Verbesserte Biokatalysatoren zur Herstellung von Duloxetinalkohol

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Phenylethanol-Dehydrogenase-Mutanten, Verfahren zu deren Herstellung; dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Mikroorganismen, welche diese Sequenzen enthalten; Verfahren zur biokatalytischen Synthese von substituierten, optisch aktiven Alkoholen unter Verwendung dieser Mutanten; sowie insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Duloxetinalkohol bzw. Duloxetin, umfassend einen von diesen Mutanten katalysierten biokatalytischen Syntheseschritt.

Hintergrund der Erfindung:

Duloxetinalkohol (3) ist eine wichtige Vorstufe bei der Herstellung von Duloxetin (4) (vgl. Schema 1 ), welches unter dem Handelsname Cymbalta® unter anderem als Anti- depressivum vertrieben wird.

TAC TACA, nicht isoliert Duloxetinalkohol 1 2 3

Duloxetin 4

Schema 1 : Herstellung von Duloxetin über Duloxetinalkohol Die dabei auftretende Zwischenstufe (TACA) (2) kann mit Hilfe einer Dehydrogenase hergestellt werden (vgl. WO2005/033094). Beispielsweise reduziert die Phenylethanol- Dehydrogenase EbN1 aus Azoarcus sp. (neuere Bezeichnung Aromatoleum aromati- cum) (vgl. Höffken et al., Biochemistry, Vol. 45, No.1 , 2006) das Chlorketon 3-Chlor-1- (thienyl-2-yl)-propan-1-on (1 ) zum korrespondierenden Chloralkohol (1 S)-3-Chlor-1- (thienyl-2-yl)-propan-1-ol (2), analog zu einer Meerwein-Ponndorf-Reduktion. Die Dehydrogenase benötigt dazu den Kofaktor Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH), der die notwendigen Reduktionsäquivalente liefert. Dieser teure Kofaktor kann mit Hilfe eines sekundären „Opferalkohols" (z.B. 2-Propanol oder 2-Butanol) regeneriert werden, wobei das entsprechende Keton (z.B. Aceton bzw. 2-Butanon) entsteht. Längerkettige Alkohole werden dabei vom Enzym bevorzugt, sind jedoch auch deutlich teurer. Aus diesem Grund wird 2-Butanol als Opferalkohol eingesetzt (vgl. Schema 2) (vgl. auch WO2006/072465).

NAD NADH

2-Butanol 2-Butanon

Schema 2: Regenerierung des Kofaktors NADH mit Hilfe eines „Opferalkohols"

Das Wildtypenzym EbN 1 und für dessen Expression brauchbare Expressionssysteme sind in der WO2005/108590 und der WO2006/094945 beschrieben.

Kurzfassung der Erfindung:

Aufgabe der Erfindung war es, die Aktivität von Biokatalysatoren zu erhöhen, welche zur Duloxetinherstellung verwendet werden können.

Insbesondere sollten Biokatalysatoren bereitgestellt werden, welche die enzymatische Reduktion von TAC (1 ) zu TACA (2) verbessern. Die zu erzielende Verbesserung kann dabei bestehen in: - Höhere Reaktionsgeschwindigkeit

Höhere Produktausbeute geringere Anfälligkeit gegen Produktinhibition Verbesserung der Kofaktorregeneration Kombinationen davon

Gelöst wurde diese Aufgabe überraschenderweise durch Bereitstellung spezieller Mut- anten der oben bezeichneten Phenylalkohol Dehydrogenase EbN 1 aus Azoarcus sp.

Insbesondere gelang die Lösung obiger Aufgabe überraschenderweise auf zwei verschiedenen Wegen. Nach dem ersten Lösungsweg wurde die Sequenz des für den Biokatalysator kodierenden Gens durch Fehler-Polymerasekettenreaktion („error-prone PCR") zufällig mutiert und so eine Vielzahl an Varianten generiert, aus denen verbesserte Mutanten selektioniert werden konnten. Diese wiederum wurden zur weiteren Verbesserung erneut mutiert (Directed Evolution).

Ein anderer Lösungsweg bestand darin, an ausgewählten Sequenzpositionen gezielt Sättigungsmutagenesen durchzuführen. Zunächst wurden aus der Kristallstruktur der Dehydrogenase (Höffken et al., Biochemistry, Vol. 45, No.1 , 2006) Ziel-Positionen für geeignete Mutationen durch „Rationales Design" bestimmt. An diesen Positionen wurden dann Sättigungsmutagenesen durchgeführt.

Figurenbeschreibunq:

Figur 1 zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz (A) bzw. die Aminosäuresequenz (B) der Phenylethanol-Dehydrogenase EbN1.

Figur 2 zeige das Bändermodell eines Monomers von EbNL

Figur 3 zeigt schematisch die Klonierungsstrategie für verschiedene Mutanten.

Figur 4 zeigt das Ergebnis von Versuchen zur Hemmung der Phenylethanol- Dehydrogenase EbN 1 in Gegenwart von jeweils 10 mM TA, TAA bzw. TACA sowie das Ergebnis eines Kontrollansatzes ohne inhibierende Substanz. Die Versuche wurden mit ganzen Zellen durchgeführt; es wurde jeweils 25 bzw. 50 μl Zellsuspension getestet. Figur 5A veranschaulicht die Fähigkeit zur Regeneration des Kofaktors mit 2-Butanol in Anwesenheit und Abwesenheit von TACA durch verschiedene Mutanten des Typs Y151X.

Figur 5B veranschaulicht die Fähigkeit zur Regeneration des Kofaktors mit 2-Butanol in Anwesenheit und Abwesenheit von TACA durch verschiedene Mutanten des Typs T192X.

Figur 6A zeigt die Aktivität verschiedener Mutanten des Typs T192X in einem TAC- Test ohne Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Referenz (LU11558).

Figur 6B zeigt die Aktivität verschiedener Mutanten des Typs T192X in einem TAC- Test mit Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Referenz (LU11558).

Figur 6C zeigt die Aktivität verschiedener Mutanten des Typs T192X in einem TACA- Test im Vergleich zur Referenz (LU1 1558).

Figur 7A zeigt die enzymatische Aktivität verschiedener Mutanten des Typs Y151X in einem TAC-Test ohne Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Referenz (LU 1 1558).

Figur 7B zeigt die enzymatische Aktivität verschiedener Mutanten des Typs Y151X in einem TAC-Test mit Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Referenz (LU1 1558).

Figur 7B zeigt die Aktivität verschiedener Mutanten des Typs Y151X in einem TAC- Test im Vergleich zur Referenz (LU 1 1558).

Figur 8A veranschaulicht die Regeneration des Kofaktors mit 2-Butanol in Anwesenheit und Abwesenheit von TAC durch Mutanten des Typs Y151A-T192X.

Figur 8B veranschaulicht die Aktivität von Mutanten des Typs Y151A-T192X in einem TAC-Test mit Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Kontrolle (Y151A).

Figur 9 veranschaulicht die mit Hilfe der Mutante Y151A erzielten Ausbeuten an TACA in verschiedenen Reaktionsansätzen jeweils im Vergleich zur Referenz sowie in Ab- hängigkeit von verschiedenen TAC-Konzentrationen (400 mM in Figur 9A bzw. 600 mM in Figur 9B).

Figur 10 veranschaulicht in einem computeranimierten Modell die Substratbindung (TA) in Wildtyp-Enzym EbN 1 (Darstellung A) bzw. in Mutante Y151A (Darstellung B). Das jeweils zugeordnete untere Bild stellt einen vergrößerten Ausschnitt aus der Substratbindungstasche dar.

Figur 1 1 zeigt eine computersimulierte Darstellung eines Ausschnitts aus dem aktiven Zentrum von EbN1 , hervorgehoben sind dabei die Anordnung der amphiphilen HeNx, des Loops 2, des Substrats sowie des Kofaktors (NADH).

Figur 12 veranschaulicht die Klonierungsstrategie für eine site-directed Mutagenese.

Figur 13A und Figur 13B veranschaulichen die Ergebnisse von Aktivitätstests mit verschiedenen erfindungsgemäßen Punkt-Mutationen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

1. Definition allgemeiner Begriffe

„Phenylethanol Dehydrogenasen" (EC Nr.1.1.1 ) sind allgemein Enzyme, welche die NAD H a bh ängige, stereospezifische Reduktion von Acetophenon zu S-1- Phenylethanol katalysieren. . Eine „Phenylethanol Dehydrogenase" bzw. ein „Enzym mit Phenylethanol Dehydrogenase Aktivität" im Sinne der Erfindung katalysiert insbesondere die enzymatische Synthese optisch aktiver Alkohole der allgemeine Formel II, ausgehend vom Keton der Formel I, und insbesondere die stereospezifische Gleichgewichtsreaktion zwischen 3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-on und (1 S)-3-Chlor-1- (thienyl-2-yl)-propan-1-ol.

Aufgrund der Reversibilität enzymatischer Reaktionen betrifft die vorliegende Erfindung die hierin beschriebenen enzymatischen Umsetzungen in beiden Umsetzungsrichtungen (d.h. unter Bildung bzw. Verbrauch von reduktionsäquivalenten). „Funktionale Mutanten" einer „Phenylethanol Dehydrogenase" umfassen die unten definierten „funktionalen Äquivalente" solcher Enzyme.

Der Begriff „biokatalytisches Verfahren" betrifft jegliches in Gegenwart von katalytischer Aktivität einer erfindungsgemäßen „Phenylethanol Dehydrogenase" bzw. eines Enzyms mit „Phenylethanol Dehydrogenase Aktivität" durchgeführtes Verfahren, d.h. Verfahren in Gegenwart von rohem, oder gereinigtem, gelöstem, dispergiertem oder immobilisiertem Enzym, oder in Gegenwart ganzer mikrobieller Zellen, welche derartige Enzymak- tivität aufweisen oder exprimieren. Biokatalytische Verfahren umfassen somit enzyma- tische als auch mikrobielle Verfahren.

Der Begriff „stereospezifisch" bedeutet, dass eines von mehreren möglichen Stereoisomeren einer erfindungsgemäß hergestellten Verbindung mit wenigstens eine Asym- metriezentrum durch die Wirkung eines erfindungsgemäßen Enzyms in hohem „Enati- omerenüberschuß" oder hoher "Enantiomerenreinheit", wie z.B. wenigstens 90%ee, insbesondere wenigstens 95 %ee, oder wenigstens 98 %ee, oder wenigstens 99 %ee produziert wird. Der ee% Wert wird nach folgender Formel berechnet: ee% = [X _A -X _B ]/[ X _A +X _B ] ^* 100, worin X _A und X ₆ für den Molenbruch der Enantiomere A bzw B stehen.

