DETECTION, IN VITRO, D'ANTICORPS PRODU ITS A LA SU ITE D'U N E INFECTION A LEGIONELLA PNEUMOPHILA

La présente invention concerne un outil de diagnostic sérologique multiparamétrique des infections à Legionella pneumophila.

Plus précisément, l'invention porte sur l'utilisation de polypeptides nouvellement sélectionnés, de polynucléotides codant pour lesdits polypeptides, et d'anticorps correspondants, d'une part, dans le domaine du diagnostic sérologique des infections impliquant Legionella pneumophila et, d'autre part, dans le domaine de la production de vaccins vis-à-vis de cette bactérie.

La légionellose est une infection respiratoire sévère résultant de l'inhalation d'aérosols contaminés par des bactéries à croissance intracellulaire du genre Legionella, et qui se manifestent sous forme sporadique ou épidémique. Cette infection survient aussi bien en ville (infections communautaires) qu'en milieu hospitalier (infections nosocomiales). L'espèce Legionella pneumophila est responsable de 95% de l'ensemble des cas de légionellose.

La lég ionellose se présente principalement comme une infection pulmonaire aiguë. Elle se caractérise par la sévérité du tableau clinique : après une incubation de 2 à 10 jours et un début pseudo-grippal, le malade présente une température élevée, un malaise général, des douleurs abdominales, voire des troubles psychiques. L'atteinte radiologique est souvent bilatérale. La mortalité associée, particulièrement élevée chez certaines personnes dites à risque (sujets âgés ou souffrant d'un cancer, d'une hémopathie), varie de 10 à 20% (10% des 1443 cas recensés en France en 2006). Du fait de l'enjeu thérapeutique évident, il est essentiel de pouvoir poser précocement le diagnostic de légionellose. En effet, les lég ionelles sont insensibles aux bêta-lactamines - qui sont les principaux antibiotiques prescrits en cas de pneumopathie - et il faut avoir recours à un traitement spécifique reposant sur les macrolides (érythromycine) ou les fluoroquinolones. A l'heure actuelle, le diagnostic est réalisé par trois méthodes générales : la mise en évidence des bactéries à partir de prélèvements broncho-pulmonaires (soit directement par immunofluorescence soit par culture sur milieux sélectifs) ; la

détection d'antigènes urinaires spécifiques ; la mise en évidence d'une augmentation significative du titre des anticorps dans le sérum (sérologie).

L'examen direct des prélèvements, réalisé par microscopie à fluorescence, se pratique pour la majorité des réactifs commercialisés, à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux qui reconnaissent l'ensemble des sérogroupes connus de L. pneumophila. Le principal inconvénient de cette technique est sa faible sensibilité. Sa spécificité est également imparfaite (-90%), du fait de réactions immunologiques croisées avec certaines bactéries comme Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis ou Bacteroides fragilis. La culture sur mil ieux spécifiques est la méthode de choix, notamment dans un but épidémiologique (typage des souches), mais donne des résultats tardifs puisque l es l ég i o n e l l es c u l ti ve n t e n 3 à 4 j o u rs , vo i re p l us. La technique d'immunofluorescence indirecte (IFI) est la technique la plus employée pour le diagnostic sérologique (McDade JE, Shepard CC, Fraser DW, Tsai TR, Redus MA et Dowdle WR (1977), Légionnaires' disease : isolation of a bacterium and démonstration of its rôle in other respiratory disease, N Engl J Med. 297 (22) : 1197-203). Environ 70% des diagnostics au niveau européen sont posés par cette méthode.

Les tests urinaires sont rapides et très spécifiques. Néanmoins, leur sensibilité est très variable, de 50-90% ; cette forte variabilité est liée non seulement aux caractéristiques du patient mais aussi au fait que les tests actuels permettent seulement la détection de L. pneumophila de sérogroupe 1. De plus, la cinétique d'apparition et de disparition des antigènes de Legionella dans les urines est aussi très variable selon les patients. Un test positif ne peut pas signer une légionellose en phase aiguë et la rechute ou la récidive ne peuvent pas être évaluées par cette méthode. Enfin, en présence d'une recherche positive d'antigènes urinaires de légionelles, il reste nécessaire de réaliser en parallèle une culture de prélèvements respiratoires pour l'isolement de la bactérie dans un but épidémiologique. Le sérodiagnostic est tout particulièrement utile chez les patients qui ne produisent pas d'expectoration et en cas d'enquête épidémiologique. Il repose sur la mise en évidence d'une augmentation significative du taux des anticorps entre un premier sérum et un sérum prélevé 4 à 6 semaines plus tard. Environ 30% des

cas de lég ionellose sont identifiés par cette méthode à l'heure actuelle. Néanmoins, les antigènes utilisés dans les tests actuels sont constitués de simples extraits préparés directement à partir de culture de légionelles inactivées par la chaleur ou après ensemencement des bactéries dans le sac vitellin d'œufs embryonnés. Les anticorps détectés reconnaissent en majorité des déterminants du lipopolysaccharide (LPS), qui peuvent être proches de déterminants du LPS d'autres bactéries et provoquer des réactions croisées. De fait, des réactions de ce type ont été décrites avec d'autres bactéries à Gram négatif telles que Pseudomonas sp., Bacteroides sp., Bordetella sp. et certaines entérobactéries. Enfin, la plupart des tests actuels permettent seulement la détection d'anticorps de type IgG, ce qui nécessite deux prises de sang à 4-6 semaines d'intervalle pour faire un diagnostic d'infection récente.

En résumé, les pratiques courantes répondent imparfaitement aux attentes médicales pour établir le diagnostic de légionellose. En particulier, les tests sérologiques actuels reposent sur des méthodes de détection anciennes et non automatisables, ou utilisent des antigènes non caractérisés («soupes antigéniques»), dont la spécificité et la sensibilité sont peu satisfaisantes. L'utilisation de la sérologie souffre de très grandes variations selon les malades, les tests basés sur la lecture d'un titre unique précoce possédant des valeurs prédictives positives très faibles de l'ordre de 10-15% (Jarraud S, Reyrolle M et Etienne J. dans Freney J, Renaud F, Hansen W, Bollet C, Précis de bactériologie clinique, éd. ESKA, Paris, 2000).

