Die Erfindung betrifft ein Implantat zur Behandlung von osteochondralen Defekten, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Osteochondrale Defekte, also Defekte, die sowohl den Gelenkknorpel als auch den direkt darunter befindlichen Knochen umfassen, können auf zweierlei Art entstehen: zum einen durch fortgeschrittene entzündliche Prozesse wie Arthrosen, welche neben dem Knorpelgewebe auch schon den Knochen geschädigt haben, und zum anderen durch Verletzungen oder weit fortgeschrittenen Verschleiß.

Osteochondrale Defekte werden zum Teil aber auch aus therapeutischen Gründen vom Arzt bewusst erzeugt: da sich ein reines Knorpel-Implantat in der nur 2 mm bis 5 mm dicken Knorpelschicht der Gelenke schlecht verankern lässt, wird manchmal nicht nur das geschädigte Knorpelgewebe entfernt, sondern der Defekt absichtlich in Richtung des darunter liegenden Knochens vergrößert, um im Anschluss daran ein Implantat dann besser fixieren zu können.

Zur Behandlung der Defekte werden sowohl Implantate, die aus natürlichem Gewebe gewonnen werden, als auch Implantate mit Gewebeersatzmaterialien, die meist durch Tissue Engineering hergestellt werden, verwendet. Zur Herstellung von Implantaten durch Tissue Engineering wird im ersten Schritt eine die extrazelluläre Struktur imitierende Matrix mit vielen Hohlräumen aus vorzugsweise biologisch abbaubaren Materialien geschaffen, deren Hohlräume dann im nächsten Schritt mit vorwiegend körpereigenen Zellen besiedelt und durch Schaffung entsprechender Wachstumsbedingungen ausgefüllt werden. Es ist auch bekannt, Zellen in gelartigen Trägermaterialien zu immobilisieren. Matrixmaterial und Zellen werden spezifisch danach ausgewählt, ob ein knöchernes oder ein Knorpelgewebe implantiert werden soll.

Implantate, die an der Grenzfläche von zwei oder mehr unterschiedlichen Gewebetypen eingesetzt werden sollen, sind optimalerweise bi- oder mehrphasisch aufgebaut, um den Anforderungen aller jeweiligen Umgebungsgewebe gerecht zu werden, mit denen das Implantat in Kontakt kommt.

Bereits bekannte biphasische Implantatmaterialien für osteochondrale Defekte bestehen jeweils aus zwei gänzlich unterschiedlichen Material-Komponenten, die dann zu einem Werkstück zusammengesetzt werden. Für die Knochenmatrix werden z. B. poröse Calciumphosphat-Keramiken (ß-TCP) und für die Knorpelmatrix Gele verwendet. Das Problem dieser zusammengesetzten Implantate ist die Verbindung der unterschiedlichen Komponenten. Nach dem Stand der Technik erfolgt diese z. B. durch Verklebung mit Fibrinkleber, welche allerdings den im Gelenk auftretenden Scherbelasrungen auf Dauer nicht gewachsen ist.

DE 197 21 661 beschreibt beispielsweise ein Knochen-Knorpel-Implantat, welches aus einer Vielzahl von regelmäßig in einem Gitter angeordneten Stäben besteht. Die Verbindung der Gitterstrukturen geschieht zum einen durch Kleben und zum anderen durch Verschmelzen bzw. Schweißen der Gittermaterialien. Letzteres schafft einen festeren Verbund, setzt aber entsprechende Materialien voraus.

In der WO 97/46665 nach Fig. 2 ist ein biphasisches Implantat beschrieben. Eine Kammer wird an einer Seite von einer porösen Knochenmatrix abgeschlossen. Die Kammer wird mit Knorpelzellen besiedelt. Die Knorpelzellen wachsen in die Knochenmatrix ein. Dadurch und durch die Produktion der Knorpelmatrix entsteht ein fester Verbund beider Schichten, ohne dass eine Klebeverbindung erforderlich wäre. Die Besiedelung mit den Knorpelzellen muss vor der Operation erfolgen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Implantat zur Behandlung von osteochondralen Defekten anzugeben, bei dem Knochen- und Knorpelmatrix fest miteinander verbunden sind.

Die Aufgabe wird erfmdungsgemäß gelöst durch ein Implantat mit wenigstens zwei übereinanderliegenden Schichten, darunter einer porösen Knochenmatrix und einer porösen Knorpelmatrix, wobei die Schichtmaterialien an den Grenzflächen der sich berührenden Schichten lokal vermischt sind.

Die lokale Vermischung bewirkt ein Ineinandergreifen der Schichten an ihren Berührungsstellen bis hinunter zur molekularen Ebene. In einem schmalen Bereich durchdringen sich die Schichtmaterialien. Im Grenzflächenbereich liegen vergleichsweise ähnliche Verknüpfungen der Matrixmoleküle vor wie innerhalb der Schichten. Hierdurch werden die Schichten auch ohne Kleber stark miteinander verbunden. Die Verbindung ist auch auf Scherkräfte belastbar.

