалах Патента на изобретение РФ JN 2141339. Для обеспечения анаэроб- ных условий в среды вносят тиогликолевую кислоту или ее соли, для стимуляции ро- ста возбудителя добавляется нативная сыворотка лошадей, кроликов, крупного рога- того скота. Оптимальный рост возбудителя на жидких питательных средах можно наблюдать на 7-10 сутки выращивания при температуре 37±1 °С.
Проведенные исследования эффективности заявляемого препарата на моделях перевиваемых опухолей, таких как меланома, саркома и др., которые обычно исполь- зуются при оценке эффективности разрабатываемых противоопухолевых препаратов (Трещалина, Е.М Противоопухолевая активность веществ природного происхожде- ния / Е.М. Трещалина. - М.:, 2005 г.; Руководство по экспериментальному (доклини- ческому) изучению новых фармакологических веществ / под. ред. Р.У. Хабриева. - М.: «Медицина», 2005 г.- 832 с), показали положительное действие трепонемного антигена на рост и метастазирование злокачественных новообразований. Получен- ные результаты обусловлены опосредованными через иммунную систему механиз- мами, имеющими общие неспецифические черты при реализации противоинфекци- онного и противоопухолевого иммунитета, который в данном случае развивается по ТЫ -зависимому типу с активацией цитотоксических Т-лимфоцитов, макрофагов, синтезом большого количества разнообразных медиаторов иммунокомпетентными клетками, что также иллюстрируется приведенными ниже примерами. Некоторые данные проведенных исследований представлены в примерах ниже, которые не огра- ничивают настоящее изобретение, а лишь демонстрируют достигаемый технический результат.
В рамках данного изобретения были решены задачи по созданию противо- опухолевого препарата на основе возбудителя сифилиса посредством использования культуральных штаммов бледной трепонемы.
По итогам проведенных исследований следует отметить, что эффект достига- ется при использовании в качестве основного компонента, по меньшей мере, одного штамма бледной трепонемы, наилучший эффект от реализации изобретения достига- ется при использовании в качестве основы препарата не менее 3 культуральных штаммов бледных трепонем, относящихся, по меньшей мере, к 3 известным антиген- ным группам в различных комбинациях (/Зебницкая Л.В. - Вести, дерматол извест- ным., 1955, N 4, с. 24-27 ). В частности, известно, что к первой группе относится IX «ставропольский» штамм; ко второй - VII, VIII «ставропольские» штаммы; к третьей - V «казанский» штамм и штамм Рейтера, и т.д. В одном из вариантов реализации изобретения был приготовлен поливалентный корпускулярный антигена на основе концентрированных нативных суспензий культуральных штаммов трепонем, в дру- гом - на основе термоинактивированных суспензий культуральных штаммов трепо- нем. В результате проведенных экспериментов была показана эффективность от применения заявляемого препарата в качестве иммуностимулирующего препарата для профилактики и терапии опухолей.
Таким образом, в основе изобретения лежит получение и использование ново- го препарата микробного происхождения, приготовленного из нативных или инак- тивированных клеток культуральньгх штаммов бледных трепонем. Средство характе- ризуется воспроизводимой технологией получения, безопасностью, высокой имму- ностимулирующей и противоопухолевой эффективностью в экспериментах на лабо- раторных животных и моделях перевиваемых опухолей.
Разработанная технология приготовления препарата основана на определен- ной последовательности действий (этапов) с использованием на отдельных этапах питательных сред, условий выращивания, концентрирования, щадящей инактивации, очистки микробных взвесей и обеспечивает получение необходимых количеств пол- ноценного по иммунобиологическим свойствам антигенного препарата (таблица 1).
Использование комплекса показателей контроля на всех стадиях приготовле- ния препарата (таблица 2) обеспечивает воспроизводимость и стандартность техно- логии получения препарата. Применение корпускулярного трепонемного антигена в качестве иммуностимулирующего средства при парентеральном введении лабора- торным животным характеризуется высоким иммуностимулирующим действием на показатели клеточного звена иммунитета и выраженным противоопухолевым эффек- том при использовании на моделях перевиваемых опухолей.
Таким образом, созданный новый препарат микробного происхождения на ос- нове культуральных бледных трепонем и его использование для профилактики и те- рапии опухолей являются новыми и отвечающими критерию «изобретательский уро- вень».
