SUPPORT DE TEST BIOLOGIQUE AMELIORE

Le présent document est relatif généralement aux dispositifs de diagnostic par amplification d’acide nucléique, notamment, à partir d'un échantillon biologique tel que des gouttes de sang, d'urine, de salive et de sueur. Plus spécifiquement, la présente invention concerne des plaquettes de test, utilisées dans un système de test biologique automatisé destiné à identifier la présence d’un microorganisme infectieux (bactérie, virus, etc.). Toutefois, le dispositif et la méthode proposés peuvent être appliqués à la détection d’autres marqueurs biologiques pouvant révéler d’autre types de pathologie quelconque, cancer y compris.

S’agissant des tests de diagnostic basés sur la détection par amplification de l’ADN/ARN d’un microorganisme infectieux, on connait les méthodes de tests PCR (PCR pour Réaction de Polymérisation en Chaîne) ou les méthodes de test dites LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) ou RT-LAMP (Reverse transcriptase Loop-mediated isothermal amplification).

Généralement, un échantillon biologique à tester subit une opération de lyse, puis l’échantillon lysé est incubé avec une membrane d’extraction. Ensuite, après rinçage, séchage éventuel et élution des molécules d’intérêt depuis la membrane d’extraction, on dirige l’éluat résultant vers une ou plusieurs première zone(s) de réaction d’amplification.

Selon une réalisation d’intérêt, on pratique les opérations de rinçage, élution et lecture du résultat sur une cartouche à usage unique.

Les documents suivants donnent des exemples de technologies existantes.

Le document US2009325276 enseigne diverses configurations de cartouches pour réaliser de telles méthodes de test.

Le document CA3100263 décrit un dispositif microfluidique pour la séparation, la purification et la concentration de composants dans un média fludique.

Le document « An integrated, self-contained microfluidic cassette for isolation, amplification, and detection of nucleic acids" de Chen et al., Biomed Microdevices (2010) 12 705-719 [doi : 10.1007/s10544-010-9423-4] décrit une cassette intégrée et autosuffisante pour l’isolation, l’amplification et la détection d’acides nucléiques.

Exposé de l’invention

Il a été constaté par les inventeurs que l’échantillon élué qui est transporté depuis la membrane d’extraction jusqu’à la zone de réaction/amplification peut contenir quelques résidus indésirables qui vont gêner voire empêcher les réactions d’amplification de se produire. Ces impuretés sont plus fréquemment trouvées sur des dispositifs point-of-care (« au chevet du patient »), qui automatisent de nombreuses étapes des méthodes d’analyse, plutôt que sur des dispositifs de laboratoire.

Les inventeurs ont de plus constaté que ce type d’impuretés se trouve généralement dans une portion de front (i.e. le début du flux) du flux d’échantillon élué, alors que la portion suivante est dépourvue de ce type d’impuretés indésirables.

À cet effet, il est proposé ici un support de test biologique, à usage unique, destiné à être utilisé avec une station de test pour former un système de test biologique (ST) permettant de détecter la présence d’une une ou plusieurs espèces pathogènes et/ou d’une séquence nucléique à révéler, le support de test comprenant :

- un réservoir amont, pour recevoir un échantillon biologique à tester sous forme liquide,

- une membrane d’extraction, agencée dans un premier logement, en communication fluidique avec le réservoir amont,

- une zone de réaction comprenant un logement de réaction contenant un mélange réactionnel de test,

- un canal de transfert reliant le premier logement au logement de réaction,

- une membrane de prélèvement agencée dans un troisième logement, le troisième logement étant placé en communication fluidique avec le canal de transfert.

La membrane de prélèvement permet ainsi de piéger le front de l’éluat, qui peut contenir des impuretés et éviter qu’il n’arrive jusqu’au(x) mélange(s) réactionnel(s).

En particulier, la capacité d’absorption de la membrane de prélèvement est choisie de sorte qu’un flux de liquide transitant par le canal de transfert soit partiellement prélevé par la membrane de prélèvement.

Une portion de front de l’éluat est capturée et retenue par la membrane de prélèvement sans parvenir au premier mélange réactionnel de test, alors qu’une portion suivante de l’éluat parvient au premier mélange réactionnel de test. On peut considérer que la membrane de prélèvement fait office ici de membrane de ‘dépollution’. Une telle membrane permet de gérer efficacement les impuretés sans intervention particulière sur la plaquette de test et en particulier sans pilotage du système de test biologique. Il s’agit d’un piégeage passif.

En particulier, ladite communication fluidique est directe.

Le terme « placé en communication fluidique » recouvre notamment une disposition où la membrane de prélèvement est placée de manière adjacente au canal de transfert. Toutefois il n’est pas exclu d’avoir un canal de dérivation spécifique fonctionnant comme une liaison, par exemple capillaire, entre le canal de transfert et la membrane de prélèvement. Quand la membrane de prélèvement est saturée, elle ne capte plus de liquide supplémentaire et laisse passer le fluide qui arrive sans en capturer plus.

Le terme « membrane d’extraction » désigne ici un organe poreux permettant d’absorber momentanément les acides nucléiques contenus dans l’échantillon à tester, de retenir ces acides nucléiques pendant une ou plusieurs opérations de rinçage destinées à éliminer des espèces chimiques telles protéines ou débris, résidus de tampon de lyse y compris. Suite à quoi, un éluant à plus forte affinité ionique avec lesdits acides nucléiques est introduit, permet de capter les acides nucléiques d’intérêt et de les entraîner, sous forme d’un éluat, vers les zones de réaction/d’amplification.

Le support de test biologique forme une cartouche, c’est-à-dire un objet consommable (i.e. à usage unique) destiné à être utilisé avec une station de test qui reçoit la cartouche et qui interagit avec cette dernière. La station de test permet d’analyser successivement une pluralité de cartouches.

Le logement de réaction susmentionnée peut comprendre un ou plusieurs logements, appelés deuxième et/ou quatrième logement.

Dans divers modes de réalisation de l’invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l’une et/ou à l’autre des dispositions suivantes, prises isolément ou en combinaison.

Selon un aspect, la membrane de prélèvement peut présenter une capacité d’absorption représentant un volume compris entre 10% et 90 % du volume prédéfini d’éluant. Le volume prédéfini d’éluant est typiquement embarqué dans un logement de la plaquette de test (dans un blister par exemple). Avantageusement, on capte le début de l’écoulement grâce à la membrane de prélèvement, mais elle devient saturée à un moment donné et il reste encore de l’éluat qui va poursuivre son chemin jusqu’à la zone de réaction.

Selon un aspect optionnel, la membrane de prélèvement peut présenter une capacité d’absorption représentant un volume compris entre 20% et 70 % du volume prédéfini d’éluant, voire un volume compris entre 30% et 60 % du volume prédéfini d’éluant. Selon diverses possibilités, on peut prévoir assez précisément le volume qui va être piégé par la membrane de prélèvement et aussi par conséquent le volume qui reste disponible pour aller réagir dans les zones de mélange réactionnel. De plus on écarte par piégeage un volume suffisant de l’éluat qui pourrait comporter des éléments indésirables.

Selon un aspect, la membrane de prélèvement peut côtoyer le canal de transfert sur une distance supérieure à 4 mm ou bien N fois un diamètre ou une dimension (largeur ou hauteur) de la section transversale du canal de transfert, N étant de préférence supérieur à 3, 5, 10 voire 15.

Ainsi on obtient une aspiration par effet buvard (capillarité), avec une surface d’interface suffisante pour capturer la portion précurseuse (i.e. de front) du flux sur une large plage de vitesses et débits possibles.

Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre au moins un premier volume de premier liquide de rinçage, et/ou un volume prédéfini d’éluant. Les volumes peuvent être contenus directement dans des logements du support de test ou contenus dans des sachets agencés dans des logements du support de test.

Les liquides sont hébergés à bord du support de test, et ainsi la seule interface nécessaire pour la transmission de fluide entre la plaquette de test et la station de test est une interface pneumatique. On minimise ainsi des transferts de fluide entre la station de test et le support de test et, de fait, les risques de fuite et de contamination de la station de test.

Selon un aspect, le mélange réactionnel de test est sous forme lyophilisée. La forme lyophilisée permet de conserver le support de test prêt à l’usage sur une période longue avant son utilisation effective. Le mélange peut permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt.

Selon un aspect, la zone de réaction comprend une première zone de réaction qui peut contenir un media poreux de réaction agencé dans un deuxième logement du logement de réaction et contenant le premier mélange réactionnel de test sous forme lyophilisée, le premier mélange réactionnel permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt.

Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre au moins un réservoir de récupération, pour récupérer les liquides issus du rinçage, et le trop plein d’éluat.

Aucun liquide ne sort, on garde la station propre et on évite des contaminations croisées.

Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre au moins une sortie d’air, pour faciliter le remplissage dudit réservoir. Moyennant quoi l’air qui se trouvait dans le réservoir de récupération peut facilement s’échapper lorsqu’on pousse les liquides en direction du réservoir de récupération.

Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre un système de valve pour diriger un flux de fluide (liquide et/ou air) depuis la membrane d’extraction sélectivement vers le réservoir de récupération ou vers la zone de réaction via le canal de transfert. On peut diriger de manière fiable les flux de liquide à l’intérieur du support de test en pilotant le système de valve. Ledit système de valve peut être activé depuis la station de test qui traite le support de test.

Selon un aspect, le système de valve peut comprendre une première valve de dérivation et une deuxième valve de dérivation pour diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction sélectivement vers le réservoir de récupération ou vers la ou les zone(s) de réaction via le canal de transfert. Les valves de dérivation peuvent être des valves de type membrane. Ce genre de valve de type membrane peut être facilement pilotée grâce à des poussoirs agencés dans la station de test qui traite le(s) support(s) de test.

Selon un aspect, la membrane de prélèvement (ou le troisième logement) se situe fluidiquement entre le système de valve et la zone de réaction. Dit autrement, la membrane de prélèvement (ou le troisième logement) se situe fluidiquement sur le parcours qui mène du système de valve à la zone de réaction. Ainsi, la membrane de prélèvement est agencée à l’endroit le plus pertinent du circuit microfluidique, i.e. juste en amont des zones de mélange réactionnel et après le système de valve, ce qui évite à la membrane de prélèvement de prélever par exemple des liquides de rinçage qui sont utilisés pour nettoyer la membrane d’extraction.

Selon un aspect, la zone de réaction peut comprendre en outre une deuxième zone de réaction contenant un quatrième logement et contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle. Ceci permet de vérifier que l’éluat est bien arrivé à bon port dans les zones de mélange réactionnel ; car en effet le mélange réactionnel de contrôle réagit à la présence de molécules toujours présentes dans l’éluat, que ce dernier contienne ou pas les espèces nucléiques d’intérêt.

Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre une zone de lecture de résultat comprenant au moins la zone de réaction et en particulier la première zone de réaction et/ou la deuxième zone de réaction. Par exemple, il peut s’agir d’une lecture optique du résultat. Le résultat peut être obtenu rapidement et directement sur place alors que le support de test n’a pas été manipulé ou transporté, dans une logique d’accessibilité et de rapidité de point- of-care.

Selon un aspect, le support de test (plus précisément la zone de réaction) peut comprendre en outre un réservoir de distribution agencé de manière adjacente à la première, et le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction de manière à pouvoir alimenter en éluat les première et deuxième zones de réaction par pompage capillaire. On fiabilise ainsi l’alimentation en éluat à des zones de réaction.

Selon un aspect, la membrane de prélèvement peut être formée d’un matériau comprenant au moins un parmi : cellulose, polyfluorure de vinylidène (‘PVDF’). Ces matières ont une porosité adéquate pour capturer et retenir l’éluat.

Selon un aspect, la capacité d’absorption de la membrane de prélèvement est déterminée de sorte qu’un flux de liquide transitant par le canal de transfert soit partiellement prélevé par la membrane de prélèvement. Par partiellement prélevé, il est signifié qu’uniquement une portion du flux soit prélevée et pas l’intégralité (par exemple entre 5 et 90%, ou 10 et 90%, ou entre 10 et 50% du flux). La capacité d’absorption est notamment définie par les dimensions de la membrane de prélèvement, son matériau, l’interface avec le canal de transfert, etc.

Selon un aspect, la membrane de prélèvement peut être formée d’un matériau présentant une absorption d’eau comprise entre 50 mg/cm ² et 150 mg/cm ² , voire entre 95 et 105 mg/cm ²

Selon un aspect, le support de test biologique est configuré pour amener l’échantillon biologique à tester dans la membrane d’extraction, puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, diriger l’éluat résultant vers au moins la première zone de réaction, une portion précurseuse de l’éluat étant piégée par la membrane de prélèvement sans parvenir au mélange réactionnel de test, une portion suivante de l’éluat parvenant au mélange réactionnel de test. Ainsi, on procède à de multiples opérations fluidiques à l’intérieur du support de test de manière à pouvoir en déduire, après réaction d’amplification, un résultat au travers de la zone de lecture.

Selon un aspect, le logement de réaction est situé dans une zone d’interaction thermique configurée pour être chauffée par la station d’analyse, et le troisième logement est situé hors de la zone d’interaction thermique. La zone d’interaction thermique est typiquement inférieure à 5cm ² .

Cela permet d’éviter d’éventuelles perturbations optiques, d’une part parce que la membrane de prélèvement n’est pas chauffée (ou moins chauffée), de sorte que les réactions permettant une visualisation optique ne sont pas activées. De plus, la membrane de prélèvement étant éloignée de la zone de réaction (dans laquelle est incluse la zone de lecture optique), les risques d’interférence sont encore réduits.

Selon un aspect, le premier logement est agencé dans la zone de d’interaction thermique ou optique de surface au plus égale à 5 cm ² . Cela permet d’utiliser le même système de chauffage pour la membrane d’extraction et pour la zone de réaction, ce qui diminue la complexité de la station et augmente la compacité de l’ensemble. Accessoirement, cela peut accélérer le séchage de la membrane d’extraction.

Selon un aspect, le support de test peut se présenter comme une plaquette avec un corps dans lequel sont formés des canaux et des logements, lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur. Un tel support de test peut être fabriqué en grande série à des coûts bien maîtrisés.

Selon un aspect, le support peut présenter une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales. Il peut être prévu une entrée d’air et il peut être prévu une entrée en communication fluidique avec le réservoir amont pour recevoir un échantillon biologique à tester. Ces deux entrées peuvent être agencées sur une seule face principale.

Préférentiellement toutes les interfaces peuvent être agencées sur une seule face principale. On a ainsi une interface avec la station de test particulièrement simple, ce qui permet de fiabil iser les tests et d’augmenter la productivité. Selon un aspect, le support de test est configuré pour coopérer avec une station de test biologique pour former le système de test biologique.

Selon un aspect, l’éluant contenu dans le volume d’éluant est de l’eau distillée exempte d’ARNase et/ou d’ADNase et le volume d’éluant présente un volume compris entre 30 microlitres et 100 microlitres.