Ein solches Implantat mit wenigstens zwei Schichten, darunter eine poröse Knochen- und eine poröse Knorpelmatrix, wird erfindungsgemäß hergestellt mit den Schritten a) Herstellen der einzelnen Schichten bzw. des jeweiligen Schichtmaterials, wobei wenigstens eine Schicht bzw. ein Schichtmaterial mit einem Lösungsmittel, das wenigstens die Oberflächen der anderen Schichten anlösen kann, in einen pastösen oder flüssigen Zustand überführt wird, b) Übereinanderlegen oder -schichten der Schichten bzw. Schichtmaterialien und c) Gefriertrocknen des Verbundes.

Dadurch, dass die Schichten zumindest teilweise in fließfähiger oder pastöser Form vorliegen und ein Lösungsmittel enthalten, das auch die Oberfläche der benachbarten Schicht anlösen kann, vermischen sich die Schichten lokal an den sich berührenden Grenzflächen.

Das Lösungsmittel der Schichten ist dabei so ausgewählt, dass es während des Gefriertrocknens, d. h. durch das Anlegen eines Vakuums an das eingefrorene Material, direkt aus dem gefrorenen Zustand in den gasförmigen Zustand übergeht. Neben Wasser sind Essigsäure und Cyclohexan weitere bevorzugte Lösungsmittel.

Die Porengröße der Matrixschichten wird dabei vorzugsweise durch Einfrieren eingestellt. Durch Gefriertrocknen bleiben an den Stellen, an denen im gefrorenen Zustand Lösungsmittelkristalle enthalten waren, Poren zurück. Es wird ein schwammartiger, schaumstoffähnlicher Werkstoff gebildet, der eine Vielzahl statistisch verteilter Poren enthält, die in einem nach außen offenen Porensystem angeordnet sind. (s. a. M. Gelinsky, U. König, A. Sewing, W. Pompe: Poröse Scaffolds aus mineralisiertem Kollagen - ein biomimetisches Knochenersatzmaterial. Materialwiss. Werkstofftech. 2004, 35, 229-233).

Das Implantat kann vorteilhaft beliebig geformt sein und damit in seiner äußeren Geometrie an die Größe und Struktur des zu ersetzenden Knochen- und Knorpel-Gewebes angepasst werden.

Das erfindungsgemäße Implantat ist im feuchten Zustand elastisch und passt sich damit der Defektgeometrie an, was einen guten Kontakt zwischen den Geweben und dem Implantatmaterial garantiert. Außerdem erlaubt die Elastizität eine Vorkultivierung mit Zellen unter zyklischer mechanischer Stimulation. Seine Druckfestigkeit ist höher als bei konventionell hergestellten, unvernetzten Kollagenschwämmchen vergleichbarer Porosität, deren Poren zumeist bereits beim Anfeuchten kollabieren; es wird daher bevorzugt für die Therapie kleinerer bis mittlerer Defekte verwendet. In zyklischen Druckexperimenten weist ein Implantat mit Zylindergeometrie bei einer 30%igen uniaxialen Kompression in Richtung der Zylinderachse bevorzugt einen E-Modus von 10-40 kPa, besonders bevorzugt 15 bis 25 kPa auf.

Das Implantat ist porös, mit nach außen offenen und interkonnektierenden Poren, vorzugsweise komplett resorbierbar und kann entweder zellfrei, oder aber in vitro vorbesiedelt mit einem oder mehreren Zelltypen implantiert werden. Die durchschnittliche Porengröße beträgt bevorzugt mindestens 80 μm, besonders bevorzugt 100 bis 200 μm, ein Durchmesser, der optimal für die Besiedlung mit Zellen ist. Knochenanteil und Knorpelanteil weisen bevorzugt eine vergleichbare Porosität auf (gleiche durchschnittliche Porengröße, Verteilung der Poren). Unter resorbierbarem Material ist hier und im folgenden Text zu verstehen, dass das Material nach der Implantation im Körper langsam durch biologische oder chemische Prozesse abgebaut wird bzw. sich langsam auflöst. Eine partielle Resorption des Materials kann auch während der Zellkultivierung in vitro einsetzen.

Das Implantat wird binnen 3 bis 24 Wochen, bevorzugt zwischen 4 und 8 Wochen, im Körper vollständig resorbiert und zu lebendem Gewebe umgebaut.

Zur Behandlung eines osteochondralen Defektes wird der nicht-mineralisierte Knorpelersatzanteil vorzugsweise mit autologen Knorpelzellen (Chondrozyten) besiedelt. Der Knochenanteil wird in einer besonderen Ausführungsform mit autologen Knochenzellen (Osteoblasten) oder auch autologen mesenchymalen Stammzellen des Patienten vorbesiedelt.

Die Knochenmatrix besteht im wesentlichen aus fibrillärem Kollagen Typ I, welches vorzugsweise mit Calciumphosphat, besonders bevorzugt mit Hydroxylapatit (HAP), mineralisiert ist - und imitiert damit die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix des Knochengewebes.

Das mineralisierte Kollagen wird bevorzugt nach dem bereits aus EP0945146 oder EP0945147 bekannten Verfahren hergestellt.