Il existe donc un très grand besoin dans le domaine du diagnostic sérologique de la légionellose afin de réaliser des tests rapides, peu coûteux et non invasifs, et qui pourrait également permettre un diagnostic plus précoce. Enfin, dans l'avenir, en cas de développement d'approches vaccinales visant à préven ir les infections à Legionella pneumophila, de tels tests seront indispensables pour détecter les échecs de vaccination.

L'inventeur de la présente invention a identifié, de façon tout à fait inattendue, à partir du génome de Legionella pneumophila, de nouveaux polynucléotides et de nouveaux polypeptides dont les utilisations possibles sont décrites ci-après. L'identification de ces polypeptides est le résultat d'un crible et d'études approfondies que les séquences issues des programmes de génomique

de L. pneumophila ne laissaient pas envisager. Les polypeptides ont été sélectionnés spécifiquement pour leurs propriétés antigéniques, parmi nombre d'autres issus de L. pneumophila, dont certains localisés à la surface de la bactérie ou intrinsèques à la membrane et qui se sont avérés non pertinents pour le diagnostic sérologique d'une telle infection. Par exemple, la Déposante connaît des polypeptides issus de L. pneumophila, comme les protéines PAL, RpoS, PpsA, peroxydase catalase recombinants chez E. coli, ou d'autres encore, qui ne permettent pas de diagnostiquer par sérologie une infection à L. pneumophila.

La présente invention a comme objectifs de résoudre les déficiences des tests sérologiques actuels et de permettre une analyse plus précise et plus complète de l'infection grâce à la détection des différents isotypes d'anticorps spécifiques des polypeptides de l'invention particulièrement performants pour le diagnostic d'infection à Legionella, notamment à L. pneumophila.

Description de l'invention Définitions

Les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de certains termes utilisés dans cette description.

On entend par «polynucléotide» , un polyribonucléotide ou un polydésoxyhbonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non.

Le terme polynucléotide inclut, sans limitation, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin, un ADN qui est un mélange de régions simple brin, double brin et/ou triple brin, un ARN simple brin ou double brin, un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin et les molécules hybrides comprenant un ADN et un ARN qui peuvent comprendre des régions simple brin, double brin et/ou triple brin ou un mélange de régions simple brin et double brin. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brin. Les brins, dans de telles régions, peuvent provenir de la même molécule ou de molécules différentes. Par conséquent, les ADN ou ARN, ayant des squelettes modifiés pour la stabilité ou d'autres raisons, sont inclus dans le terme polynucléotide. On entend également par polynucléotide, les ADN et ARN

contenant une ou plusieurs bases modifiées. On entend par «base modifiée», par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine. Le terme polynucléotide vise ég a l e m e n t l e s po l y n u c l éot i d e s d e fo rm e m od i f i é e c h imiquement, enzymatiquement ou métaboliquement. Les polynucléotides comprennent également les polynucléotides courts tels que les oligonucléotides.

On entend par «polypeptide», un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée.

Le terme polypeptide comprend les chaînes courtes, appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et les chaînes longues, appelées protéines.

Un polypeptide peut être composé d'acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits du polypeptide et n'importe où dans le polypeptide : dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou amino-terminales.

Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturels ou synthétiques, qui sont bien connus de l'homme du métier.

On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP-ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés, telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. (PROTEINS

STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) and WoId, F., Posttranslational Protein Modifications : Perspectives and Prospects, pgs 1 -12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODI FICATION OF PROTEI NS, B.C. Johnson , Ed., Académie Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 : 626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis : Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663 : 48-62 (1992)).

Par ailleurs, lorsqu'il est obtenu par voie recombinante le polypeptide selon l'invention comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 et 22, le polypeptide homologue de celui-ci, ou les fragments de ces derniers, tels que définis dans la présente description, peuvent également comprendre des séquences utiles pour la purification des protéines (des étiquettes de purification), telles que des étiquettes polyhistidine, et éventuellement une séquence permettant de cliver ces étiquettes, par exemple des sites de coupures par des protéases.

De préférence, comme on l'entend ici, un polypeptide comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 1 4, 1 6, 1 8, 20 et 22, com prend 350, 400, 500, ou 1 000 acides aminés au maximum. On entend par «isolé», modifié par la main de l'homme à partir de l'état naturel, c'est-à-dire que le polynucléotide ou le polypeptide présent dans la nature a été rendu autre ou séparé de son environnement naturel , ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas «isolé», mais le même polynucléotide ou polypeptide séparé des matériaux qui coexistent avec lui dans son état naturel est «isolé».

On entend pa r « pou rcentag e d ' id e ntité » entre d eux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques, le pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par

«fenêtre de comparaison» pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Cette comparaison peut être réalisée grâce à un programme, par exemple le programme EMBOSS-Needle (alignement global Needleman-Wunsch ) à l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10.0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman, S. B. and Wunsch, CD. (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 et Kruskal, J. B. (1983), An overview of séquence comparison, In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed), Time warps, strind edits and macromolecules : the theory and practice of séquence comparison, pp. 1 -44 Addison Wesley).

Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, notamment en divisant par le nombre total de positions de la plus grande des deux séquences alignées, et en multipliant le résultat obtenu par 100. Un premier polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins

95% avec un second polynucléotide est donc un polynucléotide comportant, au plus, 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à la séquence dudit second polynucléotide. En d'autres termes jusqu'à 5% des nucléotides dudit second polynucléotide peuvent être délétés ou substitués par un autre nucléotide, ou ledit premier polynucléotide peut comporter jusqu'à 5% de nucléotides en plus par rapport au nombre total de nucléotides du second polynucléotide. Ces modifications peuvent être positionnées aux extrémités 3' et/ou 5', ou à un endroit quelconque entre ces extrémités, en un seul ou plusieurs emplacements.