Weiterhin werden hierin folgende Abkürzungen verwendet TAC = 3-Chloro-1-thiophen-2-yl-propan-1-one TACA = 3-Chloro-1-thiophen-2-yl-propan-1-ol TA = 1-Thiophen-2-yl-propenone

TAA = 1-Thiophen-2-yl-prop-2-en-1-ol

Ein „Niedrigalkohol" ist insbesondere ein Monool und umfasst erfindungsgemäß einen Niedrigalkylrest. Dieser stehtinsbesondere für Ci-Cβ-Alkylreste insbesondere CrC ₆ - Alkylreste, die verzweigt oder insbesondere linear sind und 1 bis 8, insbesondere 1 , 2, 3, 4, 5 oder 6 C-Atome aufweisen. Beispiele sind Ci-C ₄ -Alkylreste, wie Methyl, Ethyl, n- Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, 2-Butyl, iso-Butyl oder te/f-Butyl; und zusätzlich Reste mit mehr als 4 C-Atomen, wie Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2- Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, 1 ,1-Dimethylpropyl, 1 ,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, n-Hexyl, 1 ,1-Dimethylbutyl, 1 ,2- Dimethylbutyl, 1 ,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl und 3,3- Dimethylbutyl.

„Cyclische Ringe" (Cyc) umfassen einen ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocyclischen oder heterocyclischen, aromatischen oder nichtaromatischen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten Ring,

Als Beispiele für carbo- und heterocyclische Gruppen Cyc sind insbesondere ein- oder zweikernigen, vorzugsweise einkernige, Gruppen mit bis zu 4, wie z.B. 0, 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Ring-Heteroatomen, ausgewählt unter O, N und S sind zu nennen.

Diese carbo- oder heterocyclischen Ringe umfassen insbesondere 3 bis 12, vorzugs- weise 4, 5 oder 6 Ring-Kohlenstoffatomen. Als Beispiele können genannt werden Cyc- lopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, die ein- oder mehrfach ungesättigten Analoga davon, wie Cyclobutenyl, Cyclopentenyl, Cyclopentadienyl, Cyclo- hexenyl, Cycloheptenyl, Cyclohexadienyl, Cycloheptadienyl, und Phenyl; sowie 5- bis 7-gliedrige gesättigte oder ein- oder mehrfach ungesättigte heterocyclische Reste mit 1 bis 4 Heteroatomen, die ausgewählt sind unter O, N und S. Insbesondere sind zu nennen heterocyclische Reste, abgeleitet von Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Piperidin, Morpholin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyrazol, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyridin, Pyran, Pyrimidin, Pyridazin und Pyrazin.

Weiterhin sind zu nennen zweikernige Rests, bei welchen einer der oben erwähnten Carbo- oder Heterocyclen mit einem weiteren Heterocyclus oder Carbocyclus kondensiert ist, wie z.B. Reste abgeleitet von Cumaron, Indol, Chinolin und Naphthalin.

Eine weitere bevorzugte Gruppe von Cyc-Resten sind Aryl-Reste. „Aryl" steht für einen ein- oder mehrkernigen, vorzugsweise ein- oder zweikernigen, gegebenenfalls substituierten aromatischen Rest, insbesondere für Phenyl oder für ein über eine beliebige Ringposition gebundenes Naphthyl, wie 1- oder 2-Naphthyl. Die Reste Cyc können dabei über eine beliebige Ringposition, vorzugsweise über ein Ring-Kohlenstoffatom, gebunden sein.

Beispiele für geeignet Cyc-Reste sind Phenyl, Naphthyl, 2-Thienyl, 3-Thienyl; 2- Furanyl, 3-Furanyl; 2-Pyridyl, 3-Pyridyl oder 4-Pyridyl; 2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl oder 5- Thiazolyl; 4-Methyl-2-thienyl, 3-Ethyl-2-thienyl, 2-Methyl-3-thienyl, 4-Propyl-3-thienyl, 5- n-Butyl-2-thienyl, 4-Methyl-3-thienyl, 3-Methyl-2-thienyl; 3-Chlor-2-thienyl, 4-Brom-3- thienyl, 2-lod-3-thienyl, 5-lod-3-thienyl, 4-Fluor-2-thienyl, 2-Brom-3-thienyl, und 4- Chlor-2-thienyl.

Die Reste Cyc können weiterhin ein- oder mehrfach, wie z.B. ein- oder zweifach, substituiert sein. Vorzugsweise sitzen die Substituenten an einem Ring-Kohlenstoffatom. Beispiele für geeignete Substituenten sind Halogen, Niedrigalkyl, Niedrigalkenyl, Niedrigalkoxy, -OH, -SH, -NO ₂ oder NR ² R ³ , wobei R ² und R ³ unabhängig voneinander für H, Methyl oder Ethyl stehen.

„Halogen" steht für Fluor, Chlor, Brom oder Jod, insbesondere Fluor oder Chlor.

„Niedrigalkyl" steht bevorzugt für geradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 2 bis 8, insbesondere 2 bis 6 C-Atomen, wie Ethyl, i- oder n-Propyl, n-, i-, sec- oder tert.-Butyl, n-Pentyl oder 2-Methyl-Butyl, n-Hexyl, 2-Methyl-pentyl, 3-Methyl-pentyl, 2-Ethyl-butyl.

„Niedrigalkoxy" steht bevorzugt für die korrespondierenden Sauerstoff-terminierten Analoga der obigen Niedrigalkylreste.

„Niedrigalkenyl" steht für die ein- oder mehrfach, vorzugsweise einfach ungesättigten Analoga oben genannter Alkylreste mit 2 bis 8, insbesondere 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei die Doppelbindung in beliebiger Position der Kohlenstoffkette liegen kann.

2. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft funktionale Phenylethanol Dehydrogenase-Mutanten, abgeleitet von der Phenylethanol Dehydrogenase EbN 1 aus Azoarcus sp. mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2. Insbesondere betrifft die Erfindung funktionale Phenylethanol Dehydrogenase- Mutanten, abgeleitet von der Phenylethanol Dehydrogenase EbN1 aus Azoarcus sp. mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Mutante wenigsten eine Mutation in wenigstens einem Sequenzbereich, ausgewählt unter

(1 ) Sequenzbereich 142 bis 153 (auch bezeichnet als Loop 2) und

(2) Sequenzbereich 190 bis 21 1 (auch bezeichnet als HeNx alpha FG1 )

aufweisen.

Insbesondere betrifft die Erfindung funktionale Phenylethanol Dehydrogenase- Mutanten, welche zusätzlich wenigstens eine weitere Mutation in einem weiteren Sequenzbereich, ausgewählt unter

(3) Sequenzbereich 93 bis 96 (auch bezeichnet als Loop 1 )

(4) Sequenzbereich 241 bis 249 (C-Terminus)

(5) Sequenzbereich 138 bis 141 (hydrophiler Bereich Bindungstasche, auch bezeichnet als Loop 2) und (6) Cys61 und / oder Cys 83

aufweisen.

Weiterhin betrifft die Erfindung funktionale Phenylethanol Dehydrogenase-Mutanten, abgeleitet von der Phenylethanol Dehydrogenase EbN 1 aus Azoarcus sp. mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Mutante ausgewählt ist unter den in Tabelle 1 aufgelisteten Mutanten.

Insbesondere sind zu nennen Mutante, wobei wenigstens einer der folgenden Reste mutiert ist:

T192, L197, M200, F201 , L204, M246, L139, T140, T142, L146, 1148, Y151 , C61 , C83, L186, wobei die jeweilige Aminosäure durch eine beliebige andere natürliche Aminosäure ersetzt ist Insbesondere sind erfindungsgemäße Mutanten ausgewählt unter Mutanten enthaltend wenigstens eine der folgenden Mutationen:

(a) Einzelmutationen:

Y151X _A , wobei X _A = A, R, N, E, Q, G, H, I, L, M, T oder V ist; T192X _B , wobei X _B = A, E, G, I, P, S, W, V oder L ist;

(b) Mehrfachmutationen:

Y151X _A T192X _B , wobei X _A und X ₆ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Mutanten, welche durch wenigstens eine der folgenden modifizierten Teilsequenzen charakterisiert sind:

(Teilsequenz 1 ) 142-TTYWX ₁ KX ₂ EAX ₃ T-I SS (modifizierter Loop 2) und (Teilsequenz 2) 190-ATX ₄ EASAX ₅ SAX ₆ X ₇ DVX ₈ P N M LQAI-21 1 (modifizierte HeNx alpha FG1 )

worin X ₁ bis X ₈ unabhängig voneinander für beliebige Aminosäurereste stehen, wobei wenigstens einer der Reste X ₁ bis X3 und X ₄ bis X ₈ kein natürlicher Aminosäurerest des nativen Enzyms gemäß SEQ ID NO:2 ist, wobei insbesondere

X ₁ für L steht oder substituiert ist durch I, V, A, M, F oder H.

X ₂ für I steht oder substituiert ist durch L, V, A, M, F oder H.

X ₃ für Y steht oder substituiert ist durch A, R, N, E, Q, G, H, I, L, M, T oder V; oder worin

X ₄ für T steht oder substituiert ist durch A, E, G, I, P, S, W, V oder L X ₅ für L steht oder substituiert ist durch I, V, A, M, F oder H.

