CARACTERÍSTICAS INMUNOMODULADORAS.

Sector Técnico

La presente tecnología puede ser utilizada en la industria veterinaria, sin embargo no se limita a una especie particular, sino que es transversal a cualquier especie de mamíferos, eventualmente podría ser utilizada en el área de salud humana. Como resultado de la misma, se obtendrá un fenotipo celular inmunocompetente, que permitirá su uso en terapias alogénicas (entre individuos distintos).

Técnica Anterior

Muchas dolencias de animales no pueden ser tratadas de forma eficaz con las tecnologías convencionales actuales basadas en fármacos y requieren enfoques terapéuticos novedosos. Lo anterior se puede ¡lustrar con datos concretos: el 50% de los caballos de deporte en Chile (rodeo, salto o carrera) sufren lesiones músculo esqueléticas, la mayoría (56%) de ellas no se solucionan o se vuelven crónicas, debido a la ineficacia de los métodos convencionales para tratar dichas lesiones y sólo el 27% retorna a competencias. Cerca del 25% de las yeguas de criaderos (Harás) no logran reproducirse por lesiones fibróticas/degenerativas del útero para las cuales no existe tratamiento efectivo hoy en día. El desarrollo reciente a nivel mundial, de terapias de regeneración tisular basadas en el tratamiento de las lesiones músculo esqueléticas con células madre solas o en combinación con factores de crecimiento (propios o exógenos) y biomatrices comerciales, abre la oportunidad de introducir dichas terapias a diferentes disciplinas ecuestres, aportando un enfoque multifactorial, novedoso y de gran eficacia, para el tratamiento y la cura de las lesiones anteriormente mencionadas. Estudios publicados en la literatura mundial concerniente al uso de células madre para el tratamiento de lesiones músculo-esqueléticas de caballos de carreras muestran que alrededor del 70% de los caballos con lesiones moderadas a severas ha logrado volver a los resultados competitivos pre-lesión, con una tasa de repetición de la lesión tan baja como el 17%.

Hoy en día un gran número de mascotas son tratadas como un miembro más de la familia a la que pertenecen, por lo cual, la mejora de sus cuidados, expectativa y calidad de vida se han visto incrementados en los últimos años. Muchos de estos animales presentan durante su cada vez más larga vida, problemas de salud que no son curados con medicamentos o procedimientos convencionales, destacando entre otros: problemas articulares (osteoartritis/artrosis), fístulas peri-anales, quemaduras de distintos grados, nefropatías, ceguera. Estudios iniciales han demostrado que la administración i ntra -articular de células madre incrementa la calidad de vida en más del 80% de los perros tratados, disminuyendo significativamente el dolor y completamente el uso de AINES (antiinflamatorios no esteroideos) en un 34% de los perros tratados.

Las células estromales multipotentes son conocidas comúnmente como células madre mesenquimales (MSC por su acrónimo en inglés acuñado por Horwitz y cois, en 2005). Las MSCs son poblaciones de células progenitoras de origen estromal, dotadas de capacidad diferenciadora a múltiples linajes dentro de la estirpe mesodérmica y poseedoras de una extraordinaria capacidad inmunomoduladora tanto in vitro, como in vivo. Las terapias basadas en MSCs constituyen una prometedora herramienta para el tratamiento de un amplio rango de enfermedades degenerativas e inflamatorias, tanto de seres humanos, como de animales. Las MSCs son usadas en bioingeniería tisular fundamentalmente por su capacidad de diferenciación a osteoblastos, condrocitos, tenocitos y adipocitos in vitro e in vivo. La extensa actividad investigativa sobre el tema ha llevado a que numerosos laboratorios en el mundo utilicen distintos métodos para aislar, expandir, caracterizar, diferenciar in vitro y administrar a pacientes las células con potencial terapéutico, lo que dificulta la comparación y evaluación de los resultados publicados.

La International Society for Cellular Therapy (ISCT) ha colegiado los criterios mínimos estandarizados para definir las MSCs humanas, que incluyen: i) las células deben ser adherentes en plástico, ¡i) deben ser positivas para los marcadores de superficie CD105, CD73 and CD90 y negativas para los marcadores de superficie CD45, CD34, CD14, CDllb, CD79a y CD19, así como para el receptor de superficie del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) del tipo II HLA-DR y iii) mostrar tri-potencia diferenciativa in vitro a osteoblastos, adipocitos y condrocitos (Horwitz et al., 2005; Ranera et al., 2011). No existe una sistemática similar para MSCs de animales.

En contraposición al lento transcurrir de las aplicaciones de terapias con MSCs en seres humanos, la situación de liberalización y de ausencia de un ambiente regulatorio, llevó a un rápido traspaso de las investigaciones de laboratorio, a pruebas en animales de terapias regenerativas basadas en células madre en el ámbito veterinario, la revista Nature ha clasificado esto como el boom de las terapias regenerativas en las clínicas veterinarias (Cyranoski, 2013). Desafortunadamente esto ha ocurrido sin que existan evidencias clínicamente comprobadas en estudios a doble ciego de la mayoría de los tratamientos usados. Hasta la fecha sólo 3 estudios, uno de ellos a doble ciegas han sido publicados en el ámbito de la bioingeniería tisular veterinaria, con resultados concisos y rigurosamente documentados: i) estudio en 21 perros que demostró mejoras sustanciales en el tratamiento de osteoartirtis (Black et al., 2007); ¡i) inyección de MSCs ayudó a la regeneración de huesos de la extremidades posteriores en 12 caballos con fracturas (Fortier et al., 2011) y Ni) las MSCs de médula ósea evitaron la recidiva de la lesión de tendones en caballos de carrera (Godwin et al., 2012).

Las MSCs fueron descritas por primera vez por Friedenstein y cois, en 1966 en la médula ósea de ratones y fueron aplicadas en la medicina veterinaria por primera vez por Herthel en 2001 en el tratamiento de caballos con desmitis de los ligamentos suspensorios. En la actualidad se han aislado MSCs de múltiples tejidos, como médula ósea, cordón umbilical (tanto sangre de cordón, como de la gelatina de Wharton), tejido adiposo subcutáneo, endometrio de ratones, humanos, vacas, músculo, piel, sangre menstrual, dientes de leche y muelas del juicio, pericitos, cartílago articular, placenta entre otros tejidos (Alviano, et al., 2007; Bianco et al., 2008; Rebelatto et al., 2008; Cabezas et al., 2014, Gargett 2007). Las MSCs aisladas pueden ser cultivadas in vitro, manteniendo el fenotipo indiferenciado y la auto renovación, y son capaces de diferenciarse in vitro ante estímulos apropiados, no sólo a linaje mesodérmico, sino que también a hepatocitos, neuronas, células de tejido muscular, tejido beta -pancreático o células epiteliales en dependencia del estímulo y del microambiente (Hoffmann et al., 2006; Violini et al., 2009; Kocaefe et al., 2010; Vater et al., 2011).

