Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm, der zur fer- mentativen Herstellung von L-Cystein geeignet ist, dadurch ge- kennzeichnet, dass die relative Enzymaktivität der in der KEGG- Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten Enzymklasse inaktiviert oder bezogen auf die spezifische Aktivität des Wildtyp-Enzyms reduziert ist, und der gegenüber dem Mikroorga- nismenstamm mit Wildtyp-Enzymaktivität der in der KEGG- Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten Enzymklasse eine erhöhte Menge an L-Cystein bildet, wobei das diese Enzym- aktivität kodierende Gen mit ppsA bezeichnet wird. Des Weiteren stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Cys- tein unter Verwendung dieser Mikroorganismenzellen zur Verfü- gung.

Cystein, abgekürzt Cys oder C, ist eine α-Aminosäure mit der Seitenkette -CH2-SH. Da die natürlich vorkommende enantiomere Form L-Cystein ist und nur diese eine proteinogene Aminosäure darstellt, ist im Rahmen dieser Erfindung L-Cystein gemeint, wenn der Ausdruck Cystein ohne Deskriptor gebraucht wird. Durch Oxidation der Sulfhydrylgruppen können zwei Cysteinreste mitei- nander eine Disulfidbrücke bilden, womit Cystin entsteht, für das das gleiche gilt, d.h. ohne Deskriptor ist in dieser Erfin- dung das L-Enantiomer (oder L-Cystin, bzw. (R,R)-3,3'-Dithio- bis (2-aminopropionsäure)) gemeint. L-Cystein ist für den Men- schen eine semi-essenzielle Aminosäure, da sie aus der Amino- säure Methionin gebildet werden kann.

Cystein nimmt in allen Organismen eine Schlüsselposition im Schwefelmetabolismus ein und wird in der Synthese von Protei- nen, Glutathion, Biotin, Liponsäure, Thiamin, Taurin, Methionin und anderen schwefelhaltigen Metaboliten verwendet. Zudem dient L-Cystein als Vorläufer für die Biosynthese von Coenzym A. Die Biosynthese von Cystein wurde in Bakterien, insbesondere in Enterobakterien, detailliert untersucht. Eine Zusammenfassung über die Cystein Biosynthese findet sich in Wada und Takagi, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 73: 48-54.

Die Aminosäure L-Cystein ist von wirtschaftlicher Bedeutung.

Sie wird beispielsweise als Lebensmittelzusatzstoff (insbeson- dere in der Backmittelindustrie), als Einsatzstoff in der Kos- metik, sowie als Ausgangsprodukt für die Herstellung von Phar- mawirkstoffen (insbesondere N-Acetyl-Cystein und S-Carboxyme- thyl-Cystein) verwendet.

Neben der klassischen Gewinnung von Cystein mittels Extraktion aus keratinhaltigem Material wie Haaren, Borsten, Hörnern,

Hufen und Federn, oder mittels Biotransformation durch enzyma- tische Umsetzung von Vorstufen, steht auch ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cystein zur Verfügung. Der Stand der Technik bezüglich der fermentativen Gewinnung von Cystein mit Mikroorganismen ist z.B. in EP 0858510 Bl, EP 0885962 Bl, EP 1382 684 Bl, EP 1220 940 B2, EP 1769 080 Bl und EP 2 138 585 Bl offenbart. Als bakterielle Wirtsorganismen werden dabei u.a. Stämme der Gattung Corynebakterium sowie Vertreter aus der Familie der Enterobacteriaceae, wie z. B. Escherichia coli oder Pantoea ananatis eingesetzt.

Zur Verbesserung der Cystein-Produktion in einem Mikroorganis- menstamm stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Neben der klassischen Vorgehensweise, um durch Mutation und Selektion zu verbesserten Cystein-Produzenten zu gelangen, wurden auch ge- zielt genetische Veränderungen an den Stämmen vorgenommen, um eine effektive Cystein-Überproduktion zu erreichen.

So führte das Einbringen eines cysE-Allels, das für eine Serin- O-Acetyl-Transferase mit verminderter Feedback-Hemmung durch Cystein kodiert, zu einer Steigerung der Cystein-Produktion (EP 0 858 510 Bl; Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64:

1607-1611). Durch ein Feedback-resistentes CysE-Enzym wird die Bildung von O-Acetyl-L-Serin, der direkten Vorstufe von Cys- tein, weitgehend vom Cystein-Spiegel der Zelle entkoppelt.

O-Acetyl-L-Serin wird aus L-Serin und Acetyl-CoA gebildet. Da- her ist die Bereitstellung von L-Serin in ausreichender Menge für die Cystein-Produktion von großer Bedeutung. Dies kann durch das Einbringen eines serA-Allels, das für eine 3-Phospho- glycerat-Dehydrogenase mit verminderter Feedback- Hemmbarkeit durch L-Serin kodiert, erreicht werden. Dadurch wird die Bil- dung von 3-Hydroxypyruvat, einer biosynthetischen Vorstufe von L-Serin, weitgehend vom L-Serin-Spiegel der Zelle entkoppelt. Beispiele für derartige SerA-Enzyme sind in EP 0620853 Bl und EP 1496 111 Bl beschrieben. Aber auch Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-4184 offenbaren Veränderungen am serA-Gen zur Deregulierung der Enzymaktivität.

Darüber hinaus ist bekannt, dass die Cystein-Ausbeute in der Fermentation dadurch erhöht werden kann, dass Gene abgeschwächt oder zerstört werden, die für Cystein-abbauende Enzyme kodie- ren, wie z.B. die Tryptophanase TnaA oder die Cystathionin-ß- Lyasen MalY oder MetC (EP 1571223 Bl).

Die Steigerung des Transports von Cystein aus der Zelle ist eine weitere Möglichkeit, um die Produktausbeute im Medium zu erhöhen. Dies kann durch Überexpression sogenannter Efflux-Gene erreicht werden. Diese Gene kodieren für membrangebundene Pro- teine, die den Export von Cystein aus der Zelle vermitteln.

Verschiedene Effluxgene für den Cystein-Export wurden beschrie- ben (EP 0885 962 Bl, EP 1382684 Bl). Der Export von Cystein aus der Zelle in das Fermentationsmedium hat mehrere Vorteile:

1) L-Cystein wird kontinuierlich aus dem intrazellulären Reak- tionsgleichgewicht entzogen mit der Folge, dass der Spiegel dieser Aminosäure in der Zelle niedrig gehalten wird und somit die Feedback-Hemmung von sensitiven Enzymen durch L- Cystein unterbleibt: (1) L-Cystein (intrazellulär) L-Cystein (Medium)

2) Das in das Medium ausgeschiedene L-Cystein wird in Gegen- wart von Sauerstoff, der während der Kultivierung in das Medium eingebracht wird, zum Disulfid L-Cystin oxidiert (EP 0 885962 Bl):

(2) 2 L-Cystein + 1/2 O ₂ -> L-Cystin + H ₂ O

Da die Löslichkeit von L-Cystin in wässriger Lösung bei ei- nem neutralen pH-Wert im Vergleich zu Cystein nur sehr ge- ring ist, fällt das Disulfid schon bei einer niedrigen Kon- zentration aus und bildet einen weissen Niederschlag:

(3) L-Cystin (gelöst) -> L-Cystin (Niederschlag)

Durch die Präzipitation von L-Cystin wird der Spiegel des im Medium gelösten Produkts abgesenkt, wodurch auch jeweils das Reaktionsgleichgewicht von (1) und (2) auf die Produkt- seite gezogen wird.

3) Der technische Aufwand für die Reinigung des Produkts ist bedeutend geringer, wenn die Aminosäure direkt aus dem Fer- mentationsmedium gewonnen werden kann, als wenn das Produkt intrazellulär akkumuliert und zuerst ein Zellaufschluß er- folgen muss.

Neben der gentechnischen Veränderung des Cystein Produktions- stammes spielt bei der Entwicklung eines effizienten Produkti- onsprozesses auch die Optimierung des Fermentationsverfahrens, d. h. die Art und Weise der Kultivierung der Zellen, eine wich- tige Rolle. Dabei können verschiedene Kultivierungsparameter, wie z.B. die Art und Dosierung der Kohlenstoff- und Energie- quelle, die Temperatur, die Versorgung mit Sauerstoff (EP 2707 492 Bl), der pH-Wert sowie die Zusammensetzung des Kulturmedi- ums die Produktausbeute und/oder das ProduktSpektrum bei der fermentativen Herstellung von Cystein beeinflussen. Aufgrund laufend steigender Rohstoff- und Energiekosten besteht fortwährend der Bedarf, die Produktausbeute bei der Cystein- Herstellung zu steigern, um auf diese Weise die Wirtschaftlich- keit des Prozesses zu verbessern.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Mikroorganis- menstamm zur fermentativen Herstellung von Cystein zur Verfü- gung zu stellen, mit dem im Vergleich zu bekannten Stämmen aus dem Stand der Technik in der Fermentation höhere Ausbeuten von L-Cystein, bzw. L-Cystin erzielt werden können.

Gelöst wird die Aufgabe durch einen Mikroorganismenstamm, der zur fermentativen Herstellung von L-Cystein geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass die relative Enzymaktivität der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.Ί.9.2 bezeichneten En- zymklasse inaktiviert oder bezogen auf die spezifische Aktivi- tät des Wildtyp-Enzyms reduziert ist, und der gegenüber dem Mikroorganismenstamm mit Wildtyp-Enzymaktivität der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten Enzym- klasse eine erhöhte Menge an L-Cystein bildet, wobei das diese Enzymaktivität kodierende Gen mit ppsA bezeichnet wird.

Die Enzymaktivität der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.Ί.9.2 bezeichneten Enzymklasse ist definiert dadurch, dass diese in einer reversiblen Reaktion Pyruvat aus Phos- phoenolpyruvat hersteilen kann gemäß der Formel:

(4) Phosphoenolpyruvat + Phosphat + AMP <-> Pyruvat + H2O + ATP

(AMP: Adenosin-Monophosphat; ATP: Adenosin-Triphosphat)

Diese Enzymaktivität wird daher auch bezeichnet als Phos- phoenolpyruvat-Synthase (PEP-Synthase, EC 2.7.9.2) oder auch synonym als Phosphoenolpyruvat-H ₂ 0-Dikinase. Das dieses Protein kodierende Gen wird im Rahmen dieser Erfindung mit ppsA abge- kürzt. Nachweis der Enzymaktivität (Enzymassay, PEP-Synthase-Assay): Die PEP-Synthase-Aktivität eines Mikroorganismenstamms kann be- stimmt werden, indem die Zellen aus der Anzucht in einem Flüs- sigmedium pelletiert, gewaschen und z.B. mit Hilfe eines Fast- Prep-24™ 5G Zellhomogenisators (MP Biomedicals) ein Zellextrakt hergestellt wird. Der Proteingehalt des Extrakts kann z.B. mit- tels „Qubit ^® Protein Assay Kit" (Thermo Fisher Scientific) be- stimmt werden.

Die PEP-Synthase-Enzymaktivität kann durch die stöchiometrische Produktion von Phosphat aus der Reaktion von Pyruvat und ATP, entsprechend Gleichung (4), gemessen werden, beispielsweise mit Hilfe des "Malachite Green Phosphate Assay Kit" (SigmaAldrich). Alternativ kann auch die stöchiometrische Produktion von AMP o- der Phosphoenolpyruvat oder der stöchiometrische Verbrauch von Pyruvat oder ATP bestimmt werden (vgl. Gleichung 4). Ein Test zur Bestimmung der PEP-Synthase-Enzymaktivität über den ATP- abhängigen Verbrauch von Pyruvat ist z.B. beschrieben in Berman and Cohn, J. Biol. Chem. (1970) 245: 5309-5318. Ebenfalls in Berman and Cohn, J. Biol. Chem. (1970) 245: 5309-5318 ist ein Test zur ATP-abhängigen Bildung von Phosphoenolpyruvat be- schrieben.