Selon un aspect, il peut être prévu au moins une entrée d’air, confondue ou distincte de l’entrée pour recevoir l’échantillon biologique. L’entrée d’air distincte ou l’entrée combinée peut en outre être munie d’un clapet anti-retour.

Selon un aspect, l’entrée pour recevoir l’échantillon biologique peut être de préférence scellable ou refermable, voire être muni d’un clapet anti-retour

Selon un aspect, il peut être prévu un deuxième volume d’un deuxième liquide de rinçage, les premier et deuxième volumes de liquide de rinçage ayant un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres.

La présente invention vise aussi un système de test biologique comprenant une station d’analyse et une ou plusieurs supports de test biologique tels que décrits précédemment, la station d’analyse comprenant au moins un connecteur pneumatique configuré pour être accouplé à l’entrée d’air du support de test biologique.

D’autres aspects, buts et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description suivante de plusieurs modes de réalisation de l’invention, donnés à titre d’exemple non limitatif. L’invention sera également mieux comprise en regard des dessins joints sur lesquels :

- la figure 1 est une vue schématique en plan d’un premier exemple de réalisation de support de test selon la présente invention

- la figure 2 est une vue en plan d’un deuxième exemple de réalisation de support de test selon la présente invention.

- la figure 3 illustre schématiquement en élévation le couplage entre le canal de transfert et la membrane de prélèvement.

- la figure 4 illustre schématiquement en coupe transversale de détail le couplage entre le canal de transfert et la membrane de prélèvement.

- la figure 5 illustre schématiquement l’interface entre la station d’analyse et le support de test biologique dans les zones d’activation des fluides.

- la figure 6 illustre schématiquement l’interface entre la station d’analyse et le support de test biologique, dans la zone de lecture du résultat.

- la figure 7 illustre une station d’analyse avec un support de test biologique.

- les figures 8A et 8B sont des vues de détail illustrant une valve de type membrane.

- la figure 9 est une vue de détail illustrant un sachet de liquide embarqué sur la plaquette et poussé par un piston de la station d’analyse.

- la figure 10 est une vue schématique en plan d’un autre exemple de réalisation de support de test selon la présente invention. - la figure 11 est une vue en plan d’un autre exemple de réalisation de support de test selon la présente invention.

- la figure 12 est une vue tridimensionnelle de l’exemple de la figure 11 .

- la figure 13 est une vue analogue à la figure 4 et montre une coupe relative à l’exemple de réalisation des figures 11 et 12.

DESCRIPTION DETAILLEE

Sur les différentes figures, les mêmes références désignent des éléments identiques ou similaires. Pour des raisons de clarté de l’exposé, certaines dimensions peuvent ne pas être représentées à l’échelle.

Système - généralités

Selon la vue synoptique présentés à la figure 7, il est proposé un système de test biologique ST qui comprend une station d’analyse 8 qui sera commentée plus loin, et un support de test 1.

Le support de test 1 , que l’on peut appeler en pratique la « cartouche » ou la « plaquette » est prévu pour usage unique ; il y a donc autant de supports de test que de tests à réaliser.

On recueille un échantillon biologique, par exemple de la salive, un prélèvement naso-pharyngé, ou de l’urine, voire de la sueur. Bien que le système proposé s’adresse en particulier au traitement d’échantillons humains, il n’est pas exclu d’utiliser le système proposé pour traiter des échantillons prélevés sur des animaux. Optionnellement, pour certains types de tests, on peut être amené à recueillir du sang ou de la lymphe comme un échantillon biologique à tester.

Le recueil de l’échantillon biologique peut être introduit dans un récipient de collecte où on lui adjoint un tampon de lyse (pour rompre les membranes des cellules biologiques). On peut agiter le récipient de collecte pendant un temps suffisant d’une à plusieurs minutes, suite à quoi on verse une quantité prédéfinie d’éthanol dans le récipient pour figer l’échantillon dans un état d’échantillon préparé. On note qu’il suffit de prélever une quantité faible de fluide corporel brut, typiquement un volume entre 0,1 millilitre et 1 millilitre suffit pour de multiples types de tests.

L’échantillon biologique dans récipient de collecte ainsi préparé (noté ET) est ensuite versé dans un orifice d’entrée du support de test repéré 12. Suite à quoi on rebouche cet orifice d’entrée, i.e. on rend hermétique cette entrée par un bouchon voire un scellement de membrane de fermeture étanche. L’orifice d’entrée 12 est connectée fluidiquement à un réservoir amont 11, qui reçoit l’échantillon biologique. Par exemple, le réservoir amont 11 peut stocker temporairement l’échantillon biologique (pendant quelques minutes). Le réservoir amont 11 peut aussi être un simple canal de passage.

On peut aussi utiliser un clapet anti-retour qui permet en outre d’utiliser cette entrée comme entrée d’air pour les opérations ultérieures. Ce clapet autorise une entrée dans le support de test mais interdit le mouvement inverse. Le clapet peut être monté sur l’orifice d’entrée par une bague de retenue, par exemple. Le clapet peut être une valve en silicone, comme une « duckbill valve », « dome valve », « umbrella valve », etc.

Le support de test 1 contenant désormais l’échantillon biologique à traiter est placé sur un poste de test dans la station d’analyse 8 qui a alors son capot 80 ouvert. Ensuite la porte (le capot) est refermée et un utilisateur déclenche un cycle de traitement, i.e. un cycle de test. A la fin dudit cycle, un résultat de test est donné par la station d’analyse, sous une forme qui sera décrite plus loin. Le support de test et la station d’analyse peuvent présenter diverses fonctions et caractéristiques ; des exemples de réalisation sont présentés ci-après.

Le résultat est obtenu dans un temps qui va de de quelques minutes à quelques dizaines de minutes.

Un tel système peut être utilisé dans le contexte d’un laboratoire d’analyse, mais, au vu de sa simplicité et la rapidité de sa mise en œuvre, ce système de test biologique peut être utilisé au-delà, dans un contexte très large, de type « point-of-care », à savoir dans une pharmacie, dans un cabinet médical, dans un établissement de soins généraux, dans un système de mise en quarantaine et libération de quarantaine, etc. Ce système de test biologique peut aussi être utilisé dans un véhicule de vétérinaire pour tester des animaux.

D’une façon générale, le terme « support de test » doit être pris ici au sens très large, le support de test est ici un support qui peut prendre toute forme géométrique, par exemple une forme de plaquette, mais tout autre forme n’est toutefois pas exclue.

Par abus de langage en parlant du support de test, on peut aussi l’appeler ‘chip’ ou ‘puce’, terme qui vient de la logique ‘Lab-on-a-chip’.

L’ensemble des opérations de traitement pratiqué sur l’échantillon biologique à tester sont réalisés dans cette plaquette, notamment l’extraction des molécules ADN/ARN rinçage élution, la plaquette comprenant également au moins une zone de lecture du résultat.

Dans l’exemple illustré, le support de test / la plaquette de test présente une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales, à savoir une première face principale 10A dite face d’interaction et une deuxième principale 10B dite face arrière. De plus, une tranche périphérique 10C formant les quatre autres faces s’étend entre les deux faces principales. Dans l’exemple illustré, l’épaisseur de la plaquette notée H1 est comprise entre 3 mm et 20 mm. La longueur L1 est comprise entre 20 mm et 80 mm et la largeur W1 est comprise entre 10 mm et 60 mm. La configuration géométrique peut s’apparenter à un format carte de crédit avec toutefois une épaisseur un peu plus importante.

La plaquette de test 1 peut toutefois présenter une autre forme. Pour des raisons de lectures optiques, les formes comprenant une faible épaisseur et des faces principales planes sont privilégiées.