Al ser aisladas de los distintos nichos fisiológicos mediante metodologías convencionales de cultivos celulares, las poblaciones resultantes, aun cuando expresen los marcadores mencionados, son poblaciones mixtas, en las cuales conviven células incluso de distintos orígenes ontogénicos (epiteliales y estromales por ejemplo). La ausencia de un marcador único, exclusivo de MSCs hace difícil la separación confiable de poblaciones puras de células madre. No obstante, se han empleado distintos marcadores como CD90 y el CD271 para separar mediante una clasificación de células con anticuerpos monoclonales acoplados a perlas magnéticas, poblaciones específicas células (Bühring et al., 2007; Watson et al., 2013). Esto es especialmente conflictivo para especies no murinas/humanas.

Las MSCs demandan expansión ex vivo para generar suficientes cantidades tanto para la caracterización, como para los tratamientos en animales o personas. El cultivo in vitro por largos períodos podría eventualmente alterar la calidad de las MSCs, no sólo a nivel de sobrevivencia al mismo, sino en la expresión de marcadores y en la disminución del potencial de diferenciación (Ra et al., 2011), por lo que se requieren de condiciones de buenas prácticas de manejo y de producción, que incluyan condiciones repetibles y verificables de cultivo in vitro y de escalado, sin que se pierdan los atributos esenciales de las MSCs: auto renovación y capacidad de diferenciación. El objetivo de cualquier terapia regenerativa con células madre es aportar una gran cantidad de dichas células en la región de interés (lesión) y que éstas permanezcan y se aniden en el sitio deseado, en donde eventualmente comandarán el proceso de regeneración. Existen tres posibles escenarios para que esto ocurra: i) las MSCs se multiplican en el sitio de la lesión y posteriormente se diferencian al (los) tejido(s) necesario(s), ¡i) las MSCs se diferencian y llevan a cabo su acción biológica o Ni) las MSCs estimulan a otras células (locales o migratorias) para que hagan la acción biológica requerida. En cualquiera de los casos, una importante limitación de las terapias regenerativas lo es la extensiva pérdida de células debido a la interacción con el ambiente inflamatorio local (Gargiolli et al., 2008; Copland et al., 2009; Chavakis et al., 2010). Una posible acción estimuladora o preventiva de esta situación podría ser la manipulación in vitro de las células antes del trasplante, para maximizar las propiedades biológicas y funcionales que garanticen la sobrevida, retención, anidamiento y proliferación (homing) in situ. Esto es conocido actualmente como preacondicionamiento celular (Ma et al., 2013).

La principal propiedad trófica de las MSCs es la secreción de factores de crecimiento y de otras citosinas para inducir esencialmente la proliferación y la angiogénesis, esto se logra a través de la síntesis y excreción de TGF-a, TGF-β, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), EGF, VEGF, FGF-2 angiopoietina-1 e IGF-1 (de Miguel et al., 2012). Sin embargo, los efectos tróficos de las proteínas secretadas se extienden más allá de la proliferación celular y de la angiogénesis e incluyen la reducción de la formación de cicatrices y fibrotización tisular, presumiblemente mediante la estimulación a la secreción local de SDF-1 (stromal cell-derived factor-1) y de proteínas inflamatorias de macrófagos del tipo 1 α y β (Caplan et al., 2011; Lee, 2012). Está firmemente documentada la capacidad inmunoreguladora e inmunosupresiva de las MSCs debido a la baja (o casi nula) expresión de moléculas del complejo MHC-II y de moléculas co-estimuladoras en su superficie (Allison, 2009; Malliaras et al., 2011, Tyndall, 2011). También las MSCs interfieren con distintas rutas de la respuesta inmune mediante la interacción por contacto directo célula-célula y la secreción de factores solubles (Mastri et al., 2014). De igual modo, la activación de los Toll-Like Receptor (TLR) se ha demostrado fundamental para que se ejecuten los cambios funcionales y fenotípicos requeridos para que las MSCs adquieran un estado activo y su respuesta va a estar definida por el ligando, la cinética de unión y la intensidad del estímulo (de la Rosa y Lombardo, 2010). Idealmente un marcador predictivo de la capacidad de inmunomodulación de MSCs sería de gran utilidad para pre-seleccionar in vitro aquellas células y/o tratamientos que garantizarían una apropiada inmunomodulación in vivo al ser administradas las células a pacientes, sin embargo, no existe tal marcador (de Miguel et al., 2012).

In vitro, las MSCs inhiben la proliferación celular de una amplia variedad de células del sistema inmune y pueden incluso detener ciertas funciones en dichas células, tales como la secreción de citosinas y la citotoxicidad de células T y NK respectivamente (de Miguel et al., 2012), así como la maduración de los linfocitos B y la secreción de anticuerpos entre otras funciones (Krampera et al., 2013). Para ello, las MSCs deben ser activadas probablemente por el ambiente inflamatorio en el cual se encuentren. Se conoce que las MSCs secretan moléculas antiinflamatorias en respuesta a los factores de inflamación presentes localmente en los sitios lesionados o que migran a éstos (Murphy et al., 2013). Típicamente, un ambiente inflamatorio conlleva a un desbalance en el patrón de presencia de células T-auxiliadoras (T-helpers; TH) y macrófagos. Las MSCs promueven la transición de células THi a TH ₂ mediante la reducción de la expresión de INF-γ y el aumento en la expresión de citosinas como IL-4 e IL-10 (Mantovani et al., 2004 y 2009). La restauración de este balance ha demostrado ser necesaria para mejorar la regeneración de cartílago, músculo y de otros tejidos blandos, así como para aliviar los síntomas de enfermedades autoinmunes, promoviendo un cambio de macrófagos MI (pro-inflamatorios, anti- angiogénicos e inhibidores del crecimiento tisular) por macrófagos del tipo M2 (antiinflamatorios, pro remodelamiento y estimuladores del crecimiento; (Tollervey et al., 2011; In et al., 2013).