Die spezifische Enzymaktivität berechnet sich, indem die Enzym- aktivität auf 1 mg Gesamtprotein des nicht weiter aufgereinig- ten oder behandelten Zellextrakts bezogen wird (U/mg Protein). Dabei ist zu berücksichtigen, dass zum Vergleich verschiedener PEP-Synthase Enzyme der Zellextrakt in gleicher Weise herge- stellt werden muss. Wie bereits beschrieben, kann der Zellex- trakt z.B. mit Hilfe eines FastPrep-24™ 5G Zellhomogenisators (MP Biomedicals) hergestellt werden.

Alternativ kann, um verschiedene Enzyme zu vergleichen, die spezifische Aktivität auch auf 1 mg der jeweils in gleicher Weise gereinigten Enzyme bezogen werden (U/mg gereinigtes Pro- tein). Ein Verfahren zur Reinigung von PEP-Synthase und zur Be- stimmung der spezifischen Aktivität des gereinigten Proteins ist z.B. in Berman and Cohn, J. Biol. Chem. (1970) 245: 5309- 5318 beschrieben. Die relative Enzymaktivität kann bestimmt werden, indem die spezifische Enzymaktivität, bestimmt im PEP-Synthase-Assay des Mikroorganismenstamms, der in Bezug auf das Gen kodierend die PEP-Synthase das Wt-Allel trägt, auf 100% gesetzt wird. Der im PEP-Synthase-Assay gemessene Wert für die spezifische Enzymak- tivität einer Probe wird prozentual im Verhältnis zu diesem Stamm mit Wt-Enzym angegeben.

Als offener Leserahmen (open reading frame, ORF, gleichbedeu- tend mit cds, coding sequence) wird derjenige Bereich der DNS bzw. RNS bezeichnet, der mit einem Startcodon beginnt und mit einem Stoppcodon endet und für die Aminosäuresequenz eines Pro- teins codiert. Der ORF wird auch als codierende Region oder Strukturgen bezeichnet.

Als Gen wird der DNS-Abschnitt bezeichnet, der alle Grundinfor- mationen zur Herstellung einer biologisch aktiven RNS enthält. Ein Gen enthält den DNS-Abschnitt, von dem durch Transkription eine einzelsträngige RNS-Kopie hergestellt wird und die Expres- sionssignale, die an der Regulation dieses Kopiervorgangs be- teiligt sind. Zu den Expressionssignalen zählen z.B. mindestens ein Promotor, ein Transkriptions-, ein Translationsstart und eine Ribosomenbindestelle. Des Weiteren sind als Expressions- signale ein Terminator und ein oder mehrere Operatoren möglich.

Im Rahmen dieser Erfindung beginnen die Proteine wie z.B. PpsA mit einem Großbuchstaben, während die diese Proteine kodieren- den Sequenzen (cds) mit einem Kleinbuchstaben bezeichnet werden (z.B. ppsA).

Dementsprechend bezeichnet E. coli ppsA die in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 333-2711 angegebene cds des ppsA-Gens aus E. coli. E. coli PpsA bezeichnet das von dieser cds (E. coli ppsA) kodierte Protein, angegeben in SEQ ID NO: 2. Beim Protein handelt es sich um eine Phosphoenolpyruvat-Synthase. P. ananatis ppsA bezeichnet die in SEQ ID NO: 3 von Nukleotid 417-2801 angegebene cds des ppsA-Gens aus P. ananatis. P. ananatis PpsA bezeichnet das von dieser cds (P. ananatis ppsA) ko- dierte Protein, angegeben in SEQ ID NO: 4.

Die Abkürzung WT (Wt) bezeichnet den Wildtyp. Als Wildtyp-Gen wird die Form des Gens bezeichnet, die natürlicherweise durch die Evolution entstanden und im Wildtyp-Genom vorhanden ist.

Die DNS-Sequenz von Wt-Genen ist in Datenbanken wie NCBI öf- fentlich zugänglich.

Als Allele werden die Zustandsformen eines Gens definiert, die durch Mutation, d.h. durch Änderungen der Nucleotidsequenz der DNS ineinander übergeführt werden können. Dabei wird das natür- licherweise in einem Mikroorganismus vorkommende Gen als Wild- typ-Allel bezeichnet und die davon abgeleiteten Varianten als mutierte Allele des Gens.

Unter homologen Genen bzw. homologen Sequenzen ist zu verste- hen, dass die DNS-Sequenzen dieser Gene bzw. DNS-Abschnitte zu mindestens 80%, bevorzugt zu mindestens 90% und besonders be- vorzugt zu mindestens 95% identisch sind.

Der Grad der DNA-Identität wird durch das Programm „nucleotide blast", zu finden auf der Seite http://blast.ncbi.nlm,nih.gov/, bestimmt, welches auf dem blastn-Algorithmus basiert. Als Algo- rithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Nukle- otidsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt.

Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target se- quences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 28; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die entsprechenden voreingestellten Scoring Parameter sind: Match/Mismatch Scores = 1,-2; Gap Costs = Linear. Für den Vergleich von Proteinsequenzen wird das Programm „pro- tein blast", auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, ge- nutzt. Dieses Programm greift auf den blastp-Algorithmus zu- rück. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Proteinsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust Parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 3; Automatically adjust pararaeters for short input sequences = 0. Die voreingestellten Scoring Parameter sind: Ma- trix = BLOSUM62; Gap Costs = Existence: 11 Extension: 1; Compo- sitional adjustments = Conditional compositional score matrix adjustment.

Bei den erfindungsgemäßen Mikroorganismen ist die relative En- zymaktivität der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten Enzymklasse inaktiviert oder bezogen auf die spezifische Aktivität des Wildtyp-Enzyms bevorzugt um min- destens 10%, besonders bevorzugt um mindestens 25%, insbeson- dere bevorzugt um mindestens 60% und im speziellen bevorzugt um mindestens 70% reduziert. Eine um mindestens 10% (bzw. 25%/60%/70%) reduzierte Enzymaktivität des durch das ppsA-Gen kodierten Enzyms wird auch als Restaktivität von höchstens 90% (bzw. 75%/40%/30%) bezeichnet.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismen- stamm dadurch gekennzeichnet, dass in diesem keine Enzymaktivi- tät der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 be- zeichneten Enzymklasse mehr vorhanden ist, d.h. die relative Enzymaktivität der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten Enzymklasse ist bezogen auf die spezifi- sche Aktivität des Wildtyp-Enzyms um 100% reduziert.

„Verglichen mit dem/im Vergleich zum/bezogen auf das (entspre- chende) Wildtyp-Enzym" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung im Vergleich zur Aktivität des Proteins, das von der nicht mutier- ten Form des Gens aus einem Mikroorganismus kodiert wird, d.h. von dem Gen, das natürlicherweise durch die Evolution entstan- den und im Wildtyp-Genom dieses Mikroorganismus vorhanden ist. Zu den zur fermentativen Herstellung von L-Cystein geeigneten Mikroorganismenstämmen zählen alle Mikroorganismen, die einen deregulierten biosynthetischen Stoffwechselweg (homolog oder heterolog) enthalten, der zur Synthese von Cystein, Cystin oder davon abgeleiteten Derivaten führt. Derartige Stämme sind bei- spielsweise offenbart in EP 0885962 Bl, EP 1382684 Bl, EP 1 220 940 B2, EP 1769080 Bl und EP 2138585 Bl.

Die zur fermentativen Herstellung von L-Cystein geeigneten Mik- roorganismen sind bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie eine der folgenden Veränderungen aufweisen: a) Die Mikroorganismenstämme zeichnen sich durch eine verän- derte 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (serA) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch L-Serin aus (wie beispielsweise beschrieben in EP 1950287 Bl). Besonders bevorzugte Varianten der 3-Phosphoglycerat Dehyd- rogenase (serA) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hinausgehend bevorzugten Ausführung um mindestens den Fak- tor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch L-Serin auf. b) Die Mikroorganismenstämme enthalten eine Serin-O-Acetyl-

Transferase (cysE), die im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor zwei verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein aufweist (wie beispielsweise beschrieben in EP 0858 510 Bl oder Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611).

Besonders bevorzugte Varianten der Serin-O-Acetyl-Trans- ferase (cysE) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wild- typenzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere be- vorzugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hinausgehend bevorzugten Ausführung um mindestens den Fak- tor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein auf. c) Die Mikroorganismenstämme weisen einen durch Überexpression eines Effluxgens um mindestens den Faktor zwei erhöhten Cystein-Export aus der Zelle im Vergleich zu der entspre- chenden Wildtypzelle auf.

Die Überexpression eines Effluxgens führt im Vergleich zu einer Wildtypzelle bevorzugt zu einem um mindestens den Faktor 5, besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 20 erhöhten Cystein-Export aus der Zelle.

Das Effluxgen stammt vorzugsweise aus der Gruppe ydeD (siehe EP 0885 962 Bl), yfiK (siehe EP 1382684 Bl), cydDC (siehe WO 2004/113373 Al), bcr (siehe US 2005-221453 AA) und emrAB (siehe US 2005-221453 AA) von E. coli oder dem entsprechend homologen Gen aus einem anderen Mikroorga- nismus.

Derartige Stämme sind beispielsweise aus EP 0858510 Bl und EP 0 885 962 Bl bekannt.

Die zur fermentativen Herstellung von L-Cystein geeigneten Mik- roorganismenstämme sind darüber hinaus bevorzugt dadurch ge- kennzeichnet, dass mindestens ein Cystein-abbauendes Enzym so- weit abgeschwächt ist, dass in der Zelle nur noch maximal 50% dieser Enzym-Aktivität im Vergleich zu einer Wildtypzelle vor- handen ist. Das Cystein-abbauende Enzym stammt vorzugsweise aus der Gruppe Tryptophanase (TnaA) und Cystathionin-ß-Lyase (MalY, MetC).

Die in den vorherigen Abschnitten beschriebenen Mikroorganis- menstämme, die zur fermentativen Herstellung von L-Cystein ge- eignet sind, sind in ihrem Cysteinstoffwechsel so dereguliert, dass sie im Vergleich zum im Cysteinstoffwechsel nicht deregu- lierten Mikroorganismenstamm mit Wildtyp-Enzymaktivität der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten En- zymklasse eine erhöhte Menge an L-Cystein bilden. Da in den Zellen eines im Cysteinstoffwechsel nicht deregulierten Mikro- organismenstamms mit Wildtyp-Enzymaktivität der in der KEGG- Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten Enzymklasse die Menge an L-Cystein im Kulturansatz ungefähr 0 g/1 ist (vgl. Tab. 2), ist mit erhöhter Menge jede Menge gemeint, die 0,05 g/1 L-Cystein gemessen im Kulturansatz nach 24-stündiger An- zucht übersteigt.

Bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Mikroorganismenstamm um einen Stamm aus der Familie der Enterobacteriaceae oder Corynebacteriaceae, beson- ders bevorzugt um einen Stamm aus der Familie der Enterobacte- riaceae handelt. Solche Stämme sind unter anderem käuflich er- hältlich z.B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganis- men und Zellkulturen GmbH (Braunschweig).

Bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Pantoea ananatis und Co- rynehacterium glutamicum, besonders bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli und Pantoea ananatis. Insbeson- dere bevorzugt handelt es sich beim Mikroorganismenstamm um ei- nen Stamm der Spezies Escherichia coli.

Insbesondere bevorzugt ist der E. coli-Stamm ausgewählt aus E. coli K12, besonders bevorzugt E. coli K12 W3110. Solche Stämme sind unter anderem käuflich erhältlich z.B. bei der DSMZ Deut- sche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braun- schweig), darunter auch E. coli K12 W3110 DSM 5911 (id. ATCC 27325) und Pantoea ananatis DSM 30070 (id. ATCC 11530). Bei PpsA handelt es sich bevorzugt um PpsA aus E. coli mit der SEQ ID NO: 2 oder PpsA aus P. ananatis mit SEQ ID NO: 4.