Le support de test peut être identifiée par un élément d’identification, qui peut être agencé sur le support (i.e. QR Code) ou dans le support comme dans le cas d’une puce RFID, NFC ou équivalents. L’élément d’identification peut être même plus simple, comme un codage couleur ou un codage mécanique. L’élément d’identification, lorsqu’il est numérique, permet d’identifier unitairement sans ambiguïté le support de test, et accessoirement de stocker le résultat dans l’élément d’identification à la fin du test avant l’ouverture de la porte/capot.

Par ailleurs, l’échantillon biologique ET étant associé à un individu duquel provient cet échantillon biologique, ce qui permet d’associer de façon bi- univoque l’échantillon biologique, le support et/ou l’individu donneur.

La puce RFID ou NFC permet aussi d’identifier qu’un support est bien montée dans la station. Cela peut conditionner l’activation du verrouillage de la station.

Dans l’exemple illustré, le support de test formé comme une plaquette est obtenu par enlèvement de manière à partir d’un bloc de matière homogène parallélépipédique. On pratique depuis la face arrière 10B des fraisages et des perçages pour obtenir les canaux et logements qui seront discutés plus loin.

Optionnellement, des fraisages et des perçages peuvent être réalisés depuis la face avant également.

Le corps de la plaquette est formé en matériau plastique translucide 100, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycarbonate (PC), le copolymère cyclo-oléfinique (COC) ou le Cyclo Oléfines Polymères (COP).

Au lieu de partir d’un bloc homogène parallélépipédique, on peut partir d’une forme moulée où les principaux logements sont déjà formés de moulage et seuls des perçages de petit diamètre restent à faire.

On peut aussi obtenir directement de moulage la plaquette avec tous ses canaux et logements, sans reprise d’usinage.

En outre, au lieu d’une méthode par enlèvement de matière, on peut utiliser un procédé de fabrication additive de type impression 3D.

On note que le substrat choisi forme une barrière efficace pour contenir les fluides considérés, il ne laisse pas passer ni n’absorbe l’air et les liquides de rinçage dont il va être question plus loin.

Sur la face arrière 10B, pour fermer les canaux et les logements, on vient coller une membrane de fermeture 59, comme illustré en figure 4, par exemple un film plastique adhésif bio-compatible. Alternativement, on peut prévoir de souder un capot arrière, par exemple par soudure ultrasons.

Il peut être aussi prévu une membrane de fermeture sur une partie de la face avant de la plaquette.

Ainsi les canaux et les logements sont généralement isolés de l’environnement extérieur.

Les figures 1 , 2 et 10 illustrent plusieurs modes de réalisation du support de test. Dans les canaux (généralement repérés par 13) et les logements circule du fluide qui peut être du liquide ou de l’air. Les canaux ont généralement une section transversale petite et/ou une longueur petite au regard des dimensions des logements. Parmi les logements, on trouve un réservoir dit amont 11 qui forme un réservoir pour le stockage temporaire de l’échantillon biologique à tester ET ; ce réservoir est un canal élargi en forme de serpentin dans l’exemple illustré II peut néanmoins avoir une autre forme. On trouve aussi un réservoir aval aussi appelé réservoir de récupération 18. Ce réservoir de récupération 18 est en aval des canaux transportant des fluides liquides et ce réservoir de récupération 18 est dimensionné pour contenir : le volume de l’échantillon biologique à tester + les volumes de liquide de rinçage + le volume d’éluat. Le volume de ce réservoir de récupération 18 est par exemple compris entre 0,1 millilitre et 2 millilitres.

Selon une configuration optionnelle, le réservoir de récupération 18 contient un tampon absorbant 180 (cf Fig 10). Ce tampon absorbant présente un effet buvard et capture les liquides. Il est prévu que le tampon absorbant n’occupe pas tout le volume disponible dans le réservoir de récupération, et de laisser au moins un passage d’air entre le tampon et les parois du réservoir afin que de l’air puisse s’échapper par un orifice de sortie 16.

Pour en revenir aux canaux et en référence notamment à la figure 2, un canal (dit canal d’injection 14a) relie l’entrée d’air 14 à l’espace formant le réservoir amont 11. Le réservoir amont 11 peut être un logement sous forme d’un canal d’une longueur et/ou d’une section supérieure à celles des canaux de communication 13. L’échantillon biologique comprend typiquement de la salive et du tampon de lyse.

Un autre canal (dit canal de liaison 11a) relie l’espace formant réservoir amont 11 à un premier logement 24 contenant une membrane d’extraction 2 qui sera discutée plus loin.

Un autre canal (dit premier canal intermédiaire 24a) relie le logement 24 à une valve de dérivation 52 (dite deuxième valve de dérivation). A partir de là, un autre canal, dit canal de transfert 44, relie la sortie de la valve de dérivation 52 à la zone contenant les réactants, notamment à un réservoir de distribution 38. On parlera de logement de réaction ou de zone de réaction pour signifier l’emplacement dans la cartouche où les molécules d’intérêt réagissent et sont analysées optiquement.

Un autre canal (dit deuxième canal intermédiaire 24b) relie le logement 24 (ou bien l’entrée de valve de dérivation 52) à une autre valve de dérivation 51 (dite première valve de dérivation) qui autorise ou stoppe le passage de fluide vers l’aval en direction du réservoir de récupération 18, via un canal d’évacuation 18a. Le canal d’évacuation 18a débouche donc dans le réservoir de récupération 18 et peut comprendre une sortie d’air 17 optionnelle (figure 2).

Comme illustré sur les figures 1 , 2 et 10, le premier canal intermédiaire 24a et le deuxième canal intermédiaire 24b peuvent avoir une portion commune puis se diviser en deux sous-portions, les sous-portions intégrant respectivement la première valve de dérivation 52 et la deuxième valve de dérivation 51 . Les deux valves de dérivation 51 , 52 sont alors disposées en parallèle en sortie du premier logement 24.

Alternativement (non illustré), une valve unique peut être prévue, à la place des valves 51 , 52. La valve unique comprend alors une entrée et deux sorties, choisissables sélectivement.

D’autres canaux 61a, 62a, 63a s’étendent respectivement depuis des logements 61 , 62, 63, qui contiennent des liquides de traitement, jusqu’au logement 24 de la membrane d’extraction (typiquement les canaux 61a, 62a, 63a rejoignent le canal de liaison 11a). Les figures 1 et 2 illustrent trois logements 61 , 62, 63 (deux liquides de rinçage et un éluant) ; la figure 10 illustre deux logements 61 , 63 (un liquide de rinçage et un éluant).

Les liquides de traitement sont disposés en amont du logement 24 de la membrane d’extraction 2, et sont configurés pour être activés sélectivement par la station d’analyse.

On remarque que pour chacun des canaux à l’intérieur du support de test, les liquides s’écoulent dans une seule direction. Sauf indication contraire, les canaux sont utilisés à sens unique.

Il est prévu une interface pneumatique 66, représentée schématiquement sur la figure 6, au niveau de l’entrée d’air 14. Grâce à cette entrée pneumatique, et la commande d’un système de valve déjà présenté mais décrit plus en détail plus bas, la station d’analyse peut pousser les liquides à l’intérieur des canaux de la plaquette de test.

Membrane d’extraction, liquides de traitement et valves

Comme déjà évoqué, le support de test 1 comprend une membrane d’extraction repérée 2. La membrane d’extraction 2 peut être une membrane de silice ou membrane de cellulose. La membrane d’extraction présente une structure poreuse, c’est-à-dire une structure alvéolaire. La fonction de la membrane d’extraction est l’isolation des molécules ADN/ARN et l’élimination des protéines et autres déchets à molécules courtes comme il va être décrit ci- après.