Par analogie, un premier polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec un second polypeptide est un polypeptide comportant, au plus, 5 acides aminés modifiés sur 100 acides aminés, par rapport à la séquence dudit second polypeptide. En d'autres termes, jusqu'à 5% des acides aminés dudit second polypeptide peuvent être délétés ou substitués par d'autres acides aminés, ou ledit premier polypeptide peut comporter jusqu'à 5% d'acides aminés en plus par rapport au nombre total d'acides aminés du second polypeptide. Ces modifications peuvent être positionnées aux extrémités amino et/ou carboxy- terminales, ou à un endroit quelconque entre ces positions terminales, en un seul ou plusieurs emplacements (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., éd.,

Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Génome Projects, Smith, D. W., éd., Académie Press, New York, 1993 ; Computer Analysis of Séquence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994 ; Séquence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Académie Press, 1987). On désignera par « polypeptide homologue » d'un polypeptide comprenant ou constitué de SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22, un polypeptide ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité de séquence avec le polypeptide comprenant ou constitué de SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22. On entend par «fragment de polypeptide», un polypeptide comprenant au moins «n» acides aminés consécutifs issus des polypeptides SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, où, selon les séquences, n sera égal à 7 acides aminés ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50 ou plus acides aminés). De préférence, le « fragment de polypeptide » selon l'invention comprend au moins 20 acides aminés, plus préférablement au moins 30 acides aminés, et encore pl us préférablement au moins 40 acides am inés. De préférence également, le « fragment de polypeptide » selon l'invention comprend 100 acides aminés au plus, plus préférablement 80 acides aminés au plus, et encore plus préférablement 60 acides aminés au plus. De préférence, lesdits fragments comportent un épitope des séquences SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,

20 ou 22. Ces épitopes, notamment de type B ou T, peuvent être déterminés par un logiciel (par exemple, PEOPLE [Alix, 1999], PREDITOP [Pellequer et Westhof, 1993] ou TEST [Zao et al., 2001 ]) ou expérimentalement par des techniques classiques [par exemple, par cartographie d'épitope ou protéolyse ménagée]. On entend par «frag ment de polynucléotide» , u n polynucléotide comprenant au moins «n» nucléotides consécutifs issus des polynucléotides SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 où, selon les séquences, n sera égal à

21 nucléotides ou plus (par exemple, 22, 23, 24, 25, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 90, 120, 150 ou plus nucléotides). On entend par «cellule hôte», une cellule qui a été transformée ou transfectée, ou est capable de transformation ou de transfection, par une séquence polynucléotidique exogène.

On entend par «amorces spécifiques», de courtes séquences nucléotidiques capables de s'hybrider de façon spécifiq u e, g râce à l a complémentarité des bases, sur le brin d'ADN ou sur son brin complémentaire.

Ces amorces sont choisies par l'homme de l'art de façon à encadrer la séquence d'ADN et à l'amplifier spécifiquement.

On entend par «milieu de culture», le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques bien connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification.

On entend par «fonction», l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide. La fonction d'un polypeptide conforme à l'invention est celle d'un antigène de L. pneumophila, et la fonction d'un polynucléotide conforme à l'invention est celle de coder ce polypeptide.

On entend par «antigène», tout composé qui, seul ou en association avec un adjuvant ou porteur, est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique. Cette définition comprend également tout composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène. La fonction d'un antigène de L. pneumophila est donc de permettre d'établir le diagnostic d'une infection à L. pneumophila, mais elle peut être aussi de réaliser des suivis thérapeutiques ou de préciser s'il s'agit d'une infection active ou aiguë, par exemple, par l'utilisation de la détection de différents isotypes d'anticorps. De préférence, comme on l'entend ici :

- un polypeptide homologue d'un polypeptide comprenant ou constitué de SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22, ou

- un fragment ou une partie d'un polypeptide comprenant ou constitué de SEQ I D NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 1 6, 1 8, 20 ou 22, ou du polypeptide homologue, est dit présenter la même fonction antigénique ou la même fonction d'antigène, notamment de Legionella pneumophila, que le polypeptide comprenant ou constitué de SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22 s'il peut être lié

par au moins un anticorps dirigé contre un polypeptide représenté par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 et 22.

On entend par «analogie structurale», une analogie aussi bien de la structure primaire (séquence) que de la structure secondaire (éléments structuraux), de la structure tertiaire (structure tridimensionnelle) ou de la structure quaternaire (association de plusieurs polypeptides dans un même complexe)

(BIOCHEMISTRY, 4ème Ed, L. Stryer, New York, 1995).

On entend par «variant» d'un polynucléotide dit initial ou d'un polypeptide dit initial, respectivement, un polynucléotide ou un polypeptide qui en diffère par au moins un nucléotide ou un acide aminé, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est-à-dire la même fonction.

Une différence dans la séquence polynucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide initial. Néanmoins, par définition, ces variants doivent conférer la même fonction que la séquence polynucléotidique initiale, par exemple, coder un polypeptide ayant une fonction antigénique.

Le polynucléotide ou le polypeptide variant diffère généralement du polynucléotide initial ou du polypeptide initial par une substitution, addition, délétion, fusion ou troncation, ou par plusieurs de ces modifications prises en combinaison. Un variant non-naturel d'un polynucléotide initial ou d'un polypeptide initial peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe.

On définit comme «séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique», un polynucléotide qui peut être hybride avec cette séquence polynucléotidique dans des conditions stringentes.

On entend généralement, mais pas nécessairement, par «conditions stringentes», les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences polynucléotidiques ont une identité d'au moins 80%. Ces conditions peuvent être obtenues selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.

On entend par «anticorps», les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés, ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines.

Le terme «immunospécifique» appliqué au terme anticorps, vis-à-vis d'un polypeptide donné, signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour ce polypeptide que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur.

Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par administration à un animal d'un polypeptide donné, suivie d'une récupération des anticorps produits par ledit animal, par extraction depuis ses fluides corporels. On peut également administrer à l'animal un variant dudit polypeptide, ou des cellules hôtes exprimant ce polypeptide.

Par «affinité», on entend à la fois une complémentarité structurale et une complémentarité des liaisons de faible énergie entre deux molécules au sens d'une définition communément admise (voir, par exemple, Klotz IM. Ligand-protein binding affinities. In Protein Function, a Practical Approach (T. E. Creighton, Ed).

1989 ; 25-35. IRL Press, Oxford, ou encore Ajay, Murcko MA. Computational methods to predict binding free energy in ligand-receptor complexes. J. Med Chem. 1995; 38:4953-67). L'affinité peut être mesurée par les techniques classiques de la biochimie (ELISA, compétition, fluorescence,...) bien connues de la personne du métier.

Par sérum «positif», on entend un sérum contenant des anticorps, produits à la suite d'une infection à Legionella, notamment à L. pneumophila, identifiés par leur liaison avec un polypeptide (antigène) de l'invention.

On entend par «sensibilité», la proportion de malades infectés, diagnostiqués selon l'art antérieur et donnés positifs par le diagnostic selon l'invention.

On entend par «spécificité», la proportion de donneurs de sang, testés comme témoins, soumis au diagnostic selon l'invention et donnés négatifs par le diagnostic selon l'invention.

On entend par «kit de diagnostic», un ensemble contenant au moins l'un des produ its tels que définis selon l'invention (polypeptide, polynucléotide, anticorps) et un diluant convenable, rassemblés dans un contenant approprié fait dans un matériau adapté. Ce contenant peut rassembler les différents moyens complémentaires nécessaires au test sérologique (par exemple, des réactifs marqués, des tampons, des solutions qui contiennent des ions adaptés, etc.) ainsi que les instructions requises pour réaliser le test.

La présente invention répond aux objectifs qu'elle s'est fixés plus haut en apportant de nouveaux polynucléotides et de nouveaux polypeptides.

L'invention a pour objet l'utilisation, in vitro, de l'une au moins des polypeptides de séquence SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 1 0, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22, d'une partie ou de variants de ces protéines, de cellules hôtes comprenant des vecteurs incluant un polynucléotide codant pour l'une au moins desdites protéines ou un variant desdites protéines, dans la production d'anticorps et le domaine du diagnostic in vitro de Legionella, notamment de L. pneumophila. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic et une composition pharmaceutique Utilisation de polvpeptides

Comme indiqué plus haut, l'identification des polypeptides utilisables selon l'invention est le résultat d'un crible et d'études approfondies que les séquences issues des programmes de génomique de L. pneumophila ne laissaient pas envisager. Comme également indiqué, le laboratoire de la Déposante connaît par ailleurs des polypeptides issus de L. pneumophila qui ne permettent pas de diagnostiquer une infection à cette bactérie. La Déposante a cependant identifié, de façon tout à fait inattendue, qu'un tel diagnostic était possible en utilisant d'autres polypeptides et, même, des frag ments de polypeptides issus de L. pneumophila, qu'elle a spécifiquement identifiés.

Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation, dans le diagnostic d'une infection à Legionella, notamment à L. pneumophila, et dans la prévention, par la vaccination, d'infection à Legionella, notamment à L. pneumophila, d'au moins un polypeptide comprenant : - la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2 (appelée protéine 8B4), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 1 ; ou

- la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4 (appelée protéine 6G5), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 3 ; ou

- la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6 (appelée protéine 6C6), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 5 ; ou

- la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8 (appelée protéine 8F4), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 7 ; ou

- la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10 (appelée protéine 8H5), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 9 ; ou

- la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12 (appelée protéine 8D5), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 1 1 ; ou - la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 (appelée protéine 8C6), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 13 ; ou

- la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 16 (appelée protéine 8D6), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 15 ; ou

- la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 18 (appelée protéine 6A6), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 17 ; ou

- la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 20 (appelée protéine 2H2), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 19 ; ou

- la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 22 (appelée protéine 10H3), codée par la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 21 . La présente invention vise également l'util isation d'au moins un polypeptide comprenant : a) une partie de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10,

1 2, 1 4, 1 6, 1 8, 20 ou 22, et ayant la même fonction antigénique que ladite séquence, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec l'une des séquences d'acides aminés SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou

22, ou avec la partie de séquence définie sous a), et ayant la même fonction antigénique que ladite séquence. Ainsi, des polypeptides conformes à l'invention peuvent comprendre des variants ou des fragments des séquences d'acides aminés SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8,

10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, qui consiste à cultiver une cellule hôte telle que définie précédemment et comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide, et à isoler ledit polypeptide du milieu de culture.

Le polypeptide peut être purifié à partir du milieu de culture, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide trichloroacétique, ou de moyens tels que l'extraction à l'acide, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie sur phosphocellulose, la chromatographie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographie sur hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion.

Utilisation de polynucléotides La présente invention a également pour objet l'utilisation, dans le diagnostic d'une infection à Legionella, notamment à L. pneumophila, et dans la prévention d'infection par la vaccination à Legionella, notamment à L. pneumophila, d'au moins un polynucléotide comprenant la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19 ou 21 , codant, respectivement, pour la protéine SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22.

L'invention vise également l'utilisation d'au moins un polynucléotide comprenant : a) une partie de la séquence SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9 1 1 , 13, 15, 17, 19 ou 21 et ayant la même fonction de codage pour un polypeptide antigénique que ladite séquence, ou b) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9 11 , 13, 15, 17, 19 ou 21 , ou avec la partie de séquence telle que définie sous a), et ayant la même fonction de codage pour un polypeptide antigénique que ladite séquence, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9 1 1 , 13, 15, 17, 19 ou 21 ou à la partie de séquence définie sous a) ou à la séquence définie sous b). Ainsi, des polynucléotides conformes à l'invention peuvent comprendre des variants ou des fragments de l'une des séquences polynucléotidiques SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9 11 , 13, 15, 17, 19 ou 21.