Como se mencionó, las MSCs son una población heterogénea lo que dificulta su caracterización. Una complicación adicional es la proveniencia de tejidos muy distintos (médula ósea y grasa, por ejemplo), por lo que necesariamente contienen poblaciones disímiles de células progenitoras, provenientes de programas de desarrollo embrionario distintos (Krampera et al., 2013). En su nicho fisiológico, las MSCs se encuentran en un estado de reposo tendiente a la represión de sus propiedades biológicas, básicamente en un estado anti-apoptótico y de homeostasis en cuanto a sus propiedades inmunes. Estas propiedades se potencian cuando las células sufren la activación funcional, debido a la exposición a citosinas pro-inflamatorias, como INF-γ, TNF-α, IL-l-a o IL-Ιβ y adquieren un estado inhibitorio de la respuesta inflamatoria, este proceso se conoce con el término de "licensing" (licénciamiento, concesión) de la respuesta inmune (Krampera, 2011; de Miguel et al., 2012). In vitro el licénciamiento recapitula lo que ocurriría in vivo, cuando las MSCs son administradas a pacientes con deregulaciones del sistema inmune (enfermedades autoinmunes) o con inflamación sistémica (Krampera et al., 2013). Por ello, es imprescindible comparar los resultados de la respuesta inmunoreguladora de las MSCs tanto en su estado de reposo, como en el estado activado o licenciado, independientemente del nicho de donde fueron aisladas las células, además para lograr un licénciamiento "puro" es necesario usar sólo inductores purificados de modo que se obtengan respuestas verdaderamente fisiológicas a la presencia de los estímulos. Por ejemplo, es común que muchos grupos induzcan el licénciamiento de MSCs in vitro con fracción de serie blanca sanguínea y no con linfocitos purificados, lo primero comprende otras poblaciones de la serie blanca, como monocitos y neutrófilos, que influyen en la respuesta inmunomoduladora de las células. Este paso es clave para poder llegar a datos confiables que sean después trasladados al uso clínico en seres humanos o animales.

Existen numerosas moléculas que han sido usadas para inducir estado de competencia inmunomoduladora en MSCs humanas, sin embargo, no es posible encontrar similar información para MSCs de uso veterinario, algunas potenciales moléculas con esta característica podrían ser:

Prostaglandina E ₂ (PGE ₂ ), ya que se conoce desde hace mucho tiempo su participación en los procesos inflamatorios, con un rol dual, tanto pro, como antiinflamatorio, en dependencia del tejido en el que se produzca la lesión, así como otras funciones no inmunes (revisado en Kalinski 2012), también es conocido que las MSCs secretan PGE ₂ . Esta molécula estimula su propia síntesis a través de un lazo de autoregulación positivo incrementando la transcripción de COX2 y PGES, a la vez que suprime a los mediadores proinflamatorios agudos (Kalinski 2012). Esto coloca a PGE ₂ en las vías de la inflamación crónica/tardía.

La Sustancia P (SP) fue descubierta en 1931 (von Euler and Gadum), 70 años después es sin dudas el neuropéptido mejor estudiado (revisado en Harrison, 2001). La SP es undecapéptido, de la familia de las taquininas, también denominado neurokinina (NK) con un C-terminus conservado en casi todas las especies de mamíferos, su papel biológico es la transmisión y potenciación de señales excitativas del sistema nociceptivo de las neuronas (Datar et al., 2004), o sea transmisión del dolor. El receptor NK1 tiene una gran afinidad por la SP y su bloqueo se ha usado como diana para el desarrollo de analgésicos (Gobbi et al., 2007). La SP y su receptor NK1 se encuentran ampliamente distribuidos en el sistema nervioso central (Datar et al., 2004). Recientemente se ha demostrado que SP y su receptor se encuentran también en áreas del sistema nervioso central relacionadas con las emociones, el comportamiento, la ansiedad y el estrés, por lo que el rol de la SP se ha ensanchado notoriamente (Ebner y Singewald 2006), siendo importante su papel en varias situaciones fisiológicas como el reflejo del vómito, la contracción muscular, cambios en el tono cardiovascular y vasodilatación entre otros (Hesketh, 2001). En estudios con ratones KO se ha logrado descifrar que la actividad biológica de la SP se lleva a cabo a través de la ruta del óxido nítrico sintetasa (¡NOS; Ziche et al., 1994). La SP ha sido usada in vivo como inductor para atraer células CD29+ a sitios de lesión con resultados positivos en un modelo de quemadura alcalina en ojos de conejo (Hyun-Sook et al., 2008). La oxitocina (OT) es secretada por la neurohipófisis en forma de un neuropeptido secretable con acción exocrina, compuesto por 9 aminoácidos (CYIQNCPLG) con un puente disulfuro que le confiere estabilidad. Su papel en la lactación, parto, estimulación sexual entre otras está ampliamente estudiado (revisado en Gimpl 2001). OT ha sido usada para el preacondicionamiento de varios tipos celulares, confiriéndoles resistencia al estrés oxidativo (Szeto et al., 2012). Otros han inducido la diferenciación de MSCs a cardiomiocitos (Pasquín et al., 2002) y células de endotelio vascular (Cattaneo et al., 2009). Esto puede tener grandes implicaciones para terapias regenerativas, ya que el preacondicionamiento de MSCs con OT puede jugar un papel importante en la optimización de la vascularización y angiogénesis de novo de las células trasplantadas a un ambiente lesionado. La oxitocina ha sido empleada como molécula precondicionante de miocardiocitos in vitro y en modelos de infarto del miocardio en ratones.

La inmensa mayoría de los datos discutidos anteriormente, provienen de estudios en humanos o ratones, los cuales no pueden ser extrapolados literalmente a todos los sistemas celulares y modelos animales, ya que la literatura del tema para animales de granja y/o compañía es muy escasa o prácticamente nula. Sin embargo, las MSCs son usadas cada vez con más frecuencia en la clínica veterinaria, especialmente en caballos y perros y en menor grado en vacas y gatos. Es relevante sobre todo el área equina, especialmente para Suramérica que tiene en Brasil y Argentina una de las masas caballares más grandes del mundo. Chile si bien no llega a las cifras de dichos países, también posee una arraigada tradición de cultura caballar, con Harás e hipódromos de renombre continental. Como se mencionó, es muy poco lo que se ha hecho en MSCs equinas en lo referente a la caracterización de sus propiedades secretoras e inmunomoduladoras, habiendo contradictoriamente, miles de animales siendo tratados con MScs a nivel mundial. Esto puede atentar contra el uso futuro de las MSCs, ya que del mismo modo que ha sucedido para humanos, resulta imposible analizar los datos clínicos de los distintos ensayos a la luz de los diferentes protocolos de obtención y uso de las MSCs, lo propio sucede en perros, en donde la caracterización es aún menor.