X ₆ für M steht oder substituiert ist durch Y, W, E, V, S, R, Q, K, I, H, G, F, E oder

D

X ₇ für F steht oder substituiert ist durch G, K, T, Y, M, W oder R

X ₈ für L steht oder substituiert ist durch I, V, A, M, F oder H. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch solche Mutanten, die noch mindestens etwa 50% der enzymatischen Aktivität der Dehydrogenase mit SEQ ID NO:2 aufweisen, wie z. B. solche mit 50 bis 100% oder mehr als 100% wie z.B. >100 bis 1000%, jeweils bestimmt unter Standardbedingungen unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie TAC oder TACA (vergleiche unten, Angaben zur Bestimmung der Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität)

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch solche Mutanten, wobei diese eine prozentuale Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 von wenigstens etwa 70%, wie z.B. 70 bis 99,9%, 75 bis 99,9%, 80 bis 99,9%, 85 bis 99,9%, 90 bis 99,9% oder 95 bis 99,9%, aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch solche Mutanten, bei welcher zu- sätzlich zu wenigstens einer Mutation in den oben definierten Bereichen (1 ) bis (6) bis zu 25% der Aminosäurereste außerhalb dieser Bereiche gegenüber SEQ ID NO: 2 durch Addition, Deletion, Insertion, Substitution, Inversion oder einer Kombination davon verändert sind.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere solche Mutanten, welche die stereospezifische Gleichgewichtsreaktion zwischen 3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-on (1 ) und (1 S)-3-Chlor-1 -(thienyl-2-yl)-propan-1 -ol (2)

1 2 in Gegenwart des Cofaktors NAD ⁺ bzw. NADH katalysieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, kodierend für eine hierin definierte Mutante. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Expressionskassetten, umfassend wenigstens eine hierin definierte Nukleinsäuresequenz, funktional verknüpft mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Vektoren, umfassend wenigsten eine hierin definierte Expressionskassette.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft rekombinante Mikroorganismen, umfassend wenigstens eine hierin definierte Nukleinsäure, eine hierin definierte Expressions- kassette oder einen hierin definierten Vektor.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung einer hierin definierten Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante, wobei man einen hierin definierten rekombinanten Mikroorganismus kultiviert, die für die Mutante kodierende Nukleinsäu- resequenz exprimiert und das Expressionsprodukt gegebenenfalls isoliert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiel- len/enzymatischen Synthese von substituierten, optisch aktiven Alkoholen der Formel

(II)

worin

Cyc für einen ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocycli- schen oder heterocyclischen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten Ring steht, jeweils in stereoisomerenreiner Form oder als Gemisch von Stereoisomeren,

umfassend die biokataytische (mikrobielle/enzymatische) Reduktion eines Ketons der Formel (I) in Gegenwart einer hierin definierten Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante, gegebenenfalls unter Zugabe von Reduktionsequivalenten, wie insbesondere NADH.

Gegenstand sind insbesondere auch solche Verfahren, wobei die Reaktion unter Bedingungen der Reduktionsäquivalent-Regenerierung erfolgt, wobei man als Opferalkohol einen Niedrigalkohol, wie insbesondere einen Ci bis C ₆ -Monoalkohol verwendet.

Mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren werden insbesondere solche Ver- bindungen der Formel (I) umgesetzt, wobei Cyc für einen Heterocyclischen Rest, insbesondere einen Thienylrest steht.

Gegenstand sind insbesondere auch solche Verfahren, wobei man einen im wesentlichen enantiomerenreinen Alkohol der Formel (II), insbesondere das (S)-Enantiomer, erhält.

Gegenstand sind insbesondere auch solche Verfahren, wobei die Mutante in isolierter Form und dabei gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert; oder exprimiert in mikrobiellen Zellen, welche gegebenenfalls an einem festen Träger, immobilisiert sind, eingesetzt wird. Geeignete feste Träger, wie z.B. polymere Trägermaterialen, wie Beads oder Membranen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Biotransformation und Enzymreaktortechnik geläufig.

Gegenstand sind insbesondere auch Verfahren zur Herstellung von Duloxetin, umfas- send

a) die mikrobielle/enzymatische Reduktion von 3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-on (1 ) zu (1 S)-3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-ol (2)

1 2 unter Anwendung eines biokatalytischen Verfahrens wie hierin definiert;

b) die chemische Umsetzung des Alkohols (2) durch Methylaminierung zum Duloxeti- nalkohol (3)

und schließlich

c) die chemische Umsetzung von des Duloxetinalkohols (3) durch Einführung einer Naphthylgruppe zu Duloxetin (4).

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur mikrobiellen/enzymatischen Synthese von substituierten Ketonen der Formel (I) worin

Cyc für einen ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocycli- sehen oder heterocyclischen, aromatischen oder nicht-aromatischen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten Ring steht, umfassend die mikrobielle/enzymatische Oxidation eines Alkohols der Formel (II)

jeweils in stereoisomerenreiner Form oder als Gemisch von Stereoisomeren, in Gegenwart einer hierin definierten Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante, gegebenenfalls unter Zugabe von Oxidationssequivalenten, wie insbesondere NAD ⁺ .

Insbesondere erfolgt die Reaktion unter Bedingungen der Oxidationsäquivalent- Regenerierung, wobei man als Opferketon einen Ci bis C ₆ -Monoalkanon verwendet.

Die verwendete Enzym-Mutante kann dabei in isolierter Form, wie z.B. gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert, oder exprimiert in mikrobiellen Zellen, welche gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert sind, eingesetzt werden.

Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung einer hierin definierten Enzymmutan- te bei der Herstellung von Duloxetinalkohol und/ oder Duloxetin.

3. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung

3.1 Proteine Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die konkret offenbarten Proteine bzw. Enzyme mit Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität beschränkt, sondern erstreckt sich vielmehr auch auf funktionale Äquivalente davon.

„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Phenylethanol Dehydrogenase Aktivität, besitzen.

So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die im verwendeten Test auf „Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität" im Sinne der Erfindung eine um mindestens 1 %, insbesondere um mindestens etwa 5 bis 10 % wie z.B. mindestens 10% oder mindestens 20 %, wie z.B. mindestens 50 % oder 75% oder 90 % höhere oder niedrigere Aktivität eines Enzyms, umfassend eine hierin definierte Ami- nosäuresequenz aufweisen. Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 4 bis 1 1 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum in einem Bereich von pH 5 bis 10, wie insbesondere 6,5 bis 9,5 oder 7 bis 8 oder etwa bei 7,5, sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 15°C bis 80 ⁰ C oder 20 ⁰ C bis 70°C, wie z.B. etwa 30 bis 60 ⁰ C oder etwa 35 bis 45°C, wie etwa bei 40°C

Die „Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität" im Sinne der Erfindung kann mit Hilfe verschiedener bekannter Tests nachgewiesen werden. Ohne darauf beschränkt zu sein, sei ein Test unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z. B. TAC oder TACA, unter Standardbedingungen, wie im experimentellen Teil definiert (vgl. Be- Schreibung Tests 1 ), 2) oder 3)), oder eine Biotransformation (Komplettreaktion- TAC->TACA mit Kofaktorregenerierung mittels i-Propanol oder 2-Butanol) im 4-I- Reaktor zu nennen.

Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch „Mutanten", welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden. Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind in folgender Tabelle zu- sammengefasst:

Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution

AIa Ser

Arg Lys

Asn GIn; His

Asp GIu

Cys Ser

GIn Asn

GIu Asp

GIy Pro

His Asn ; GIn

Ne Leu; VaI

Leu Ne; VaI

Lys Arg ; GIn ; GIu

Met Leu ; Ne

Phe Met ; Leu ; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp ; Phe

VaI Ne; Leu

„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen

Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.

„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Ei- sen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhält- lieh durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.

„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispie- Ie für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide, Histidin-Anker oder Enzyme.

Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den kon- kret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 oder 99%, Homologie (bzw. Identität) zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie bzw. Identität eines erfin- dungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.

Die prozentualen Identitätswerte können auch anhand von BLAST Alignments, Algo- rithmus blastp (protein-protein BLAST), oder durch Anwendung der unten angegebenen Clustal Einstellungen ermittelt werden.

Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutage- nese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation, Verlängerung oder Verkürzung des Proteins.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Muta- genese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligo- nukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:781 1-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ).

3.2 Nukleinsäuren und Konstrukte

3.2.1 Nukleinsäuren

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, die für ein Enzym mit Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität kodieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren mit einem bestimmten Ideti- tätsgrad zu den hierin beschriebenen konkreten Sequenzen. Unter „Identität" zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:

Multiple alignment parameters: Gap opening penalty 10

Gap extension penalty 10

Gap Separation penalty ränge 8

Gap Separation penalty off

% identity for alignment delay 40 Residue specific gaps off

Hydrophilic residue gap off

Transition weighing 0

Pairwise alignment parameter: FAST algorithm on

K-tuple size 1

Gap penalty 3

Window size 5

Number of best diagonals 5

Alternativ dazu kann die Identität auch nach Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Ko- ike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie

D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic

A c i d s R e s 3 1 ( 1 3 ) : 34 9 7-500, gemäß I nternetadresse: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.htmW und mit den folgenden Parametern bestimmt werden:

DNA Gap Open Penalty 15.0

DNA Gap Extension Penalty 6.66 DNA Matrix Identity

Protein Gap Open Penalty 10.0

Protein Gap Extension Penalty 0.2

Protein matrix Gönnet

Protein/DNA ENDGAP -1

Protein/DNA GAPDIST 4

Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- un d d oppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalente, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.

Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten. Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter „stringenten" Bedingungen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinander folgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer er- findungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense- Stranges hybridisiert.

Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Stan- dard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nuklein- säu re ka n n i n ei n en geeig neten Vektor klon iert werd en u n d d u rch D NA- Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA- Synthesegerät, hergestellt werden. Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen oder Derivate davon, Homologe oder Teile dieser Sequenzen, lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Bakterien, z.B. über genomische oder cDNA- Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen.

Unter "hybridisieren" versteht man die Fähigkeit eines PoIy- oder Oligonukleotids an eine nahezu komplementäre Sequenz unter Standardbedingungen zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu können die Sequenzen zu 90-100% komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.

Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybri- disierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10 ⁰ C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 ⁰ C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 ⁰ C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 ⁰ C bis 45 ⁰ C, bevorzugt zwischen etwa 30 ⁰ C bis 45 ⁰ C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 ⁰ C bis 55 ⁰ C, bevorzugt zwischen etwa 45 ⁰ C bis 55 ⁰ C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA- Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridi- zation: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Die „Hybridisierung" kann insbesondere unter stringenten Bedingungen erfolgen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben.

Unter „stringenten" Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden: Die Inkubation bei 42°C über Nacht in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium-citrat), 50 mM Natrium Phosphat (pH7,6), 5x Denhardt Lösung, 1 0% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschschritt der Filter mit 0,1 x SSC bei 65°C.

Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.

So können weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen z.B. von SEQ ID NO:1 oder 3 abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder DeIe- tion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon.

Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den kon- kret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.

Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder 3 sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausführungen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenzen, insbesondere der SEQ ID NO: 1 und 3, beispielsweise pilzliche oder bak- terielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenz, zu verstehen.

Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, kön- nen durch wenigstens einen Nukleotidaustausch, wenigstens eine Insertion, Inversion und/oder Deletion verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden. 3.2.2 Generierung funktionaler Mutanten

Dem Fachmann sind darüber hinaus Verfahren zur Erzeugung funktionaler Mutanten erfindungsgemäßer Enzyme bekannt.

Je nach verwendeter Technik kann der Fachmann völlig zufällige oder auch gezieltere Mutationen in Gene oder auch nicht codierende Nukleinsäurebereiche (die beispielsweise für die Regulation der Expression wichtig sind) einbringen und anschließend Genbanken erstellen. Die dazu erforderlichen molekularbiologischen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook und Russell, Molecular Cloning. 3. Edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press 2001.

Methoden zur Veränderung von Genen und somit zur Veränderung der durch diese codierten Protein sind dem Fachmann seit langem geläufig, wie beispielsweise

- die ortsspezifische Mutagenese, bei der gezielt einzelne oder mehrere Nukleotide eines Gens ausgetauscht werden (Trower MK (Hrsg.) 1996; In vitro mutagenesis pro- tocols. Humana Press, New Jersey),

- die Sättigungsmutagenese, bei der an jeder beliebigen Stelle eines Gens ein Codon für eine beliebige Aminosäure ausgetauscht oder hinzugefügt werden kann (Kegler-

Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Fei- genbutz M, Valcärel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541 ; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1 ),

- die fehleranfällige Polymerase-Kettenreaktion (error-prone PCR), bei der Nukleotid- Sequenzen durch fehlerhaft arbeitende DNA-Polymerasen mutiert werden (Eckert KA,

Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);

- die SeSaM-Methode (Sequence Saturation Method), bei der bevorzugte Austausche durch die Polymerase verhindert werden. Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279 - das Passagieren von Genen in Mutator-Stämmen, in denen beispielsweise aufgrund defekter DNA-Reperaturmechanismen eine erhöhte Mutationsrate von Nukleotidse- quenzen auftritt (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. In: Trower MK (Hrsg.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), oder - das DNA-Shuffling, bei dem ein Pool aus nahe verwandten Genen gebildet und verdaut wird und die Bruchstücke als Templates für eine Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, bei der durch wiederholte Strangtrennung und Wiederannäherung letztendlich Mosaikgene voller Länge erzeugt werden (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747).

Unter Anwendung der so genannten gerichteten Evolution („directed evolution"; beschrieben unter anderem in Reetz MT und Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31 ; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing in- dustrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Hrsg.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology) kann der Fachmann auch in gezielter Weise und auch in großem Maßstab funktionale Mutanten erzeugen. Dabei werden in einem ersten Schritt zunächst Genbanken der jeweiligen Proteine erzeugt, wobei beispielsweise die oben angegebenen Methoden zur Anwen- düng kommen können. Die Genbanken werden auf geeignete Weise exprimiert, beispielsweise durch Bakterien oder durch Phagen-Display-Systeme.

Die betreffenden Gene von Wirtsorganismen, die funktionale Mutanten mit Eigenschaften exprimieren, welche den gewünschten Eigenschaften weitgehend entsprechen, können einer weiteren Mutationsrunde unterworfen werden. Die Schritte der Mutation und der Selektion oder des Screening können iterativ solange wiederholt werden, bis die vorliegenden funktionalen Mutanten die gewünschten Eigenschaften in ausreichendem Maße aufweisen. Durch diese iterative Arbeitsweise können stufenweise eine begrenzte Anzahl von Mutationen, wie z.B. 1 bis 5 Mutationen, vorgenommen und auf deren Einfluss auf die betreffende Enzymeigenschaft bewertet und selektiert werden. Die selektierte Mutante kann dann in gleicher Weise einem weiteren Mutationsschritt unterworfen werden. Dadurch lässt sich die Anzahl der zu untersuchenden Einzelmutanten signifikant verringern.

Nicht limitierende Beispiele erfindungsgemäßer Mutanten, welche durch error prone Mutagenese eines Enzyms gemäß SEQ ID NO:2 zugänglich gemacht wurden sind in folgender Tabelle 1 zusammengefasst

Tabelle 1 : Mutanten erzeugt durch error prone Mutagenese

Die erfindungsgemäßen Ergebnisse liefern auch wichtige Informationen in Bezug auf Struktur und Sequenz der betreffenden Enzyme, die erforderlich sind, um gezielt weitere Enzyme mit gewünschten modifizierten Eigenschaften zu generieren. Insbesondere können sogenannte „hot spots" definiert werden, d.h. Sequenzabschnitte, die sich potentiell eignen, um über die Einführung gezielter Mutationen eine Enzymeigenschaft zu modifizieren.

Nicht limitierende Beispiele solcher hot spot-Regionen der erfindungsgemäßen Enzyme sind, bezogen auf SEQ ID NO:2, im Folgenden zusammengefasst:

(1 ) 142 bis 153 (Loop 2) und

(2) 190 bis 21 1 (Helix alpha FG1 ) (3) 93 bis 96 (Loop 1 )

(4) 241 bis 249 (C-Terminus)

(5) 138 bis 141 (hydrophiler Bereich Bindungstasche) und

(6) Cys61 und / oder Cys 83

Ebenfalls sind Informationen ableitbar bezüglich Aminosäure-Sequenzpositionen, in deren Bereich Mutationen durchgeführt werden können, die voraussichtlich wenig Einfuß auf die Enzymaktivität haben sollten, und als potentielle „silent mutations bezeich- net werden können. Derartige Mutationspositionen sind für SEQ ID NO:2 in folgender Tabelle 2 zusammengefasst:

Tabelle 2 :

3.2.3 Konstrukte

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Unter einer „Expressionseinheit" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressionsaktivität verstanden, die einen Promotor, wie hierein definiert umfasst, und nach funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure oder einem Gen, die Expression, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert. Man spricht deshalb auch in diesem Zusammenhang von einer „regulativen Nukleinsäuresequenz". Zusätzlich zum Promotor können weitere, regulative Elemente, wie z.B. Enhancer, enthalten sein.

Unter einer „Expressionskassette" oder „Expressionskonstrukt" wird erfindungsgemäß eine Expressionseinheit verstanden, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäure oder dem zu exprimierenden Gen funktionell verknüpft ist. Im Gegensatz zu einer Expressionseinheit umfasst eine Expressionskassette somit nicht nur Nukleinsäuresequenzen, welche Transkription und Translation regulieren, sondern auch die Nukleinsäuresequenzen, welche als Folge der Transkription und Translation als Protein exprimiert werden sollen.

Die Begriffe "Expression" oder „Überexpression" beschreiben im Kontext der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.

Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einem „Promotor", einer „Nukleinsäure mit Promotoraktivität" oder einer „Promotorsequenz" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu transkribierenden Nukleinsäure die Transkription dieser Nukleinsäure reguliert.

Unter einer „funktionellen" oder „operativen" Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer der Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente, wie zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen, die die Transkription von Nukleinsäuren gewährleisten, sowie zum Beispiel einen Terminator, derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positio- nen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter (d.h. am 3'-Ende) der Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Dabei kann der Abstand zwischen der Promotor- sequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, oder kleiner als 100 Basenpaare oder kleiner als 50 Basenpaare sein.

Neben Promotoren und Terminator sind als Beispiele weiterer regulativer Elemente zu nennen Targeting-Sequenzen, Enhancer, Polyadenylierungssignale, selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte umfassen insbesondere Sequenz SEQ ID NO: 1 oder 3 oder Derivate und Homologe davon, sowie die davon ableitbaren Nuk- leinsäuresequenzen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden.

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder meh- rere der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Beispiele geeigneter Regulationssequenzen sind in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet- , trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, lacl ^q" 17-, 15-, 13-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaP _BAD )SP6-, lambda-P _R - oder im Iambda-Pι_-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gramnegativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inse- riert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar.

Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-IN ¹¹³ -B1 , λgtl 1 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacte- rium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB1 16, in Hefen 2alphaM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac ⁺ , pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsge- mäßen Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "Codonnutzung" zu verändern. Der "Codonnutzung" lässt sich anhand von Computer- auswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pou- wels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.

3.3 Mikroorganismen

Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff „Mikroorganismus" der Wildtyp- Mikroorganismus oder ein genetisch veränderter, rekombinanter Mikroorganismus oder beides verstanden werden. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemä- ßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und expri- miert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungsund Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Clon- ing: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta-Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien zu finden

Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäurese- quenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität gemäß obiger Definition kodieren.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 ⁰ C und 100 ⁰ C, bevorzugt zwischen 10 ⁰ C bis 60 ⁰ C unter Sauer- stoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann „batch"-weise, „semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden.

3.4 Rekombinante Herstellung von erfindungsgemäßen Enzymen

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäße Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.

Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mik- roorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten. Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder CeI- lulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vor- teilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.

Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.

Als Schwefelquelle können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organi- sehe Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikali- umhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyri- doxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Me- dienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.

Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40 ⁰ C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zu- gäbe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20 ⁰ C bis 45°C. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentri- fugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.

Die Zellen können auch, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen werden. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisati- on, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin- Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarb- Stoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.

Für die Expression erfindungsgemäßer Mutanten kann auf die Beschreibung der Ex- pression des Wildtypenzyms EbN 1 und der dafür brauchbaren Expressionssysteme in der WO2005/108590 und der WO2006/094945, zurückgegriffen werden, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.

3.5 Enzymimmobilisierung

Die erfindungsgemäßen Enzyme können in den hierin beschriebenen Verfahren frei oder immobilisiert eingesetzt werden. Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf immobilisierten Enzyme sind aus der EP-A-1149849, EP-A- 1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat, Cellulosepulver, Anionenaustauschermaterialien, synthetische Polymere, wie Polystyrol, Acrylharze, Phenolformaldehydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie Polyethylen und Polypropylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträgerten Enzyme üblicherweise in einer feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt üblicherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Siebli- nie). Analog kann bei Einsatz der Dehydrogenase als Ganzzell-Katalysator eine freie oder immobiliserte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat, und Carrageenan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaraldehyd vernetzt werden (Cross-linking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfah- ren sind beispielsweise in J. Lalonde und A. Margolin „Immobilization of Enzymes" " in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991- 1032, Wiley-VCH, Weinheim beschrieben. Weitere Informationen zu Biotransformationen und Bioreaktoren zur Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren findet man z.B. auch in Rehm et al (Ed) Biotechology, 2nd Edn, VoI 3, Chapter 17, VCH, Weinheim.