Лучший вариант осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ получения поливалентного корпускулярного инактивированного антигена на основе культуральных штаммов трепонем
Из уровня техники известно деление бледных трепонем на 3 антигенные груп- пы Для получения поливалентного корпускулярного инактивированного антигенного препарата использовали штаммы трепонем N° o Рейтера, V (3 антигенная группа), VII, VIII (2 антигенная группа), IX (1 антигенная группа) в различных комбинациях. T RU2016/000427
Основные стадии приготовления антигена, контрольные точки и требования к пока- зателям качества представлены в таблицах 1, 2.
Согласно указанной схеме было приготовлено 4 серии антигенного препарата, отличающиеся комбинацией входящих в их состав штаммов. Характеристики каче- ства представлены в таблице 3.
ю Таблица 1 - Основные стадии приготовления поливалентного корпускулярного инактивированного антигена на основе культура ных штаммов трепонем
Номер Наименование ста-
Содержание работ Контролируемые показатели стадии дии
4. Среда для получения глубинной культуры: коммерческий «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия), готовится согласно прилагаемой инструкции, дополнительно вводится нативная сыворотка крупного рогатого ск та в количестве 10%; а также искусственная тиогликолевая среда, представленная в материалах Патента на изобретение РФ N°2141339.
Таблица 2 - Показатели качества полуфабрикатов и конечных препаратов, получаемых в процессе приготовления поливалентн корпускулярного инактивированного антигена на основе культуральных штаммов бледной трепонемы
Таблица 3 - Характеристики качества поливалентных корпускулярных инактивированных антигенов, приготовленных на осн различных комбинаций культуральных штаммов трепонем
Таким образом, использование в составе представленных образцов препаратов не менее 3 культуральных штаммов бледных трепонем, относящихся к известным 3 антигенным группам в различных комбинациях, обеспечивает антигенную полно- ценность, представительность и гомологичность препарата в отношении патогенных тканевых трепонем.
Пример 2. Способ получения поливалентного корпускулярного нативного антигена на основе лабораторных штаммов трепонем
Для получения поливалентного корпускулярного нативного антигенного пре- парата использовали штаммы трепонем N°N° Рейтера, V (3 антигенная группа) , VII,
VIII (2 антигенная группа), IX (1 антигенная группа) в различных комбинациях. Ос- новные стадии приготовления антигена, контрольные точки и требования к показате- лям качества представлены в таблицах 4, 5.
Согласно указанной схеме было приготовлено 4 серии антигенного препарата, отличающиеся комбинацией входящих в их состав штаммов. Характеристики каче- ства представлены в таблице 6.
Таблица 4 - Основные стадии приготовления поливалентного корпускулярного нативного антигена на основе культуральных шт мов трепонем
Таблица 5 - Показатели качества полуфабрикатов и конечных препаратов, получаемых в процессе приготовления поливалентн корпускулярного нативного антигена на основе культуральных штаммов бледной трепонемы
Таблица 6 - Характеристики качества поливалентных корпускулярных нативных антигенов, приготовленных на основе различн комбинаций культуральных штаммов трепонем
Пример 3. Характеристики неспецифического иммуностимулирующего эффекта по- ливалентного антигена на основе штаммов культуральных трепонем на показатели Т- клеточного звена иммунитета
Оценку неспецифического иммуностимулирующего действия поливалентного корпускулярного трепонемного антигена на показатели клеточного звена иммунитета оценивали на нелинейных белых мышах. Препарат вводили животным подкожно в разовой дозе 0,125 мг антигена в пересчете на сухое вещество пятикратно с интерва- лом 1 сутки. Показатели стимуляции иммунитета оценивали на 14 и 21 сутки после введения.
В опытах изучали стимулирующее влияние препарата на относительное (до- ля) и абсолютное содержание (клет гмл "1 ) популяций (субпопуляций) лимфоцитов, которым принадлежит основная роль в реализации противоопухолевого иммунитета. С целью дифференциации отдельных пулов лимфоцитов использовались традицион- ные CD - маркеры. Количественную оценку субпопуляций лимфоцитов проводили с использованием проточного цитофлуориметра Navios («Весктап Coulter», США).
При оценке динамики показателей клеточного иммунитета для наглядности представления информации использовали коэффициент стимуляции, который рас- считывали по формуле:
KC = (A 2 -Ai) : А 100 (1);
где:
Ai - абсолютное (относительное) фоновое значение показателя;
А 2 - абсолютное (относительное) значение показателя после введения препа- рата.
Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 7 и 8.
Таблица 7 - Динамика популяций (субпопуляций) лимфоцитов в крови мышей после пятикратного введения поливалентного к пускулярного трепонемного антигена в суммарной дозе 0,625 мг антигена
Таблица 8 - Динамика показателей клеточного иммунитета по коэффициенту стимуляции популяций (субпопуляций) лимфоцито крови мышей после пятикратного лечебного введения корпускулярного инактивированного антигена из культуральных штамм трепонем в дозе 0,625 мг антигена
В течение всего периода наблюдения отмечается стимуляция показателей противоопухолевого клеточного иммунитета, выражающаяся в повышении содержа- ния ΝΚ-клеток, Т-лимфоцитов хелперов и Т-лимфоцитов цитотоксических, повы- шенном уровне продукции INF-γ Т-лимфоцитами хелперами и Т-лимфоцитами су- прессорами. Максимальная стимуляция указанных показателей наблюдается на 14 сутки с момента начала терапии, к 21 суткам наблюдения их величины снижаются, тем не менее, превышают фоновые.
Пример 4. Терапия заявляемым средством линейных мышей с привитым опухолевым штаммом меланомы В 16.
Для оценки терапевтической эффективности препарата в отношении солидных опухолей (мезенхимального происхождения) проводили эксперимент на перевивае- мом подкожно мышином опухолевом штамме меланомы В 16. В опыте использовали мышей линии C57BL/6 обоего пола. Опухоль трансплантировали путем подкожного введения в область передней конечности ближе к позвоночнику в объеме 0,2 мл (200 тыс. клеток) на мышь. Одной группе животных с лечебными целями вводили поли- валентный антиген на основе культуральных трепонем подкожно через 1, 3, 5, 7, 14 суток после имплантации опухоли в разовой дозе 0,125 мг. Второй группе животных вводили сорбированный на гидроокиси алюминия препарат подкожно в разовой дозе 0,625 мг однократно через 1 сут. после имплантации опухоли.
В качестве контрольной группы использовали мышей той же линии без введе- ния исследуемого препарата.
Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показа- телям: торможение роста опухоли (ТРО), увеличение продолжительности жизни (УПЖ), индекс торможения метастазирования (ИТМ).
Расчет индекса торможения роста опухоли проводили следующим образом. Начиная с 12-14 суток с момента имплантации опухоли, проводили 3 измерения опу- холевых узлов - через каждые 5-7 дней (в зависимости от интенсивности опухолево- го роста). Для этого с помощью штангенциркуля определяли два размера (длину и ширину) опухолевых узлов. Объем (V, мм 3 ) вычисляли по формуле:
V = (a -b 2 ) : 2 (3);
где:
а - длина опухолевого узла, мм,
b - ширина опухолевого узла, мм. Индекс торможения роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле:
ТРО ~ ( KO HTpcma-VonbiTa) · V K0HT p 0Jla - 100 % (4),
где:
ТРО - индекс торможения роста опухоли, %;
V контроля - средний объем опухоли в контрольной группе, мм ;
Vomi T a - средний объем опухоли в опытной группе, мм .
Индекс увеличения продолжительности жизни (УПЖ) рассчитывали по фор- муле:
УПЖ= (СПЖопыта-СПЖконтроля) ' СПЖ КО нтроля ' 100 % (5);
где:
СПЖопыта - средняя продолжительность жизни животных в опытной группе, дни;
СПЖ К онтроля - средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе, дни.
Изучение влияния на метастатическую активность опухоли осуществляли в соответствии с приведенной ниже методикой. В каждой опытной группе умерщвляли по 5 мышей в день гибели первой мыши в контрольной группе. Грудную полость животных вскрывали, извлекали легкие и подсчитывали количество метастазов. Вы- числяли частоту метастазирования опухоли в процентах по отношению числа живот- ных с метастазами к общему количеству животных в группе. Подсчитывали среднее количество метастазов у одного животного в группе. Индекс торможения метастази- рования (ИТМ) вычисляли по формуле:
ИТМ=(А, ·Βι - А 2 В 2 ) : (А, · В1) · 100% (6);
где:
Αι - частота метастазирования в контрольной группе;
А 2 - частота метастазирования в опытной группе;
В \ - среднее количество метастазов у животных в контрольной группе;
В 2 - среднее количество метастазов у животных в опытной группе.