A la luz de lo anterior, la generación de MSC de calidad GMP (good manufacturing procedures) debe ser validada tanto en células madre en "reposo" o sea sin exposición a estímulos, como en células estimuladas o "primed" en función de su uso clínico previsto. Por estos motivos, emerge con claridad la necesidad, dada la inmensa plasticidad trófica y habilidad de las MSCs de modular la actividad de las células del sistema inmune, de una evaluación de sus propiedades inmunoregulatorias que vaya más allá de la especulación y de la búsqueda de conocimientos biológicos, y que se convierta en la base de investigación requerida para el uso clínico de estas células en tratamientos regenerativos e inmunomoduladores.

Este problema es, como se mencionó, global o macro y no tiene solución efectiva hoy en día, siendo la mayor esperanza el uso de terapias regenerativas basadas en células madre. Si bien se han logrado avances en modelos celulares y ensayos preclínicos animales, así como en ensayos clínicos en humanos, con células madre de diversas procedencias, también han comenzado a evidenciarse otros problemas, más concretos que dan al traste con terapias de regeneración realmente eficaces y efectivas, el principal problema (localizado o micro) del uso terapéutico de las células madre en la actualidad es la inconsistencia en la potencia de los tratamientos con ellas y el temor al rechazo inmune de los tratamientos heterólogos (con células no del mismo paciente), aun siendo alogénicos, es decir de dos individuos de una misma especie. Ha sido reconocido de manera precisa en la literatura actual que la principal causa de la falla de los tratamientos, es la baja (o ausente) capacidad inmunomoduladora de las células madre que se administra a los pacientes. Al emplearse células del propio animal, se presentan tres problemas: i) se necesita un tiempo no menor entre la toma de muestras y el uso de las células; ¡i) no se pueden hacer estudios de caracterización de la respuesta inmune de estas células en los pacientes y Ni) no se pueden caracterizar adecuadamente dichas células en términos de sus marcadores, características, propiedades biológicas y potencia, dada la necesidad de cultivar, expandir y administrar las células a los pacientes en el menor lapso de tiempo posible. La situación seria diferente con un banco de células de los pacientes o con el uso de células de otros animales donantes. A manera de resumen, el problema global o macro, es la alta incidencia de enfermedades degenerativas en animales, que no pueden ser curadas eficazmente con los métodos actuales.

Por otro lado, no se debe sobredimensionar el valor de las células autólogas, como se ha venido haciendo en la práctica clínica en humanos, ya que cada vez son más las evidencias de que el sexo, edad y estado de salud del donante, pueden ser tan o más críticos que la fuente de donde se obtuvieron las células madre. En la actualidad, se ha demostrado por ejemplo que pacientes ancianos presentan un declive marcado en la cantidad y calidad de las células madre hematopoyéticas, de igual modo, se ha visto que la diabetes impacta negativamente en la capacidad angiogénica y el potencial terapéutico de células madre. En adición, ciertos defectos genéticos impiden el uso de células madre propias, al estar presentes en las células también. Debido a estos y otros factores no menores como la inmediatez con la que se pueden requerir las células autólogas (por ejemplo, ante un infarto agudo de miocardio) y la demora en obtenerlas y expandirlas del propio paciente, es que la tendencia de las investigaciones y finalmente del mercado se orienta hacia las células y terapias alogénicas.

La situación descrita anteriormente no es exclusiva para las terapias en seres humanos, sino que es también crítica en el área veterinaria, sobre todo en equinos en donde la aprensión de los dueños por que los posibles riesgos para sus animales sean cero (absoluto) es muy grande y en donde las consideraciones estéticas no son menores. En nuestra experiencia obteniendo células madre de tejido adiposo, hemos constatado que caballos de deporte o feria, que podrían beneficiarse de una terapia con dichas células no la reciben por la negativa de los dueños a que quede visible, la cicatriz que eventualmente (ya que no sucede en la mayoría de los casos) pudiera dejar una incisión mínima requerida para obtener la grasa. Todos estos problemas, que también son comunes en mascotas, pueden solucionarse con el uso de terapias alogénicas. Dentro de las ventajas de las terapias alogénicas están la implementación de buenas prácticas de producción (GMP) que garantizan lotes estandarizados de células con actividad biológica (potencia y capacidad inmunomoduladora comprobadas), estables desde el punto de vista cromosómico, seguras desde el punto de vista microbiologico y disponibles "off-the-shelf" o sea de inmediato, pues estarían guardadas en criogenia. Un punto a tener en cuenta, es la posible existencia de efectos indeseados a futuro, pues hoy en día no se conocen los efectos a largo plazo como incidencia de tumores, por ejemplo, ya que recién comienza esta tecnología a estar disponible. Breve descripción de las figuras

Figura 1: Morfología representativa de las células obtenidas con esta tecnología.

Figura 2: Diferenciación de células mesenquimales obtenidas con esta tecnología.

Figura 3: Capacidad de inhibición de la proliferación de linfocitos heterólogos después del enfrentamiento a MSCs preacondicionadas.

Figura 4: Panel de inducción de ROS en linfocitos inducidos y enfrentados a MSCs preacondicionadas.

Figura 5: Expresión relativa de marcadores de inflamación en células tratadas. Divulgación de la Invención

La presente tecnología corresponde a un proceso de preacondicionamiento celular in vitro para la obtención de células madre mesenquimales (MSCs) con características inmumoduladoras, lo que permite que estas células no sean rechazadas por el organismo receptor de ellas. La tecnología descrita a continuación no se limita a una especie particular, sino que es transversal a cualquier especie de mamíferos humanos y no humanos. Como resultado de la misma, se obtendrá un fenotipo celular i nmunocom pétente, que permitirá su uso en terapias alogénicas (entre individuos distintos).

Esta tecnología propone el uso de 3 moléculas con potencial de inducción de inmunocompetencia en las MSCs, dichas moléculas son: Prostaglandina E ₂ , sustancia P y oxitocina.