Bevorzugt ist der Mikroorganismenstamm dadurch gekennzeichnet, dass dieser mindestens eine Mutation im ppsA-Gen enthält. Gleichzeitig bildet der Stamm auch in dieser bevorzugten Aus- führungsform im Vergleich zu Wildtyp-Zellen eine erhöhte Menge an L-Cystein. Bevorzugt führt die genetische Veränderung im ppsA-Gen dazu, dass das von diesem Gen exprimierte Protein keine oder eine reduzierte relative Enzymaktivität der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten Enzym- klasse bezogen auf die spezifische Aktivität des Wildtyp-Enzyms besitzt. Der erfindungsgemäße Produktionsstamm kann darüber hinaus noch weiter optimiert werden, um die Cystein Produktion noch zusätz- lich zu verbessern.

Die Optimierung kann z.B. gentechnisch erfolgen durch zusätzli- che Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Genkonstrukte o- der aber auch kombiniert als eine Expressionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden.

Der Produktionsstamm kann darüber hinaus dadurch optimiert wer- den, dass neben dem ppsA Gen noch weitere Gene inaktiviert wer- den, deren Genprodukte sich negativ auf die Cystein Produktion auswirken.

Die Optimierung ist jedoch auch in an sich bekannter Weise mög- lich durch Mutagenese und Selektion von Stämmen mit verbesser- ter Cystein Produktion.

Im Sinne der Erfindung sind genetische Veränderungen im ppsA- Gen so definiert, dass a) die codierende Sequenz des ppsA-Gens teilweise oder ganz deletiert ist, b) die codierende Sequenz des ppsA-Gens durch eine oder meh- rere Insertionen oder 5'-, bzw. 3'-Elongationen verändert ist, c) das ppsA-Strukturgen eine oder mehrere Mutationen, insbe- sondere Punktmutationen, enthält mit der Folge, dass die exprimierte Phosphoenolpyruvat-Synthase eine abgeschwächte Enzymaktivität besitzt oder völlig inaktiv ist, d) das ppsA-Strukturgen eine oder mehrere Mutationen, insbe- sondere Punktmutationen enthält mit der Folge, dass die ppsA-Expression stark abgeschwächt oder völlig unterdrückt wird, oder die Stabilität der mRNS reduziert wird oder e) durch genetische Veränderungen der 5'- oder 3'-nicht-codie- renden ppsA-Sequenzen (Promotor, 5'-UTR, Shine-Dalgarno-Se- quenz bzw. Terminator) die Expression des ppsA-Gens oder die Translation der ppsA-mRNS abgeschwächt oder vollständig unterdrückt wird und das von dieser Sequenz exprimierte Protein eine reduzierte relative PEP-Synthase-Enzymaktivität bezogen auf die spezifi- sche Aktivität des Wildtyp-Enzyms besitzt.

Im Sinne der Erfindung ist auch eine beliebige Kombination der in a) bis e) aufgeführten genetischen Veränderungen im ppsA-Gen möglich. Zusammengefasst ist es im Sinne der Erfindung also so- wohl möglich, dass weniger bis kein PpsA-Protein gebildet wird und/oder dass das exprimierte PpsA-Protein weniger aktiv bis inaktiv ist.

In einem alternativen Ansatz ist es auch möglich, auf der Ebene der Gen-Transkription die Abschwächung, bzw. vollständige Inak- tivierung der ppsA-Enzymaktivität durch eine dem Fachmann be- kannte sog. „anti-sense RNS " Strategie zu erreichen. Es ist auch denkbar, dass die Abschwächung, bzw. vollständige Inakti- vierung der ppsA-Enzymaktivität durch Zugabe eines Inhibitors, sei es ein chemischer oder Proteininhibitor, erreicht wird.

Vorzugsweise beruht die Veränderung des ppsA-Gens im erfin- dungsgemäßen Stamm auf vollständiger oder teilweiser Deletion des ppsA-Strukturgens, Mutation des ppsA-Strukturgens in einer Weise, die zur Schwächung der Enzymaktivität, bzw. Inaktivie- rung des Enzyms führt, oder Mutation des ppsA-Strukturgens und/oder seiner die Expression regulierenden 5'- und 3'-flan- kierenden nicht transkribierten, bzw. nicht translatierten Gen- bereiche in einer Weise, dass die Expression, bzw. Translation des ppsA-Gens geschwächt, bzw. völlig unterdrückt wird, oder aber die Stabilität der ppsA-mRNS verringert wird.

Besonders bevorzugt sind entweder die Inaktivierung des ppsA- Gens im erfindungsgemäßen Stamm infolge vollständiger oder teilweiser Deletion der ppsA-cds (d.h. für die ppsA-cds von E. coli Nukleotid 333 - 2711 von SEQ ID NO: 1, bzw. für die ppsA- cds von P. ananatis Nukleotid 417 - 2801 von SEQ ID NO: 3) oder die Mutation des ppsA-Strukturgens in einer Weise, die zur Schwächung der Enzymaktivität, bzw. Inaktivierung des Enzyms o- der Reduktion der Stabilität der mRNS führt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismen- stamm dadurch gekennzeichnet, dass das mutierte Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem ppsA-Gen aus Escherichia coli, dem ppsA-Gen aus Pantoea ananatis und einem zu diesen Ge- nen homologen Gen. Das ppsA-Gen aus E. coli ist offenbart im Eintrag in der NCBI Gendatenbank mit der Gene-ID 946209, das ppsA-Gen aus P. ananatis ist offenbart im Eintrag in der NCBI Gendatenbank mit der Gene-ID 11796889. Für den Begriff des ho- mologen Gens gilt die oben angegebene Definition. Insbesondere bevorzugt handelt es sich beim mutierten ppsA-Gen um das ppsA- Gen aus Escherichia coli. In einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um die cds des ppsA-Gens aus E. coli, die in SEQ ID NO: 1 Nukleotid 333-2711 (kodierend für ein Protein mit SEQ ID NO: 2) offenbart ist, oder um die cds des ppsA-Gens aus Pantoea ananatis, die in SEQ ID NO: 3 Nukleotid 417-2801 (kodierend für ein Protein mit SEQ ID NO: 4) offenbart ist .

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismen- stamm dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der kodierenden DNS-Sequenz des ppsA-Gens um SEQ ID NO: 5 oder einer dazu homo- logen Sequenz, besonders bevorzugt um SEQ ID NO: 5 handelt. Für den Begriff der homologen Sequenz gilt die oben angegebene De- finition.

In diesem Fall führen die Mutationen der in SEQ ID NO: 1 ange- gebenen DNS-Sequenz zur Mutation der drei Aminosäuren der in SEQ ID NO: 2 angegebenen WT-Proteinsequenz, nämlich Valin an Position 126 mutiert zu Methionin (V126M), Arginin an Position 427 mutiert zu Histidin (R427H) und Valin an Position 434 mu- tiert zu Isoleucin (V434I), entsprechend einem ppsA-MHI Gen mit der DNS-Sequenz wie in SEQ ID NO: 5, codierend für ein ppsA-MHI Protein mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 6 offen- bart. Zur Inaktivierung und Mutation des ppsA Gens sind dem Fachmann verschiedene Methoden bekannt. Im einfachsten Fall kann der Ausgangsstamm in bekannter Weise einer Mutagenese (z.B. che- misch durch mutagen wirkende Chemikalien wie N-Methyl-N'-Nitro- N-Nitrosoguanidin oder physikalisch durch UV-Bestrahlung) un- terzogen werden, wobei zufällig Mutationen in der genomischen DNS erzeugt werden und die gewünschte ppsA-Mutante dann aus der Vielzahl erzeugter Mutanten selektiert wird, z.B., jeweils nach Vereinzelung der Mutanten, durch Fehlen einer auf der Enzymak- tivität basierenden Farbreaktion oder genetisch durch Nachweis eines fehlerhaften ppsA Gens.

Im Gegensatz zur aufwendigen, zufälligen Mutagenese und Selek- tion der gesuchten ppsA-Mutante kann das ppsA Gen in einfache- rer Weise gezielt inaktiviert werden, z.B. durch den bekannten Mechanismus der homologen Rekombination. Kloniersysteme zur ge- zielten Geninaktivierung mittels homologer Rekombination sind dem Fachmann bekannt und kommerziell erhältlich, wie z.B. of- fenbart im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", basierend auf der Red ^® /ET ^® -Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH (siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red ^® /ET ^® Recombination, Cat. No.

K006 , Version 2.3, Juni 2012" und darin zitierter Literatur).

Dem Stand der Technik entsprechend kann das ppsA-Gen oder ein Teil des Gens isoliert und eine Fremd-DNS in das ppsA-Gen klo- niert werden, wodurch der das Protein definierende offene Le- serahmen des ppsA-Gens unterbrochen wird. Ein für die gezielte Inaktivierung des ppsA-Gens geeignetes DNS-Konstrukt kann also aus einem 5'-DNS-Abschnitt, der zum genomischen ppsA-Gen homo- log ist, gefolgt von einem die Fremd-DNS umfassenden Genab- schnitt und daran angeschlossen einem 3'-DNS-Abschnitt, der wiederum zum genomischen ppsA-Gen homolog ist, bestehen.

Der für die homologe Rekombination in Frage kommende Bereich des ppsA-Gens kann dabei also nicht nur den für die Phos- phoenolpyruvat Synthase kodierenden Bereich umfassen. Der in Frage kommende Bereich kann auch das ppsA-Gen flankierende DNS- Sequenzen umfassen, nämlich im 5'-Bereich vor Beginn des kodie- renden Bereichs (Promotor der Gentranskription, z.B. Nukleotid 1 - 332 in SEQ ID NO: 1, bzw. Nukleotid 1 - 416 in SEQ ID NO:

3) sowie im 3'-Bereich nach dem Ende des kodierenden Bereichs (Terminator der Gentranskription, z.B. Nukleotid 2712 - 3000 in SEQ ID NO: 1, bzw. Nukleotid 2802 - 3062 in SEQ ID NO: 3), de- ren Veränderung durch homologe Rekombination ebenso wie die Veränderung des kodierenden Bereichs zur Inaktivierung des ppsA-Gens führen kann.

Bei der Fremd-DNS handelt es sich bevorzugt um eine Selektions- marker-Expressionskassette. Diese besteht aus einem Promotor der Gentranskription, der funktionell verbunden ist mit dem ei- gentlichen Selektionsmarkergen und gegebenenfalls gefolgt von einem Terminator der Gentranskription. Der Selektionsmarker enthält in diesem Fall außerdem 5'- und 3'-flankierende homo- loge Sequenzen des ppsA-Gens.

Vorzugsweise enthält der Selektionsmarker 5'- und 3'-flankie- rende homologe Sequenzen des ppsA-Gens von jeweils mindestens 30 Nukleotiden Länge, besonders bevorzugt jeweils mindestens 50 Nukleotiden Länge.

Das DNS-Konstrukt zur Inaktivierung des ppsA-Gens kann also, beginnend vom 5'-Ende, aus einer zum ppsA-Gen homologen Se- quenz, gefolgt von der Expressionskassette des Selektionsmar- kers, z.B. ausgewählt aus der Klasse der Antibiotikaresistenz- gene sowie gefolgt von einer weiteren, zum ppsA-Gen homologen Sequenz bestehen.

In einer bevorzugten Ausführung besteht das DNS-Konstrukt zur Inaktivierung des ppsA-Gens, beginnend vom 5'-Ende, aus einer zum ppsA-Gen homologen Sequenz von mindestens 30 Nukleotiden Länge, insbesondere bevorzugt mindestens 50 Nukleotiden Länge, gefolgt von der Expressionskassette des Selektionsmarkers, aus- gewählt aus der Klasse der Antibiotikaresistenzgene sowie ge- folgt von einer weiteren, zum ppsA-Gen homologen Sequenz von mindestens 30 Nukleotiden Länge, insbesondere bevorzugt mindes- tens 50 Nukleotiden Länge.