Результаты эксперимента приведены в таблице 9.
Как следует из представленных в таблице данных, на все сроки наблюдения отмечается торможение роста опухоли (максимальное значение индекса ТРО зареги- стрировано на 23 сутки наблюдения и составило 40,2%) и значительное снижение уровня метастазирования (значение ИТМ составило 68,1%) у животных, получавших препарат на основе культуральных штаммов трепонем по вышеуказанной схеме. До- стоверного влияния на продолжительность жизни леченных животных по сравнению с нелеченными особями в проведённом эксперименте отмечено не было.
При оценке эффективности использования по лечебной схеме препарата, сор- бированного на геле гидроокиси алюминия, установлена значительная противоопу- холевая эффективность в отношении модели меланомы В 16, превышающая таковую при использовании несорбированного препарата. Максимальные значения индекса ТРО составили соответственно 61,7 и 40,2 %. Кроме увеличения значений показате- лей ТРО и ИТМ в данном эксперименте наблюдалось достоверное увеличение про- должительности жизни животных (показатель УПЖ составил 45,3 % против минус 5,0 % при пятикратном введении несорбированного препарата).
Таблица 9 - Оценка терапевтической противоопухолевой активности поливалентного корпускулярного инактивированного анти на из культуральных штаммов трепонем с использованием опухолевой модели меланомы В16
Пример 5. Терапия заявляемым средством мышей с привитым опухолевым штаммом саркомы Sa37.
Для оценки терапевтической эффективности препарата в отношении солидных опухолей (мезенхимального происхождения) проводили эксперимент на перевивае- мом подкожно мышином опухолевом штамме саркомы Sa37 ^ В опыте использовали мышей линии Balb/c обоего пола. Опухоль трансплантировали путем подкожного введения в область передней конечности ближе к позвоночнику в объеме 0,2 мл (300 тыс. клеток) на мышь. Одной группе животных с лечебными целями вводили поли- валентный корпускулярный трепонемный антиген подкожно через 1, 3, 5, 7, 14 суток после имплантации опухоли в разовой дозе 0,125 мг. Второй группе животных вводили сорбированный на гидроокиси алюминия препарат подкожно в разовой дозе 0,625 мг однократно через 1 сут. после имплантации опухоли.
В качестве контрольной группы использовали мышей той же линии без введе- ния исследуемого препарата.
Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показа- телям: торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ). Порядок расчета показателей приведен в примере 4.
Данные, представленные в таблице 10, свидетельствуют о том, что на 12-е и 17-е сутки наблюдения в группе животных, получавших пятикратную инъекцию препарата, отмечалось торможение роста опухоли (значения индекса ТРО составляли соответственно 10,9% и 26,8%).
Результаты оценки эффективности использования препарата, сорбированного на геле гидроокиси алюминия, по лечебной схеме не показали увеличения противо- опухолевой активности в сравнении с несорбированным препаратом.
Таблица 10 - Оценка противоопухолевой активности поливалентного корпускулярного инактивированного антигена из культура ных штаммов трепонем с использованием опухолевой модели саркомы Sa37
Пример 6. Сочетанное применение заявляемого средства и коммерческой вакцины бруцеллезной живой сухой для профилактики опухолевого роста в эксперименте на мышах с использованием перевиваемых штаммов меланомы В16 и саркомы Sa37.
Для оценки противоопухолевой эффективности препарата на основе культу- ральных штаммов бледной трепонемы в комбинации с вакциной бруцеллезной живой проводили эксперимент на перевиваемых подкожно мышиных опухолевых штаммах меланомы В16 и саркомы Sa37. В опыте использовали мышей линии C57BL/6 обоего пола (для меланомы) и Balb/c обоего пола (для саркомы). Опухоль трансплантирова- ли путем подкожного введения в область передней конечности ближе к позвоночни- ку в объеме 0,2 мл (200 тыс. опухолевых клеток меланомы штамма В16 и 300 тыс. клеток саркомы штамма Sa37) на мышь. Схемы и дозы комбинированного введения препаратов представлены в таблицах 11 и 12. Суспензии клеток перевиваемых опу- холевых штаммов имплантировали через 45 суток после последнего введения вак- цин.
В качестве контрольной группы использовали мышей той же линии без введе- ния исследуемого препарата.
Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показа- телям: торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ). Порядок расчета показателей приведен в примере 4.
Анализ данных, представленных в таблицах 11 и 12 (имплантация опухолевого материала через 45 суток после последнего введения комбинации препаратов), в сравне- нии с результатами изучения эффективности моноторапии заявляемого средства (табли- цы 9, 10) показал повышение противоопухолевой эффективности при сочетанном при- менении поливалентного трепонемного антигена и бруцеллезной вакцины.
Этот эффект в большей степени проявился на модели меланомы В 16, в меньшей
- на модели саркомы Sa37. Максимальное значение показателя ТРО составляло для ме- ланомы В16 - 73,6 %, для саркомы Sa37 - 47,0 %, значение индекса УПЖ для меланомы В16 - 13,5%, для саркомы Sa37 - 29,2 %. Максимальное значение показателя ИТМ для меланомы В16 составило 56,7 %. Наибольший эффект был достигнут на обеих моделях при использовании схемы сочетанного применения, при которой первоначально живот- ным вводили поливалентный корпускулярный инактивированный сорбированный на гидроокиси алюминия антигенный препарат на основе трепонем в дозе 7,0 мг, а через 3 суток - вакцину бруцеллезную живую в дозе согласно инструкции при подкожном вве- дении, что составляет 400 млн клеток на мышь. Данная схема сочетанного применения может быть использована для профилак- тики (торможения) опухолевого роста в группах повышенного риска.
Таблица 1 1 - Оценка противоопухолевой активности поливалентного корпускулярного инактивированного антигена из культура ных штаммов трепонем в комбинации с вакциной бруцеллезной живой при использовании опухолевой модели меланомы В 16, Х ср ±
Таблица 12 - Оценка противоопухолевой активности поливалентного корпускулярного инактивированного антигена из культура ных штаммов трепонем в комбинации с вакциной бруцеллезной живой при использовании опухолевой модели саркомы Sa37, X cp ±
Пример 7. Терапия заявляемым средством мышей с привитым опухолевым штаммом карциномы легкого Льюиса LLC.
Для оценки терапевтической эффективности препарата в отношении карцино- мы легкого Льюиса использовали самцов мышей линии C57BL/6. Опухоль транс- плантировали путем подкожного введения в область передней конечности ближе к позвоночнику в объеме 0,5 мл (1 млн. клеток) на мышь. Одной группе животных с лечебными целями вводили поливалентный корпускулярный антиген на основе куль- туральных трепонем подкожно через 1, 3, 5, 7, 14 суток после имплантации опухоли в ра- зовой дозе 0, 125 мг. Второй группе животных вводили сорбированный на гидроокиси алюминия препарат подкожно в разовой дозе 0,625 мг однократно через 1 сут. после имплантации опухоли.
В качестве контрольной группы использовали мышей той же линии с имплан- тированной опухолью без введения исследуемого препарата.
Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показа- телям: торможение роста опухоли (ТРО), увеличение продолжительности жизни (УПЖ) и индекс торможения метастазирования (ИТМ). Порядок расчета показателей приведен в примере 4.
Данные, представленные в таблице 13, свидетельствуют о том, что при пяти- кратном введении поливалентного антигена происходит некоторое (около 13%) тор- можение роста опухоли, и не отмечается существенного увеличения продолжитель- ности жизни животных.
Результаты оценки эффективности использования сорбированного на геле гидроокиси алюминия препарата по лечебной схеме свидетельствуют о том, что дан- ный способ лечения ведет к торможению роста опухоли в пределах 18-24% и сни- жению метастазирования (ИТМ=17,6%).
Таблица 13 - Оценка противоопухолевой активности корпускулярного инактивированного антигена из культуральных штаммов т понем с использованием опухолевой модели карциномы Люиса LLC, Χφ±ΐ9 5
Пример 8. Терапия заявляемым средством кроликов с привитым опухолевым штам- мом карциномы Браун-Пирс
Для оценки профилактической эффективности препарата в отношении карци- номы Браун-Пирс использовали самцов кроликов породы «Великан».
Опухоль трансплантировали путем инъекции опухолевой ткани в яичко. Для этого опухолевый узел бережно гомогенизировали в стерильной ступке с небольшим количеством стерильного 0,9% физиологического раствора хлорида натрия и филь- тровали через 2 слоя марли для удаления крупных кусков опухолевой ткани. Для инъекций брали 0,5 мл 20% взвеси опухолевых клеток.