El proceso de preacondicionamiento comprende las siguientes etapas:

a) obtención de las MSCs a partir de tejidos de animales donantes (biopsias); b) transporte y procesamiento de las biopsias;

c) desarrollo de los cultivos mediante incubación a 39°C con 5% de C0 ₂ ; d) determinación de la viabilidad de las células;

e) análisis de los marcadores de superficie para MSC;

f) preacondicionamiento de las células, caracterizadas anteriormente, con Sustancia P, PGE2, Oxitocina y/o a sus combinaciones; además de condiciones de tensión de oxígeno atmosférico (normoxia) y/o hipoxia;

g) constatación de la adquisición del fenotipo inmunomodulador; y

h) uso de las células precondicionadas, directamente en pacientes o congeladas para uso futuro. El proceso comienza con la obtención de las MSCs a partir de tejidos de animales donantes, como tejido graso, endometrial, médula ósea, gingiva, dientes, placenta, cordón umbilical o tejidos adyacentes o componentes del mismo, pero no excluye otros no mencionados. La obtención de los tejidos en cuestión, puede realizarse desde individuos vivos o cadáveres, utilizando siempre un protocolo aséptico y bajo anestésico local en el caso de individuos vivos, la cantidad de tejido obtenido debe estar en el rango de los 15 a 20 gramos de tejido original, especialmente graso y al menos 1 gramo para otras fuentes, en particular para el endometrio.

En ambos casos, el tejido extraído es colocado en un tubo con medio EBSS (Earle's Balanced Salt Solution) a temperatura ambiente. El tiempo máximo para transportar las muestras desde el sitio de trabajo hasta el laboratorio es de menos de 2 horas.

Las biopsias son calentadas por 10-15 minutos a 37°C en baño María dentro de tubos que contienen EBSS, los tejidos son cortados manualmente en pequeños trozos menores a 1 mm y lavados cinco veces en EBSS suplementado con 10 unidades/mL de penicilina, lOpg/mL de estreptomicina y 0,25pg/mL del antimicótico fungizona. Después del lavado final, las muestras son transferidas usando pinzas estériles a tubos con 1 mi de medio de cultivo DMEM/F12 enriquecido con 10% de suero fetal bovino y l-2,5mg/ml de Colagenasa tipo I e incubados por 8-18 horas a 39°C en una plataforma balanceadora para tubos Falcon, según Houck et ¿9/(1994).

Después de pasado el periodo de tiempo en incubación, la solución se mezcla vigorosamente por pipeteo y se le deja sedimentar. El sobrenadante es cuidadosamente removido y sembrado en placas plásticas de 24 pocilios a un volumen final de 2 mi de medio DMEM/F12 que contiene 30% de suero fetal bovino, 10 ng/ml de rEGF, lmM de piruvato, 2 mM de L-glutamina, aminoácidos esenciales y no esenciales (dilución final IX) y antibiótico- antimicótico IX. Los cultivos se desarrollan mediante incubación a 39°C con 5% de C0 ₂ . Durante el tiempo de cultivo se realizan recambios periódicos de medio de cultivo en las placas de cultivo cada 3 días. Las células se pueden mantener en cultivo por al menos 20 pases sin detrimento de su viabilidad y funcionalidad. No obstante, se congelan en pases tempranos para contar con resguardos congelados de éstas.

Para determinar la viabilidad de las células obtenidas se usan dos métodos complementarios: 1) detección cuantificable por tinción con Azul de Alamar y 2) potencial proliferativo. El primero se usa para tener un dato exacto del número y proporción de células viables en el cultivo, mientras que el segundo permite cuantificar el potencial de multiplicación o sea la viabilidad a futuro. Una vez obtenidas las células y determinada su viabilidad, las mismas se someten al análisis de los marcadores de superficie para MSC, mediante citometría de flujo. En el caso de esta invención se utilizan los siguientes marcadores para la especie equina: CD44, CD79, CD90 y MHC1, debiendo ser positivas a los mismos, así como CD34, CD45 y MHC2, debiendo ser negativas a los mismos. Para otras especies animales, los marcadores pueden no necesariamente ser los mismos, sí se requiere la identificación de un set de marcadores positivos y otros negativos según la especie de la cual se obtienen las MSCs, a manera de consenso deben ser positivas las células de cualquier especie para al menos: CD44, CD90 y MHC1 y obligatoriamente negativos para CD34, CD45 y MHC2, pudiendo haber más marcadores en dependencia de la especie y de la literaturta existente para la misma. Los marcadores nombrados anteriormente permiten afirmar la existencia de una población de células madre mesenquimales en el cultivo.

Como requisito común, para las células de cualquier especie, éstas tienen que diferenciarse in vitro a osteoblastos, adipocitos y condrocitos una vez inducidas con los inductores descritos para cada estirpe.

Las células caracterizadas de la manera descrita anteriormente son expuestas o precondicionadas a Sustancia P, PGE2, Oxitocina y/o a sus combinaciones. La mejor combinación que resultó en los experimentos de esta invención estuvo compuesta por PGE2 y Sustancia P en las proporciones y condiciones que se mencionan más abajo para que adquieran un potencial inmunomodulado y sean invisibles al sistema inmune.

Para dotar a las MSC de un fenotipo inmunomodulador en esta invención se usan tres (3) moléculas ya sea separadas, o en combinación. Los detalles se listan a continuación.

Molécula 1. Prostaglandina E2 (PGE2) a una concentración final de 3 μΜ

Molécula 2. Sustancia P (SP) a una concentración final de 100 nM

Molécula 3. Oxitocina (OXT) a una concentración final de 10 nM

Para cada una de las moléculas usadas por separado, se agregan al medio de cultivo estándar final (DMEM). La inducción (duración de las sustancias en dicho medio) es de 24 horas.

Es posible usar combinaciones de las moléculas manteniendo las concentraciones indicadas arriba. Se usan las 4 posibles combinaciones, a saber: 1) PGE ₂ + SP; 2) PGE ₂ + OXT; 3) PGE ₂ + SP + OXT; 4) SP + OXT; 5). La combinación con los mejores resultados es la compuesta por PGE2 y Sustancia P. Adicionalmente el protocolo establecido en el marco de esta invención contempla el uso de las moléculas individuales o las combinaciones en condiciones de tensión de oxígeno atmosférico (normoxia) y/o hipoxia, que contempla la reducción de la tensión de oxígeno atmosférico del 20% al 1, 2, 3, 4 ó 5% de 0 ₂ .

Las células expuestas a la(s) molécula(s) y condiciones de tensión de oxígeno descritas anteriormente por 24 horas, son analizadas para constatar la adquisición del fenotipo inmunomodulador que se expresa esencialmente en su capacidad de impedir la proliferación in vitro de linfocitos previamente estimulados a multiplicarse. Esto constituye una etapa de validación de la tecnología descrita.