Die Knorpelmatrix besteht bevorzugt aus fibrillärem, nicht-mineralisiertem Kollagen Typ I und/oder Kollagen Typ II oder Hyaluronsäure bzw. Hyaluronsäure-Derivaten oder aus einem Komposit aus Kollagen und Hyaluronsäure oder Hyaluronsäure-Derivaten und gegebenenfalls weiteren Bestandteilen der extrazellulären Knorpelmatrix, wie Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat und/oder Heparansulfat.

Bevorzugt wird der Komposit aus fibrillärem Kollagen und Hyaluronsäure dadurch gebildet, dass die Hyaluronsäure während der Fibrillogenese des Kollagens anwesend ist und damit zumindest teilweise in die sich während der Fibrillogenese bildenden Kollagenfibrillen eingebaut wird. Dadurch entsteht ein Kompositmaterial, in dem beide Komponenten homogen verteilt und miteinander verbunden sind.

Das Kollagen für die Knochenmatrix ist bevorzugt vom Typ I, welches als humanes Kollagen rekombinant hergestellt oder aus Rindersehnen oder anderen tierischen Quellen isoliert wurde und zur klinischen Anwendung zugelassen ist. Bevorzugt wird ein säurelösliches Kollagen gewählt, wie z. B säurelösliches bovines Kollagen I des Herstellers Syntacoll (Saal/Donau, Deutschland).

Das Kollagen für die Knorpelmatrix ist bevorzugt vom Typ I oder II oder eine Mischung beider Typen. Es wird als humanes Kollagen ebenfalls bevorzugt rekombinant hergestellt oder aus Kalbshaut bzw. anderen tierischen Quellen isoliert und sollte zur klinischen Anwendung zugelassen sein, wie beispielsweise das Produkt Collaplex 1.0 des Herstellers GfN (Waldmichelbach, Deutschland).

Die Hyaluronsäure für die Knorpelmatrix ist bevorzugt eine durch Mikroorganismen (z. B. Streptococcus equi) hergestellte. Der Begriff Hyaluronsäure schließt dabei auch ihre Salze mit ein, wie z. B. das von Fa. Fluka angebotene Produkt Hyaluronsäure Natriumsalz mit einer Löslichkeit in Wasser von 5 mg/ml. Bevorzugte Hyaluronsäure-Derivate sind Hyaluronsäure- Ester (z. B. Benzylester).

In einer besonderen Ausführungsform des Implantats liegt zwischen den Schichten für den Knochenersatz und für den Knorpelersatz eine filmartige, aus resorbierbaren Biopolymeren bestehende porenlose bzw. -arme Zwischenschicht.

Die Zwischenschicht besteht dabei bevorzugt aus einem Biopolymer, das wenigstens an der Oberfläche vom Lösungsmittel der Schichten für den Knochenersatz und den Knorpelersatz anlösbar ist. Dadurch sind die Materialien der sich berührenden Schichten an den jeweiligen Grenzflächen ebenfalls lokal vermischt.

Bevorzugt besteht die Zwischenschicht aus einer Folie aus Hyaluronsäure oder Hyaluronsäure-Drivaten oder einer Folie aus einem anderen Glycosaminoglycan, wie z. B. Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat und Heparansulfat, Die Zwischenschicht wird bevorzugt an Luft getrocknet. Sie ist dabei im Vergleich zur Knochen- bzw. Knorpelmatrix weitgehend porenlos und dadurch für Chondrozyten und/oder Osteoblasten bzw. mesenchymale Stammzellen undurchlässig Sie erfüllt damit eine Doppelfunktion. Hinsichtlich der Festigkeit des Implantats verbindet sie und in Bezug auf das Einwachsen der Zellen wirkt sie als Trennschicht.

In einer vorzugsweisen Ausführung enthält das Implantat eine Stützstruktur mit Öffnungen. Die Stützstruktur versteift das Implantat. Durch die Öffnungen können sich die Schichtmaterialien direkt berühren und ebenfalls lokal vermischen Bevorzugt wird als Stützstruktur ein zwei- oder dreidimensionale Gestick aus resorbierbaren und biokompatiblen Polymerfasern (bevorzugt aus Poly-L-lactid, Poly-DL-lactid, Polyglykolid, Polyhydroxybutyrat oder Copolymeren aus diesen) eingesetzt.

In einer weiteren Ausführungsform bestellt die Stützstruktur aus einem mit Fasern beflockten Trägermaterial gemäß DE 103 12 144.7, wobei der Abstand zwischen den Flockfasern so dimensioniert sein muss, dass die flüssigen Matrixmaterialien die Zwischenräume vollständig ausfüllen können. Der bevorzugter Abstand der Fasern liegt hierbei bei ca. 200-1000 μm.

Durch die parallele Anordnung der Flockfasern wird eine mechanische Stabilisierung in Richtung der Fasern erreicht.

Als Materialien des Basismaterials, der Fasern und des Klebstoffs kommen grundsätzliche alle in DE 103 12 144.7 genannten resorbierbaren Materialien in Betracht.

Bevorzugte Materialien für die Fasern sind Polyhydroxybutyrate oder Polylactide und als Klebstoff findet bevorzugt Gelatine Verwendung.

