Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro Vollhautmodell mit einem Dermis- und einem Epidermisäquivalent, wobei in dem Dermis- und/oder Epidermisäquivalent 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente mit 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen sowie einem Durchmesser von 100 bis 6.000 μιη, enthalten sind. Durch die Inkorporation der Schweißdrüsenäquivalente in die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle kann die in-vivo Situation in der Humanhaut sehr gut nachgestellt werden. Insbesondere können die in-vivo vorhanden Zell-Zell-Interaktionen zwischen den verschiedenen Zelltypen sehr gut abgebildet werden, da die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente auch nach der Inkorporation in das Vollhautmodell ihre Funktion beibehalten.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, bei welchem zunächst ein Dermisäquivalent auf einer Trägerschicht bereitgestellt wird. Anschließend wird auf dieses Dermisäquivalent ein Epidermisäquivalent aufgebracht. Die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in das in-vitro-Vollhautmodell erfolgt hierbei während der Bereitstellung des Dermis- und/oder Epidermisäquivalents.

Zudem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodells in der Kosmetik und der Körperpflege, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs sowie zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung und/oder Verminderung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein System, insbesondere Testsystem, welches ein erfindungsgemäßes in-vitro Vollhautmodell umfasst.

Das Waschen, Reinigen und Pflegen des eigenen Körpers stellt ein menschliches Grundbedürfnis dar und die moderne Industrie versucht fortlaufend, diesen Bedürfnissen des Menschen in vielfältiger Weise gerecht zu werden. Besonders wichtig für die tägliche Hygiene ist die anhaltende Beseitigung oder zumindest Reduzierung des Körpergeruchs und der Achselnässe. Achselnässe und Körpergeruch entstehen durch die Sekretion aus ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen in der humanen Achselhöhle. Während die ekkrinen Drüsen der Thermoregulation des Körpers dienen und für die Entstehung der Achselnässe verantwortlich sind, scheiden die apokrinen Drüsen ein viskoses Sekret in Reaktion auf Stress ab, aus welchem durch bakterielle Zersetzung unangenehmer Körpergeruch entsteht. Erste Forschungsarbeiten an nativen ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen wurden bereits Anfang des 20. Jahrhunderts durchgeführt, um diese zur Gruppe der exokrinen Drüsen gehörenden Hautanhangsgebilde zu klassifizieren. Schweißdrüsen lassen sich hiernach in apokrine und ekkrine Schweißdrüsen sowie eine Mischform aus apokrinen und ekkrinen Schweißdrüsen (auch als apoekkrine Schweißdrüse bezeichnet) einteilen. Die zuvor genannten Formen können anhand morphologischer und charakteristischer Merkmale unterschieden werden.

Die ekkrine Schweißdrüse, insbesondere die humane ekkrine Schweißdrüse, gehört zu den unverzweigten gewunden tubulären Drüsen und lässt sich in das sekretorische Endstück (auch als Coil bezeichnet), den dermalen Ausführgang (auch als Dukt bezeichnet) sowie den epidermalen Ausführgang (auch als Acrosyringium bezeichnet) unterteilen. Die in diesen Drüsenabschnitten vorhanden Zellen weisen unterschiedliche Aufgaben und Funktionen auf, wie beispielsweise die Sekretion im Coil, Rückresorption von Ionen im Dukt sowie Abgabe des Sekrets, insbesondere des Schweißes, an die umliegende Haut durch das Acrosyringium. Die ekkrinen Schweißdrüsen werden durch den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) stimuliert.

Im Hinblick auf die Vermeidung von Achselnässe und/oder Körpergeruch ist es daher wünschenswert, die Sekretion aus ekkrinen und/oder apokrinen Schweißdrüsen zu vermindern und/oder zu vermeiden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Ausführungsgänge der ekkrinen Schweißdrüsen mittels sogenannter Plugs verstopft werden. Hierzu werden im Stand der Technik schweißhemmende Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalze eingesetzt, welche jedoch vom Verbraucher als kritisch empfunden werden. Weiterhin werden im Stand der Technik antibakterielle Mittel eingesetzt, welche den bakteriellen Abbau des Schweißes verhindern. Derartige Mittel können jedoch die natürliche Mikroflora der Haut unter der Achselhöhle negativ beeinflussen. Es ist daher wünschenswert, kosmetische Mittel bereitzustellen, welche in der Lage sind, die Achselnässe und/oder den Körpergeruch zuverlässig zu verhindern und welche weder die im Stand der Technik eingesetzten Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalze noch antibakteriellen Mittel enthalten. Eine Möglichkeit zur Bereitstellung derartiger Mittel besteht in dem Einsatz von Substanzen, welche die Stimulierung der Schweißdrüsen effektiv hemmen und somit die Schweißsekretion vermindern bzw. vermeiden. Um derartige Substanzen identifizieren zu können, können in-vivo Tests mit Versuchsteilnehmern durchgeführt werden. Solche Tests sind jedoch aufwändig und erlauben keine Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten.