Una vez precondicionadas, las células pueden ser usadas directamente en pacientes o congeladas para uso futuro. En el segundo caso, existen dos opciones: 1) su descongelación y aplicación directa sin expansión en cultivo in vitra, 2) expansión in vitro después de la descongelación. Para esta segunda opción es necesario repetir el procedimiento listado anteriormente.

Las células resultantes de este protocolo permiten su administración intralesionalmente o de modo sistémico a animales de modo heterólogo, es decir, células de un animal donante a otro receptor, en cantidades y por vías que vanarán en dependencia de la lesión a tratar.

La modulación de la respuesta inmunoreguladora de las células madre permitiría en principio, acceder a tratamientos alogénicos, sin que hubiese rechazo inmune, con los consiguientes beneficios regúlatenos, de costos y de uso que esto implica.

La utilización de este procedimiento permite contar con células madre capaces de ser toleradas por el sistema inmune de cualquier paciente, sin que mediase rechazo y con un nivel de potencia (equivalente en términos biológicos a garantía de éxito en el tratamiento) consistente y por ende efectivo. A través de este protocolo se generarán modelos celulares de utilidad no solo para una especie y una patología en particular, sino para otras especies y enfermedades, incluso como modelo de ensayo para futuras aplicaciones traslacionales a seres humanos.

El futuro de las terapias de bioingeniería tisular o regenerativas pasa en gran medida por el establecimiento de metodologías que permitan obtener ya sea de forma natural o inducida, células madre adultas capaces de modular su repertorio de marcadores de superficie y de factores secretables de modo que no generen respuesta inmune una vez trasladadas a los pacientes con lesiones degenerativas, este fenómeno se denomina inmunomodulación y como producto se obtendrían células útiles para terapias alogénicas, (no autólogas), siendo la gran diferencia, que las primeras son de individuos distintos de una misma especie, mientras que las segundas son células obtenidas del propio paciente. Las ventajas sobresalientes de nuestra tecnología versus lo que existe hoy en día se resume en: 1) ofrece una alternativa tecnológica a la disponibilidad de células madre alogénicas para los dueños de animales, tanto de granja, deporte, afectivos o silvestres, 2) profundiza en la dilucidación de los mecanismos moleculares que facilitan o potencian la diferenciación funcional de células madre in vitro y por ende in vivo, 3) ofrece un proceso escalado para la producción incrementada de células madre, 4) incorpora moléculas novedosas al tratamiento con células madre y 5) ofrece un enfoque integral del problema de las lesiones y su solución. Ejemplos de aplicación

Ejemplo 1: Preacondicionamiento de células madre mesenquimales equinas con las moléculas por separado y en sus combinaciones.

El proceso comenzó con la obtención de las MSCs a partir de tejidos de animales donantes, en el caso preciso de esta invención, se usaron células provenientes de 6 caballos deportistas con lesiones músculo-esqueléticas que llegaron a la clínica veterinaria de la Universidad de Concepción por dichos motivos.

El tejido se obtuvo mediante cirugía menor de la grupa de animales de la cual se extrajeron de modo estéril 15 gramos de grasa subcutánea. También en el caso de individuos del sexo femenino (8 yeguas), esta invención refiere a la obtención de biopsia del endometrio uterino, mediante pinzas especializadas con un protocolo aséptico y bajo anestésico local.

En ambos casos, el tejido extraído fue colocado en un tubo con EBSS a temperatura ambiente. El tiempo máximo de transporte de las muestras desde el sitio de trabajo hasta el laboratorio fue menor a 2 horas.

Las biopsias fueron calentadas dentro de tubos que contenían EBSS por 10 minutos a 37°C en baño María, los tejidos fueron cortados manualmente en pequeños trozos menores a 1 mm y lavados cinco veces en EBSS suplementado con antibióticos y antimicóticos a una concentración final de IX. Después del lavado final, las muestras fueron transferidas usando pinzas estériles a tubos con 1 mi de medio de cultivo DMEM/F12 enriquecido con 10% de suero fetal bovino y lmg/ml de Colagenasa tipo I e incubados por 18 horas a 39°C en una plataforma balanceadora para tubos Falcon.

Después de pasado el período de tiempo en incubación, la solución se mezcló vigorosamente por pipeteo y se le dejó sedimentar. El sobrenadante fue cuidadosamente removido y sembrado en placas plásticas de 24 pocilios (Nuclon™ Inc., Dinamarca) a un volumen final de 2 mi de medio DMEM/F12 conteniendo 30% de suero fetal bovino, 10 ng/ml de rEGF, lmM de piruvato, 2 mM de L-glutamina, aminoácidos esenciales y no esenciales (dilución final IX) y antibiótico-antimicótico IX. Los cultivos se desarrollaron mediante incubación a 39°C con 5% de C0 ₂ . Durante el tiempo de cultivo se hicieron recambios periódicos de medio de cultivo en las placas de cultivo cada 3 días. En la figura 1 se muestra la morfología representativa de los cultivos obtenidos desde las muestras de los 6 caballos identificados por sus nombres comunes (A) Caballo Ortiz, (B) Destacado; (C) Maihue; (D) Estrellón; (E) Euro; y (F) Caballo Nuevo.

La medición del porcentaje de viabilidad celular se realizó a través de un conteo de exclusión por muerte con azul de tripan 0,4% con 90-100% confluencia (tripsina EDTA 2 min). El cual consiste en esencia, en comparar el número de células vivas y muertas después de haberlas desprendido de la placa y contadas posteriormente con un contador automático Luna II (Seoul, Corea). Para la determinación cuantitativa, se realiza el ensayo de Azul de Alamar. Los resultados de los ensayos de viabilidad, fueron de 95±4% en promedio para los 6 animales ensayados.

Posteriormente las células se diferenciaron in vitro para demostrar que eran células madre, a través del siguiente diseño experimental: se dispusieron de 60000 cel/mm2 en 3 placas de cultivo de 12 pocilios, donde cada columna correspondía a una condición de diferenciación: condrogénica, osteogénica, adipogénica, con sus respectivos controles negativos. Todas las diferenciaciones se realizaron por triplicado, para cada equino, donde las células de cada placa se mantuvieron en cultivo por 7, 14 y 21 días respectivamente. Como control positivo se utilizó una línea celular comercial de células derivadas de tejido adiposo humanas (STEMPRO® Human Adipose Derived Stem Cells, Invitrogen™).