Bei den Selektionsmarkergenen handelt es sich im Allgemeinen um Gene, deren Genprodukt dem Ausgangsstamm das Wachstum unter se- lektiven Bedingungen ermöglicht, unter denen der ursprüngliche Ausgangsstamm nicht wachsen kann.

Bevorzugte Selektionsmarkergene sind ausgewählt aus der Gruppe der Antibiotika-Resistenzgene wie z.B. das Ampicillin-Resis- tenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin-Resistenz- gen, das Chloramphenicol-Resistenzgen oder aber auch das Neomy- cin-Resistenzgen. Andere bevorzugte Selektionsmarkergene ermög- lichen Ausgangsstämmen mit einem Stoffwechseldefekt (z.B. Ami- nosäureauxotrophien) das Wachstum unter selektiven Bedingungen, indem ihre Expression den Stoffwechseldefekt korrigiert. Schliesslich sind auch Selektionsmarkergene möglich, deren Gen- produkt eine an sich für den Ausgangsstamm toxische Verbindung chemisch verändert und somit inaktiviert (z.B. das Gen des En- zyms Acetamidase, welches die für viele Mikroorganismen toxi- sche Verbindung Acetamid in die ungiftigen Produkte Acetat und Ammoniak spaltet).

Unter den Selektionsmarkergenen besonders bevorzugt sind das Ampicillin-Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Ka- namycin-Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen. Insbe- sondere bevorzugt sind das Tetracyclin-Resistenzgen und das Ka- namycin-Resistenzgen.

Auf Basis der homologen Rekombination gibt es weiterhin Sys- teme, die zusätzlich zur gezielten Geninaktivierung auch die Möglichkeit bieten, den Selektionsmarker wieder aus dem Genom zu entfernen, womit die Möglichkeit der Herstellung von Doppel- und Mehrfachmutanten gegeben ist. Ein solches System ist z.B. die sog. Lambda-Red Technologie, käuflich erhältlich als „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", basierend auf der Red ^® /ET ^® ~ Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH (siehe „Technical Proto- col, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red ^® /ET ^® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012" und darin zitierte Literatur).

Beispiele für erfindungsgemäße Stämme mit inaktiviertem ppsA- Gen sind die in den Beispielen offenbarten Stämme E. coli W3110-AppsA und P. ananatis-ΔppsA::kan. Beide Stämme sind dadurch gekennzeichnet, dass ihr ppsA-Gen durch homologe Rekom- bination inaktiviert wurde.

Ein weiteres solches System zur gezielten Geninaktivierung auf Basis der homologen Rekombination ist eine dem Fachmann be- kannte und im Beispiel 3 beschriebene Methode zur Geninaktivie- rung, bzw. genetischen Modifikation, beruhend auf einer Kombi- nation aus der Lambda-Red Rekombination mit einem Gegenselekti- ons-Screening. Dieses System ist z.B. beschrieben in Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245. Verwendet wird dabei ein DNS-Konstrukt zur Inaktivierung z.B. des ppsA-Gens, beginnend vom 5'-Ende, bestehend aus einer zum ppsA-Gen homolo- gen Sequenz gefolgt von zwei Expressionskassetten beliebiger Reihenfolge, bestehend a) aus einer Expressionskassette des Se- lektionsmarkers, ausgewählt aus der Klasse der Antibiotikare- sistenzgene sowie b) einer Expressionskassette des sacB-Gens, kodierend für das Enzym Levansucrase und schließlich gefolgt von einer weiteren, zum ppsA-Gen homologen Sequenz.

In einem ersten Schritt wird das DNS-Konstrukt in den Produkti- onsstamm transformiert und Antibiotika-resistente Klone iso- liert. Die erhaltenen Klone zeichnen sich dadurch aus, dass sie infolge des mit-aufgenommenen sacB-Gens nicht auf Saccharose wachsen können. Durch das Prinzip der Gegenselektion können die beiden Markergene entfernt werden, indem in einem zweiten Schritt ein geeignetes DNS-Fragment die beiden Markergene durch homologe Rekombiation ersetzt. Die in diesem Schritt erhaltenen Klone können dann wieder auf Saccharose wachsen und sind dann auch wieder sensitiv gegen das Antibiotikum. Dieses Verfahren findet Anwendung in Beispiel 3 zum Austausch des ppsA-WT-Gens von E. coli (SEQ ID NO: 1) durch die im Folgenden beschriebene Dreifachmutante ppsA-MHI (SEQ ID NO: 5). Als Beispiel für einen erfindungsgemäßen Stamm, der aufgrund einer Mutation der kodierenden Sequenz des ppsA-Gens eine abge- schwächte PpsA-Enzymaktivität aufweist, ist in den Beispielen der E. coli Stamm W3110-ppsA-MHI offenbart. W3110-ppsA-MHI ent- hält die cds der PpsA-Dreifachmutante PpsA-V126M-R427H-V434I (ppsA-MHI). Die cds des mutierten Gens von ppsA-MHI entspricht der DNS-Sequenz SEQ ID NO: 5 und codiert für ein PpsA-Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 6. PpsA-MHI ist dadurch gekennzeich- net, dass das Protein mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 gegenüber der in SEQ ID NO: 2 angegebenen WT-Sequenz folgende Änderungen der AminosäureSequenz enthält: Valin an Position 126 ist mu- tiert zu Methionin (V126M), Arginin an Position 427 ist mutiert zu Histidin (R427H) und Valin an Position 434 ist mutiert zu Isoleucin (V434I).

Als Folge dieser Mutationen hatte das PpsA-MHI-Protein nur noch eine relative Enzymaktivität von 26,8% im Vergleich zur spezi- fischen Wildtyp-Enzymaktivität (s. Beispiel 5, Tab. 1).

Im Falle des E. coli ppsA-Gens ist es bevorzugt, dass mindes- tens eine der Mutationen in der cds zu mindestens einer der folgenden Veränderungen in der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:

2 führt: Valin an Position 126, Arginin an Position 427 und/o- der Valin an Position 434, wobei jede der drei Aminosäuren durch eine beliebige, andere Aminosäure ausgetauscht werden kann.

Besonders bevorzugt sind Mutationen, die zur gleichzeitigen Mu- tation der drei Aminosäuren der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäure-Sequenz des WT-Proteins führen.

Die Mutationen im erfindungsgemäßen ppsA-MHI Gen werden in an sich bekannter Weise in das ppsA WT-Gen eingeführt, beispiels- weise durch sog. „site-directed" Mutagenese unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Klonierkits, wie z.B. im Anwen- derhandbuch zum „QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit" der Fa. Agilent offenbart. Alternativ kann das erfindungsgemäße ppsA-MHI Gen in bekannter Weise auch durch DNS-Synthese herge- stellt werden. Der erfindungsgemäße Stamm, gekennzeichnet durch Mutation des ppsA Strukturgens in einer Weise, die zur Abschwächung der En- zymaktivität führt, wie beispielsweise die E. coli ppsA-MHI Dreifachmutante, kann hergestellt werden durch Verwendung der bereits beschriebenen Kombination der Lambda-Red Rekombination mit einem Gegenselektions-Screening zur genetischen Modifika- tion (siehe z.B. Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74:

4241-4245), wie in den Beispielen offenbart.

Als Stämme besonders bevorzugt sind E. coli W3110 AppsA (be- schrieben in Beispiel 1) und E. coli W3110 ppsA-MHI (beschrie- ben in Beispiel 3).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Cystein, dadurch gekennzeich- net, dass die erfindungsgemäßen Mikroorganismenzellen einge- setzt werden.

Als Primärprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird L-Cys- tein gebildet, woraus die Verbindungen L-Cystin und Thiazolidin gebildet werden können. L-Cystin und Thiazolidin entstehen wäh- rend der Fermentation und akkumulieren sowohl im Kulturüber- stand wie im Niederschlag. Bei Thiazolidin handelt es sich um 2-Methyl-2,4-Thiazolidindicarbonsäure, ein Addukt aus Cystein und Pyruvat, das als Nebenprodukt der Cystein Produktion gebil- det werden kann (EP 0885962 Bl).

Die Ausbeute an Gesamtcystein wird im Rahmen dieser Erfindung definiert als Summe des hergestellten Cysteins, Cystins und Thiazolidins. Diese wird aus dem gesamten Kulturansatz be- stimmt, wie in Beispiel 7 beschrieben. Sie kann beispielsweise mit Hilfe des colorimetrische Test von Gaitonde (Gaitonde, M.

K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633) quantifiziert werden.

Der Stand der Technik offenbart keine Verfahren oder Produkti- onsstämme, bei denen durch Abschwächung, bzw. Inaktivierung der Phosphoenolpyruvat-Synthase-Enzymaktivität die Produktion einer Aminosäure, insbesondere von Cystein, verbessert werden kann.

Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist die Abschwächung, bzw. Inaktivierung der ppsA-Enzymaktivität in einem zur Cystein-Produktion geeigneten Mikroorganismenstamm dazu geeignet, in einem fermentativen Verfahren die Ausbeuten an Gesamtcystein, d.h. die Summe des hergestellten Cysteins, Cystins und Thiazolidins, signifikant zu steigern. Nach dem Stand der Technik war dies völlig unerwartet.

Es war überraschend, wie in Tabelle 4 des Beispiels 7 zusammen- gefasst, dass in der Fermentation der ppsA-Mutanten von E. coli W3110 signifikant höhere Cystein Ausbeuten im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-Stamm erzielt werden konnten. Entgegen dem Stand der Technik und für den Fachmann unerwartet, führte die Abschwächung, bzw. die Inaktivierung der Phos- phoenolpyruvat-Synthase-Aktivität zu verbesserten Cystein-pro- duzierenden Stämmen.

Diese neue und erfinderische Maßnahme zur Verbesserung Cystein- produzierender Stämme wurde bestätigt durch die in Tabelle 2 und Tabelle 3 des Beispiels 6 zusammengefassten Ergebnisse, in denen die Inaktivierung des ppsA-Gens, bzw. ein mutiertes ppsA- Gen resultierend in einem PpsA-Enzym mit abgeschwächter Enzym- aktivität in Escherichia coli und die Inaktivierung des ppsA- Gens in Pantoea ananatis bereits in der Anzucht in Schüttelkol- ben zu verbesserten Cystein Ausbeuten führte.

Für den Fachmann stellt die Abschwächung, bzw. die Inaktivie- rung der Phosphoenolpyruvat-Synthase-Aktivität somit eine neue nützliche Maßnahme dar, die Cystein-Produktion auch in anderen Cystein-produzierenden Stämmen zu verbessern.

Im erfindungsgemäßen, zur Cystein-Produktion geeigneten Mikro- organismenstamm wird dementsprechend die Enzymaktivität des durch das ppsA-Gen codierten Proteins im Produktionsstamm abge- schwächt, bzw. vollständig gehemmt und gleichzeitig die Cystein-Produktion erhöht. Beispiel 7 belegt, dass ein zur Cys- tein-Produktion befähigter Stamm kodierend die ppsA-Mutante ppsA-MHI mit reduzierter PpsA-Enzymaktivität anstelle des Wt- Enzyms in der Fermentation signifikant höhere Cystein Ausbeuten erzielt als ein Stamm enthaltend ein ppsA WT-Gen.

Im betreffenden fermentativen Verfahren werden einerseits Bio- masse des erfindungsgemäßen Produktionsstammes und andererseits Cystein und sein Oxidationsprodukt Cystin gebildet. Die Bildung von Biomasse und Cystein kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht er- folgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die An- zucht in Schüttelkolben (Labormaßstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmaßstab).

Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmaßstab durch Fermen- tation mit einem Fermentationsvolumen von grösser 1 L, wobei der Produktionsmaßstab grösser 10 L bevorzugt, grösser 1000 L besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen grösser 10000 L insbesondere bevorzugt ist.

Anzuchtsmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiel- len Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus ei- ner Kohlenstoffquelle (C-Quelle), einer Stickstoffguelle (N- Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelemen- ten sowie einer Schwefelquelle (S-Quelle), durch die das Zell- wachstum und die Cystein Produktion optimiert werden.