Животным вводили сорбированный на гидроокиси алюминия поливалентный корпускулярный инактивировнный антиген на основе культуральных трепонем под- кожно в дозе 28 мг антигена в пересчете на сухое вещество однократно. Через месяц после введения препарата проводили интратестикулярную прививку карциномы Браун-Пирс. В качестве контрольной группы использовали кроликов той же породы с имплантированной опухолью без введения исследуемого препарата.
Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показа- телям: торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ). Порядок расчета показателей приведен в примере 4.
Данные, представленные в таблице 14, свидетельствуют о том, что при введе- нии исследуемого препарата, сорбированного на геле гидроокиси алюминия, по про- филактической схеме наблюдается торможения роста карциномы Браун-Пирс на 30 и 60 сутки эксперимента в пределах 20-25%, при этом продолжительность жизни экс- периментальных животных возрастает на 30%.
Таблица 13 - Оценка противоопухолевой активности поливалентного корпускулярного инактивированного сорбированного анти на основе культуральных трепонем с использованием опухолевой модели карциномы Браун-Пирс
Таким образом, заявляемый препарат обладает неспецифическим иммуностиму- лирующим действием с преимущественным влиянием на звенья Т-клеточного иммуни- тета. Препарат при терапевтическом применении эффективно воздействует на опухоли различного гистогенеза
Пример 9. Характеристики неспецифического иммуностимулирующего эффекта по- ливалентного антигена на основе штаммов культуральных трепонем в отношении гетерологичного патогена Salmonella typhimurium
Оценку напряженности гетерологичного иммунитета на фоне иммунизации экспериментальными образцами вакцины проводили на белых мышах обоего пола массой 18,0-20,0 г.
Животных иммунизировали сорбированным на гидроокиси алюминия препа- ратом подкожно в объеме 0,5 мл двукратно с интервалом в 14 сут. в дозе 3,5 мг кор- пускулярного микробного антигена в пересчете на сухое вещество. В иммунизиро- ванной и контрольной группе в последующем оценивали величину показателя LD 50 для культуры штамма Salmonella typhimurium с использованием метода подгрупп.
С этой целью через 60 сут. после введения препарата мышей заражали под- кожно кратными дозами микробной суспензии, приготовленной из агаровой культу- ры штамма S. typhimurium. Всего в опыте использовали 5 доз. Каждой дозой заража- ли по 6 интактных и по 6 иммунизированных животных. За мышами наблюдали в те- чение 14 сут. и регистрировали наличие и сроки гибели животных по группам. Спе- цифичность гибели подтверждали бактериологическим методом.
По окончании наблюдения для контрольной и иммунизированной группы рас- считывали величину показателя LD 0 по методу Кербера в модификации Ашмарина.
lg LD 50 = lg D max - δ · (ΣΠ - 0,5) (2);
где:
LD 50 - доза, вызывающая гибель 50% животных;
δ - логарифм кратности разведения;
Dma - максимальная заражающая доза;
Li - отношение числа павших по специфической причине животных при за- ражении данной дозой к общему числу животных, которым эта доза была введена;
Li - сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.
Коэффициент защиты - отношение величины показателя LD 50 иммунизиро- ванных животных к величине показателя LD50 интактных животных. Полученные данные указывают на наличие у препарата существенного не- специфического иммуностимулирующего действия. Величина показателя LD 50 куль- туры S. typhimurium (гетерологичного патогена) в опытной группе (14,45-10 6 живых микробов) в 6,75 раза превышала аналогичный показатель для контрольной группы животных (2, 14-10 6 живых микробов).
Следует также отметить, что у вакцинированных животных отмечалось удли- нение сроков жизни при инфицировании максимальной из использованных доз воз- будителя сальмонеллеза по сравнению с аналогичной группой интактных животных: среднее время жизни после заражения у вакцинированных животных (группа 5/1) со- ставило 6,5 сут., у интактных (группа 5/2) - 3,5 сут.
Таким образом, проведенные исследования показывают, что заявляемый препа- рат обладает неспецифическим иммуностимулирующим действием с преимуществен- ным влиянием на звенья Т-клеточного иммунитета. Препарат при терапевтическом при- менении эффективно воздействует на опухоли различного гистогенеза.