Para las células sometidas a diferenciación se utilizó un medio comercial STEMPRO® de Gibco. En la diferenciación osteogénica y condrogénica se utilizó el medio base

Osteocyte/chondrocyte diferentiation basal médium (STEMPRO® de Gibco) y para la diferenciación adipogénica se utilizó el medio base Adipocyte diferentiation basal médium

(STEMPRO® de Gibco). Estos medios base fueron suplementados con aditivos comerciales que son específicos para cada tipo de diferenciación, en el caso de osteogénesis (STEMPRO® Osteogénesis Supplement), condrogénesis (STEMPRO® Chondrogenesis

Supplement) y adipogénesis (STEPRO® Adipogenesis Supplement). Las células después de haber sido sometidas a diferenciación, fueron fijadas y teñidas con sus respectivas tinciones, Alcian blue para condrogénesis, Alizarin red para osteogénesis y Oil red para adipogénesis.

Las células a partir del día 14 post inducción, comenzaron a mostrar patrones morfológicos que no eran fibroblastoides respecto a sus controles negativos (células a las que se les aplicó solo medio base suplementado con 10% de SFB). Al finalizar el ensayo, todas las células equinas resultaron positivas para osteogénesis, adipogénesis y condrogenesis, no así sus respectivos controles negativos. En la Figura 2 Se muestran los resultados representativos de esta diferenciación, donde: a y b) osteoblastos con tinción de Alizarina Roja; c y d) Células adiposas con tinción de Aceite rojo; e y f) a condrocitos con tinción Azul de Alcián, nótese la formación de estructura tridimensional; g y h) células controles.

Posteriormente, se realizó la evaluación del patrón inmunofenotípico de las MSC equinas, para lo cual se analizó la positividad para marcadores de multi potencia: CD29, CD44, CD90 y MHC tipo I y marcadores negativos, CD45 y MHC tipo II. También se evaluaron (no en todos) marcadores asociados a pluripotencia como OCT4 y SOX2. Como control interno se utilizó el isotipo correspondiente a cada anticuerpo, siendo IgGlk e IgG2a.

El panel de anticuerpos utilizados para realizar la citometría de flujo esta descrito en la Tabla 1. Tabla 1: Panel de anticuerpos utilizados en la citometría de flujo.

Anticuerpo Especificidad Tipo Empresa

Ratón anti caballo CD44:RPE CD44 Monoclonal ABD

PE ratón anti humano CD90 CD90 Monoclonal BD

Ratón anti caballo MHC clase II Monomórfico:RPE MHC clase II Monomórfico Monoclonal ABD

Ratón anti caballo MHC clase I Monomórfico :RPE MHC clase I Monomórfico Monoclonal ABD

POU5F1 OCT(4) Policlonal Thermo

SOX2 SOX2 Policlonal Thermo

CD45, conjugado PE (EM-5) CD45 Monoclonal Thermo

CD29 CD29 Monoclonal Beckman

Para la medición se utilizó el equino Attune NxT (Invitrogen). La mayor parte de los anticuerpos estaban conjugados con ficoeritrina (exitación a 574±26 nm) el cual fue leído en el canal BL2 (láser azul), mientras que en el caso de OCT4, el anticuerpo secundario está conjugado con Alexa flúor 594 (excitación a 488, emisión a 594 nm), el cual fue leído con el canal BL1. Los resultados de la positividad a todos los marcadores anteriormente mencionados se muestran en la tabla 2, donde se concluye que los cultivos analizados corresponden a células madre mesenquimales multi potentes. Tabla 2: Resultado de la citometría de flujo.

AF CD90 CD44 CD29 MHC I MHC II CD45 IgGlk IgG2a

Caballo 1 0 97,92 96,23 95,44 99,87 8,79 7,55 0,88 22,67

Caballo 2 0 84,96 96,42 94,04 99,56 0,54 2,94 0,17 1,4

Caballo 3 0,1 96,22 91,29 98,42 99,23 0,55 7,6 0 6,59

Caballo 4 0,1 98,91 97,05 99,55 99,42 1,38 1,66 0,07 1,39

Caballo 5 0,3 80,17 87,6 93,8 99,41 1,28 0,39 0,07 2,64

Caballo 6 0 99,72 97,68 99,77 99,9 0,25 0,38 0,11 0,7

Las células caracterizadas en los pasos anteriores fueron sometidas al proceso de preacondicionamiento con las moléculas por separado y en sus combinaciones, tanto en condiciones de normoxia, como hipoxia severa (1%).

Para cada una de las moléculas usadas por separado, se agregaron al medio de cultivo estándar final (DMEM) las siguientes concentraciones: Prostaglandina E2 (PGE2) a una concentración final de 3 μΜ; Sustancia P (SP) a una concentración final de 100 nM; Oxitocina (OXT) a una concentración final de 10 nM. El condicionamiento se llevó a cabo en 5% de C02, 5% de 02 y 90% de N2 (normoxia) o 5% de C02, 1% de 02 y 94% de N2 (hipoxia) por 24 horas, usando mezclas comerciales, con certificiación de la concentración requerida de los gases. Todo esto en incubadora con control de temperatura (39 grados) y de humedad (100%).

Ejemplo 2: Evaluación in vitro de la adquisición de un fenotipo inmunomodulado.

Las células expuestas a la(s) molécula(s) y condiciones de tensión de oxígeno descritas anteriormente por 24 horas, fueron analizadas para constatar la adquisición del fenotipo inmunomodulador que se expresa esencialmente en su capacidad de impedir la proliferación in vitro de linfocitos previamente estimulados a multiplicarse. Esto constituye una etapa de validación de la tecnología descrita.

Una vez concluido el proceso de preacondicionamiento de 24 horas, las células fueron co-cultivadas con linfocitos de caballos no relacionados con las células (alogénicos). Los cuales previamente habían sido estimulados con una batería de mitógenos para determinar cuál inducía una mayor proliferación de los mismos. De este modo, 1 millón de MSCs equinas (de cada uno de los 6 caballos) fueron precondicionadas por 24 horas con cada una de las moléculas, en las concentraciones, tiempo y condiciones listadas anteriormente. En paralelo, 10 millones de linfocitos de sangre periférica de caballos no relacionados fueron estimulados por 24 horas con 1 nM de poli I:C según los experimentos que soportaron la selección de esas condiciones y concentración.