C-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Cystein- Produktbildung genutzt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker (Hexosen) wie z. B. Glucose, Mannose, Fructose oder Galactose sowie C5-Zucker (Pen- tosen) wie z.B. Xylose, Arabinose oder Ribose.

Das erfindungsgemäße Produktionsverfahren umfasst jedoch auch alle C-Quellen in Form von Disacchariden, insbesondere Saccha- rose, Lactose, Maltose oder Cellobiose. Das erfindungsgemäße Produktionsverfahren umfasst weiterhin auch alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Malto- dextrin, Stärke, Cellulose, Hemicellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Mono- mere oder Oligomere. Dabei kann die Hydrolyse der höheren C- Quellen dem erfindungsgemäßen Produktionsverfahren vorgeschal- tet sein oder aber in situ während des erfindungsgemäßen Pro- duktionsverfahrens erfolgen.

Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze), Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat (und dessen Salze). Es sind aber auch gasförmige C- Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmonoxid denkbar.

Die vom erfindungsgemäßen Produktionsverfahren betroffenen C- Quellen umfassen sowohl die isolierten Reinsubstanzen oder aber auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufge- reinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydroly- sate durch chemischen oder enzymatischen Aufschluss der pflanz- lichen Rohstoffe gewonnen werden können. Dazu gehören z.B. Hyd- rolysate der Stärke (Monosaccharid Glucose), der Zuckerrübe (Monosaccharide Glucose, Fructose und Arabinose), des Zucker- rohrs (Disaccharid Saccharose), des Pektins (Monosaccharid Ga- lacturonsäure) oder auch der Lignozellulose (Monosaccharid Glu- cose aus Cellulose, Monosaccharide Xylose, Arabinose, Mannose, Galactose aus Hemicellulose sowie das nicht zu den Kohlehydra- ten gehörende Lignin). Weiterhin können als C-Quellen auch Ab- fallprodukte aus dem Aufschluss pflanzlicher Rohstoffe dienen, so z.B. Melasse (Zuckerrübe) oder Bagasse (Zuckerrohr).

Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstämme sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose, Arabinose sowie pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zu- ckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können. Besonders bevorzugte C-Quellen sind Glucose und Saccharose, entweder in isolierter Form oder als Bestandteil eines pflanz- lichen Hydrolysats.

Insbesondere bevorzugte C-Quelle ist Glucose.

N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomasse- bildung genützt werden können. Dazu gehört Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH ₄ OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N- Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO ₃ , NaNCb, Ammoniumnitrat, Ca(NO ₃₎₂ , Mg(NO ₃ ) ₂ sowie andere N-Quellen wie z.B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Amino- säuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzex- trakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.

Die Zudosierung einer Schwefel-Quelle, entweder als einmalige Zugabe in Batch-Form oder als kontinuierlicher Feed, ist für die effiziente Produktion von Cystein und Cystein-Derivaten er- forderlich. Die kontinuierliche Zudosierung kann dabei als reine Feedlösung oder aber auch im Gemisch mit einer weiteren Feed-Komponente wie z.B. Glucose erfolgen.

Geeignete Schwefel-Quellen sind Salze der Sulfate, Sulfite, Dithionite, Thiosulfate oder Sulfide, wobei auch bei gegebener Stabilität der Einsatz der jeweiligen Säuren denkbar ist.

Bevorzugte Schwefelquellen sind Salze der Sulfate, Sulfite, Thiosulfate und Sulfide.

Besonders bevorzugte Schwefelquellen sind Salze der Sulfate und Thiosulfate.

Insbesondere bevorzugt sind Salze des Thiosulfats, wie z.B. Natriumthiosulfat und Ammoniumthiosulfat. Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das An- zuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes in- okuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.

Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zu- sätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed), um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C- Quelle, der N-Quelle, der Schwefel-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen o- der aus einer Kombination der Vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die Cystein Produk- tion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zu- geführt werden, oder aber auch in Kombination aus kontinuierli- chem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.

Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Saccharose sowie Glucose oder Saccharose enthaltende pflanzliche Hydrolysate so- wie Mischungen der bevorzugten C-Quellen in beliebigem Mi- schungsverhältnis.

Besonders bevorzugte C-Quelle im Feed ist Glucose.

Bevorzugt wird die C-Quelle der Kultur so zudosiert, dass der Gehalt der Kohlenstoffquelle im Fermenter während der Produktionsphase 10 g/L nicht übersteigt. Bevorzugt ist eine maximale Konzentration von 2 g/L, besonders bevorzugt von 0,5 g/L, insbesondere bevorzugt von 0,1 g/L.

Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH ₄ OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Am- moniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KNO ₃ , NaNO ₃ und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwas- ser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.

Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Am- moniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt o- der Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form).

Bevorzugte Schwefelquellen im Feed sind Salze der Sulfate, Sul- fite, Thiosulfate und Sulfide.

Besonders bevorzugte Schwefelquellen im Feed sind Salze der Sulfate und Thiosulfate.

Insbesondere bevorzugt als Schwefelquelle im Feed sind Salze des Thiosulfats, wie z.B. Natriumthiosulfat und Ammoniumthio- sulfat.

Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren (d. h. in mM Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink, Kupfer und Nickel zuge- setzt werden. Des Weiteren können organische Säuren (z.B. Ace- tat, Citrat), Aminosäuren (z.B. Isoleucin) und Vitamine (z.B. Vitamin Bl, Vitamin B6) dem Medium zugesetzt werden.

Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die Cystein Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 9. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 8. Besonders be- vorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7,5.

Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produkti- onsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 37°C und insbesondere bevorzugt von 28°C bis 34°C. Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauer- stoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung). Bevorzugt ist die ae- robe Kultivierung mit Sauerstoff.

Bei der aeroben Kultivierung des erfindungsgemäßen Stammes zur Cystein-Produktion wird eine Sättigung des Sauerstoff-Gehalts von mindestens 10% (v/v), bevorzugt von mindestens 20% (v/v) und besonders bevorzugt von mindestens 30% (v/v) eingestellt. Die Regulation der Sauerstoff-Sättigung in der Kultur erfolgt dabei entsprechend dem Stand der Technik automatisch über eine Kombination aus Gaszufuhr und Rührgeschwindigkeit.

Die Sauerstoffversorgung wird durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet. Bevorzugt ist die aerobe Kul- tivierung durch Eintrag von Pressluft. Der nützliche Bereich der Pressluftzufuhr bei der aeroben Kultivierung beträgt 0,05 vvm bis 10 vvm (vvm: Eintrag von Pressluft in den Fermentati- onsansatz angegeben in Liter Pressluft je Liter Fermentations- volumen pro Minute). Bevorzugt ist ein Presslufteintrag von 0,2 vvm bis 8 vvm, besonders bevorzugt von 0,4 bis 6 vvm und insbe- sondere bevorzugt von 0,8 bis 5 vvm.

Die maximale Rührgeschwindigkeit beträgt 2500 rpm, bevorzugt 2000 rpm und besonders bevorzugt 1800 rpm.

Die Kultivierungsdauer beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevor- zugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.

Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das Cystein entweder gelöst im Kul- turüberstand oder, oxidiert als Cystin, in präzipitierter Form. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene Cystein, bzw. Cys- tin kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterver- wendet oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das gebildete Cystein isoliert wird. Zur Isolierung des Cysteins und Cystins stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Ver- fügung, darunter Zentrifugation, Dekantierung, Lösen des Roh- produkts mit einer Mineralsäure, Filtration, Extraktion, Chro- matographie oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfah- rensschritte können dabei in jeder beliebigen Form kombiniert werden, um das Cystein in der gewünschten Reinheit zu isolie- ren. Der dabei angestrebte Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung.

Das bei der Aufarbeitung erhaltene Cystin kann für die weitere Verwendung zu Cystein reduziert werden. Ein Verfahren zur Re- duktion von L-Cystin zu L-Cystein in einem elektrochemischen Prozess ist in EP 0235908 offenbart.

Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quanti- fizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades des Cystein, bzw. Cystin Produkts sind verfügbar, darunter Spektralphotometrie, NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie, Gravimetrie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden.

Mit der Erfindung können auch verbesserte Mikroorganismenstämme zur fermentativen Herstellung von Verbindungen, deren Biosyn- these von 3-Phosphoglycerat ausgeht und über L-Serin zu L-Cys- tein und L-Cystin führt, hergestellt werden. Dies umfasst auch Mikroorganismenstämme zur fermentativen Herstellung von Deriva- ten des L-Serins und L-Cysteins, darunter Phosphoserin, O-Ace- tylserin, N-Acetylserin und Thiazolidin, ein Kondensationspro- dukt aus L-Cystein und Pyruvat.

Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide. Fig. 1 zeigt den in Beispiel 1 und Beispiel 2 verwendeten 3,4 kb grossen Vektor pKD13. Fig. 2 zeigt den in Beispiel 1 und Beispiel 3 verwendeten 6,3 kb grossen Vektor pKD46.

Fig. 3 zeigt den in Beispiel 3 verwendeten 5 kb grossen Vektor pKan-SacB.

Fig. 4 zeigt den in Beispiel 4 verwendeten 4,2 kb grossen Vek- tor pACYC184.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläu- tert, ohne durch sie eingeschränkt zu werden:

Beispiel 1: Herstellung einer ppsA-Deletionsmutante in E- scherichia coli

Als Ausgangsstamm für die Genisolierung sowie für die Stamment- wicklung wurde Escherichia coli K12 W3110 verwendet (käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 5911 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).

Ziel der Geninaktivierung war die kodierende Sequenz des ppsA- Gens aus E. coli. Die DNS-Sequenz des ppsA-Gens aus E. coli K12 (Genbank GenelD: 946209) ist offenbart in SEQ ID NO: 1. Die Nukleotide 333-2711 (bezeichnet mit E. coli ppsA) kodieren für ein Phosphoenolpyruvat-Synthase Protein mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz (E. coli PpsA).

Das E. coli ppsA-Gen wurde mit der Red ^® /ET ^® -Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH wie unten detailliert aufgeführt inaktiviert (beschrieben im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red ^® /ET ^® Recombination, Cat. No.

KO06, Version 2.3, Juni 2012 und darin zitierter Literatur, z.B. Datsenko und Wanner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97 (2000): 6640-6645). Dazu wurden die Plasmide pKD13, pKD46 und pCP20 verwendet:

- Das 3,4 kb grosse Plasmid pKD13 (Fig. 1) ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer

AY048744.1.

- Das 6,3 kb grosse Plasmid pKD46 (Fig. 2) ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer

AY048746.1.

- Das 9,4 kb grosse Plasmid pCP20 ist offenbart in Cherepanov und Wackernagel, Gene 158 (1995): 9-14.

Zur Inaktivierung des ppsA Gens in E. coli W3110 durch homologe Rekombination mit dem Lambda Red System wurden folgende Schritte durchgeführt: 1. E. coli W3110 wurde mit dem Plasmid pKD46 (sog. „Red Recom- binase" Plasmid, Fig. 2) transformiert und ein Ampicillin- resistenter Klon isoliert (bezeichnet als W3110 x pKD46).

2. Ein ppsA-spezifisches, zu dessen Inaktivierung geeignetes DNS-Fragment wurde in einer PCR-Reaktion („Phusion™ High-Fi- delity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit DNS des Plasmids pKD13 (Fig. 1) und den Primern pps-5f (SEQ ID NO:

7) und pps-6r (SEQ ID NO: 8) hergestellt.

Primer pps-5f enthielt 30 Nukleotide (nt) aus dem 5'-Bereich des ppsA Gens (nt 333-362 in SEQ ID NO: 1) und daran ange- schlossen 20 nt spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „pr-1" in Fig. 1).

Primer pps-6r enthielt 30 nt aus dem 3'-Bereich des ppsA Gens (nt 2682-2711 in SEQ ID NO: 1, in revers komplementärer Form) und daran angeschlossen 20 nt spezifisch für das Plas- mid pKD13 (bezeichnet als „pr-2" in Fig. 1).