Dans un exemple, la matrice en silice de la membrane d’extraction est capable de fixer sélectivement les ADN/ARN en condition de force ionique élevée et en pH < 7. Les impuretés sont éliminées par des rinçages et après séchage, les molécules d’ADN et séquences ARN sont élués dans une solution en force ionique faible et à pH > 7. La matrice en silice peut être sous un format de poudre de verre, de particules de verre/silice ou de fibres en verre.

Pour plus de détails sur les membranes d’extraction utilisées ici, on pourra se référer au document EP1463744.

On note que la membrane d’extraction 2 occupe tout le logement 24 dans lequel elle est disposée dans la direction transversale à l’écoulement des fluides que l’on fait passer dans la membrane d’extraction 2. Autrement dit, le flux d’écoulement des fluides (rinçage, séchage, élution) ne peut pas contourner la membrane d’extraction 2.

On peut choisir pour la membrane d’extraction la membrane GF/F Whatman de source Sigma-Aldrich™. Selon un autre exemple, on peut choisir pour la membrane d’extraction la membrane GF/D Whatman de source Sigma- Aldrich™.

Par exemple, la longueur de la membrane peut être de l’ordre de 10 mm, sa largeur peut être comprise entre 3 mm et 5 mm et son épaisseur peut être comprise entre 0,3 mm et 0,6 mm.

De plus, le support de test comprend des liquides de traitement qui sont prédisposés sur le support de test, c’est-à-dire présents sur le support de test lui-même. On peut dire qu’ils sont embarqués ou à bord du support de test.

Dans l’exemple illustré, il est prévu un premier volume de liquide de rinçage R1 agencé dans le logement 61 , et optionnellement un deuxième volume d’un deuxième liquide de rinçage R2 agencé dans l’autre logement 62. De plus il est prévu un volume d’éluant 23 agencé dans l’autre logement 63, dont la contenance est prédéterminée et connue à l’avance.

Ces volumes/produits sont contenus directement dans des logements du corps 10 ou contenus dans des sachets lesquels sont agencés dans des logements du corps. Dans la configuration sachet/blister, ces sachets sont préparés en avance et ont une contenance bien précise. Le liquide d’intérêt est contenu dans ce sachet, par exemple en film d’aluminium, et il n’y a pas de contact direct entre le corps de la plaquette et le liquide d’intérêt avant utilisation effective par percement/déchirement du sachet.

Le contenu de ces volumes de liquide peut être déversé et dirigé vers la membrane d’extraction 2 au travers des canaux 61a, 62a, 63a susmentionnés comme il sera vu plus tard, en réponse à une activation pneumatique.

Dans l’exemple illustré, les premier et deuxième volumes V1 , V2 de liquide de rinçage R1, R2 des logements 61 , 62 ont un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres. L’invention fonctionne aussi pour des volumes de rinçage plus petits et aussi pour des volumes plus grands.

Concernant le volume (noté V3) d’éluant 23 du logement 63, il peut être compris entre 30 microlitres et 50 microlitres.

Concernant l’éluant, on choisira de préférence une eau particulière, à savoir une eau distillée exempte de RNase et de Dnase, i.e. dépourvue de Rnase et Dnase, dite « Dnase/Rnase free water». Dans un autre exemple on utilise un tampon Tris/EDTA. Pour l’éluant, on peut aussi choisir comme éluant un composé connu sous le nom d’Ibuffer™ d’Optigene™.

L’éluant présente une force ionique faible et présente un pH > 7.

Pour plus de détails sur le type d’éluant utilisé ici, on pourra se référer au document EP1463744.

En outre, dans l’exemple illustré, le support de test comprend un système de valves 5 pour diriger un flux de fluide depuis la sortie de la membrane d’extraction sélectivement vers le réservoir de récupération 18 ou vers la ou les zone(s) de réaction via le canal de transfert 44.

Dans un exemple tel qu’illustré, le support de test comprend deux valves de dérivation qui servent à diriger ou stopper un flux de fluide circulant dans les canaux 13.

Plus précisément, les deux valves permettent de diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction 2 sélectivement vers le réservoir de récupération 18 ou vers la zone de réaction.

La première valve de dérivation 51 peut sélectivement fermer l’accès au réservoir de récupération 18. La deuxième valve de dérivation 52 peut sélectivement ouvrir l’accès vers les zones de réaction. Les deux valves de dérivation 51 , 52 sont disposées en parallèle en sortie du logement 24, de sorte que l’activation de l’une ou de l’autre permet de sélectivement guider les fluides vers le réservoir de récupération 18 ou les zone des réactions.

Comme décrit précédemment, le système de valve 5 peut comprendre différentes configurations, comme une unique valve qui permet de sélectivement envoyer une entrée vers les deux voies précédemment décrites.

Les valves de dérivation 51, 52 sont dans l’exemple illustré des valves de type membrane. En effet une membrane déformable vient sélectivement ouvrir ou fermer un passage entre deux orifices voisins, la membrane étant placée dans un logement fermé, les deux orifices étant les seules voies de passages disponibles pour le fluide. Alternativement, les valves de dérivation 51 , 52 sont des valves de types robinet, dont la rotation est activable pneumatiquement.

La valve membrane a été illustrée dans une configuration normalement ouverte, mais il est aussi possible d’utiliser une membrane de configuration normalement fermée.

La sortie d’air 16 est agencée au fond ou en communication avec le fond du réservoir de récupération, tandis que la sortie d’air intermédiaire optionnelle 17 est agencée à proximité de l’entrée du réservoir de récupération. L’une et l’autre peuvent être équipées d’une capsule Goretex™ ou équivalente qui empêche tout déversement de liquide tout en laissant passer l’air.

Pour la sortie d’air 16 du fond de réservoir, en fonction de la configuration du réservoir et notamment s’il a un volume excédentaire par rapport au besoin de stockage, la capsule Goretex™ est optionnelle.

Canal de transfert, zones de réaction et zone de lecture

De plus, le support de test 1 , et en particulier la zone de réaction, comprend une première zone de réaction 31 avec un premier mélange réactionnel de test 33 positionné dans un logement de réaction. Plus précisément, la première zone de réaction contient un media poreux 35 contenant le premier mélange réactionnel de test 33.

Optionnellement, il est prévu dans la zone de réaction une deuxième zone de réaction 32 un deuxième mélange réactionnel de contrôle 34. En pratique, la deuxième zone de réaction contient un media poreux 35 contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle 34. Les première et deuxième zones de réaction sont agencées respectivement dans un deuxième logement 72 et dans un quatrième logement 74. Le deuxième logement 72 et le quatrième logement 74 font partie du logement de réaction.

On parlera donc plus généralement d’un logement (ou zone) de réaction, qu’il comprenne un, deux ou plus de logements (ou zones) de réaction, et/ou le réservoir de distribution 38.

Selon la configuration promue ici, le canal de transfert 44 relie le premier logement 24 au logement de réaction 72, 74. Il y est prévu une membrane de prélèvement 4 agencée dans un troisième logement 73, le troisième logement 73 étant placé en communication fluidique avec le canal de transfert 44.

La membrane de prélèvement 4 est dimensionnée de sorte qu’une partie seulement du flux de fluide passant par le canal de transfert 44 en utilisation normale soit prélevé par la membrane de prélèvement 4. Plus spécifiquement, la partie prélevée comprend le front du flux. Concrètement, lorsqu’un flux de fluide transite par le canal de transfert 44, le front du flux est capté par la membrane de prélèvement 4. Une fois cette dernière saturée, elle cesse d’absorber et le reste du flux rejoint la zone de réaction.