Das Trägermaterial gemäß DE 103 12 144.7 besteht dabei bevorzugt aus einer Schicht eines Basismaterial, welches auf einer Seite mit Fasern beflockt ist. Bevorzugt besteht das Basismaterial selbst aus einem Tape aus mineralisiertem Kollagen und bildet die unterste Schicht des Knochenersatzanteils. Der poröse Knochenersatzmaterialanteil liegt dabei bevorzugt auf dem Tape aus mineralisiertem Kollagen auf und umgibt die Fasern, bevorzugt jedoch nur den unteren Teil oder die unteren Enden (d. h. die Enden der Fasern, die mit dem Basismaterial verbunden sind). Die Knorpelersatzanteilschicht schließt sich dabei bevorzugt so an die Knochenersatzmaterialanteilschicht an, dass ein Teil der Fasern oder die Spitzen der Fasern noch in die Knorpelmatrix hineinragen.

In einer besonderen Variante des erfindungsgemäßen Implantats enthält der Knochen¬ ersatzanteil und/oder der Knorpelersatzanteil Wirkstoffe, wie z. B. pharmazeutische Stoffe, Aminosäuren oder Aminosäurederivate, Peptide, Proteine, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Antikörper, Oligonukleotide, cDNA, DNA-Fragmente, Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate.

Vorteilhaft lassen sich mit dem Verfahren leicht Implantate in beliebiger Form und Größe und somit - für die Herstellung von Implantaten für osteochondrale Defekte - auch mit einem individuellen Dicke- Verhältnis von Knochenersatzanteil und Knorpelersatzanteil erzeugen. Das Übereinanderschichten geschieht bevorzugt durch Übereinandergießen in einem dreidimensionalen Behälter. Zum Zeitpunkt des Übereinanderschichtens liegen dazu die Matrixmaterialien bevorzugt in pastöser oder flüssiger Form vor.

Geometrie und Größe des Implantats werden durch die Geometrie und Größe des zum Übereinanderschichten der Schichten verwendeten Behälters bestimmt, der vorteilhaft beliebig geformt sein kann. Außerdem kann sowohl der eingefrorene Körper (vor der Gefriertrocknung) als auch das gefriergetrocknete Implantat durch Schneiden, Fräsen, Bohren oder dergl. bearbeitet werden und damit die Größe und Form des Implantats vorteilhaft weiter angepasst werden.

Die Mikrostruktur der Poren, insbesondere die Porengröße, des Implantats ist abhängig von der Größe der während des Einfrierens gebildeten Lösungsmittelkristalle. Diese kann vorteilhaft durch Geschwindigkeit und Temperatur des Einfrierens eingestellt werden. Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 100 bis 250 μm, der optimal für das Einwachsen von Zellen ist, werden vorteilhaft durch langsames Einfrieren bei -5°C bis -50°C, vorzugsweise -15°C bis -35°C gebildet. Das langsame Einfrieren wird beispielsweise dadurch erreicht, dass der übereinandergeschichtete Knochersatzanteil und der Knorpelersatzanteil, bzw. der Behälter, der diese enthält, in einen auf die entsprechende Temperatur vortemperierten Gefrierschrank gestellt wird.

Die Mikrostruktur der Poren wird auch durch den Lösungsmittelgehalt der Schichten für den Knochersatzanteil und den Knorpelersatzanteil beeinflusst. Um die gewünschte, hohe Porosität zu erhalten, enthalten beide Schichten vor dem Einfrieren bevorzugt 75 bis 98%, besonders bevorzugt 80 bis 90% Lösungsmittel

In einer besonderen Variante des Verfahrens wird zunächst die eine Schicht in einen Behälter gegossen und eingefroren. Vor oder bei dem Übereinanderschichten mit der zweiten Schicht wird dann die erste (gefrorene) Schicht an der Oberfläche angetaut. Die zweite Schicht vermischt sich dann lokal mit der angetauten Oberfläche. Die zweite Schicht wird dazu entweder auf die angetaute Oberfläche gegossen, oder selbst etwas erwärmt, so dass die Oberfläche der ersten Schicht durch das Übereinanderschichten selbst angetaut wird. Bevorzugt wird hier die gefrorene Schicht vor dem Übereinandergießen durch Schneiden, Fräsen, Bohren oder dergl. an die gewünschte Form angepasst. Diese Variante hat damit den Vorteil, dass die Verbundfläche zwischen Knochenersatzanteil und Knorpelersatzanteil beliebig dreidimensional gestaltet und damit an die natürliche Form des Gelenks angepasst werden kann. Darüberhinaus kann durch eine dreidimensionale Verbundfläche die Festigkeit des Implantats gegenüber einer zweidimensionalen Verbundfläche erhöht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das nach der Gefriertrocknung erhaltene Implantat chemisch quervernetzt, um die Schichten durch die Einführung chemischer Bindungen in sich zu stabilisieren und fest miteinander zu verknüpfen. Die Einführung chemischer Bindung geschieht bevorzugt mit einem chemischen Crosslinker, wie z. B. Glutaraldehyd oder einem Carbodiimid-Derivat, besonders bevorzugt mit EDC (N- Dimethylaminopropyl-N'-ethyl-carbodiimid Hydrochlorid). Durch EDC als chemischen Crosslinker werden beispielsweise Aminoguppen des Kollagens kovalent mit Carboxylgruppen zu Arnidbindungen verknüpft sowie Carboxylgruppen des Kollagens bzw. der Hyaluronsäure kovalent mit Hydroxylgruppen der Hyaluronsäure zu Esterbindungen verknüpft.