Weiterhin können Zellmodelle von Schweißdrüsen eingesetzt werden, an welchen der Einfluss von Testsubstanzen auf die Stimulation der Schweißdrüsen untersucht werden kann. Derartige Modelle müssen die in-vivo Situation möglichst genau nachbilden, standardisierbar und kostengünstig sein sowie Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten ermöglichen. Ein im Stand der Technik bekanntes dreidimensionales Schweißdrüsenmodell ist beispielsweise durch Li (Li et. al.;„Matrigel basement membrane matrix induces eccrine sweat gland cells to reconstitute sweat gland-like structures in nude mice"; Experimental Cell Research, 2015, 332, Seiten 67 bis 77) beschrieben. Zur Herstellung dieses Schweißdrüsenmodells werden zunächst primären Schweißdrüsenzellen mit Wachstumsfaktoren in einer gelartigen Substanz (Matrigel®) kultiviert und anschließend in den Rücken von lebenden Mäusen implantiert. Nach Implantierung bilden sich Sphäroid-Strukturen aus, welche Schweißdrüsenspezifische Markerproteine exprimieren. Da zur Ausbildung der differenzierten Strukturen der Einsatz von Mäusen erforderlich ist, kann dieses Modell nicht in der kosmetischen und pharmazeutischen Forschung, wo der Einsatz von Versuchstieren verboten ist, verwendet werden.

Schließlich ist auch der Einsatz von Vollhautmodellen, welche neben einer Dermis und einer Epidermis auch Schweißdrüsen enthalten, bekannt. Durch Ausstanzen von Proben aus nativer adulter Humanhaut werden Modelle erhalten, welche alle in diesem Hautbereich befindlichen Hautanhangsgebilde, worunter auch Schweißdrüsen fallen, enthalten. Derartige Modelle werden auch als ex-vivo Vollhautmodelle bezeichnet. Ein Nachteil dieser Modelle ist deren geringe Standardisierbarkeit, da eine Steuerung der genauen Anzahl an Schweißdrüsen nicht möglich ist und zudem die Eigenschaften des Modells von dem jeweiligen Spender abhängen.

Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an in-vitro Vollhautmodellen, welche eine ähnliche, vorzugsweise identische, histologische Architektur wie humane Haut aufweisen und welche ausschließlich unter Einsatz von in-vitro Methoden herstellbar sind. Weiterhin ist es wünschenswert, wenn diese in-vitro Vollhautmodelle standardisierbar und kostengünstig herstellbar sind und sich für den Einsatz in Screeningverfahren mit hohen Durchsätzen eignen.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein in-vitro Vollhautmodell (im Folgenden als Hautäquivalent bezeichnet) bereitzustellen, dessen Zellstruktur und Zell-Zell- Wechselwirkungen eine hohe Ähnlichkeit zu der Zellstruktur und den Zell-Zell-Wechselwirkungen von nativen Haut aufweisen und welches ausschließlich durch in-vitro Methoden herstellbar ist. Weiterhin soll dieses Modell kostengünstig herstellbar sein, standardisierbar sein und sich für den Einsatz in Screeningverfahren mit hohen Durchsatzzahlen eignen.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass durch Einbringung von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten in ein Dermis- und/oder Epidermisäquivalent eines Hautäquivalents Modelle erhalten werden können, in welchen die Zell-Zell-Interkationen zwischen den verschiedenen Zelltypen denen in der nativen Haut nahezu entsprechen. Die Herstellung erfolgt ausschließlich durch in-vitro Methoden und erlaubt eine hohe Standardisierbarkeit sowie eine kostengünstige Herstellung der Hautäquivalente. Daher eignen sich diese Hautäquivalente insbesondere zum Einsatz in Screeningverfahren mit hohen Durchsätzen zur Testung von schweißhemmenden Substanzen zum Einsatz in der Kosmetik und der Pharmazie.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein in-vitro Vollhautmodell, umfassend a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix

b) mindestens ein Dermisäquivalent c) mindestens ein Epidermisäquivalent

d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,

dadurch gekennzeichnet, dass

das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.