Se co-incubaron las células en placas de cultivo en una proporción de 10 linfocitos por cada 1 célula mensenquimal. Se dejaron en co-cultivo por 4 días. Al cabo de los cuales se colectaron el sobrenadante (linfocitos) y se contó el número de éstos. Como controles, se emplearon linfocitos no expuestos a células, los cuales deberían proliferar durante los 4 días de cultivo, células MSC no precondicionadas, las cuales indicarán el nivel basal de inhibición de la proliferación de los linfocitos y células madre no seleccionadas por nuestros protocolos de purificación, como comparación con la competencia, enfrentadas en la misma proporción de 1: 10 con linfocitos.

Como resultado de esta metodología se logró inhibir el crecimiento de linfocitos alogénicos en todos los tratamientos usados, siendo más notorio el efecto inhibitorio cuando se usó la combinación de PGE ₂ y SP. Los resultados se muestran en la figura 3A donde controles del experimento, de izquierda a derecha: leuco c-: leucocitos no estimulados; Leuco+LPS C+: control positivo de leucocitos estimulados con el mitógeno LPS; Leuco+PHA C+: control positivo de leucocitos estimulados con el mitógeno PHA; Leuco+Poli I:C C+: control positivo de leucocitos estimulados con el mitógeno poli I:C; a partir de esa columna se muestran los grupos de las columnas 2, 3 y 4, pero coincubados con MSC sin precondicionar, para determinar el valor basal de inhibición de crecimiento de los leucocitos. Se seleccionó el mejor mitógeno, Leuco+Poli I:C C+, y se enfrentaron los leucocitos estimulados con él a las MSC condicionadas con cada una de las sustancias y sus combinaciones. En la figura 3B se muestran estos resultados. Controles negativos (última columna; células sin precondicionar). Letras distintas indican diferencias significativas; p<0,05.

Adicionalmente se tomó el sobrenadante de cultivo libre de células y se midió la liberación de especies reactivas de oxígeno, lo cual es un indicador del potencial anti- inflamatorio e inhibitorio de la respuesta inmune. Nuevamente con la combinación de PGE ₂ y SP se obtuvieron los mejores resultados, figura 4.

Finalmente se midió el nivel de citoquinas proinflamatorias generado por las células precondicionadas. Los diferentes gráficos muestran los resultados de expresión de los marcadores de inflamación en células sin purificar, como las usa la competencia, (FVE) y nuestras células (MSC), los diferentes tratamientos fueron: Control (5A), Oxitocina (5B), PGE2 (5C) o su combinación PGE2 + OXT (5D).

Los resultados indican que se disminuye la expresión de citoquinas pro-inflamatorias, particularmente IL-la e IL-6, mientras que se observa un incremento en la expresión del gen que codifica para la enzima PGETS, responsable de la secreción de PGE2. Este fenómeno se observa in vivo, se ha demostrado que es necesario un aumento de PGE2 en el ambiente inflamatorio para que las MSCs adquieran su mayor capacidad inmunomoduladora, lo cual se refleja en la disminución de citoquinas pro-inflamatorias como IL-la e IL-6.

Los datos obtenidos, nos permiten afirmar que en condiciones de cultivo in vitro, las moléculas usadas, así como sus combinaciones impiden la proliferación de linfocitos, disminuyen la liberación de especies reactivas de oxígeno y modulan la liberación de citoquinas proinflamatorias, lo que en resumen les otorga un fenotipo condicionado para la inmunomodulación de respuesta inflamatoria. Ejemplo 3: Inyección de modo alogénico de alta dosis de células precondicionadas a equinos, y evaluación de reactogenicidad y respuesta inflamatoria aguda.

Para demostrar que ese efecto también ocurre in vivo, se cultivaron y precondicionaron con PGE ₂ y SP, células de 3 animales y se hizo un estudio piloto in vivo en 6 yeguas (dos por cada línea celular) que recibieron 20 millones de células de manera subcutánea en la tabla del cuello en un volúmen de inyección de 1 mi. En el lado opuesto del cuello se inyectó sólo vehículo. Se midió la respuesta local a la inyección durante 72 horas, así como se monitorearon los valores de inflamación sistémica en el laboratorio clínico. Como era de esperar, inmediatamente después de la inoculación de las células y durante las primeras 48 horas hay un enrojecimiento de la zona y un leve aumento del área reactogénica, pero esta desaparece a las 72 horas. Los resultados demostraron una total ausencia de respuesta inflamatoria ni local, ni sistémica, la cual era esperada por tratarse de células exógenas a los animales que la recibieron.

De este modo se demostró la adquisición de un fenotipo inmunomodulado o inmunosuprimido de las células precondicionadas por la metodología descrita en esta invención, lo cual es representado en la tabla 3 Tabla 3: Valores de la respuesta local a la inyección durante 72 horas.

Animales Yegua 1 Yegua 2

Tratamiento Control Tratamiento Control

T0 18mm 15mm 12mm 25mm

T24 27mm - 54mm -

T48 24mm - 48mm -

T72 18mm - 13mm -

Ejemplo 4: Inyección de modo alogénico, de alta dosis de células precondicionadas, a equinos con lesiones tendinosas y evaluación de actividad biológica curativa.

Caso 1. Marzo de 2016. Aplicación local eco guiada de células madres en el tendón flexor superficial de un caballo. Ensayo completado el día 22 de marzo del 2016 sin detectar reacción adversa alguna. El caballo retornó a trabajo, lo que indica que remitió de la lesión. Evaluación realizada por el Dr. Cristian Landero. Regimiento de Quillota, Ejército de Chile, V Región. Veinte millones de células del caballo Destacado, precondicionadas con la combinación de las 3 moléculas.

Caso 2. Marzo de 2017. Aplicación intravenosa de 20 millones de células precondicionadas con las 3 moléculas, caballo donante Estrellón. Tratamiento de quemaduras severas y laminitis secundaria. El caballo se sanó totalmente. Regimiento de caballería Tacna, San Bernardo, Región Metropolitana. Médico tratante Paula Inocenti.

Caso 3. Junio de 2017. Aplicación local eco guiada de células madres en el tendón flexor superficial de un caballo del regimiento de Quillota, V Región. El caballo retornó a trabajo, lo que indica que remitió de la lesión. Evaluación realizada por el Dr. Cristian Landero. Regimiento de Quillota, Ejército de Chile, V Región. Veinte millones de células del caballo Estrellón, precondicionadas con la combinación de PGE2 y SP.