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf folgende, nichtlimitierende Beispiele näher beschrieben.

Experimenteller Teil

Beispiel 1 : Sättigungsmutagenese

1.1 Molecular Modelling

Die Auswahl der Mutanten erfolgte anhand der Kristallstruktur des Enzyms Pheny- lethanol-Dehydrogenase EbN1 (Figur 2).

Die Substratspezifität des Enzyms wird durch zwei Loop-Bereiche und eine HeNx (Loop 1 und 2 und HeNx αFG1 in Figur 2) bestimmt. Die HeNx αFG1 ist flexibel und verschließt das aktive Zentrum nach Bindung des Substrats. Tyr 93 auf dem Loop 1 schließt die Substratbindetasche nach vorne hin ab und ist dadurch für die Stereoselektivität verantwortlich. Tyr151 gehört zum Loop 2 und zeigt in die Bindetasche. Thr192 ist ein Teil der flexiblen HeNx αFG1 und weist in Richtung der Substratbindestelle. Diese beiden Positionen wurden ausgewählt, da sie die Substratbindung beeinflussen ohne jedoch die Aminosäuren des katalytischen Zentrums und den Kofaktor NAD, d.h. den katalytischen Mechanismus, zu stören. 1.2 Sättigungsmutagenese

Zunächst wurden Sättigungsmutagenesen an den Positionen Y151X bzw. T192X (d.h. Austausch der Position Y151 und T192 gegen alle anderen 19 Aminosäuren, auch Permutation genannt) separat durchgeführt, anschließend wurde eine Doppelmutante (Y 151 A-T192X) generiert.

Dies erfolgte mittels „Site-directed mutagenesis" in jeweils 3 Polymeraseketten- reaktionen (siehe Klonierungsstrategie, Figur 3). Dabei wurden folgende Oligonukleoti- de zur Amplifikation der DNA eingesetzt:

1 ) Mke123 Upper: δ'-GTTCATCTTTCCCTGGTTG-S' (SEQ ID NO:5)

2) Mke124 Lower: δ'-GCTACGGCGTTTCACTTC-S' (SEQ ID NO:6)

3) Mke798 Y151X Lower: δ'-GTAATGGGTNNNCGCCTCGA-S' (SEQ ID NO:7)

4) Mke793 Y151 X Upper: δ'-TCGAGGCGNNNACCCATTAC-S' (SEQ ID NO:8) 5) Mke796 T192X Upper: 5'-CGGCAACANNNGAAGCGTC-3' (SEQ ID NO:9)

6) Mke797 T192 X Lower: δ'-GACGCTTCNNNTGTTGCCGT-S' (SEQ ID NO:10)

7) Mke951 Y151AT192X: δ'-GGCAACANNNGAAGCGTC-S' (SEQ ID NO:11 )

8) Mke952 Y151AT192X: δ'-GACGCTTCNNNTGTTGCC-S' (SEQ ID NO:12)

Die PCR zum Amplifizieren des ebn1 H-Genabschnitts wurde wie folgt durchgeführt: 100 μl Reaktionsansatz enthielten: 1 μl Template (ca. 50 ng Vektor pDHE-ebn1 H), je 1 μl Oligonukleotid (20ng), 2 μl dNTPMix (ä 10 mM Endkonzentration von Roche), 1 μl Pfu-Ultra-DNA-Polymerase ( 1 U/μl von Stratagene), 1 0 μ l 1 0X Pfu-Ultra-Puffer (Stratagene) und 80 μl steriles Wasser.

Folgendes Temperaturprogramm wurde am Thermocycler (Biometra) eingestellt: 95°C

- 5 min; 30 Zyklen: 95°C - 45 sec, 50 ⁰ C - 45 sec, 72°C - 45 sec ; 72°C - 10 min;

10 ⁰ C

1 a) PCR Oligonukleotide 1 und 3 (6 für T192X) 1 b) PCR Oligonukleotide 2 und 4 (5 für T192X)

2) PCR Oligonukleotide 1 und 2 mit Produkt aus PCR 1 a und b als Template (overlap extension) Das daraus erhaltene amplifizierte ebn1-Gen wurde über ein 1 .2 %iges Agarose-Gel mit Hilfe eines GFX-Kits (GE Healthcare) aufgereinigt.

Die amplifizierte DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Ndel und I— lind 111 (Fermen- tas) gespalten, in die Multiple Cloning Site (MCS) des Vektors pDHE (ebenfalls mit Ndel-Hindlll gespalten) ligiert und in XL10 ultrakompetenten Zellen (Stratagene) transformiert. Durch eine Mini-Präparation dieser Zellen wurde die Plasmid-DNA der Mutanten gewonnen. Vektor pDHE ist beschrieben als pDHE19.2-Vektor in DE 19848129 oder WO2005/108590.

1.3 Anzucht der Zellen

Der Vektor pDHE-ebn1 H-Y151X bzw. pDHE-ebn1 H-T192X (und später pDHE-ebn1 H- Y151A-T192X) wurde zunächst in den Stamm LU12037 (E. coli Derivat TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: ein RhaA ^" -Derivat von E. coli TG1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; M; M; Masahashi, W; T (1987) Gene 61 , 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001 ), Mol. Microbiol. 40 (2)) transformiert, der die Chaperone GroEL/S und den laclq Repressor co-exprimiert, und auf Q-Tray-Platten ausplattiert. Die gewachsenen Kolonien wurden mit einem Pickroboter (Qpix) gepickt und in eine CG-Vorkultur (Circular Growth, Gibco) mit Antibiotika (100 μM Ampicillin, 20 μM Chloramphenicol und 100 μM Spectinomycin) in Mikrotiterplatten (MTP) beiimpft. Nach einer Wachstumszeit von 5 h bei 37 ⁰ C und 200 Upm, wurden die Zellen per Hand in die LB-Hauptkultur mit Antibiotika (siehe oben) und den entsprechenden Induktoren (Rhamnose 0.5 g/l und IPTG 0.1 mM) überstempelt. Nach 16-18 h Wachstum werden die Zellen im Test eingesetzt.

Zum Aufschluss der Zellen wurden diese zunächst zentrifugiert, der Überstand abge- schüttet und die MTP mit einer Klebefolie versehen. Die MTP wurde für ca. 3 Sekunden komplett in flüssigem Stickstoff getaucht und dann wieder auf die Laborbank zum Auftauen gestellt. Die gleichmäßigsten Ergebnisse erhielt man bei 3-maligem Schockgefrieren mit zwischenzeitlichem Auftauen bei Raumtemperatur.

1.4 Enzymhemmung Es zeigte sich, dass das TAC-Umsetzungsprodukt TACA oder eine Nebenkomponente, welche bei der Umsetzung entsteht, die Reaktion hemmt. Das Substrat wurde nicht vollständig umgesetzt. Es handelte sich hier zwar um eine Gleichgewichtsreaktion, gab man jedoch beispielsweise nach 4 Stunden erneut Zellen bzw. Substrat hinzu, so erfolgte keine weitere Umsetzung. Des Weiteren entfernte man das entstehende 2-Butanon destillativ, um das Gleichgewicht möglichst auf die Seite der Produkte zu verschieben. Trotz dieser Maßnahmen erreichte man keinen vollständigen Umsatz.

Ziel war es also, eine Mutante zu finden, die nicht unbedingt aktiver, sondern vor allen Dingen höhere Mengen an Produkt bzw. Nebenkomponente toleriert, um einen möglichst vollständigen Umsatz und damit eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute zu erzielen.

Im nachfolgenden Test wurden sowohl TACA, als auch TA bzw. TAA als Inhibitoren getestet. Dazu wurden in einem 0.2 ml Ansatz (MTP) 50 μl Zellen (LU1 1558; ein Escherichia coli TG10+ Stamm mit einem durch Rhamnose induzierbaren pDHE1650- Derivat als Überexpressionsplasmid. Die Chaperone GroEL/S und der laclq-Repressor werden co-exprimiert; das Wildtyp-Enzym EbN 1 wird überexprimiert) aus einer Anzucht im 100 ml-Schüttelkolben, 1.75 mM NAD und 100 mM 2-Butanol in einen 80 mM TrisHCI Puffer pH 8.0 gegeben. Dazu wurden jeweils 10 mM TA, TAA bzw. TACA gegeben. Im Photometer wurde dann bei 340 nm die Entstehung von NADH gemessen. In Figur 4 wird die Hemmung der Phenylethanol-Dehydrogenase EbN 1 veranschau- licht, indem die jeweiligen V _max -Werte (entstandene NADH-Menge pro Zeit) angegeben werden. Die Kontrolle (ohne Inhibitor) ist mit ButOH gekennzeichnet.

Wie in Figur 4 zu sehen ist, zeigt TACA die stärkste Hemmung. Da TA sehr stark in diesem Wellenlängenbereich absorbiert, kann hier die Entstehung von NADH nicht nachgewiesen werden.

Aus diesem Grund wurde in den weiteren Assays TACA als Inhibitor zugesetzt. Hierzu wurde zu dem bisher durchgeführten Regenerationstest mit 2-Butanol und NAD noch TACA als Inhibitor zugegeben. Um die geeignete TACA-Konzentration zu bestimmen, wurden verschiedene Konzentrationen an Zellen und TACA getestet. Zunächst wurde eine Konzentrationsreihe von 0 bis 30 mM, anschließend eine zwischen 0 und 10 mM angesetzt. Aufgrund der ermittelten Ergebnisse (nicht gezeigt) wurde in den weiteren Test eine TACA-Konzentration von 10 mM mit jeweils 25 μl Zellen eingesetzt. 1.5 Ablauf des 2-Butanoltests mit und ohne Zugabe von TACA (Regeneration des Kofaktors)

Dabei wurden je Aminosäureposition zwei Mikrotiterplatten (96-well) voll Klone gepickt. Die Mikrotiterplatten wurden komplett sequenziert und die Werte den einzelnen Mutati- onen zugeordnet.