DNS des Plasmids pKD13 wurde verwendet, um mit den Primern pps-5f und pps-6r ein 1,4 kb PCR-Produkt herzustellen, das am 5'- und am 3'-Ende jeweils einen DNS-Abschnitt von 30 nt enthielt, der spezifisch für das ppsA Gen aus E. coli W3110 war. Darüber hinaus enthielt das PCR-Produkt die Expressi- onskassette des in pKD13 enthaltenen Kanamycin Resistenzgens und, jeweils flankierend zum 5'- und 3'-Ende der Kanamycin Expressionskassette, sog. „FRT direct repeats" (bezeichnet als „FRT1 " und „FRT2 " in Fig. 1), kurze DNS-Abschnitte, die in einem späteren Arbeitsschritt zur Entfernung des Antibio- tikamarkers Kanamycin als Erkennungssequenz für die „FLP Re- kombinase" (enthalten auf dem Plasmid pCP20) dienten.

3. Das 1,4 kb große PCR-Produkt wurde isoliert und mit der, dem Fachmann geläufigen, nur methylierte DNS schneidenden Rest- rikitonsendonuclease Dpn I behandelt, um restliche pKD13 Plasmid-DNS zu entfernen. Nicht-methylierte DNS aus der PCR- Reaktion wird dabei nicht abgebaut.

4. Das 1,4 kb große, für das ppsA-Gen spezifische und eine Ex- pressionskassette für das Kanamycin Resistenzgen enthaltende PCR-Produkt wurde in E. coli W3110 x pKD46 transformiert und auf LBkan-Platten bei 30°C Kanamycin-resistente Klone iso- liert. LBkan-Platten enthielten LB-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl), 1,5% Agar und 15 mg/L Ka- namycin. Zehn der erhaltenen Kanamycin-resistenten Klone wurden auf LBkan-Platten gereinigt (d.h. Isolieren eines Klons durch Vereinzeln) und in einer PCR-Reaktion überprüft, ob die Ka- namycin-Resistenz Kassette korrekt im ppsA-Gen integriert worden war.

Die für die PCR-Reaktion („Phusion™ High-Fidelity" DNS Poly- merase, Thermo Scientific™) verwendete genomische DNS wurde mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von Kanamycin-resistenten Klonen von E. coli W3110 in LBkan- Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 15 mg/L Kanamycin) isoliert. Dabei diente genomische DNS des E. coli W3110 Wildtyp Stammes als Kontrolle. Die für die PCR- Reaktion verwendeten Primer waren pps-7f (SEQ ID NO: 9) und pps-8r (SEQ ID NO: 10). Primer pps-7f enthielt nt 167-188 aus SEQ ID NO: 1, Primer pps-8r nt 2779-2800 aus SEQ ID NO:

1 in revers komplementärer Form).

E. coli W3110 Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 2630 bp, wie für das intakte Gen erwartet. Ein untersuchter Kanamycin-resistenter Klon hingegen ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 1660 bp, wie für den Fall erwartet, dass das 1,4 kb PCR-Produkt an den durch die Primer pps-5f und pps-6r definierten Stellen im ppsA-Gen integriert worden war. Dieses Ergebnis zeigte, dass am Gen- ort des ppsA Gens erfolgreich das Kanamycin-Resistenzgen in- tegriert werden konnte und somit das ppsA-Gen inaktiviert worden war. Der Klon mit inaktiviertem ppsA Gen wurde ausge- wählt und erhielt die Bezeichnung W3110-AppsA::kan. Zur Eliminierung des Kanamycin Selektionsmarkers wurde W3110-AppsA::kan mit dem Plasmid pCP20 transformiert und Transformanten bei 30°C selektiert. Der 9,4 kb Vektor pCP20 ist offenbart in Cherepanov und Wackernagel (1995), Gene 158: 9-14. Auf dem Vektor pCP20 ist das Gen der FLP- Rekombinase enthalten. Die FLP-Rekombinase erkennt die FRT- Sequenzen, welche die Expressionskassette des Kanamycin-Re- sistenzgens flankieren und bewirkt die Entfernung der Ka- namycin Expressionskassette. Dazu wurden die bei 30°C erhal- tenen Klone bei 37°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen wurde zum einen die Expression der FLP-Rekombinase induziert und zum zweiten die Replikation des pCP20 Vektors unterbun- den.

Das Resultat dieses Schrittes waren Klone, in denen zum ei- nen das ppsA Gen inaktiviert worden war und die zum anderen wieder sensitiv gegen Kanamycin waren (sog. „Curing" des An- tibiotika Selektionsmarkers). Die Entfernung der Kanamycin- Kassette aus dem Genom der AppsA Mutanten ermöglicht die Einführung weiterer Mutationen, um Doppel- oder auch Mehr- fachmutanten herzustellen.

W3110-AppsA::kan war nach der Behandlung mit dem pCP20 Plas- mid wieder Kanamycin-sensitiv, was wie folgt überprüft wurde:

- durch Plattieren auf LB- und LBkan-Platten:

Wachstum auf LB-Platten war positiv, während auf LBkan- Platten kein Wachstum mehr beobachtet werden konnte, was auf die erfolgreiche Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom hindeutete.

- durch PCR-Reaktion:

Dazu wurde von den Kanamycin-sensitiven Klonen genomische DNS isoliert (Qiagen DNS-Isolierungskit) und in einer PCR- Reaktion („Phusion™ High-Fidelity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit den Primern pps-7f (SEQ ID NO: 9) und pps-8r (SEQ ID NO: 10) eingesetzt. E. coli W3110 Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von ca. 2630 bp, wie für das intakte ppsA Gen erwartet. Der Ka- namycin-sensitive Klon hingegen ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 300 bp, was der erwarteten Größe der nach der homologen Rekombination verbliebenen 5'- und 3 '-Fragmente des inaktivierten ppsA Gens entsprach. Der aus diesem Schritt isolierte Stamm erhielt die Bezeich- nung E. coli W3110-ΔppsA. Dieser Stamm zeichnet sich dadurch aus, dass er ein inaktiviertes ppsA Gen enthielt, und dass dieser Stamm wieder sensitiv gegen das Antibiotikum Ka- namycin war.

Beispiel 2: Herstellung einer ppsA-Deletionsmutante in Pan- toea ananatis

Als Ausgangsstamm für die Genisolierung sowie für die Stamment- wicklung wurde Pantoea ananatis verwendet (käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 30070 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).

Ziel der Geninaktivierung war das ppsA Gen aus Pantoea ananatis. Die DNS-Sequenz des ppsA-Gens aus P. ananatis (Genbank Ge- nelD: 31510655) ist offenbart in SEQ ID NO: 3. Die Nukleotide 417 - 2801 (bezeichnet mit P. ananatis ppsA) kodieren für ein Phosphoenolpyruvat-Synthase Protein mit der in SEQ ID NO: 4 of- fenbarten Aminosäuresequenz (P. ananatis PpsA).

Das P. ananatis ppsA Gen wurde mit der Red ^® /ET ^® -Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH wie unten detailliert aufgeführt inakti- viert (beschrieben im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red ^® /ET ^® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012 und darin zitierter Literatur, z.B. Datsenko und Wanner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97 (2000): 6640-6645). Dazu wurden die Plasmide pKD13 und pRedET verwen- det.

- Das 3,4 kb grosse Plasmid pKD13 (Fig. 1) ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer

AY048744.1.

- Das kommerziell erhältliche, 9,3 kb grosse Plasmid pRedET ist offenbart im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red ^® /ET ^® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012. Zur Inaktivierung des ppsA Gens in P. ananatis durch homologe

Rekombination mit dem Lambda Red System wurden, folgende

Schritte durchgeführt:

1. P. ananatis wurde mit dem Plasmid pRedET (sog. „Red Recombi- nase" Plasmid) transformiert und ein Tetracyclin-resistenter Klon isoliert (bezeichnet als P. ananatis x pRedET).

2. Ein ppsA-spezifisches, zu dessen Inaktivierung geeignetes DNS-Fragment wurde in einer PCR-Reaktion („Phusion™ High-Fi- delity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit DNS des Plasmids pKD13 (Fig. 1) und den Primern ppsapa-3f (SEQ ID NO: 11) und pps-4r (SEQ ID NO: 12) hergestellt.

Primer ppsapa-3f enthielt 49 nt aus dem 5'-Bereich des ppsA Gens (nt 417-465 in SEQ ID NO: 3) und daran angeschlossen 20 nt spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „pr-1" in Fig. 1).

Primer ppsapa-4r enthielt 49 nt aus dem 3'-Bereich des ppsA Gens (nt 2753-2801 in SEQ ID NO: 3, in revers komplementärer Form) und daran angeschlossen 20 nt spezifisch für das Plas- mid pKD13 (bezeichnet als „pr-2" in Fig. 1).

DNS des Plasmids pKD13 wurde verwendet, um mit den Primern ppsapa-3f und pps-4r ein 1,4 kb PCR-Produkt herzustellen, das am 5'- und am 3'-Ende jeweils einen DNS-Abschnitt von 49 nt enthielt, der spezifisch für das ppsA Gen aus P. ananatis war. Darüber hinaus enthielt das PCR-Produkt die Expressi- onskassette des in pKD13 enthaltenen Kanamycin Resistenzgens und, jeweils flankierend zum 5'- und 3'-Ende der Kanamycin Expressionskassette, sog. „FRT direct repeats" (bezeichnet als „FRT1 " und „FRT2 " in Fig. 1), kurze DNS-Abschnitte, die bei Bedarf eine Entfernung des Antibiotikamarkers Kanamycin in ppsA Deletionsmutanten ermöglichen.

3. Das 1,4 kb grosse PCR-Produkt wurde isoliert und mit der, dem Fachmann geläufigen, nur methylierte DNS schneidenden Restrikitonsendonuclease Dpn I behandelt, um restliche pKD13 Plasmid-DNS zu entfernen. Nicht-methylierte DNS aus der PCR- Reaktion wird dabei nicht abgebaut. Das 1,4 kb grosse, für das ppsA Gen spezifische und eine Ex- pressionskassette für das Kanamycin Resistenzgen enthaltende PCR-Produkt wurde in P. ananatis x pRedET transformiert und auf LBkan-Platten bei 30°C Kanamycin-resistente Klone iso- liert. LBkan-Platten enthielten LB-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl), 1,5% Agar und 15 mg/L Ka- namycin. Ein Kanamycin-resistenter Klon wurde auf LBkan-Platten ge- reinigt (d.h. Isolieren eines Klons durch Vereinzeln) und in einer PCR-Reaktion überprüft, ob die Kanamycin-Resistenz Kassette korrekt im ppsA-Gen integriert worden war.

Die für die PCR-Reaktion („Phusion™ High-Fidelity" DNS Poly- merase, Thermo Scientific™) verwendete genomische DNS wurde mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht des Kanamycin-resistenten Klons von P. ananatis in LBkan-Me- dium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 15 mg/L Kanamycin) isoliert. Dabei diente genomische DNS des P. ana- natis Wildtyp Stammes als Kontrolle. Die für die PCR- Reaktion verwendeten Primer waren ppsapa-lf (SEQ ID NO: 13) und ppsapa-2r (SEQ ID NO: 14). Primer ppsapa-lf enthielt nt 281-302 in SEQ ID NO: 3, Primer ppsapa-2r nt 2901-2922 in SEQ ID NO: 3, in revers komplementärer Form).

P. ananatis Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 2640 bp, wie für das intakte Gen erwartet. Ein untersuchter Kanamycin-resistenter Klon hingegen ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 1670 bp, wie für den Fall erwartet, dass das 1,4 kb PCR-Produkt an den durch die Primer ppsapa-3f (SEQ ID NO: 11) und ppsapa-4r (SEQ ID NO: 12) definierten Stellen im ppsA-Gen integriert worden war. Dieses Ergebnis zeigte, dass am Genort des ppsA Gens erfolgreich das Kanamycin-Resistenzgen integriert werden konnte und somit das ppsA-Gen inaktiviert worden war. Der Klon mit inaktiviertem ppsA Gen wurde ausgewählt und erhielt die Bezeichnung P. ananatis-AppsA::kan.