In den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen werden durch Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente die in humaner Haut vorliegenden Zell-Zell- Interaktionen nachgestellt. Diese Modelle bilden daher die in-vivo-Situation sehr gut ab, so dass die mit diesen Modellen gewonnen Ergebnisse relevanter sind als die Ergebnisse, welche von Vollhautmodellen ohne Schweißdrüsenäquivalente erhalten werden. Zudem weisen die in den dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten enthaltenen ekkrinen Schweißdrüsenzellen eine potentielle Stammzell-Aktivität bei der Wundheilung auf, so dass mit dem erfindungsgemäßen Hautäquivalent weitere in der Haut ablaufende Prozesse untersucht werden können. Durch Verwendung von kultivierten Zellen zur Herstellung des Hautäquivalents kann eine hohe Standardisierung erreicht werden, da aus den kultivierten Zellen eine Vielzahl von Hautäquivalenten mit gleichen Eigenschaft erzeugt werden können. Weiterhin wird durch die Einbringung einer genau bestimmbaren Anzahl an dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten ebenfalls eine hohe Standardisierbarkeit sicherstellt.

Unter einem in-vitro Vollhautmodell (im nachfolgenden auch als Hautäquivalent bezeichnet) wird erfindungsgemäß ein Modell der Haut verstanden, welches ausschließlich unter Verwendung von in- vitro Methoden hergestellt wurde und sowohl eine stratifizierte Epidermis als auch eine Dermis aufweist, wobei sich eine Basalmembran zwischen der Dermis und der Epidermis befindet.

Weiterhin wird unter dem Begriff „Trägerschicht" im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine selbsttragende Schicht verstanden, welche als Unterlage bzw. Gerüst für das Dermisäquivalent des erfindungsgemäßen Hautäquivalents dient. Bevorzugt befindet sich diese Schicht in den Kavitäten der zur Herstellung der Hautäquivalente eingesetzten Mikrotiterplatten. Erfindungsgemäß umfasst diese Schicht eine Kollagenmatrix, wobei unter einer Kollagenmatrix ein räumliches Netzwerk aus Kollagen verstanden wird, welches bevorzugt Poren aufweist. Hierunter fällt jedoch keine Matrix, welche durch das von den Fibroblasten der Dermis produzierte Collagen gebildet wird.

Zudem wird unter einem Dermisäquivalent im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Bindegewebe-artige Schicht aus Fibroblasten verstanden, welche weitgehend der nativen Dermis entspricht. Darüber hinaus wird unter einem Epidermisäquivalent im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine bevorzugt mehrschichtige Schicht aus Keratinozyten in Form einer stratifizierten Epidermis verstanden, welche weitgehend der nativen Epidermis entspricht.

Weiterhin wird unter einer Basalmembran eine Schicht aus einem bevorzugt mehrschichtigen Geflecht aus Collagen, insbesondere Collagen IV, welches mit einem zweidimensionalen Netzwerk aus Laminin verwoben ist. Der Zusammenhalt zwischen dem Collagengeflecht und dem Lamininnetzwerk wird bevorzugt durch Perlecan (einem aus Heparinsulfat gebildeten Proteoglycan) sowie Entactin (auch als Nidogen bezeichnet) gewährleistet.

Schließlich wird unter einem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent erfindungsgemäß ein Zellmodell aus Schweißdrüsenzellen verstanden, welches eine Ausdehnung in alle drei Raumrichtungen aufweist und in welchem die Zellen eine ähnliche Funktion, insbesondere eine identische Funktion, wie Zellen einer nativen Schweißdrüse zeigen.