Les polynucléotides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes standard de synthèse d'ADN ou d'ARN.

Les polynucléotides conformes à l'invention peuvent également comprendre des séquences polynucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites, des séquences non-traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent I ¹ ARNm.

Utilisation de vecteurs d'expression et de cellules hôtes Comme indiqué plus haut, la présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'un polypeptide tel que défini selon l'invention et qui est préparé par culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide.

De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, l es pseudorabies virus, les rétrovirus.

Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence polynucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par des méthodes bien connues de l'homme du métier. Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences polynucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences polynucléotid iques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide tel que défini selon l'invention et la traduction d'un polypeptide tel que défini selon l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre.

L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon des méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la

transfection par phosphate de calcium, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection.

Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que des cellules de streptocoques, de staphylocoques, ύ'Escherichia coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que des cellules de levure et des cellules ό'Aspergillus, des cellules de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que des cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera S/9, des cellules animales telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293, ou encore des cellules végétales. Les polypeptides peuvent être purifiés à partir du milieu de culture des cellules hôtes, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, et rappelées plus haut.

Utilisation des anticorps selon l'invention

L'invention vise également l'utilisation d'anticorps, immunospécifiques pour un polypeptide tel que défini selon l'invention, pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'antigènes issus d'une infection par une bactérie du genre Legionella, notamment par L. pneumophila.

L'invention vise, en outre, l'utilisation d'anticorps tels que définis selon l'invention, pour détecter, périodiquement, in vitro, les antigènes d'une bactérie du genre Legionella, notamment de L. pneumophila, et ainsi suivre l'évolution de la pathologie et de l'effet d'un traitement appliqué à un patient.

Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide tel que défini selon l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polypeptide, à un mammifère, de préférence non humain, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.

Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes, la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines et la technique des hybridomes EBV.

Isotypes d'anticorps

Les immunoglobulines (ou anticorps) sont constituées de deux chaînes polypeptidiques différentes : deux chaînes légères (L) d'isotypes [kappa] ou

[lambda], et de deux chaînes lourdes (H) d'isotypes [gamma], [alpha], [mu], [delta] ou [epsilon]. Ces quatre chaînes sont liées de façon covalente par des ponts disulfures. Les deux types de chaînes H ou L possèdent des régions qui contribuent à la fixation des antigènes et sont très variables d'une immunoglobuline à une autre. Ces régions déterminent l'affinité des anticorps pour leur ligand.

Les isotypes des chaînes lourdes permettent de définir la classe de l'immunoglobuline ; il existe donc 5 isotypes d'anticorps (IgA, IgM, IgD, IgE et IgG). Des sous-classes, par exemple IgGI , lgG2, lgG3 et lgG4 sont définies par des différences de séquence de la chaîne lourde. Les différentes classes d'immunoglobulines ont des propriétés physicochimiques propres et leur synthèse dépend directement des phases et des niveaux d'activation de la réponse immunitaire.

Chez l'homme, les IgG représentent la principale classe d'immunoglobulines : leur concentration sérique chez l'adulte varie de 8 à 16 g/l. Leur demi-vie plasmatique est d'environ 3 semaines.

Les IgA constituent la deuxième classe d'immunoglobulines sériques, après les IgG, en terme de concentration (2 à 4 g/l). En revanche, elles représentent la classe prépondérante des immunoglobulines dans les sécrétions (sécrétions respiratoires, salivaires, digestives..., lait, colostrum, larmes). Sur le plan structural, les IgA ont la particularité de se présenter sous plusieurs formes moléculaires :

- dans le sérum, les IgA peuvent se présenter sous forme de monomères (forme prépondérante) ou sous forme de dimères associés à une chaîne J (chaîne de jonction). La chaîne J est un peptide riche en cystéine de 137 acides aminés (poids moléculaire : 15 000 Da), d'origine plasmocytaire ; la sous-classe IgAI est prépondérante dans le sérum.

- dans les sécrétions, les IgA, appelées IgA sécrétoires, sont sous forme de dimères ; elles sont donc associées à une chaîne J, mais elles comportent également un composant sécrétoire. Les IgA produites par les lymphocytes B sont captées par les cellules épithéliales, par un récepteur (polylgR) situé au pôle basai de la cellule. C'est pendant le transfert de I ¹ IgA à travers la cellule épithéliale, vers le pôle apical de la cellule, que le composant sécrétoire (poids moléculaire :

70 000 Da), ou pièce sécrétoire, est ajouté. Le rôle de la pièce sécrétoire est de protéger les IgA sécrétoires vis-à-vis des enzymes protéolytiques présents dans les sécrétions.

Comme les IgA, les IgM peuvent se présenter sous 2 formes moléculaires distinctes :

- une forme monomérique : c'est la forme sous laquelle les IgM sont synthétisées et insérées dans la membrane du lymphocyte B ;

- une forme pentamérique : c'est la forme sous laquelle les IgM sont sécrétées. Les 5 monomères de bases sont reliés par des ponts disulfures. De plus, une chaîne J relie l'extrémité de 2 monomères.

Les IgD représentent moins de 1 % des immunoglobulines sériques. Elles sont habituellement coexprimées avec les IgM à la surface des lymphocytes B où elles semblent jouer un rôle de récepteur pour les antigènes.