Die Zellen wurden wie oben beschrieben angezogen, anschließend aufgeschlossen und schließlich in 100 μl Wasser resuspendiert. 25 μl dieser Zellsuspension wurden in eine neue Mikrotiterplatte gegeben und auf ein Volumen von 100 μl mit Wasser aufge- füllt. Danach wurde die Substratlösung (Endkonzentrationen: 100 mM 2-ButOH, 1.75 mM NAD, 80 mM TrisHCI pH 8.0, (10 mM TACA)) zugegeben und die Entstehung von NADH bei 340 nm im Photometer gemessen. Die Ergebnisse aus dem Test sind in den Figuren 5A und 5B dargestellt. Es werden die V _max -Werte angezeigt.

Figur 5A und B zeigt, dass die meisten Mutanten den Kofaktor nicht mehr oder nur sehr langsam regenerieren können (Butanoltest, dunkle Balken). Durch Zugabe von TACA zum Butanoltest (helle Balken) können diese Mutanten jedoch den Kofaktor regenerieren, und zwar besser als die Kontrolle (Wildtyp). Vermutlich wird hier statt 2-Butanol zu 2-Butanon TACA zu TAC oxidiert. Diese Mutanten tolerieren höhere Mengen an TACA im Vergleich zum Wildtyp.

Die fehlenden Mutanten (für Position T192 N ₁ D ₁ Q ₁ H ₁ K ₁ M ₁ F ₁ Y und für Position Y151 C, F, S) wurden nachgezogen, doch diese waren nicht aktiv oder schlechter als die Kontrolle. Aus den Versuchen wurden folgende Mutante ausgewählt: Y151A, E, G, H bzw. T192A, G, L, I, um sie im größeren Maßstab zu testen.

1.6 Verifizierung der positiven Mutanten

Die aus diesem Test hervorgehenden positiven Klone wurden anschließend im größeren Maßstab (Anzucht im 100 ml-Schüttelkolben) untersucht. Dabei wurden drei verschiedene Assays durchgeführt:

Test 1 ) Reduktion von TAC zu TACA unter Zugabe von NADH + NADH TAC - TACA

Test 2) Komplettreaktion: Reduktion von TAC zu TACA mit Kofaktor- Regenerierung mittels iso-Propanol

i-Prop anon i-Propanol

Test 3) Oxidation von TACA zu TAC

+ NAD ⁺ TACA *- TAC

Die Testbedingungen für die einzelnen Tests lauten:

Test 1 ) Reduktion von TAC zu TACA unter Zugabe von NADH

798,6 μL VE-Wasser

50 μL 1 M NaH ₂ PO ₄ pH5

50 μL NADH (100 mM Stammlösung in Wasser)

1 ,4 μL TAC

100 μj 10x Rnhf;xtraktknn7fintrat der Anzucht aus dem Rnhiittelknlhen

1000 μL Endvolumen

Test 2) Komplettreaktion

730 μL VE-Wasser

50 μL 1 M NaH ₂ PO ₄ pH5

20 μL NAD 10 mM in Wasser

100 μL 100 mM TAC (14 μL in 1 mL Isopropanol) 100 μL 10x Rohextraktkonzentrat der Anzucht aus dem Schüttelkolben

1000 μL Endvolumen

Test 3) Oxidation TACA zu TAC

798,6 μL VE-Wasser

50 μL 1 M NaH ₂ PO ₄ pH5

50 μL NAD (10 mM Stammlösung)

1 ,4 μL TACA-

100 μL 10x Rohextraktkonzentrat der Anzucht aus dem Schüttelkolben

1000 μL Endvolumen

In obigen Tests lag die Versuchstemperatur jeweils bei 30 ⁰ C, die Enzymkonzentration betrug zwischen 0.1-10 mg/ml.

Die Proben wurden mit konzentrierter HCl abgestoppt und mittels HPLC gemessen.

HPLC-Bedingungen:

Retentionszeiten: TACA 1 ,283 min. (230nm)

TAA 0,910 min. (230 nm)

TA 1 ,168 min. (260nm)

TAC = 1 ,540 min. (260nm)

Die Versuchsergebnisse sind im folgenden Abschnitt zusammengefasst:

1.6.1 Mutanten T192X

Figur 6A zeigt, dass die Mutanten T192L und T192G TAC schneller reduzieren als die Kontrolle LU1 1558. Betrachtet man jedoch die Komplettreaktion (Figur 6B) so ist der Wildtyp am aktivsten, da die anderen Mutanten den Kofaktor schlechter regenerieren können. In Figur 6C ist zu sehen, dass die Mutante T192A TACA besser oxidieren kann als der Wildtyp, wobei die Konzentrationen an TAC, die entstehen, sehr gering sind und deshalb die Ergebnisse bei dem Test schwanken.

1.6.2 Mutanten Y151 A

In Figur 7A ist zu sehen, dass die Mutanten Y151A und Y151 H TAC etwa 4-5mal schneller den Kofaktor reduzieren als der Wildtyp (LU1 1558). Betrachtet man jedoch die Komplettreaktion, die Reduktion von TAC zu TACA mit Regeneration des Kofaktors mittels eines Opferalkohols (hier 2-Propanol), so ist nur noch die Mutante Y151A aktiv (Figur 7B). Die Gesamtaktivität ist etwas geringer als bei der Kontrolle. Durch die Vergrößerung der Bindungstasche wird möglicherweise das „kleine" Isopropanol schlechter oxidiert als 2-Butanol, welches bei Reaktoren eingesetzt wird. Die Mutanten Y151A und Y151 H können TACA besser oxidieren als der Wildtyp (Figur 7C).

Die Mutante Y151 A wurde im 21-l-Maßstab fermentiert und in 4-l-Reaktoren mit 2- Butanol sowohl als Regenerations- als auch Lösungsmittel eingesetzt, um sie mit dem Wildtyp zu vergleichen.

1.6.3 Zweite Generation: Mutanten Y151A-T192X

Da die Mutante Y151 A besser als der Wildtyp ist, wurde aufbauend auf dieser Mutante, eine zweite Sättigungsmutagenese durchgeführt an der Position T192X.

Das Ergebnis des Regenerationstests mit 2-Butanol (wobei die Regeneration des Op- feralkohols mit und ohne Zugabe von TACA bestimmt, d.h. die Entstehung von NADH im Photometer gemessen wird) ist in Figur 8A dargestellt.

Die Mutanten T192I und S zeigen besser als die Kontrolle (Y151A-T192T). Diese wurden deshalb im größeren Maßstab (Anzucht im 100-ml-Schüttelkolben) untersucht. Des Weiteren wurden noch die Mutanten T192A, L und V im größeren Maßstab untersucht, da diese etwa die gleiche Aktivität wie die Kontrolle zeigen. Betrachtet man jedoch die Komplettreaktion dieser fünf Mutanten, so ist die Kontrolle am aktivsten (siehe Figur 8B, wobei die Entstehung von TACA mit i-PropOH als Opferalkohol durch HPLC gemessen wird), so dass die einfache Mutante Y151A in den weiteren Versuchen eingesetzt wurde.

1.7 4-l-Reaktoren

Die aus diesem Screening hervorgehende aktivere Mutante Y151A wurde im 21-1- Maßstab mehrmals fermentiert. Eine Reihe von Standardreaktor-Ansätze wurde gefahren, um sie im größeren Maßstab mit der Kontrolle LU11558 zu vergleichen.

1.7.1 Ansatz:

In einem beheizbaren 4-l-Reaktor mit Rührer und Kondensator wurden 2 I 2-Butanol in einem 20 mM KH ₂ PO ₄ -Puffer pH 5.0 vorgelegt. 0.2 mM NAD (0.5 g) und 400 mM TAC

(275 g) bzw. 600 mM (420 g) wurden zugegeben. Durch Zugabe des Biokatalysators

(450 ml, 7.0 g/l BTM) in Form von ganzen Zellen (unbehandelter Fermenteraustrag) wurde die Reaktion gestartet. Bei der Zugabe der Zellen in Fermentationsmedium stieg der pH-Wert auf 6. Das zweiphasige Reaktionsgemisch wurde bei 40 ⁰ C und vermin- derten Druck (1 10 mbar) gerührt. Dabei wurde einstufig ein Gemisch aus 2-ButOH,

2-Butanon und Wasser abdestilliert. Gleichzeitig wurde die äquivalente Menge einer

Lösung bestehend aus 69 % 2-Butanol und 31 % H ₂ O (entspricht bis auf 2-Butanon der Zusammensetzung des Destillats) als Feed zugegeben. Der pH-Wert wurde mittels eines pH-Titrators überprüft und zwischen pH~5.5-6.0 konstant gehalten. Jede Stunde wurde eine Probe gezogen, mit konz. HCl abgestoppt und mittels HPLC (LJ31366) analysiert. Nach 8 h wurde die Reaktionsmischung abgelassen.

1.7.2 Vergleich Wildtyp (LU1 1558) mit der Mutante Y151A (LU14759)

Es wurden mehrere 4-l-Reaktoren der Mutante gefahren, zunächst mit 400 mM (-70 g/l) TAC, anschließend mit 600 mM (105 g/l), um zu sehen, ob die Mutante größere Mengen an Produkt/Nebenkomponente toleriert.

Figur 9A zeigt, dass die Mutante im Schnitt 15-20 % besser ist als der Wildtyp. Wie man sieht schwanken die Werte von Versuch zu Versuch (das hängt auch von den einzelnen Fermentationen ab), der Unterschied ist jedoch signifikant. Die durchschnittliche Ausbeute beträgt beim Wildtyp 67 % ± 8 % und bei der Mutante 86 % ± 7 %, wo- bei es sich jeweils um unterschiedliche Fermentationen handelt. Auch das Verhältnis TACA/(TAC+TA) (helle Balken) ist deutlich besser bei der Mutante (4.8) als bei der Kontrolle (3.0), was sich hinterher in der Methylaminierung positiv bemerkbar macht.

Betrachtet man die Läufe mit 600 mM TAC (Figur 9B), so liefert auch hier die Mutante bessere Ergebnisse als die Kontrolle. Das TACA/(TAC+TA)-Verhältnis ist jedoch deutlich schlechter als bei den 400 mM Läufen.

1.8 Ergebnis Durch rationales Design ist es gelungen, eine Mutante Y151A (LU14759) zu finden, die 15 % - 20 % aktiver als der Wildtyp (LU11558) ist und höhere Mengen an TACA bzw. TA toleriert bei der Herstellung der Zwischenstufe des Duloxetinalkohols.

Dieses Ergebnis hat sich in einer Reihe an 4-l-Standardreaktoren, die das Produkti- onsverfahren im kleinen Maßstab widerspiegeln, bestätigt.