Als ersten wesentlichen Bestandteil a) umfasst das erfindungsgemäße in-vitro Vollhautmodell eine Trägerschicht, welche eine Collagenmatrix enthält.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung weist das Hautäquivalent als Trägerschicht bevorzugt eine Matrix aus bestimmten Collagenverbindungen auf. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn die Collagenmatrix ein schwer lösliches Collagen, insbesondere ein schwer lösliches Collagen aus Sehnen von Pferden, Schweinen oder Rindern, umfasst. Unter schwer löslichem Collagen wird erfindungsgemäß grobfasriges Collagen verstanden, welches im wässrigen Medium über mindestens 5 Stunden hinweg keine sichtbare oder nur geringe Quellung bzw. keine oder nur geringe Gelbildung, insbesondere keine Gelbildung, aufweist. Derartiges Collagen wird bevorzugt aus den Sehnen von Tieren, insbesondere Säugetieren, bevorzugt von Pferden, Schweinen oder Rindern, ganz besonders bevorzugt aus den Achillessehnen oder der Haut von Ringern, insbesondere aus den Achillessehnen von Rindern, gewonnen.

Es hat sich erfindungsgemäß als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn die als Trägerschicht eingesetzte Matrix aus lyophilisiertem schwer löslichem Collagen gebildet ist. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix ein lyophilisiertes schwer lösliches Collagen, insbesondere ein lyophilisiertes schwer lösliches Collagen aus Sehnen von Pferden, Schweinen oder Rindern, umfasst. Unter lyophilisiertem schwerlöslichen Collagen wird erfindungsgemäß ein schwer lösliches Collagen verstanden, welches durch Gefriertrocknung einer homogenen Suspension dieses schwer löslichen Collagens in einem Lösungsmittel, bevorzugt Wasser, erhalten wurde. Gefriertrocknung wird auch als Sublimationstrocknung bezeichnet und steht hierbei für das Trocknen eines tiefgefroren Materials im Hochvakuum durch Ausfrieren des Lösungsmittels, bevorzugt in Form von Wasser, welches dann in gefrorenem Zustand verdampft. Besonders bevorzugt weist diese Collagenmatrix aus lyophilisiertem schwer löslichen Collagen an der Oberfläche eine Haut mit Poren auf. Diese Poren führen zu einer besonders guten Besiedelung des Trägermaterials mit Fibroblasten während der Ausbildung des Dermisäquivalents, so dass eine Störung während zur Bildung des Dermisäquivalents erforderlichen Differenzierung der Fibroblasten vermieden wird.

Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft erwiesen, wenn die Collagenmatrix der Trägerschicht eine bestimmte Gesamtmenge an Collagen enthält. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an Collagen, insbesondere lyophilisiertem schwer löslichem Collagen, von 0,5 bis 5,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,8 bis 3,5 Gew.-%, bevorzugt von 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält. Trägerschichten, welche die zuvor angeführte Gesamtmenge an Collagen, insbesondere lyophilisiertem schwer löslichen Collagen, enthalten, führen zu einer effektiven Stabilisierung des erfindungsgemäßen Hautäquivalents und erlauben auf diese Weise eine gute Handhabung der Äquivalente.

Um eine Schrumpfung des erfindungsgemäßen Hautäquivalents zu vermeiden, hat es sich der Einsatz von vernetzten Collagenmatrices bewährt. Das Vermeiden der Schrumpfung stellt eine hohe Standardisierbarkeit sicher, da die Auftragung der Testsubstanzen immer auf eine gleich große Oberfläche erfolgen kann. Hierdurch werden Konzentrationsschwankungen nach dem Auftragen der Testsubstanzen vermieden. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist. Die Vernetzung der Collagenmatrix kann beispielsweise mittels chemischer oder physikalischer Methoden erfolgen. Zur chemischen Vernetzung werden insbesondere chemische Vernetzungsmittel eingesetzt, die physikalische Vernetzung kann beispielsweise mittels UV-Bestrahlung oder dehydrothermaler Vernetzung (auch als DHT bezeichnet) erfolgen.