Zur mechanischen Verstärkung kann eine Stützstruktur, bevorzugt aus resorbierbaren und biokompatiblen Polymerfasern (bevorzugt aus Poly-L-lactid, Poly-DL-lactid, Polyglykolid, Polyhydroxybutyrat oder Copolymeren aus diesen), in das Implantat eingebracht werden. Hierzu wird eine zwei-, oder dreidimensionale Faserstruktur, bevorzugt erzeugt durch Sticken, vor dem Einfüllen der ersten Phase in die Form gelegt. Die gießfähige Lösung oder Suspension der ersten Phase wird nun so darübergegossen, dass die Zwischenräume zwischen den Fasern ausgefüllt werden. Hierzu kann auch ein leichter Unterdruck angelegt oder aber kurz zentrifugiert werden. Anschließend wird wie beschrieben die zweite Phase darübergeschichtet, das Konstrukt eingefroren und gefriergetrocknet. Die Faserstruktur kann sich entweder im gesamten Implantat befinden oder aber nur in einer der beiden Phasen.

Zur Herstellung eines Implantates, welches ein vermittels Flocktechnik hergestelltes Trägermaterial gemäß DE 103 12 144.7 enthält, wird entsprechend verfahren: das Trägermaterial wird, mit dem Basismaterial nach unten, in die Form gelegt, in welcher das Implantat hergestellt werden soll. Dann werden, wie beschrieben, die beiden Lösungen oder Suspensionen nacheinander übereinandergegossen. Zum besseren Eindringen der Lösungen oder Suspensionen in die Faserzwischenräume kann ein leichter Unterdruck angelegt oder aber kurz zentrifugiert werden. Die Flockfasern können entweder das Implantat in seiner gesamten Höhe durchdringen, oder aber nur einen Teil derselben. In direktem Kontakt mit dem Basismaterial kann sich entweder der Knochenersatzanteil, oder aber der Knorpelersatzanteil befinden. Zur Herstellung von Implantaten, welche mit Wirkstoffen funktionalisiert worden sind, können verschiedene Verfahren angewendet werden. Die Wirkstoffe können entweder einer oder beiden Phasen vor dem Übereinanderschichten zugegeben werden, oder aber nach dem ersten Gefriertrocknen (und damit noch vor der chemischen Quervernetzung). Die Wirkstoffe können in fester Form in den Lösungen oder Suspensionen suspendiert werden— oder aber als Lösung auf das gefriergetrocknete Implantat aufgebracht werden. Empfindliche Wirkstoffe, insbesondere Wachstumsfaktoren, welche durch die Prozeßschritte in ihrer biologischen Wirksamkeit beeinträchtigt werden könnten, werden bevorzugt erst nach der chemischen Quervernetzung und der zweiten Gefriertrocknung aufgebracht. Eine weitere Variante stellt die Funktionalisierung des Implantats mit Wirkstoffen direkt vor der Operation dar: in diesem Fall wird der Wirkstoff oder werden die Wirkstoffe in steriler Form auf das gleichfalls sterile Implantat aufgebracht, bevorzugt als Lösung aufgetropft. Der Knochenersatzanteil und der Knorpelersatzanteil kann in allen Fällen entweder mit den selben Wirkstoffen funktionalisiert werden, oder aber mit verschiedenen — oder aber es wird nur der Knochen- oder der Knorpelersatzanteil mit einem oder mehreren Wirkstoffen funktionalisiert.

Anhand der nachfolgend beschriebenen Figuren und Ausfuhrungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert. Im einzelnen sind dies:

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines osteochondralen Defektes A, bei dem sowohl der Gelenkknorpel B als auch der darunterliegende (subchondrale) Knochen C betroffen ist.

Fig. 2 zeigt links schematisch den Aufbau eines biphasischen Implantates für osteochondrale Defekte mit Zylinder-Geometrie, welches aus einer Knorpelmatrix 1 und einer Knochenmatrix 2 aufgebaut ist. Die Knorpelmatrix 1 besteht aus einem Kollagen- Hyaluronsäure-Komposit, die Knochenmatrix 2 aus mineralisiertem Kollagen. Rechts ist in Form eines Längsschnittes schematisch der Aufbau eines individuell geformten, biphasisches Implantates dargestellt, bei welchem die Knochenmatrix 2 nur mit Teilbereichen des Knorpelmatrix 1 verbunden ist.