Da die Kristallstruktur des Enzyms mit dem Inhibitor TA gelöst wurde, konnte ein zuverlässiges Modell des Enzym-Substrat-Komplexes erstellt werden. Aus dem Modell geht hervor, dass die OH-Gru ppe d es Tyros i n s 1 51 i n e n g em Ko nta kt zu m ß-Kohlenstoffatom der Propanon-Seitenkette des Substrates (in diesem Fall TA) steht und so eine schwache CH-O-Wasserstoffbrücke ausbildet (Figur 10A). Durch die Mutation von Tyrosin 151 zu Alanin wird diese Wechselwirkung aufgehoben und die Bindung abgeschwächt (Figur 10B). Alle anderen Wechselwirkungen bleiben bestehen, so dass die hervorragende Selektivität des Enzyms trotz der Vergrößerung der Bindungs- tasche nicht geändert wird. Der ee-Wert des Produkts liegt weiterhin bei über >99,5%.

Beispiel 2: Random-Mutaqenese

2.1 Testentwicklung für die Roboteranlage

Um die große Probenzahl, die durch eine Random Mutagenese entsteht, zu bewälti- gen, war es notwendig, statt der bisherigen HPLC-Analytik im Labor (bei der direkt das Produkt detektiert wird) eine photometrische Methode für die Roboterstrasse zu entwickeln.

Hierzu kann die Abnahme des reduzierten Kofaktors NADH bei 340 nm gemessen werden, da der Extinktionskoeffizient bei dieser Wellenlänge S _NAD ^<<: S _NADH ist. Die optimale NADH-Konzentration lag bei 0.02 mM. Das Substrat TAC konnte zwischen 1 und 2 mM eingesetzt werden. Als Puffer wurde 50 mM NaH ₂ PO ₄ pH 5.0 verwendet, da die Reduktion von TAC zu TACA im leicht sauren bevorzugt abläuft. Die Zellen, welche die Mutanten exprimieren, wurden direkt in einer Mikrotiterplatte (MTP) angezogen. Hierfür wurden die Klone von der Agarplatte mit einem Pickroboter (Qpix) gepickt und in eine LB-Vorkultur mit Antibiotika (100 μM Ampicillin, 20 μM Choramphenicol und 100 μM Spectinomycin) beiimpft. Nach einer Wachstumszeit von 24 h bei 37 ⁰ C und 200 rpm, wurden die Zellen per Hand in die LB-Hauptkultur mit Antibiotika und Induktoren (Rhamnose 0.5 g/l und IPTG 0.1 mM) überstempelt. Nach 16-18 h Wachstum wurden die Zellen im Test eingesetzt.

Vorversuche haben gezeigt, dass die Zellen aus der Kultur vor dem Assay aufgeschlossen werden müssen, da die Aktivität ansonsten zu gering ist. Zum Aufschluss der Zellen wurden verschiedene Methoden getestet, wie z.B. die Lagerung der Zellen über Nacht bei 4 ⁰ C, die Zugabe von 1-Butanol und 1 ,4-Butandiol und das Schockgefrieren mit flüssigem Stickstoff. Nur die Lagerung bei 4 ⁰ C und das Schockgefrieren mit flüssigem Stickstoff zeigten Erfolg, wobei die Stickstoffbehandlung aufgrund des Zeitgewinns vorgezogen wurde. Hierzu wurden die gewachsenen Zellen zunächst zentrifu- giert, der Überstand wurde abgeschüttet und die MTP mit einer Klebefolie verschlos- sen. Die MTP wurde für ca. 3 Sekunden komplett in flüssigen Stickstoff getaucht und dann wieder zum Auftauen abgestellt. Die gleichmäßigsten Ergebnisse erhielt man bei 4-maligem Schockgefrieren mit zwischenzeitlichem Auftauen bei Raumtemperatur.

2.2 Ablauf des Robotertests

Die Zellen wurden wie oben beschrieben angezogen und anschließend aufgeschlos- sen. Die MTP wurden mit Deckeln versehen und in den Inkubator bei 15 ⁰ C in die Roboteranlage gestellt. Im Multidrop wurden 100 μl/Well Wasser zugegeben, um anschließend die Zellen im Packard zu re-suspendieren. Danach wurde im Multidrop die Substratlösung (Endkonzentrationen: 2 mM TAC, 0.2 mM NADH, 50 mM NaH ₂ PO ₄ pH 5.0) zugegeben und die NADH-Abnahme bei 340 nm im Photometer bestimmt.

Die aus diesem Test hervorgehenden positiven Klone werden anschließend im größe- ren Maßstab umfassender untersucht. Dabei wurden drei verschiedene Assays durchgeführt

Test A Komplettreaktion: Reduktion von TAC zu TACA und NADH-Regenerierung mit Isopropanol (50 mM NaH ₂ PO ₄ pH 5.0, 0.2 mM NAD, 10 mM TAC, 10 % Isopropanol), Messung HPLC LJ31366

2-Butanon 2-Butanol

Test B Regeneration von NAD zu NADH mit 2-Butanol als Regenerierungsmittel (80 mM TrisHCI pH 8.0, 100 mM 2-Butanol, 1.75 mM NAD ) im Photometer

NAD NADH

Test C Reduktion von TAC zu TACA unter Zugabe von NADH (50 mM NaH ₂ PO ₄ pH 5.0, 0.2 mM NADH, 1.4 μl TAC pur (10 mM)) im Photometer

TAC TACA 1 2 Beim Vergleich der Ergebnisse aus den drei Assays fiel auf, dass die Regeneration von NAD (d.h. Test B) die Ergebnisse der Komplettreaktion wesentlich besser widerspiegeln, als die im Robotertest zuerst verwendete Reduktion von TAC zu TACA.

Vorversuche zeigten ebenso, dass die Regeneration des Kofaktors mit 2-Butanol (also die Bildung von NADH), nur bei Zellen, welche den Biokatalysator exprimieren, erfolgt. Deshalb wurde der Robotertest auf den Nachweis der NADH-Regeneration mit 2- Butanol umgestellt. Parallel dazu wurde jedoch weiterhin die Reduktion von TAC zu TACA, also die Abnahme von NADH, gemessen.

2.3 Ablauf des modifizierten Robotertests

Die Zellen wurden angezüchtet und anschließend aufgeschlossen. Die MTP wurden mit Deckeln versehen und in den Inkubator bei 15 ⁰ C in die Roboteranlage gestellt. Im Multidrop wurden 100 μl/Well Wasser zugegeben, um anschließend die Zellen zu resuspendieren. Daraus wurden zwei Tochterplatten mit 20 μl/Well (für Assay: Regenera- tion des Kofaktors) bzw. 70 μl/Well (für Assay: Reduktion von TAC) Zellsuspension erstellt. Die Substratlösungen (Endkonzentrationen: Reduktion: 2 mM TAC, 0.2 mM NADH, 50 mM NaH ₂ PO ₄ pH 5.0; Regeneration: 100 mM 2-Butanol, 1.75 mM NAD, 80 mM TrisHCI pH 8.0) wurden zugegeben und die Bildung von NADH bei 340 nm im Photometer bestimmt.

2.4 Auswertung der Robotertest-Ergebnisse

Im Roboterscreening wurde die Bildung/Abnahme (Reduktion/Oxidation) von NADH photometrisch bestimmt. Dazu wurden während 10 min jeweils 10 Messwerte ermittelt. Durch Berechnung der Steigung aus diesen Werten wurde die Anfangsaktivität der Dehydrogenase bestimmt.

2.5 Hemmung der Enzymreaktion

Vorversuche hatten gezeigt, dass das Produkt TACA oder eine Nebenkomponente, welche bei der Umsetzung entsteht, die Reaktion hemmen. Das Substrat wurde nicht vollständig umgesetzt. Ziel war es also, eine Mutante zu finden, die nicht nur aktiver, sondern auch höhere Mengen an Produkt bzw. Nebenkomponente toleriert, um einen möglichst vollständigen Umsatz und damit eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute zu erzielen.

Aus diesem Grund wurde im Assay TACA zugesetzt. Hierzu wird zu dem bisher durchgeführten Regenerationstest mit 2-Butanol und NAD noch 10 mM TACA zugegeben.

Aufgrund der begrenzten Biomasse war es nicht möglich, im Roboter-Screening alle drei Tests parallel durchzuführen. Deshalb wurde auf die Reduktionsreaktion von TAC zu TACA verzichtet. Die Regenerationsreaktion von NADH mit 2-Butanol blieb unverändert. Die TAC-Lösung wurde durch eine Substratlösung für die TACA-Hemmung (100 mM 2-Butanol, 1.75 mM NAD, 10 mM TACA, 80 mM TrisHCI pH 8.0) ersetzt. Der Ablauf des Robotertests blieb unverändert.

Die Auswertung wurde entsprechend an die Messung der TACA-Hemmung angepasst.

2.6 Herstellung der Mutantentenbank: Random-Mutagenese an EbN1 -Gen

Um Mutationen in der für die Dehydrogenase kodierenden Sequenz zu erzeugen, wurde eine error-prone-PCR-Reaktion (Fehler-Polymerasekettenreaktion) unter Zugabe von MnCb durchgeführt. Mit MnCI ₂ wurde die Spezifität der verwendeten Taq-DNA- Polymerase verringert, wodurch mit steigender MnCI ₂ -Konzentration mehr falsche Nukleotide eingebaut werden und demnach mehr Mutationen erzeugt werden. Für die PCR wurden folgende Oligonukleotide mit Klonierungsschnittstellen (Ndel - Hind III) ausgewählt, die einen möglichst kurzen Bereich der DNA abdecken, damit auch in den Anfangs- und Endbereichen Mutationen entstehen konnten:

Mke123 δ'-GTTCATCTTTCCCTGGTTG-S' (SEQ ID NO:13)

Mke124 δ'-GCTACGGCGTTTCACTTC-S' (SEQ ID NO:14)

Ansatz: In 50 μl PCR-Ansatz: 50 ng Plasmid-DNA (pDHE-ebn1 H) mit Dehydrogenase-Gen, je 120 ng Oligonukleotid, GCRich-Reaction buffer 1fach (Roche), 1/5 vol GCRich resolu- tion (Roche), je 0.2 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 1 U Taq DNA Polymerase. Dieser Ansatz wurde 5 min auf 95 ⁰ C erhitzt (Anfangs-Denaturierung der DNA) und dann auf 85 ⁰ C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurde MnCI ₂ in verschiedenen Konzentrationen (von 0-1 mM in 0.02 mM-Sch ritten) zugegeben. Dies war notwendig, damit sich das MnCI ₂ komplett löst. Anschließend wurde die eigentliche PCR mit folgen- dem Temperaturprogramm gestartet: 4 Zyklen: 95 ⁰ C für 45 sec, 54 ⁰ C für 45 sec, 72 ⁰ C für 45 sec; dann 26 Zyklen: 95 ⁰ C für 45 sec, 58 ⁰ C für 45 sec, 72 ⁰ C für 45 sec; 10 ⁰ C Pause.