Beispiel 3; Herstellung von Escherichia coli W3110-ppsA-MHI

E. coli W3110-ppsA-MHI, gekennzeichnet durch Mutationen des ppsA Strukturgens in einer Weise, die zur Abschwächung der En- zymaktivität führen, wurde hergestellt durch Verwendung der dem Fachmann bekannten Kombination aus Lambda-Red Rekombination und einem Gegenselektions-Screening zur genetischen Modifikation (siehe z.B. Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-

4245). Die DNS-Sequenz des Gens ppsA-MHI ist offenbart in SEQ ID NO: 5 (ppsA-MHI), codierend für ein Protein mit der Sequenz wie in SEQ ID NO: 6 (PpsA-MHI) angegeben.

Es wurde verfahren wie folgt:

1. Ein 2,6 kb DNS-Fragment, umfassend Teile des ppsA WT-Gens (nt 167 bis nt 2800 in SEQ ID NO: 1), d.h. die cds sowie 5'- und 3'-flankierende Sequenzen, wurde unter Verwendung der Primer pps-7f (SEQ ID NO: 9) und pps-8r (SEQ ID NO: 10) durch PCR aus genomischer DNS von E. coli W3110 isoliert.

2. ppsA-MHI wurde aus dem ppsA WT-Gen erhalten, indem die Muta- tionen sukzessive durch „site-directed" Mutagenese in das ppsA WT-Gen eingeführt wurden. Dies erfolgte unter Verwen- dung des kommerziell erhältlichen Klonierkits, „QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit" der Fa. Agilent entspre- chend den Angaben im Anwenderhandbuch.

3. Um das ppsA WT-Gen von E. coli W3110 gegen ppsA-MHI auszu- tauschen wurde zuerst vom Plasmid pKan-SacB (Fig. 3) die 3,2 kb Kan-sacB-Kassette durch PCR mit den Primern pps-9f (SEQ ID NO: 15) und pps-10r (SEQ ID NO: 16) isoliert.

Das Plasmid pKan-sacB enthält Expressionskassetten sowohl für das Kanamycin (Kan) Resistenz Gen wie für das sacB Gen, codierend für das Enzym Levansucrase. Der Primer pps-9f enthielt 30 nt beginnend vom Start-ATG des ppsA-Gens (nt 333-362 in SEQ ID NO: 1) und daran angeschlos- sen 20 nt spezifisch für das Plasmid pKan-SacB (bezeichnet als „pr-f" in Fig. 3).

Der Primer pps-10r enthielt 30 nt ausgehend vom stop-Codon des ppsA Gens (nt 2682-2711 in SEQ ID NO: 1, in revers kom- plementärer Form) und daran angeschlossen 21 nt spezifisch für das Plasmid pKan-SacB (bezeichnet als „pr-r" in Fig. 3).

4. E. coli W3110 x pKD46 (Herstellung siehe Beispiel 1) wurde mit dem ppsA-spezifischen 3,2 kb PCR-Produkt transformiert und Kanamycin-resistente Klone isoliert.

5. Die Klone wurden auf LBSC-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L He- feextrakt, 7% Saccharose, 1,5% Agar und 15 mg/L Kanamycin) überimpft.

Klone mit integriertem sacB-Gen produzierten aus der Saccha- rose toxisches Levan, was zur Wachstumshemmung führte. Sol- che Klone wurden ausgewählt und in einer PCR-Reaktion über- prüft, ob die Kan-sacB Kassette korrekt im ppsA Gen inte- griert worden war. Die für die PCR-Reaktion („Phusion™ High- Fidelity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) verwendete ge- nomische DNS war zuvor mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von Kanamycin-resistenten Klonen von E. coli W3110 in LBkan-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefe- extrakt, 5 g/L NaCl, 15 mg/L Kanamycin) gewonnen worden. Da- bei diente genomische DNS des E. coli W3110 Wildtyp Stammes als Kontrolle. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer waren pps-7f (SEQ ID NO: 9) und pps-8r (SEQ ID NO: 10).

E. coli W3110 Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 2630 nt, wie für das intakte Gen erwartet. Ka- namycin-resistente Klone hingegen ergaben bei der PCR- Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 3400 nt, wie für den Fall erwartet, dass das 3,2 kb PCR-Produkt an den durch die Pri- mer pps-9f (SEQ ID NO: 15) und pps-10r (SEQ ID NO: 16) defi- nierten Stellen im ppsA-Gen integriert worden war. Dieses Ergebnis zeigte, dass am Genort des ppsA Gens erfolgreich die Kan-sacB Kassette integriert werden konnte und somit das ppsA Gen inaktiviert worden war. Ein Klon mit integrierter Kan-sacB Kassette wurde ausgewählt und erhielt die Bezeich- nung W3110-ΔppsA::kan-sacB x pKD46.

6. Im nächsten Schritt wurde die Kan-sacB Kassette durch das ppsA-MHI Gen ausgetauscht. Dazu wurde aus dem ppsA-MHI DNS- Fragment aus Schritt 2 in einer PCR Reaktion („Phusion™ High-Fidelity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit den Primern pps-llf (SEQ ID NO: 17) und pps-12r (SEQ ID NO: 18) ein 2,5 kb DNS-Fragment amplifiziert. Primer pps-llf en- thielt nt 300-319 in SEQ ID NO: 1, Primer pps-12r nt 2743- 2763 in SEQ ID NO: 1, in revers komplementärer Form.

7. Das 2,5 kb ppsA-MHI Gen wurde in E. coli W3110-AppsA::kan- sacB x pKD46 transformiert und Klone auf LBS-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 7% Saccharose, 1,5% Agar) ohne Kanamycin selektiert. Auf LBS-Platten konnten nur Klone wachsen, die kein aktives sacB-Gen mehr enthielten.

Diese Klone wurden auf LBkan-Platten überimpft, um solche Klone zu selektieren, die auch kein aktives Kan-Gen mehr enthielten und deren Wachstum in Gegenwart von Kanamycin ge- hemmt wurde.

Klone mit positivem Wachstum in Gegenwart von Saccharose und negativem Wachstum in Gegenwart von Kanamycin wurden ausge- wählt und in einer PCR-Reaktion überprüft, ob die Kan-sacB Kassette korrekt durch das ppsA-MHI Gen ersetzt worden war. Genomische DNS wurde mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht in LB-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl) gewonnen. Dabei diente genomische DNS des E. coli W3110 Wildtyp Stammes als Kontrolle. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer waren pps-7f (SEQ ID NO: 9) und pps-8r (SEQ ID NO: 10). PCR-Produkte von der erwarte- ten Größe von 2630 nt wurden durch DNS-Sequenzierung (Euro- fins Genomics) analysiert. Klone mit korrekt integriertem ppsA-MHI Gen ergaben die DNS-Sequenz wie in SEQ ID NO: 5 of- fenbart, kodierend für ein Protein entsprechend der Sequenz aus SEQ ID NO: 6. Ein Klon mit korrektem ppsA-MHI Gen, enthaltend die Mutationen V126M, R427H und V434I, wurde aus- gewählt und erhielt die Bezeichnung E. coli W3110-ppsA-MHI.

Beispiel 4: Erzeugung von Cystein-Produktionsstämmen

Als Cystein-spezifisches Produktionsplasmid verwendet wurde das vom Ausgangsvektor pACYC184 (Fig. 4) abgeleitete Plasmid pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317. pACYCl84-cysEX-GAPDH- ORF306-serA317 ist ein Derivat des in EP 0885962 Bl offenbar- ten Plasmids pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306. Das Plasmid pACYC184- cysEX-GAPDH-ORF306 enthält neben dem Replikationsursprung und einem Tetracyclin-Resistenzgen (Ausgangsvektor pACYC184) das cysEX-Allel, das für eine Serin-O-Acetyl-Transferase mit einer verminderten Feedback-Hemmung durch Cystein kodiert sowie das Effluxgen ydeD (ORF306), dessen Expression durch den konstitu- tiven GAPDH Promotor gesteuert wird. pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317 enthält darüber hinaus, kloniert hinter das ydeD (ORF306) Efflux Gen, noch das serA317 Genfragment, kodierend für die N-terminalen 317 Aminosäuren des SerA Proteins (Gesamtlänge 410 Aminosäuren). Das E. coli serA Gen ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank mit der Gene ID 945258. serA317 ist offenbart in Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-4184, darin bezeichnet als „NSD:317" und ko- diert für eine gegen Serin Feedback-resistente Variante der 3- Phosphoglycerat Dehydrogenase. Die Expression von serA317 wird gesteuert durch den serA-Promotor.

Es wurden die Stämme E. coli W3110, E. coli W3110-AppsA, E. coli W3110-ppsA-MHI, P. ananatis und P. ananatis-AppsA::kan je- weils mit dem Plasmid pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317 (in den folgenden Beispielen bezeichnet als pCYS) transformiert.

Die Transformation erfolgte nach dem Stand der Technik mittels Elektroporation, wie in EP 0885962 Bl beschrieben.

Die Selektion von Plasmid-tragenden Transformanten erfolgte auf LBtet-Agarplatten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 1,5% Agar, 15 mg/L Tetracyclin). Ausgewählte Transformanten wurden auf das transformierte pCYS-Plasmid durch Plasmidisolierung mittels des QIAprep Spin Plasmid Kit (Qiagen) und Restriktionsanalyse überprüft. Transformanten mit korrekt aufgenommenem Plasmid pCYS wurden in der Kultivierung einge- setzt zur Überprüfung der ppsA-Enzymaktivität (Beispiel 5) und zur Bestimmung der Cystein-Produktion (Beispiel 6 und Beispiel 7).

Beispiel 5: Bestimmung der ppsA-Enzymaktivität

Bestimmt wurde die ppsA-Enzymaktivität der E. coli Stämme W3110, W3110-AppsA, W3110-ppsA-MHI, jeweils transformiert mit dem Produktionsplasmid pCYS (Beispiel 4). Zellen aus der Schüt- telkolbenanzucht in 50 ml SMl-Medium (Zusammensetzung siehe Beispiel 6) der drei Stämme wurden durch 10 min Zentrifugation pelletiert und einmal mit 10 ml 0,9% (w/v) NaCl gewaschen. Die Zellpellets wurden in 10 ml Testpuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM MgCl ₂ ) aufgenommen und ein Zellextrakt hergestellt.

Verwendet wurde der Zellhomogenisator FastPrep-24™ 5G der Fa. MP Biomedicals. Dazu wurden 2 x 1 ml Zellsuspension in vom Her- steller vorgefertigten 1,5 ml Röhrchen mit Glaskugeln („Lysing Matrix B") aufgeschlossen (3 x 20 sec bei einer Schüttelfre- quenz von 6000 rpm mit jeweils 30 sec Pause zwischen den Inter- vallen). Das resultierende Homogenat wurde zentrifugiert und der Überstand als Zellextrakt für die Aktivitätsbestimmung ver- wendet.

Der Proteingehalt des Extrakts wurde mit einem Qubit 3.0 Fluo- rometer der Fa. Thermo Fisher Scientific unter Einsatz des „Qubit ^® Protein Assay Kits" nach Angaben des Herstellers be- stimmt.

Zur Bestimmung der ppsA-Enzymaktivität wurde der Phosphat De- tektionskit "Malachite Green Phosphate Assay Kit" der Fa. Sig- maAldrich (Katalog Nummer MAK307) entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet. Dieser basiert darauf, dass bei der Gleichgewichtsreaktion (4) durch die ppsA-Enzymaktivität Pyruvat mit ATP zu Phosphoenolpyruvat umgesetzt wird. Dabei entsteht in stöchimetrischen Mengen Phosphat, was zur Aktivi- tätsbestimmung verwendet wird.

Die Testansätze enthielten in 1 ml Testpuffer (100 mM Tris- HCl, pH 8,0; 10 mM MgCl ₂ ) 100 μg Zellextrakt, 4 mM Na- Pyruvat und 4 mM ATP.