Les IgE ne sont présentes, chez un sujet normal, qu'à l'état de traces. Cinétique d'apparition des anticorps et affinité

La cinétique d'apparition d'anticorps spécifiques et d'un isotype donné est aujourd'hui encore mal comprise. D'une façon générale les cellules B dites naïves synthétisent différentes IgM qui constituent un large répertoire de molécules capables de fixer des antigènes (Steven A. Frank., Immunology and Evolution of Infectious Disease. (2002), Princeton University Press, Princeton, USA). Ainsi, lors de la première exposition à un antigène, celui-ci va se fixer avec une faible affinité à différentes IgM du système immunitaire. Cette interaction va néanmoins stimuler la division de la cellule B naïve correspondante. La division est d'autant plus rapide que l'affinité de NgM est forte, ce qui permet une sélection initiale des meilleurs clones. De plus, lors de la division, les réarrangements génétiques permettent l'augmentation de l'affinité des anticorps. La région constante des immunoglobulines change également afin de produire des IgG dans le système circulatoire et des IgA à la surface des muqueuses (Steven et Frank 2002.

Immunology and Evolution of Infectious Disease. Princeton University Press, Princeton, USA).

Utilisations des isotypes d'anticorps selon l'invention L'homme de l'art peut donc déduire de ce qui est explicité ci-dessus, que la présence d'une ou plusieurs classes d'anticorps et l'affinité particulière des

anticorps ont différentes implications d'un point de vue du diagnostic médical dans la différentiation des infections récurrentes ou non, d'une infection active, aiguë, chronique, latente, et/ou récente.

Sérologie Les échantillons biologiques testés peuvent être du sang, de l'urine, de la salive, du liquide de ponction de sérologie (par exemple liquide céphalo-rachidien, liquide pleural ou liquide articulaire) ou l'un de leurs constituants (par exemple, le sérum).

Les kits L'invention a également pou r objet des kits de d iagnostic in vitro comprenant, d'une part :

. au moins l'un des polypeptides tels que définis selon l'invention, ou . au moins l'un des polynucléotides codant pour lesdits polypeptides, . ou au moins l'un des anticorps tels que définis selon l'invention, et, d'autre part, au moins un diluant (par exemple, un tampon, une solution saline...) et une notice d'instructions d'utilisation. Les vaccins

L a p ré s e n te i n ve n t i o n co n ce rn e ég a l e m e n t u n e co m po sition pharmaceutique, utilisable comme vaccin, renfermant à titre de principe actif au moins un des polypeptides ou polynucléotides tels que définis selon l'invention, et un excipient pharmaceutiquement acceptable (par exemple, une solution stérile aqueuse ou non, pouvant contenir un antioxydant ou un tampon ou un soluté rendant la composition isotonique aux fluides corporels).

Les méthodes de diagnostic La présente invention concerne également une méthode, notamment in vitro, pour déterm iner si un ind ivid u est infecté par u ne bactérie du genre Legionella, notamment par Legionella pneumophila, comprenant la détection d'anticorps dirigés contre au moins un polypeptide représenté par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ I D NO : 1 6, SEQ I D NO : 1 8, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 22, dans un échantillon biologique de l'individu.

Dans un mode de réalisation de la méthode de diagnostic telle que définie ci-dessus, la détection d'anticorps dirigés contre au moins un polypeptide représenté par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 22, comprend la mise en contact de l'échantillon biologique avec:

(i) au moins un polypeptide comprenant ou constitué d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 20 et

SEQ ID NO : 22 ; ou

(ii) au moins un polypeptide homologue comprenant ou constitué d'une séquence partageant au moins 60% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12,

SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 22 ; ou

(iii) au moins un fragment du polypeptide défini en (i) ou du polypeptide homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que le polypeptide homologue défini en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins un anticorps dirigé contre un polypeptide représenté par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 22.

EXEMPLES

Partie expérimentale

A l'issue d'un crible par Western blot, il a été découvert que les protéines

8B4, 6G5, 6C6, 8F4, 8H5, 8D5, 8C6, 8D6, 6A6, 2H2 et 10H3 (SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22) ont une utilité dans le diagnostic des infections à

L. pneumophila alors que d'autres protéines, telles que la protéine « PAL », appelée ici 1 H4 (SEQ ID NO : 24), la protéine « RpoS », appelée ici 8A4 (SEQ ID

NO : 28), ou encore la protéine « preprotein translocase » appelée ici 11 C6 (SEQ

ID NO : 36), ne présentent pas les mêmes propriétés antigéniques que les protéines selon l'invention. Ces protéines sont codées par des gènes, dont la séquence est connue et accessible dans les banques de données.

A) Protocoles d'obtention des antigènes

A.1. Clonage de la séquence codant pour les polypeptides SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22

Les gènes codant pour les séquences des polypeptides,_SEQ ID NO : 2,

4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22, sont obtenus par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de la bactérie Legionella pneumophila (souche

Philadelphia-1 , ATCC 33152), en utilisant, respectivement, des amorces spécifiques des séquences SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19 ou 21.

Les fragments correspondants, ainsi amplifiés, sont clones dans des vecteurs selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ces vecteurs permettent la production des protéines clonées sous contrôle d'un promoteur inductible par l'isopropyl-thiogalactoside (IPTG). Les protéines clonées correspondent aux polypeptides SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 et 22.

A.2. Expression des protéines

U n e souche ά 'Escherichia coli est transformée par les vecteurs d'expression précédemment décrits. Les bactéries sélectionnées sont mises en culture une nuit à 30°C sous agitation dans 50 ml d e milieu Luria Bertani, en abrégé milieu LB (LB, J.Miller, « A short course in Bacteria Genetics », CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant de l'ampicilline et du chloramphénicol, tous deux, à une concentration finale de 100 μg/ml. Le

lendemain, la culture est diluée au 1/50 ^eme dans un volume final de 1 litre de milieu LB auquel on a ajouté de l'ampicilline et du chloramphénicol, tous deux, à une concentration finale de 100 μg/ml et la culture est incubée à 30°C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (en abrégé, A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par NPTG à u ne concentration finale de 0,5 mM . Les bactéries sont récoltées par centrifugation (6 minutes à 5240 tours/min à 4°C) I orsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1 ,5.