En particulier, le dimensionnement de la membrane de prélèvement 4 se fait par rapport aux volumes de fluide présents sur la plaquette. Plus spécifiquement, le dimensionnement de la membrane de prélèvement 4 se fait par rapport au volume d’éluant seul, et encore plus spécifiquement par rapport au volume d’éluant traversant la membrane d’extraction. Le volume d’éluant peut être le volume d’éluant V3 stocké dans le logement 63. Dans un mode de réalisation, la membrane de prélèvement 4 peut absorber entre 5% (ou 10%) et 90% du volume d’éluant stocké sur la plaquette de test 1.

Par dimensionner, on entend notamment la taille de la membrane de prélèvement 4 et/ou la surface de l’interface avec le canal de transfert 44, et/ou la capacité d’absorption du matériau de la membrane de prélèvement 4.

Dans un mode de réalisation illustré sur les figures et particulièrement visible sur la figure 11 , le troisième logement 73 prend la forme d’un agrandissement du canal de transfert 44 et la membrane de prélèvement 4 est positionnée dans ledit agrandissement. Par le terme agrandissement, on entend en pratique un élargissement de la section transversale du canal de transfert 44.

De la sorte, le canal de transfert 44 n’est pas obstrué par la membrane de prélèvement 4 mais l’interface fluidique entre le canal de transfert 44 et la membrane de prélèvement 4 est agrandie. Dit autrement, une paroi d’une portion du canal de transfert 44 est formée par la membrane de prélèvement 4. Cela permet au front de fluide passant par le canal d’être efficacement capté, jusqu’à saturation de la membrane de prélèvement 4. Dans un exemple, l’interface entre le volume interne du canal de transfert 44 et la membrane de prélèvement 44 s’étend sur au moins 3 mm, ou 5 mm ou même 8 mm en longueur.

La membrane de prélèvement 4 peut avoir une forme sensiblement similaire à celle du troisième logement 73, voire légèrement plus grande (par exemple homothétiquement), de sorte que la membrane de prélèvement 4 peut être inséré en la déformant légèrement dans le troisième logement 73, ce qui la maintient en place.

Dans une réalisation d’intérêt, la membrane de prélèvement 4 est agencée en aval du système de valve 5 et en amont de la première zone de réaction 31. Plus particulièrement, dans le cas d’un système de valves 5 avec la première valve de dérivation 51 et la deuxième valve de dérivation 52, la membrane de prélèvement 4 est agencée en aval de la deuxième valve 52.

La membrane de prélèvement 4 peut être obtenue à partir d’un matériau de cellulose (par exemple des fibres de coton, comme du linter de coton). En alternative, la membrane de prélèvement 4 peut être obtenue à partir d’un matériau de polyfluorure de vinylidène (‘PVDF’). D’autres matériaux poreux peuvent être également sélectionnés. L’absorption d’eau (« water absorption ») du matériau peut être comprise entre 50 mg/cm ² et 150 mg/cm ² Des tests concluants ont été obtenues pour une absorption du matériau de 99,2mg/cm ² (avec une épaisseur de 954 pm). Le matériau utilisé pour les tests était du linter de coton (« coton linter »).

En référence aux figures 3 et 4, la membrane de prélèvement 4 peut côtoyer le canal de transfert 44 sur une distance L4 supérieure à N fois un diamètre (si section circulaire) ou une dimension (largeur ou hauteur, si section rectangulaire) de la section transversale du canal de transfert 44, N étant de préférence supérieur à 3, ou 5 voire plus. Dans un mode de réalisation, le canal de transfert 44 a une section de 0,5mmx0,3mm pour une interface s’étendant sur presque 10mm, soit un N environ égal à 20 (l’intégralité de la longueur de la membrane peut être à l’interface). Cela permet de déterminer la surface de l’interface prémentionnée. Cette caractéristique est notamment permise lorsque le troisième logement 73 est formé par l’agrandissement du canal de transfert 44. Les dimensions transversales du canal de transfert sont notées D3 et H3.

H3 peut être compris entre 0,3 mm et 2 mm. D3 peut être compris entre 0,2 mm et 0,5 mm.

Selon une réalisation illustrée la figure 4, la profondeur H3 du canal de transfert peut être plus importante que la profondeur H4 du troisième logement 73. On note que les profondeurs s’entendent selon l’axe Z.

Selon une autre réalisation illustrée aux figures 12 et 13, la profondeur H3 du canal de transfert 44 peut être plus faible que la profondeur H4 du troisième logement 73.

La hauteur H2 représente la hauteur du corps de plaquette. Selon une réalisation (fig. 4), H3 peut être compris entre 50% et 90% de H2. Selon une autre réalisation (figures 12 et 13) H3 peut être compris entre 20% et 50% de H2.

Comme indiqué précédemment, la membrane de prélèvement 4 peut présenter une capacité d’absorption représentant un volume compris entre 10% et 90 % du volume prédéfini V3 d’éluant du logement 63.

Dans des modes de réalisation, la membrane de prélèvement peut même présenter une capacité d’absorption représentant un volume compris entre 20% et 70 % du volume prédéfini d’éluant, voire un volume compris entre 30% et 60 % du volume prédéfini d’éluant V3.

Dans un mode de réalisation, la membrane de prélèvement 4 peut avoir une forme parallélépipédique, comme illustré en figures 1 et 2, 3 et 4. Dans un autre mode de réalisation, la membrane de prélèvement 4 peut avoir une autre forme, notamment pour optimiser l’espace disponible (forme en L par exemple, comme illustré en figures 11 et 12).

La hauteur H4 représente la hauteur de la membrane de prélèvement 4,

Le volume occupé généralement par la membrane de prélèvement est défini par le produit H4 x L4 x D4. D4 est la dimension de la membrane de prélèvement dans la direction transversale au canal notée Y. (cf Fig 4).

En fonction du diamètre des pores et du taux de vide, la capacité d’absorption de la membrane peut être exprimée par K x H4 x L4 x D4.

K étant un coefficient compris entre 0,5 et 0,8. K peut être considéré comme taux de captation.

On peut faire en sorte que K x H4 x L4 x D4 permet d’absorber entre 5 et 90, voire 20% et 70 % ou encore 10 et 50ù du volume V3 prédéfini d’éluant. Dans un exemple d’intérêt, on choisit K x H4 x L4 x D4 de sorte que la membrane de prélèvement absorde entre 30% et 60 % du volume V3.

Dans un mode de réalisation, la membrane de prélèvement 4 est en communication fluidique uniquement avec le canal de transfert 44. Cela signifie que le logement 73 forme un cul-de-sac ou une impasse lorsqu’observé depuis le canal de transfert 44. La communication fluidique du canal de transfert 44 vers le troisième logement 73 est une impasse fluidique.

Le logement de réaction 72, 74 du support de test 1 est compris dans une zone d’interaction thermique 126 avec la station d’analyse 8. La zone d’interaction thermique 126 correspond à une région de faible superficie qui est chauffée préférentiellement par le dispositif de chauffage de la station d’analyse (décrite plus bas). En particulier, la zone d’interaction thermique 126 peut faire au plus 5 cm ² , voire 4 cm ² . Dans un mode de réalisation, la zone d’interaction thermique 126 comprend en outre le premier logement 24 (qui comprend la membrane d’extraction 2).

En particulier, pour limiter les interactions optiques, la membrane de prélèvement 4 est située hors de la zone d’interaction thermique 126, mais aussi hors d’une zone de lecture optique (voir les dispositifs optiques décrits ci- après). En effet, la membrane de prélèvement 4 peut comprendre des molécules d’intérêt, captées lors du prélèvement, qui réagissent lors de la chauffe.