Die verschiedenen Ansätze wurden bei 30°C inkubiert.

0 min, 10 min, 20 min, 30 min und 60 min nach Start der In- kubation wurden 50 mΐ des jeweiligen Ansatzes entnommen, in 750 μl H ₂ 0 gegeben und schließlich mit 200 mΐ Reagens aus dem "Malachite Green Phosphate Assay Kit" versetzt.

Nach 30 min Inkubation erfolgte die Bestimmung der gebilde- ten Phosphatmenge anhand einer Phosphat Eichgeraden, ent- sprechend den Angaben des Herstellers photometrisch durch Bestimmung der Extinktion bei 620 nm. Schließlich wurde aus der gemessenen Phosphatmenge, bezogen auf den Zeitpunkt der Probenahme aus dem jeweiligen Testansatz, die ppsA-Enzymak- tivität in U/ml Extrakt bestimmt (1 U = μmol Substratum- satz/min). Die spezifische ppsA-Enzymaktivität berechnete sich, indem die ppsA-Enzymaktivität auf 1 mg Gesamtprotein des Zellextrakts bezogen wurde (U/mg Protein).

Tabelle 1: Bestimmung der ppsA-Enzymaktivität

Beispiel 6: Cystein-Produktion im Schüttelkolben

Als Vorkultur für die Kultivierung im Schüttelkolben wurden 3 ml LB-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl), das zusätzlich 15 mg/L Tetracyclin enthielt, mit dem jeweiligen Stamm beimpft und bei 30°C und 135 rpm für 16 h in einem Schüttler inkubiert. Die untersuchten Stämme waren E. coli W3110, W3110-ΔppsA, W3110-ppsA-MHI, sowie in einem zweiten Ver- such P. ananatis und P. ananatis-ΔppsA::kan, jeweils transfor- miert mit dem Produktionsplasmid pCYS (Beispiel 4).

Hauptkultur: Anschließend wurde ein Teil der jeweiligen Vorkul- tur in einen 300 ml Erlenmeyerkolben (mit Schikane) mit 30 ml SM1-Medium, enthaltend 15 g/L Glucose, 5 mg/L Vitamin Bl und 15 mg/L Tetracyclin, überführt.

Zusammensetzung des SMl-Mediums: 12 g/L K ₂ HPO ₄ , 3 g/L KH ₂ PO ₄ , 5 g/L (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0,3 g/L MgSO ₄ x 7 H ₂ 0, 0,015 g/L CaCl ₂ x 2 H ₂ O, 0,002 g/L FeSO ₄ x 7 H ₂ 0, 1 g/L Na ₃ Citrat x 2 H ₂ O, 0,1 g/L NaCl;

1 ml/L Spurenelementlösung.

Zusammensetzung der Spurenelementlösung: 0,15 g/L Na ₂ MoO ₄ x 2 H ₂ 0, 2,5 g/L H ₃ BO ₃ , 0,7 g/L C0CI ₂ x 6 H ₂ O, 0,25 g/L CuSO ₄ x 5 H ₂ 0, 1,6 g/L MnCl ₂ x 4 H ₂ O, 0,3 g/L ZnSO ₄ x 7 H ₂ O.

Die Hauptkultur wurde mit so viel Vorkultur beimpft, dass eine anfängliche Zelldichte OÜ ₆ oo/ml (optischen Dichte der Hauptkul- tur, gemessen bei 600 nm) von 0,025/ml eingestellt wurde. Davon ausgehend wurde der gesamte 30 ml-Ansatz für 24 h bei 30°C und 135 rpm inkubiert.

Nach 24 h wurden Proben entnommen und die Zelldichte OD ₆₀₀ /ml sowie der Gesamtcystein-Gehalt im Kulturüberstand bestimmt, wo- bei zur quantitativen Bestimmung von Cystein der colorimetri- sche Test von Gaitonde (Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J.

104, 627-633) verwendet wurde. Dabei ist zu berücksichtigen, dass dieser Test unter den stark sauren Reaktionsbedingungen nicht zwischen Cystein und dem in EP 0885962 Bl beschriebenen Kondensationsprodukt von Cystein und Pyruvat, der 2-Methyl-thi- azolidin-2,4-Dicarbonsäure (Thiazolidin), unterscheidet. L-Cys- tin, dass entsprechend Gleichung (2) durch Oxidation zweier Cystein-Moleküle entsteht, wird im Test durch Reduktion mit Dithiothreitol in verdünnter Lösung bei pH 8,0 ebenfalls als Cystein nachgewiesen. Die Ergebnisse sind für die genannten E. coli-Stämme in Tabelle 2 und für die P. ananatis-Stämme in Ta- belle 3 angegeben.

Tabelle 2: Zelldichte und Gesamt-Cysteingehalt nach einer Kulturzeit von 24 h im Schüttelkolben

Tabelle 3: Zelldichte und Gesamt-Cysteingehalt nach einer Kul- turzeit von 24 h im Schüttelkolben

Beispiel 7: Cystein-Produktion im Fermenter:

Verglichen wurden E. coli W3110 x pCYS, W3110-ppsA-MHI x pCYS und W3110-AppsA x pCYS im Produktionsmaßstab der Fed-Batch Fer- mentation.

Vorkultur 1:

20 ml LB-Medium mit 15 mg/L Tetracyclin wurden in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit dem jeweiligen Stamm beimpft und 7 h auf einem Schüttler (150 rpm, 30°C) inkubiert.

Vorkultur 2:

Anschließend wurde die Vorkultur 1 vollständig in 100 ml SM1- Medium, supplementiert mit 5 g/L Glucose, 5 mg/L Vitamin Bl und 15 mg/L Tetracyclin (Zusammensetzung SMl-Medium siehe Beispiel 6), überführt. Die Kulturen wurden in Erlenmeyerkolben (1 L Volumen) bei 30°C für 17 h bei 150 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler). Nach dieser Inkubation lag die Zelldichte OD ₆₀₀ /ml zwischen 3 und 5.

Hauptkultur:

Die Fermentation wurde in einem Fermenter des Typs „DASGIP ^® Pa- rallel Bioreactor Systems für die Mikrobiologie" der Firma Ep- pendorf durchgeführt. Es wurden Kulturgefäße mit 1,81 Gesamt- volumen verwendet. Das Fermentationsmedium (900 ml) enthielt 15 g/L Glucose, 10 g/L Trypton (Difco), 5 g/L Hefeextrakt (Difco), 5 g/L (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 1,5 g/L KH ₂ PO ₄ , 0,5 g/L NaCl, 0,3 g/L MgSO ₄ x 7 H ₂ O, 0,015 g/L CaCl ₂ x 2 H ₂ O, 0,075 g/L FeSO ₄ x 7 H ₂ O, 1 g/L Na3Citrat x 2 H ₂ O und 1 ml Spurenelementlösung (siehe Beispiel 6), 0,005 g/L Vitamin Bl und 15 mg/L Tetracyclin.

Der pH-Wert im Fermenter wurde zu Beginn durch Zupumpen einer 25% NH ₄ OH-Lösung auf 6,5 eingestellt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische Korrektur mit 25% NH ₄ OH auf einem Wert von 6,5 gehalten. Zum Animpfen wurden 100 ml der Vorkultur 2 in das Fermentergefäß gepumpt. Das Anfangsvolumen betrug somit etwa 1 L. Die Kulturen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit einer Belüftungsrate von 2 vvm (Vol. Luft pro Vol. Kulturmedium pro min) einer über einen Sterilfilter entkeimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedingungen war die Sauerstoff-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung ka- libriert worden.

Der Soll-Wert für die 0 ₂ -Sättigung während der Fermentation wurde auf 30% eingestellt. Nach Absinken der 0 ₂ -Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die 0 ₂ -Sättigung wieder an den Soll-Wert heranzuführen. Dabei wurde zunächst die Gaszufuhr kontinuierlich erhöht (auf max. 5 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit (auf max. 1.500 rpm) kontinuierlich gesteigert.

Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 30°C durchge- führt. Nach 2 h Fermentationsdauer erfolgte die Zufütterung einer Schwefelquelle in Form einer sterilen 60% (w/v) Stammlö- sung von Natrium-Thiosulfat x 5 H ₂ O mit einer Rate von 1,5 ml pro Stunde.

Sobald der Glucose-Gehalt im Fermenter von anfänglich 15 g/L auf ca. 2 g/L abgesunken war, erfolgte eine kontinuierliche Zu- dosierung einer 56% (w/w) Glucose-Lösung. Die Fütterungsrate wurde so eingestellt, dass die Glucosekonzentration im Fermen- ter 2 g/L fortan nicht mehr überstieg. Die Glucose-Bestimmung erfolgte mit einem Glucoseanalysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA).

Die Fermentationsdauer betrug 48 h. Danach wurden Proben vom Fermentationsansatz entnommen und der Gehalt von L-Cystein und den davon abgeleiteten Derivaten im Kulturüberstand (v.a. L- Cystein und Thiazolidin) und im Niederschlag (L-Cystin) jeweils getrennt voneinander bestimmt. Zu diesem Zweck wurde jeweils der colorimetrische Test von Gaitonde verwendet (Gaitonde, M.K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633). Das im Niederschlag befind- liche L-Cystin musste zuerst in 8% (v/v) Salzsäure aufgelöst werden, bevor es auf dieselbe Art quantifiziert werden konnte. Schließlich wurde die Gesamtmenge Cystein als Summe aus Cystein im Pellet und im Überstand bestimmt.

Wie in Tabelle 4 zusammengefasst, war die Zelldichte OD ₆₀₀ /ml der untersuchten Stämme vergleichbar, wenn auch etwas höher für den Kontrollstamm W3110 x pCYS . Die Cystein-Volumenproduktion (in g/L) hingegen war sowohl in W3110-ppsA-MHI x pCYS wie in W3110-AppsA x pCYS signifikant höher (ca. Faktor 3) als im Kon- trollstamm W3110 x pCYS mit dem Wildtyp ppsA Gen.

Unter den kontrollierten Bedingungen einer Fermentation ergibt sich für den Produktionsmaßstab somit das bisher nicht be- schriebene und aufgrund des Stands der Technik für den Fachmann auch nicht erwartete Resultat, dass eine Aktivitätsabschwächung oder auch Inaktivierung der ppsA Enzymaktivtät zu einer signi- fikant verbesserten Cystein Produktion führt und somit eine ge- eignete Maßnahme zur Stammverbesserung ist. Tabelle 4: Zelldichte und Gesamt-Cysteingehalt nach einer Kul- turzeit von 24 h im Fermenter

In den Figuren verwendete Abkürzungen: bla: Gen, das Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht (ß-Lacta- mase) rrnB term: rrnB-Terminator für die Transkription kanR: Gen, das Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht

ORI : Replikationsursprung („origin of replication") pr-1: Bindungsstelle 1 für Primer pr-2: Bindungsstelle 2 für Primer

FRT1: Erkennungssequenz 1 für FLP Recombinase

FRT2: Erkennungssequenz 2 für FLP Recombinase araC: araC-Gen (Repressorgen)

P araC: Promotor des araC-Gens

P araB: Promotor des araB-Gens

Garn: Lambda Phage Gam-Rekombinationsgen

Bet: Lambda Phage Bet-Rekombinationsgen

Exo: Lambda Phage Exo-Rekombinationsgen

ORI101: Temperatur-sensitiver Replikationsursprung

RepA: Gen für das Plasmid-Replikationsprotein A sacB: Levansucrase-Gen pr-f: Bindungsstelle f für Primer (vorwärts) pr-r: Bindungsstelle r für Primer (revers)

OriC: Replikationsursprung C

IHF: Bindungsstelle für DNS-Bindeprotein IHF („Integration Host Factor")

CamR: Gen, das Resistenz gegen Chloramphenicol verleiht TetR: Gen, das Resistenz gegen Tetracyclin verleiht P15A ORI: Replikationsursprung