A.3. Purification des protéines Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCI 20 mM à pH 8,0 contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées par du lysozyme (0,2 g/l) en présence d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) 12,5 mM, de DNase, RNase et PMSF. La suspension est incubée 30 minutes à 4 O puis centrifugée à cette températu re pendant 10 minutes à 15500xg. Le culot est congelé à -20O pendant au mo ins une nuit. A.4. Exemple : purification de 8H5 (SEQ ID NO : 10) Les protocoles de purification diffèrent pour chaque protéine en fonction de sa solubilité et de ses caractères physicochimiques propres. Il est présenté à titre d'exemple la purification de la protéine 8H5, la transposition aux autres protéines étant du domaine de compétence de l'homme du métier. Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Mes [acide 2-(N- morpholino) éthane sulfonique] 25 mM à pH 6,0, puis soniquées 4 fois pendant 20 secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 4 O pendant 30 minutes, les culots sont repris dans 10 ml de tampon Mes 25 mM à pH 6,0, urée 8 M, β mercapto-éthanol 20 mM). Puis la suspension est centrifugée pendant 20 minutes à 14 000 tours/min à température ambiante (TA). Le surnageant est à nouveau centrifugé pendant 30 minutes à TA à 14000 tours/min, puis filtré sur membrane de porosité 0,22 μm. Le filtrat est alors déposé sur une colonne échangeuse de cation (par exemple, SP-Sépharose 12 ml, Amersham Biosciences). Après lavage de la colonne, la protéine est éluée par un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCI dans du tampon Mes 25 mM à pH 6,0 en 20 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées, dialysées sur la nuit contre du tampon Mes 25 mM à pH 6,0, puis redéposées sur cette même

colonne. La protéine est ensuite éluée par un nouveau gradient de NaCI optimisé pour la protéine 8H5. De nouveau, les fractions contenant la protéine sont rassemblées et les protéines sont précipitées par du sulfate d'ammonium à une concentration finale de 0,6 g/1. La solution est laissée au moins une nuit à 4O puis centrifugée pendant 30 minutes à 20800xg. Le culot est alors repris dans un volume de liquide le plus faible possible (en général 300 μl de tampon Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ 50 mM pH 8,0 contenant du NaCI 100 mM puis déposé sur une colonne de gel filtration, par exemple Superdex HR75-10/30, Amersham). Les fractions éluées contenant la protéine sont rassemblées et du glycérol est ajouté jusqu'à une concentration finale de 20%. Les protéines purifiées sont alors stockées à -20O jusqu'à leur utilisation dans les tests.

Les concentrations des protéines sont déterminées par spectrophotométhe à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace et al. 1995. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science 4, 2411 -2423). La pureté des protéines est vérifiée par analyse par électrophorèse SDS-PAGE et par spectrométrie de masse.

B) Test de diagnostic in vitro

Pour réaliser les tests de diagnostic, il a été utilisé des sérums provenant de patients ayant eu une infection documentée à Legionella pneumophila

(collection du laboratoire). L'infection a pu être mise en évidence soit par l'isolement/culture des bactéries à partir de prélèvements broncho-pulmonaires, soit par une séroconversion, soit encore par un test urinaire positif.

Les sérums témoins correspondaient à des sérums de donneurs de sang (collection du laboratoire).

La fixation, sur les protéines recombinantes purifiées (obtenues comme décrit précédemment), des anticorps présents dans les sérums peut être évaluée soit par des tests en Western Blot soit par la technique ELISA.

Exemple B1 : Protocole du test ELISA, pour les polvpeptides tels que définis selon l'invention

La fixation des anticorps présents dans les sérums a été évaluée par des tests ELISA. Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4O en présence de 0,5 μg d'antigène purifié (protéines 8B4, 6G5, 6C6, 8F4, 8H5, 8D5,

8C6, 8D6, 6A6, 2H2 ou 10H3) dans du «tampon salin phosphate» (PBS). Après quatre lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées pendant une heure à 37°C par du PBS-Tween contenant 5% de lait demi-écrémé (250 μl par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés, puis 100 μl de chaque sérum positif à tester, à la dilution adéquate dans du tampon PBS-Tween contenant 5% de lait demi-écrémé, sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite laissée à 25°C pendant 30 minutes. Après q u atre nou vea u x l avag es , d es a ntico rps (secondaires) anti- immunoglobulines G, M, ou A, ou simultanément anti-immunoglobulines G et/ou A et/ou M, humaines de chèvre marqués à la phosphatase alcaline (par exemple 170-6462, Biorad) sont ajoutés et laissés pendant 30 minutes à 25°C après avoir été dilués selon le protocole du fourn isseur dans du tampon PBS-Tween contenant 5% de lait demi écrémé. Quatre nouveaux lavages sont réalisés, puis 100 μl de substrat (phosphate de p-nitrophényle), pNPP, par exemple A-3469, Sigma) sont ajoutés par puits. L'absorbance à 405 nm de chaque puits est mesurée après une incubation de 30 minutes à 37O.

Sont considérés comme «positifs» en ELISA, les sérums identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention. C) Résultats et interprétation Des résultats types sont présentés dans les différents exemples ci-après.

Les sérums de patients considérés comme positifs sont ceux contenant des anticorps dirigés contre L. pneumophila, identifiés, par ELISA, par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention.

Exemple 1 : Résultats obtenus par l'utilisation des polvpeptides selon l'invention pour la détection d'anticorps spécifiques dans les sérums (ELISA)

Le panel d'échantillons testés est constitué de sérums d'individus dont l'infection à L. pneumophila a été diagnostiquée par la mise en évidence d'une séroconversion par la technique d'immunofluorescence indirecte sur plusieurs prélèvements sanguins et/ou par la mise en évidence du microorganisme par culture de prélèvements et/ou par la m ise en évidence d'antigène urinaire bactérien.