Comme visible en figure 12, le troisième logement 73 ne s’étend pas sur toute l’épaisseur de la plaquette de test 1 mais uniquement sur moins de la moitié. Cela permet d’agencer des canaux et des composants d’un côté ou de l’autre de la plaquette.

Dans les exemples illustrés, le logement de réaction 72, 74 comprend un petit réservoir de distribution 38 agencé de manière adjacente aux deuxième et quatrième logements 72,74 pour alimenter indirectement les médias poreux des logements 72, 74. Ainsi les médias poreux des zones de réaction 31, 32, i.e. les disques des premier et deuxième mélanges réactionnels 33, 34 sont alimentés en éluat par l’arrivée de cet éluat depuis le canal de transfert 44 dans le réservoir de distribution 38, sans que cet éluat ne traverse les disques.

Selon une disposition optionnelle avantageuse, dans chaque disque de mélange réactionnel 33, 34, il est prévu une projection radiale pour la fonction de pompage capillaire. Seule la projection radiale est baignée directement par le flux d’éluat. Les disques ne sont baignés par le flux d’éluat, ils sont alimentés en éluat par le pompage capillaire. On note que les deuxième et quatrième logements 72,74 qui renferment les disques ont un seul port d’entrée/sortie dans lequel passe la projection radiale, autrement dit lesdits logements sont en configuration de cul-de-sac. On note que les interfaces de contact entre les disques et le réservoir sont minimisées, tout comme les volumes morts autour des disques de manière à limiter la diffusion des réactifs contenus sur les disques.

On peut choisir pour les deux disques de test et de contrôle les références GF/DVA Whatman de source Cytiva™ (précédemment GE Healthcare™ Life Sciences™). Par exemple, les disques ont un diamètre compris entre 5 mm et 6 mm et une épaisseur comprise entre 0.7 mm et 1 mm.

Selon un exemple, chaque disque occupe tout le logement dans lequel il est placé ; il n’y a pas de jeu ou de d’espace disponible où de l’éluat pourrait se loger. Selon une variante, on prévoit que l’air contenu initialement dans le disque puisse s’échapper lors de la réhydratation du disque. Par exemple une gorge est ménagée sous les disques et un passage de fuite pour faciliter cet échappement d’air.

Les réactifs intégrés sont dans un exemple : H2O, dNTPs, 10x tampon isotherme, MgSO4, bétaine, agent intercalant, mélange d’amorces, enzyme Bst 2.0 W S, et enzyme AMV-RT. Dans un exemple, il peut s’agir du WarmStart LAMP Kit de New England Biolabs™.

Le mélange réactionnel de test contenu dans le media poreux comprend ainsi, dans un exemple, la transcriptase inverse qui permet de transcrire l’ARN en ADN, le jeu d’amorces spécifiques à l’ADN du pathogène, l’ADN polymérase, un tampon isotherme contenant des désoxynucléotides triphosphates (dNTP), nécessaires à l’amplification ADN, du MgSO4 agissant comme un cofacteur et catalyseur de la réaction, ainsi que de la bétaine, additif souvent utilisé pour améliorer l’amplification des séquences ADN. Enfin, un fluorophore ou une sonde colorimétrique est incluse afin de révéler la réaction d’amplification quand celle-ci a lieu.

Les premier et deuxième mélanges réactionnels 33, 34 se présentent sous forme lyophilisée. Cette forme est stable et autorise un stockage long des supports de test neufs avant leur utilisation.

Les premier et deuxième mélanges réactionnels 33, 34 se présentent sous une forme générale de disque.

Selon une disposition optionnelle avantageuse, le media poreux 35 est formé en papier. Sa capacité d’absorption d’eau exempte d’ARNase et/ou d’ADNase (éluant) est connue, maitrisée et répétable, ce qui contribue à la fiabilité du test.

La lecture du résultat est faite par une mesure optique, notamment un premier dispositif optique 98 agencé dans la station d’analyse 8 en vis-à-vis de la première zone de réaction 31 et un deuxième dispositif optique 99 agencé dans la station d’analyse 8 en vis-à-vis de la deuxième zone de réaction 32. Il est prévu dans la station d’analyse 8 un élément d’illumination, commun ou non et un appareil d’imagerie, un capteur optique ou des photodiodes pour recevoir des rayonnements réfléchis (ou transmis) par les media poreux des premier et deuxième mélanges réactionnels 33, 34.

Dans l’exemple illustré, on utilise les propriétés de fluorescence des media poreux où les acides nucléiques se sont multipliés.

Lesdits premier et deuxième mélanges réactionnels permettant l’amplification et la détection d’une ou plusieurs séquences d’acide nucléique.

On note qu’il est prévu une zone de lecture de résultat, comprenant au moins les première et deuxième zones de réaction 31, 32. Dans le cas où le corps est formé en matière translucide, on peut considérer que la zone de lecture est aussi large que la plaquette elle-même. Si le substrat utilisé pour le corps n’est pas transparent ou pas suffisamment translucide, on peut prévoir une fenêtre spécifique transparente pour la lecture du résultat.

On détermine la réponse en fluorescence des première et deuxième zones de réaction pour en déduire un résultat de test.

Plus précisément, on compare la réponse en fluorescence de chaque disque avant et après chauffage. Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est faible alors le test est déclaré nul.

Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est élevée et que la réponse en fluorescence du disque de test est faible, alors le test est déclaré négatif.

Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est élevée et que la réponse en fluorescence du disque de test est élevée aussi, alors le test est déclaré positif.

En effet, la première zone de test amplifie l’ADN spécifique au pathogène recherché. La deuxième zone (disque de contrôle) consiste à amplifier l’ARN non spécifique provenant de l’échantillon. En effet, les deux mélanges réactionnels sont identiques mis à part le jeu d’amorces mis en place. Dans le cas du contrôle, il s’agit d’amorces non spécifiques au virus recherché (agent pathogène recherché) mais coopérant à une séquence ARN toujours présente dans l’échantillon/l’éluat incident. Le but du contrôle étant de confirmer qu’à la fois l’étape d’extraction ainsi que l’étape d’amplification se sont bien déroulées, permettant ainsi d’éliminer l’option d’un faux négatif.

Il n’est pas exclu de délivrer un résultat plus riche qu’un résultat binaire. A condition que la réponse en fluorescence du disque de contrôle soit élevée, l’intensité de réponse en fluorescence du disque de test peut être traduite en un index allant de 0 à 1.

Il faut noter qu’en lieu et place d’une mesure de réponse en fluorescence, on pourrait aussi utiliser d’autres méthodes optiques, comme une méthode de colorimétrie, une méthode de photométrie, une méthode de coefficient de transparence.

Il faut aussi noter qu’on peut analyser optiquement les mélanges réactionnels après réactions, soit par mesure de réflectivité, soit par mesure de transmissivité (émetteur et récepteur de part et d’autre de la plaquette).

Il faut aussi noter qu’on réalise une lecture optique de référence avant chauffage, pour permettre de faire le « zéro » du système optique, aux conditions de rayonnements ambiantes et avec la plaquette telle qu’elle est en transparence. Après chauffage réaction et refroidissement, les nouvelles mesures optiques sont prises avec comme référence la mesure de référence avant chauffage (méthode différentielle).

Station d’analyse et interface

La station d’analyse 8 se présente comme une boite parallélépipédique. Dans un exemple, cette boite est proche d’une forme cubique. Dans un exemple, le côté de cette forme cubique présente une longueur comprise entre 25 cm et 40 cm. La station d’analyse pourrait toutefois présenter une forme quelconque.