Zur Herstellung dieser Implantate gemäß Fig. 2 wird für den Aufbau der Knochenmatrix 2 zunächst eine Suspension aus mineralisierten Kollagen-Fibrillen und für die Knorpelmatrix 1 eine Suspension aus Kollagen-Hyaluronsäure hergestellt.

a.) Herstellung der Suspension aus mit Hydroxylapatit mineralisierten Kollagen-Fibrillen:

In einem 2 1 Erlenmeyerkolben wird dazu 1 g säurelösliches Kollagen (Kollagen Typ I isoliert aus Rindersehnen der Fa. Innocoll in Saal/Donau, Deutschland) in 1 1 10 mmol/1 HCl (hergestellt aus 100 ml 0,1 mol/1 HCl und 900 ml deioiisiertem Wasser) unter kräftigem Rühren (großer Rührfisch/Magnetrührer) gelöst. Unter kräftigem Rühren wird nun der Reihe nach zugegeben: 1) 180 ml 0,1 mol/1 CaCl2-Lösung 2) 120 ml 2 mol/1 NaCl-Lösung 3) 168 ml 0,5 mol/1 TRIS-Pufferlösung (pH = 7,5) 4) 500 ml deionisiertes Wasser 5) 22,6 ml Phosphatpuffer nach Sörensen (0,5 mol/1; pH = 7,4)

Bei der Zugabe des Phosphatpuffers tritt eine milchige, farblose Trübung der Lösung auf (ausfallende Calciumphosphate). Zum Schluß wird mit deionisiertem Wasser auf 2,0 1 aufgefüllt. Nachdem noch für etwa 1 min. kräftig gerührt wurde, verschließt man den Kolben mit Parafüm oder Alu-Folie und stellt ihn für 12-24 h in ein auf 350C temperiertes Wärmebad.

Das mineralisierte Kollagen wird durch Zentrifugation abgetrennt. Hierzu wird der gallertartige Niederschlag kräftig aufgerührt und dann in geeignete Zentrifugenröhrchen (z. B. Metall-Becher für 200 ml oder Glasröhrchen für 50 ml) gefüllt. Es wird für 15 min bei 2500 U/min in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert (um eine Erwärmung des Produktes zu verhindern) und dann vom Überstand abgegossen; hierbei werden 120 ml des Überstandes für die spätere Verwendung aufbewahrt. Nun wird von der Kollagen-Suspension nachgefüllt und die Zentrifugation so oft wiederholt, bis alle 2 1 entsprechend behandelt worden sind. Nach dem letztmaligen Abgießen des Überstandes werden die Pellets mit einem Löffelspatel aus den Röhrchen geholt und in einem 125 ml Becherglas gesammelt. Unter Rühren mit einem schweren Rührfisch wird nun gerade soviel Mutterlauge tropfenweise zugegeben, bis eine gießfahige Suspension entsteht.

Dieses Verfahren zur Herstellung von mineralisiertem Kollagen entspricht im wesentlichen EP0945146 (J.-H. Bradt, K. Weis, W. Pompe). Alternativ wird das mineralisierte Kollagen ausgehend von rekombinatem Kollagen nach dem in EP0945147 beschriebenen Verfahren hergestellt.

b.) Herstellung der Suspension aus Kollagen und Hyaluronsäure:

Für den Aufbau des Knorpelersatzanteils 1 wird zunächst eine Suspension aus Kollagen und Hyaluronsäure mit 20 Gew.-% Hyaluronsäure hergestellt. Dazu werden 200 mg Hyaluronsäure (Hyaluronsäure Natriumsalz aus Streptococcus equi, Fa. Fluka (Sigma/Aldrich, Taufkirchen) in 40 ml deionisiertem Wasser gelöst und für 1 h gerührt, bis eine farblose, transparente Suspension hoher Viskosität entstanden ist.

In der Zwischenzeit wird 1 g säurelösliches Kollagen (z. B. Collaplex 1.0, aus Kalbshäuten isoliertes Kollagen Typ I des Herstellers GfN, Waldmichelbach) zu 1 1 10 mM HCl in einen Erlenmeyerkolben gegeben und unter Rühren gelöst (Magnetrühr er). Danach werden 80 ml Phosphatpuffer nach Sörensen (0,5 M; pH = 7,4) und 130 ml 2 M NaCl zugegeben, die Lösung wird mit 750 ml deionisiertem Wasser aufgefüllt und nochmals verrührt. Unter kräftigem Rühren wird die Hyaluronsäure-Lösung zugegeben. Der Kolben wird anschließend für etwa 14 h in ein auf 370C temperiertes Wärmebad gestellt. Der hierbei entstehende Komposit aus fϊbrillärem Kollagen und Hyaluronsäure fällt als unlöslicher Niederschlag aus. Die Suspension wird aufgerührt, in geeignete Zentrifugen-Gläser abgefüllt und für 15 min bei 2500 U/min zentrifugiert. Vom anfallenden Überstand werden etwa 100 ml aufbewahrt. Die durch die Zentrifugation erzeugten Pellets aus dem Kollagen-Hyaluronsäure-Komposit werden in einem Becherglas mit gerade soviel Überstand gründlich verrührt (Magnetrührer), bis eine homogene und pipettierfahige Suspension entsteht.

c.) Herstellung des biphasischen, porösen Implantats:

Zur Herstellung des biphasischen, porösen Implantates wird nun zunächst ca. 1 ml der gemäß a) hergestellten Suspension aus mineralisierten Kollagen-Fibrillen mit einer Pipette in die Vertiefung einer 24er Wellplatte gegeben. Darauf wird nun vorsichtig und so, dass sich die beiden Phasen nicht vermischen, 1 ml der unter b) beschriebenen Kollagen/Hyaluronsäure- Suspension pipettiert. Die Wellplatte wird nun bei ca. -25°C eingefroren und anschließend im Ölpumpenvakuum (ca. 0,1 mbar) gefriergetrocknet. Der hierbei entstandene poröse, schwammartige Scaffold wird aus der Wellplatte entnommen und für eine Stunde in einer 1%-igen Lösung von N-Dimethylaminopropyl-N'-ethyl-carbodiimid Hydrochlorid (EDC) in 80 Vol-% Ethanol chemisch quervernetzt. Im Anschluß an die Quervernetzung wird der Scaffold erst gründlich mit dest. Wasser, dann mit einer l%igen, wässrigen Glycin-Lösung und zuletzt nochmals mit dest. Wasser gewaschen. Zuletzt wird das Implantat wieder eingefroren und gefriergetrocknet.

Fig. 3 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Dünnschnittes in Längsrichtung durch ein - wie zu Fig. 2 beschrieben hergestelltes - Implantat (Vergrößerung 10*). Die mineralisierte Knochenmatrix 2 (oben) ist dunkel gefärbt - die nicht-mineralisierte Knorpelmatrix 1 (unten) ist deutlich heller. Gut erkennbar ist, dass die Matrixmaterialien direkt miteinander verbunden sind und sich an der Grenzfläche 3 gegenseitig durchdringen. Beide Phasen weisen mit einem Porendurchmessern von ca. 50-200 μm eine vergleichbare Porosität auf.

Fig. 4 zeigt eine Raster-Elektronenmikroskopieaufhahme (REM) eines Längsschnittes durch ein wie zu Fig. 2 beschrieben hergestelltes Implantat (Vergrößerung 15x). Die mineralisierte (hier heller erscheinende) Knochematrix 2 Teil befindet sich links im Bild, die Knorpelmatrix 1 rechts. Gut erkennbar ist wieder, dass die Matrixmaterialien direkt miteinander verbunden sind und sich an der Grenzfläche 3 gegenseitig durchdringen, wobei beide Schichten eine vergleichbare Porosität aufweisen.

Fig. 5 zeigt REM Element-Mapping-Aufhahmen der Grenzfläche zwischen der mineralisierten Knochenmatrix 2 (links) und der nicht-mineralisierten Knorpelmatrix 1 (rechts) des wie zu Fig. 2 beschrieben hergestellten Implantates Die Abbildungen stellen jeweils einen Ausschnitt von Fig. 4 dar (Vergrößerung: jeweils 5Ox). Die mineralisierte (hier heller erscheinende) Knochenmatrix 2 befindet sich jeweils links im Bild, die Knorpelmatrixl 1 rechts.

Oben links in Fig. 5 ist ein normales REM-BiId gezeigt (Fig. 5A). Oben rechts ist eine BSE- Aufhahme (Fig. 5B - Detektion der rückgestreuten Elektronen = backscattered electrons) abgebildet. Die im linken Bereich der Fig. 5B zu sehende Hellfärbung weist die Anwesenheit von Atomen höherer Ordungszahl nach. Diese Hellfärbung ist auf die in der Knochenmatrix enthaltenen Calcium- und Phosphoratome des Calciumphosphats zurückzuführen.

Die unteren Bilder in Fig. 5 zeigen den Nachweis von Calcium (unten links, Fig. 5C) und unten rechts den Nachweis von Phosphor (Fig. 5D) einzeln. Die Hellfärbung weißt jeweils auf Calcium (Fig. 5C) bzw. Phosphor (Fig. 5D) hin.

Fig. 5 verdeutlicht die nur partielle Mineralisierung des Implantats: die Bestandteile des Calciumphosphates (Calcium und Phosphor) können nur in der mineralisierten Knochenmatrix 2 (in den Abbildungen jeweils links) nachgewiesen werden. Die Grenzfläche 3 ist nur in den Figuren 5B-D gut zu erkennen.

Fig. 6 zeigt eine Detailaufhahme der Grenzfläche zwischen der nicht-mineralisierten Knorpelmatrix 1 (oben) und der mineralisierten Knochenmatrix 2 (unten). Die Figur stellt einen Ausschnitt von Fig. 4 dar (Vergrößerung: 500x). Deutlich sichtbar sind die hell erscheinenden Calciumphosphat-Kristallite im unteren Teil des Bildes, welche die mineralisierte Phase charakterisieren und deren Oberfläche rauher erscheinen lassen. Die oben zu sehende Knorpelmatrix 1, bestehend aus einem Komposit aus Kollagen I und Hyaluronsäure, besitzt dagegen eine glatte Oberfläche. Fig. 7 zeigt einen vergrößerten Ausschnitt des direkten Kontaktbereichs zwischen der Knorpelmatrix 1 (oben) und der mineralisierten Knochenmatrix 2 (unten) (Vergrößerung: 100Ox). Die innige Verbindung beider Phasen im Bereich der Verbundfläche 3 ist gut zu erkennen.