Les tableaux 1 et 2 présentent les résultats obtenus selon l'invention pour les polypeptides 8B4 (SEQ ID NO : 2) 6G5 (SEQ ID NO : 4), 6C6 (SEQ ID NO : 6), 8F4 (SEQ ID NO : 8), 8H5 (SEQ ID NO : 10), 8D5 (SEQ ID NO : 12), 8C6 (SEQ ID NO : 14), 8D6 (SEQ ID NO : 16), 6A6 (SEQ ID NO : 18), 2H2 (SEQ ID NO : 20), et 10H3 (SEQ ID NO : 22) avec des anticorps secondaires reconnaissant les immunoglobulines A (tableau 1 ) ou G (tableau 2) présentes dans des sérums de patients malades ou de donneurs de sang.

Tableau 1 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-lgA comme anticorps secondaires

Tableau 2 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-lgG comme anticorps secondaires.

D'après les tableaux de résultats ci-dessus, nous constatons, par le test ELISA, que les protéines 1 H4, 2E5, 8A4, 8E5, 8G4, 8G5 et 11 C6 ont de

mauvaises performances (spécificité et/ou sensibilité) et ne peuvent en conséquence être utilisées dans le cadre du diagnostic sérologique d'une infection à L. pneumophila.

En revanche, il est possible d'identifier in vitro et avec une spécificité de 94,8 %, jusqu'à 69% en détectant les IgA, et jusqu'à 65,4% en détectant les IgG, des pneumopathies causées par L. pneumophila grâce à l'utilisation de l'un ou l'autre des polypeptides selon l'invention.

Ainsi, par le test ELISA, des infections à Legionella pneumophila sont identifiées in vitro grâce aux antigènes selon l'invention. Il est donc démontré, d'une part, l'existence chez l'homme d'une réponse anticorps significative (la probabil ité associée à un test de χ ² est inférieure à 0,05) vis-à-vis des polypeptides selon l'invention au cours des infections à L. pneumophila et, d'autre part, que les protéines 8B4, 6G5, 6C6, 8F4, 8H5, 8D5, 8C6, 8D6, 6A6, 2H2, et 10H3, sont pertinentes pour le diagnostic sérologique de ce type d'infection.

Exemple 2 : Comparaison des résultats ELISA obtenus par l'utilisation des polvpeptides selon l'invention aux résultats obtenus selon une technique de l'art antérieur : rimmunofluorescence indirecte (IFI).

Le panel d'échantillons testés est constitué de sérums dont le titre en IFI est inférieur ou égal à 64, ce qui ne permet pas de suspecter une infection à L. pneumophila. L'infection à L. pneumophila a été parallèlement diagnostiquée par la mise en évidence du microorganisme par culture de prélèvements et/ou par la mise en évidence d'antigène urinaire bactérien et/ou par la mise en évidence d'une séroconversion par la technique d'IFI à partir d'échantillon(s) sanguin(s) prélevé(s) ultérieurement.

Tableau 3 : Résultats ELISA obtenus en utilisant des anti-lgG comme anticorps secondaires sur un panel de sérums négatifs en IFI.

Tableau 4 : Résultats ELISA obtenus en utilisant des anti-lgA comme anticorps secondaires sur un panel de sérums négatifs en IFI.

Ces résultats indiquent clairement que l'utilisation des polypeptides selon l'invention permet l'identification d'une forte proportion de malades non détectés par une technique de sérologie de l'art antérieur (IFI).

Exemple 3 : Utilisation des polypeptides selon l'invention pour le suivi séroloqiαue de patients-

Tableau 5 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-lgG comme anticorps secondaires.

Le panel d'échantillons testés est constitué de paires de sérums de patients prélevés à des moments différents au cours de l'infection à L. pneumophila, ou lors de la guérison. L'infection a été diagnostiquée par la mise en évidence d'une séroconversion par la technique d'immunofluorescence indirecte sur plusieurs prélèvements sanguins et/ou par la mise en évidence du microorganisme par culture de prélèvements et/ou par la mise en évidence d'antigène urinaire bactérien.

nf : le test n'a pas été effectué

Tableaux 6 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-lgA comme anticorps secondaires.

Délais Variation en pourcentage i du titre ELISA en entre deux sérums calculée selon la formule :

N°du jours (titre sérum 2-titre sérum 1 x 100/titre sérum 1 )

Patie entre 6G5 8F4 8H5 6A6 6C6 8C6 10H3 nt les 2 SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ sérum ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO ID NO s : 4 : 8 : 10 : 18 : 6 : 14 : 22

4 6 35% 0% 25% nf nf nf nf

8 21 220% 0% 10% nf nf nf nf

109 21 35% 50% 55% nf nf nf nf

77 6 nf nf nf 10% 0% 110% 0%

97 10 nf nf nf 30% 55% 70% 20%

101 252 nf nf nf nf -55% nf -30%

109 53 nf nf nf nf -55% -60% -25% nf : le test n'a pas été effectué

Chez des patients atteints de légionellose, la constatation de l'augmentation ou de la diminution, au cours du temps, des valeurs ELISA, obtenues en détectant les immunoglobulines présentes dans les sérums, par leur fixation aux polypeptides selon l'invention, indique leur guérison ou l'évolution de la maladie. L'utilisation des polypeptides selon l'invention permet donc de réaliser des suivis thérapeutiques, c'est-à-dire (i) d'évaluer l'effet d'un traitement et (ii) de suivre l'évolution de l'infection chez un patient.

D) Conclusions

Les résultats des tests précédents démontrent l'existence d'une réponse anticorps significative au cours des infections à Legionella pneumophila vis à vis des polypeptides de l'invention et la pertinence de ces polypeptides pour le diagnostic sérologique et le suivi de l'évolution de ce type d'infection.

Les taux importants d'anticorps anti-8B4, anti-6G5, anti-6C6, anti-8F4, anti-8H5, anti-8D5, anti-8C6, anti-8D6, anti-6A6, anti-2H2 et anti-10H3, retrouvés chez la plupart des patients testés suggèrent que ces antigènes peuvent, conférer aux individus infectés une protection immunitaire durable contre la réinfection. En conséquence, ces antigènes pourraient être utilisés pour la vaccination en prévention des infections à L. pneumophila.