La station d’analyse 8 comprend un capot 80 monté grâce à une articulation, et il est prévu un système de verrouillage de capot. En effet, lorsque les opérations de test sont en cours sur une plaquette de test, le capot est fermé et verrouillé. Lorsque le test est fini et que le résultat est obtenu, le système de verrouillage déverrouille le capot. Un opérateur peut alors ouvrir le capot, enlever la plaquette de test et placer sur l’embase une nouvelle plaquette de test à traiter. La station d’analyse 8 comprend une pompe à air. Ce peut être une pompe génératrice de surpression ou génératrice de dépression, suivant les configurations possibles s’agissant du support de test de la station.

La station d’analyse 8 comprend un dispositif de chauffage 96. Le dispositif de chauffage 96 chauffe la plaquette de test 1 dans une zone d’interaction thermique 126. Une première portion de chauffage 96a chauffe en face du logement 24 de la membrane d’extraction 2 et une deuxième portion de chauffage 96 en faces des zones de réaction, notamment en dessous des logements 72, 73.

On remarque que le dispositif de chauffage 96 ne se trouve pas en vis-à-vis de la membrane de prélèvement 4, qui est hors de la zone d’interaction thermique 126.

Le dispositif de chauffage peut être complémentée par un dispositif de refroidissement. La station d’analyse 8 comprend un capteur de température pour réguler la commande du dispositif de chauffage. Le dispositif de chauffage peut être une résistance chauffante, une cellule à effet Peltier, ou encore comprendre un ou plusieurs corps noir(s) disposé(s) à proximité des zones de réaction et un éclairage infrarouge pour chauffer le(s)dit(s) corps noir(s).

La station commande le dispositif de chauffage pour avoir un palier à une certaine température et sur une certaine durée. Par exemple, la température de palier est comprise entre 50°C et 70°C. Dans un exemple, la température de palier est de 65°C. La durée du palier est comprise entre 20 minutes et 40 minutes. La station d’analyse peut fonctionner avec une durée de palier prédéterminée (paramètre). Dans un mode alternatif, la fin de palier peut dépendre de l’analyse optique des zones de réaction, par exemple le résultat peut être lu avant la durée prédéfinie, ou dans le cas opposé, l’analyse optique des zones de réaction peut permettre d’identifier une erreur.

Il est prévu dans la station de test plusieurs actionneurs pour pousser sur les volumes 61 ,63 et/ou activer les valves commandées, notamment les valves de dérivation, suivant les différents exemples de réalisation. Plus précisément, un premier actionneur 91 permet d’exercer une action mécanique sur le volume du premier volume de rinçage 61. Un deuxième actionneur 92 permet d’exercer une action mécanique sur le volume du deuxième volume de rinçage 62. Un troisième actionneur 93 permet d’exercer une action mécanique sur le volume d’éluant 63. Un quatrième actionneur permet d’exercer une action mécanique sur la première valve de dérivation 51. Un cinquième actionneur permet d’exercer une action mécanique sur la deuxième valve de dérivation 52. Les actionneurs peuvent être appelés ‘poussoirs’.

Une Led illumine le disque 35 première zone de réaction 31 et le rayonnement reçu en retour est capté par une ou plusieurs photodiodes 98.

Sur l’autre disque, le même processus se déroule avec une ou plusieurs photodiodes 99, pour le disque 35 seconde zone de réaction 32.

Le dispositif de chauffage 96 peut être combiné avec les cellules optiques 98,99 (émission et/ou réception) pour former un dispositif combiné de chauffage et de lecture 120.

Le document PCT/FR2021/050545 décrit plus en détail la logique de fonctionnement de la plaquette de test 1 , notamment les activations de valves de dérivation.

Les figures 8A et 8B illustrent une valve de dérivation 51 sous forme d’une membrane déformable, qui ouvre ou ferme sélectivement un passage entre deux canaux 131, 132.

La membrane déformable délimite par le bas une chambre 151. Le corps de la plaquette délimite sur les côtés et sur le haut la chambre 151 , sauf aux endroits où débouchent les canaux, avec un premier port 131a (première embouchure) et un deuxième port 132a (deuxième embouchure). En figure 8A la membrane déformable 51 est au repos (forme plate au repos) et le passage entre les deux embouchures 131a, 132a est ouvert (circulation en flèche pointillée). En figure 8B sous l’effet d’une action mécanique de poussée par l’élément noté 94, la membrane déformable 51 est fléchie et vient porter sur les ports (deux embouchures) 131a, 132a ; le passage est entre les deux embouchures 131a, 132a est alors fermé.

En référence à la figure 9, on a illustré le déversement d’un liquide de rinçage contenu dans un sachet 37 (liquide de rinçage ou éluant). L’extrémité supérieure de l’actionneur 94 vient pousser sur la poche/le sachet. Il est prévu des picots 36 dans le fond du logement 74. Lorsqu’on presse le sachet 37, lesdits picots 36 s’y enfoncent et viennent déchirer le sachet libérant ainsi le liquide y contenu qui s’écoule dans le canal 131.

Fonctionnement général La station de test ST fonctionne comme suit. La première étape d’intérêt consiste à :

S1 - faire passer échantillon biologique à tester ET sous forme liquide dans la membrane d’extraction 2. En pratique la pompe à air pousse, grâce à une surpression d’air, l’échantillon biologique ET, depuis le réservoir amont 11 vers le réservoir de récupération 18, au travers de la membrane d’extraction 2. La première valve de dérivation 51 est ouverte alors que la deuxième valve de dérivation 52 est fermée. Les acides nucléiques et d’autres espèces moléculaires sont retenus par la membrane d’extraction 2. On note que la sortie d’air 16 permet à l’air présent dans le réservoir de récupération de s’échapper au fur et à mesure que le réservoir de récupération se remplit de liquide. Ensuite on va procéder au rinçage, dans une étape notée S2.

52- le système de test fait passer un premier liquide de rinçage R1 dans la membrane d’extraction 2, et le dirige en aval vers le réservoir de récupération 18. La première valve de dérivation 51 est ouverte alors que la deuxième valve de dérivation 52 est fermée

Optionnellement, on peut utiliser une deuxième passe de rinçage. Ensuite on va procéder au séchage, dans une étape notée S3.

53- la station de test fait passer de l’air dans la membrane d’extraction 2, pour la sécher. La station envoie de l’air sous pression dans l’entrée d’air 14. L’air peut sortir au fond du réservoir par la sortie 16 mais aussi l’air peut sortir par la sortie d’air intermédiaire 17. L’étape S3 peut aussi inclure : faire chauffer la membrane, pour accélérer le séchage, notamment dans les modes de réalisation où elle se trouve dans la zone d’interaction thermique. Cette étape de chauffage peut être alternative ou complémentaire à l’étape de passage d’air dans la membrane d’extraction pour la sécher. On procède ensuite à l’élution de la membrane d’extraction, dans une étape notée S4.

54- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction 2, et diriger l’éluat qui en sort en aval vers le canal de transfert 44. La première valve de dérivation 51 est alors fermée alors que la deuxième valve de dérivation 52 est ouverte. Le front du flux d’éluat est alors capté par la membrane de prélèvement 4, comme décrit auparavant et le reste du flux d’éluat est dirigé vers la zone de réaction, pour analyse. L’analyse consiste notamment à chauffer la zone de réaction à une température prédéfinie puis à attendre le refroidissement pour enfin éclairer la zone de réaction (les première et deuxième zone de réaction) pour recevoir en retour un niveau de fluorescence (à l’aide des dispositifs optiques 98, 99).