d.) Besiedlung des Implantats mit Chondrozyten

Zur in vzϊrσ-Besiedlung des Knorpelersatzanteiles mit primären humanen Chondrozyten wird ein steriles zylindrisches biphasisches Implantat mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 6 mm (3 mm Knorpelersatz- und 3 mm Knochenersatzphase) für 24 Stunden in 5 ml modifiziertem DMEM-Zellkulturmedium (Gibco Life Technologies GmbH, Karlsruhe) eingelegt und gequollen, wobei das Medium 4 Mal gewechselt wird. Zur Zellbesiedelung wird das Implantat aus dem Medium herausgenommen und auf ein steriles Filterpapier gesetzt, so dass das Medium weitgehend aus der porösen Struktur herausgesaugt wird. Nun werden auf die oben befindliche Knorpelersatzphase 5><105 primäre humane Chondrozyten, suspendiert in 200 μl Zellkulturmedium, pipettiert. Nach 2 Stunden Lagerung im Brutschrank werden die besiedelten Implantate in eine 24er Wellplatte mit frischem Zellkulturmedium überführt und nach Standardbedingungen bis zur Implantation kultiviert.

e.) Herstellen eines Implantats mit einer Zwischenschicht aus einer Hyaluronsäurefolie

Zur Herstellung eines Implantats mit einer Zwischenschicht aus einer Hyaluronsäurefolie werden wie unter a.) und b.) beschrieben Suspensionen aus mineralisiertem Kollagen bzw. einem Kollagen-Hyaluronsäure-Komposit hergestellt. Eine Hyaluronsäure-Folie wird durch Eintrocknen einer gesättigten wäßrigen Lösung von Hyaluronsäure Natriumsalz aus Streptococcus equi (Fa. Fluka; Sigma/Aldrich, Taufkirchen) an Luft erzeugt. Hierzu wird eine Hyaluronsäure-Lösung günstigerweise in eine Petrischale gegossen. Wie unter c.) beschrieben, wird 1 ml der mineralisierten Kollagen-Suspension in die Vertiefung einer 24er Wellplatte pipettiert. Auf die Suspension wird nun ein passend zugeschnittenes Stück der Hyaluronsäurefolie gelegt, worauf wiederum die Suspension des Kollagen-Hyaluronsäure- Komposites pipettiert wird. Wie unter c.) beschrieben, wird das entstandene biphasische Konstrukt eingefroren, gefriergetrocknet, chemisch quervernetzt, gewaschen und zuletzt erneut gefriergetrocknet.

Fig. 8 zeigt schematisch den Querschnitt durch ein solches Implantat, wobei mit 1 die Knorpelmatrix (oben), mit 2 die mineralisierte Knochenmatrix (unten) und mit 4 die Hyaluronsäurefolie als Trennschicht bezeichnet sind.

' f.) Herstellen eines Implantats mit einem dreidimensionalen Gestick als Stützstruktur

;/ Wie unter a.)~α) beschrieben wird ein biphasisches Implantat durch Übereinanderschichten zweier Suspensionen hergestellt, mit dem Unterschied, dass vor dem Einfüllen der ersten Phase in die dafür vorgesehene Form in letztere ein Gestick aus Polyhydroxybutyrat-Fäden eingelegt wird. Zum besseren Eindringen der Suspension in die Zwischenräume des Gestickes wird nach dem Aufpipettieren der beiden Suspensionen jeweils für 5 Min. für 1000 U/min zentrifugiert.

Fig. 9 demonstriert den schematischen Aufbau eines solchen Implantates in Form eines Querschnittes durch eine zylindrische Probe. Mit 1 ist die Knorpelmatrix (oben), mit 2 die mineralisierte Knochenmatrix (unten) und mit 5 das Gestick aus Polyhydroxybutyrat-Fäden bezeichnet, welches beide Phasen durchdringt.

g.) Herstellen eines Implantats mit über Flocktechnik hergestellter Stützstruktur

Analog wie unter f.) beschrieben verfährt man, wenn man ein gemäß DE 103 12 144.7 vermittels Flocktechnik hergestelltes Trägermaterial als Stützstruktur in das Implantat integrieren will. Das Trägermaterial - bestehend aus einem Basismaterial aus einer mineralisierten Kollagen-Membran, einer Klebeschicht aus Gelatine und Flockfasern aus Polyhydroxybutyrat — wird, mit dem Basismaterial nach unten, in die Vertiefung einer 24er Wellplatte gelegt, in welcher das Implantat hergestellt werden soll. Dann werden, wie unter a.)-c.) beschrieben, jeweils 1 ml der beiden Suspensionen nacheinander übereinandergegossen. Zum besseren Eindringen der Suspensionen in die Faserzwischenräume wird, wie unter f.) beschrieben, kurz zentrifugiert. Weiter verfahrt man wie unter c.) und f.) beschrieben.

Fig. 10 zeigt das Ergebnis als schematischen Längsschnitt, wobei mit 1 die Knorpelmatrix (oben), mit 2 die mineralisierte Knochenmatrix (unten), mit 6 das Basismaterial (Membran aus mineralisiertem Kollagen), mit 7 die Klebeschicht (Gelatine) und mit 8 die Flockfasern (Polyhydroxybutyrat) des Trägermaterials bezeichnet sind.