Die PCR-Produkte wurden über ein Agarosegel aufgereinigt (Gfx-Kit) und anschlie- ßend eine Restriktionsspaltung mit den Enzymen Ndel und Hindi 11 (beide von NEB) durchgeführt. Nach Ligation in den Vektor pDHE (ebenfalls Ndel / I— lind 111 geschnitten) erfolgte die Transformation in XL10 ultrakompetente Zellen der Firma Stratagene. Anschließend wurde die beste MnCI ₂ -Konzentration durch Sequenzierung einiger Klone (16 Klone pro Konzentration) bestimmt. Dabei wurde mit der MnCI ₂ -Konzentration wei- tergearbeitet, die zwischen 1-3 Basenpaar-Austausche lieferte. Dazu wurde der Ligati- onsansatz zunächst in XL10 kompetente Zellen transformiert, die Klone gezählt und anschließend alle Klone von der Agarplatte mit LB-Medium abgeschwemmt. Die Plas- mid-DNA wurde ohne weitere Inkubation der Zellen isoliert (Promega Kit) und die so isolierte DNA in den Produktionsstamm TG10, welcher auch die Chaperone pAgro pHSG co-exprimiert, transformiert, und auf Q-Tray-Platten ausplattiert. Dieses Vorgehen war notwendig, weil die Transformationsrate des Produktionsstammes TG10+ (LU12037) bei Ligationen sehr gering war, und man möglichst viele Mutanten haben wollte.

2.7 Selektionierte Mutanten Tabelle 1 , oben gibt eine Übersicht der aus dem Robotertest selektionierten Klone. Diese Klone stammen aus den Verifizierungsplatten, welche komplett sequenziert wurden. Diese wurden im größeren Maßstab angezogen und zunächst im Eppendorf getestet. Dabei war die Aktivität der meisten Mutanten jedoch vergleichbar mit dem Wildtyp. Die aktiveren Mutanten, beispielsweise K114T und M200V F201 L, wurden im 21-1- Maßstab fermentiert und in einem 0.5-l-Reaktor getestet.

In einem beheizbaren 0.5-l-Reaktor mit Rührer und Kondensator wurden 250 ml 2-Butanol in einem 20 mM KH ₂ PO ₄ -Puffer pH 5.0 vorgelegt. 0.2 mM NAD (0.1 g) und 400 mM TAC (35 g) wurden zugegeben. Durch Zugabe des Biokatalysators (45 ml, 5.5 g/l BTM) in Form von ganzen Zellen (unbehandelter Fermenteraustrag) wurde die Reaktion gestartet. Bei der Zugabe der Zellen in Fermentationsmedium stieg der pH-Wert auf 6. Das zweiphasige Reaktionsgemisch wurde bei 40 ⁰ C und verminderten Druck (1 10 mbar) gerührt. Dabei wurde einstufig ein Gemisch aus 2-ButOH, 2-Butanon und Wasser abdestilliert. Gleichzeitig wurde die äquivalente Menge einer Lösung bestehend aus 69 % 2-Butanol und 31 % H ₂ O (entspricht bis auf 2-Butanon der Zusammensetzung des Destillats) als Feed zugegeben. Der pH-Wert wurde mittels eines pH- Titrators überprüft und zwischen pH~5.5-6.0 konstant gehalten. Jede Stunde wurde eine Probe gezogen, mit konz. HCl abgestoppt und mittels HPLC (LJ31366) analysiert. Nach 8 h wurde die Reaktionsmischung abgelassen.

Die Fehlerbetrachtung der einzelnen Schritte zeigt, dass der größte Fehler im Wachstum der einzelnen Klone in der Mikrotiterplatte liegt. Dies ist nicht erstaunlich, da man die Wachstumsbedingungen (Temperatur, Sauerstoffeintrag, usw.) in der Mikrotiterplatte nicht so exakt wie in einem Fermenter steuern kann. Selbst verschiedene Fermentationen desselben Stammes schwanken um ca. 10 % - 15 %. Der Gesamtfehler bei diesem Roboterscreening liegt etwa bei 35 %. D. h. in diesem Screening sind nur Mutanten, welche eine Erhöhung um mehr als 35 % zeigen, aussagekräftig.

Beispiel 3: Site-directed Mutaqenesis und weitere Sättiqunqsmutaqenesen

Es wurden an weiteren gezielt ausgewählten Positionen einzelne Mutationen („site directed mutagenesis") bzw. Sättigungsmutagenesen durchgeführt, welche getestet wurden.

3.1 Auswahl der Positionen für eine Mutation

Die Substratbindetasche des Enzyms wird vom Loop 1 , 2 und der HeNx αFG1 gebildet (vgl. Figur 2). Die meisten Mutationen wurden aus diesem Bereich ausgewählt, da von diesen Aminosäuren eine unmittelbare Wirkung auf die Substratbindung und/oder Akti- vität des Enzyms erwartet werden kann.

Die HeNx ist ohne Substrat sehr flexibel (im Kristall ist keine Elektronendichte sichtbar) und wird erst bei Substratbindung fixiert. Das aktive Zentrum mit der Substratbindeta- sehe lässt sich in einen hydrophoben und hydrophilen Bereich einteilen. Der hydrophobe Teil wird vorwiegend durch die amphiphile HeNx αFG1 gebildet, die nach Substratbindung wie ein Deckel auf der Substratbindetasche sitzt. Die Aminosäuren 192 bis 204 liegen in diesem Bereich. Die Seitenketten der Aminosäuren Thr192, Leu197, Met200 und Leu204 zeigen in die Bindetasche, während Aminosäure Phe201 der Stabilisierung des Loops dient. Threonin 192 mit seiner OH-Gruppe bildet die Grenze zwischen dem hydrophoben und hydrophilen Bereich des aktiven Zentrums. Leu 186 sitzt am Anfang der flexiblen HeNx und dient als Scharnier für den geöffneten und den geschlossenen Zustand der aktiven Zentrums. Methionin 246 sitzt am Ende der Sub- stratbindetasche. Die Gegenseite der Substratbindetasche bildet der Loop ßEαF mit den Aminosäuren 146 bis 151. Auch hier zeigen die Seitenketten der ausgewählten Aminosäuren Leu146, Ile148 und Tyr151 in die Bindetasche. Die endständige OH- Gruppe des Tyrosins 151 ist Teil des Wasserstoffbrücken-Netzwerks des hydrophilen Teils des aktiven Zentrums, während der Rest der Seitenkette zum hydrophoben Teil gehört. Die vorwiegend hydrophile Unterseite des aktiven Zentrums bildet ein Strang aus den Aminosäuren 138-142, hier wurden die Aminosäuren Leu139, Thr140 und ThM 42 mutiert. Die zwei Cysteine 62 und 83 wurden für eine Mutation ausgewählt, da Cysteine generell oxidationsempfindlich sind und dadurch die Struktur negativ beeinflussen können.

In Figur 1 1 ist ein Ausschnitt aus dem aktiven Zentrum dargestellt. Der Kofaktor ist in violett markiert, das Substrat (hier TA) in grün, die mutierten Aminosäuren sind hervorgehoben. Im oberen Bereich ist die amphiphilen HeNx αFG1 zu sehen und im unteren Bereich der Loop ßEαF. (Loop 2)

3.2 Herstellung der gezielten Mutanten

Zunächst wurden für die jeweilige Position der DNA-Mutation zwei komplementäre ON- gonukleotide (siehe Tabelle 2) ausgewählt, welche der gewünschten DNA-Sequenz entsprachen. Zusätzlich wurden noch zwei weitere Oligonukleotide (Mke123 und Mke124, SEQ ID NO:5 und 6), die das gesamte Gen flankieren, ausgewählt. Die KIo- nierungsstrategie für die Site-directed Mutagenesis ist in Figur 12 dargestellt.

Anschließend wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt, jeweils mit einem das Gen flankierenden Oligonukleotid und einem, welches die gewünschte Mutation trägt. Dar- aus erhielt man zwei PCR-Produkte, die an der Stelle der Mutation einen kurzen komplementären Bereich aufwiesen. Mit diesen beiden PCR-Produkten als Template wurde eine zweite PCR durchgeführt, wobei die vorher verwendeten, das Gen flankierenden, Oligonukleotide erneut eingesetzt wurden. Aus dieser Reaktion erhielt man das komplette Gen mit der gewünschten Mutation.

Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Ndel und Hindlll gespalten und anschließend in pDHE Vektor ligiert. Nach erfolgreicher Transformation in die kompetenten Zellen XL10 Gold (Fa. Stratagene) und anschließender Plasmid-isolation wurden die Plasmide sequenziert, um die erfolgreiche Mutation zu bestätigen. Zur Aktivitätsbestimmung wurden die Plasmide in TG10+ kompetente Zellen, die die Chaperone- Plasmide pAgro und pHSG enthalten, transformiert (LU12037).

Tabelle 2: Oligonukleotid-Sequenzen für die Herstellung der einzelnen Mutanten

Einfache Mutationen

Sättigungsmutagenesen:

3.3 Aktivitätstests der gezielten Mutanten

Figur 13A zeigt die Ergebnisse aus den Aktivitätstests, bei denen sowohl die Reduktion von TAC zu TACA unter Zugabe von NADH als auch die Gesamtreaktion mit Regeneration (dunkle Balken) wie in Punkt 2.2 beschrieben getestet wurde. In Figur 13B ist nur die Gesamtreaktion mit Regeneration getestet worden.

Insbesondere die Mutante L197I zeigt eine dreimal so hohe Aktivität im Vergleich zum Wildtyp. Auf die Offenbarung der hierin zitierten Literaturstellen wird ausdrücklich Bezug genommen.