In diesem Zusammenhang hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn die Vernetzung der Collagenmatrix mittels chemischer Vernetzungsmittel erfolgt. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Vernetzung der Collagenmatrix mittels eines chemischen Vernetzungsmittels aus der Gruppe von Glutaraldehyd, p-Benzochinon, Dimehtyladipimidat, Dimethylpimelinidat, Dimethylsuberimidat, 1 ,4-Phenylendiisothiocyanat, Polyoxyethylen-bis-(imidazolyl carbonyl), bis[Polyoxyethylen-bis(imidazolyl carbonyl)] und Suberinsäure-bis(N-hydroxysuccinimidester), 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-carbodiimid, Enzymen sowie deren Mischungen, insbesondere Glutaraldehyd, erfolgt. Die Anmelderin hat überraschenderweise festgestellt, dass die Vernetzung der Collagenmatrix mittels des chemischen Vernetzungsmittels Glutaraldehyd zu einer hervorragenden Stabilisierung der Hautäquivalente führt, ohne dass die cytotoxischen und apoptotischen Eigenschaften des Glutaraldehyds zu einem negativen Einfluss auf das in-vitro Vollhautmodell führen. Als zweiten wesentlichen Bestandteil umfasst das erfindungsgemäße in-vitro Vollhautmodell ein Dermisäquivalent.

Dieses Dermisäquivalent wird bevorzugt aus dermalen Fibroblasten gebildet. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent aus primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, gebildet ist. Unter primären Fibroblasten werden bevorzugt natürlich vorkommende, insbesondere in der humanen Dermis vorkommende, Fibroblasten, gentechnisch veränderte Fibroblasten, aus Spontanmutation hervorgegangene Fibroblasten oder deren Vorläufer verstanden. Besonders bevorzugt werden vorkultivierte humane primäre Fibroblasten zur Bildung des Dermisäquivalents eingesetzt. Vorkultivierte humane primäre Fibroblasten können durch Kultivierung der humanen primären Fibroblasten erhalten werden, wobei die Kultivierung bevorzugt in-vitro unter Vermehrung der Zellen stattfindet. Zur Vorkultivierung der Fibroblasten wird vorzugsweise ein DMEM-Medium (Dulbecco ^' s Modified Eagle Medium) verwendet.

Es hat sich erfindungsgemäß als vorteilhaft erwiesen, wenn das Dermisäquivalent eine bestimmte Gesamtzellzahl an primären Fibroblasten enthält. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn das Dermisäquivalent primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtzellzahl von 5x10 ⁵ bis 6x10 ⁶ , vorzugsweise von 6x10 ⁵ bis 5x10 ⁶ , insbesondere von 7x10 ⁵ bis 4x10 ⁶ , enthält. Dermisäquivalente, welche die zuvor genannten Gesamtzellzahlen an primären Fibroblasten enthalten, weisen eine Differenzierung auf, welche der Differenzierung in der Dermis der humanen Haut sehr ähnlich ist. Hierdurch wird gewährleistet, dass die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle die in-vivo Situation möglichst genau nachbilden.

Als dritten wesentlichen Bestandteil c) enthält das erfindungsgemäße in-vitro Vollhautmodell mindestens ein Epidermisäquivalent.

Dieses Epidermisäquivalent wird bevorzugt aus primären Keratinozyten gebildet. Unter Keratinozyten werden erfindungsgemäß Zellen der Epidermis, welche ein verhorntes Plattenepithel bilden, gentechnisch veränderte Keratinozyten, aus Spontanmutation hervorgegangene Keratinozyten sowie deren Vorläufer verstanden. Da die Ausbildung eines gut differenzierten Epidermisäquivalents mit intakter Verhornung vom Anteil basaler Stammzellen in den zur Bildung des Epidermisäquivalents eingesetzten Keratinozyten abhängt, ist es bevorzugt, weitgehend undifferenzierte Keratinozyten-Stammzellen aus unbehandeltem Biopsie-Gewebe zu verwenden. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das Epidermisäquivalent aus primären Keratinozyten, insbesondere humanen primären Keratinozyten, gebildet ist. Bevorzugt ist das Epidermisäquivalent aus vorkultivierten Keratinozyten, welche durch Kultivierung von primären Keratinozyten, bevorzugt unter Vermehrung dieser Zellen, erhalten werden, gebildet. Zur Vorkultivierung der Keratinozyten wird bevorzugt eine Mischung aus DMEM-Medium (Dulbecco ^' s Modified Eagle Medium) und Ham ^' s F12-Medium verwendet. Besonders bevorzugt weist das Epidermisäquivalent mehrere voneinander verschiedene Zellschichten auf. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das Epidermisäquivalent mehrere voneinander verschiedene Zellschichten, insbesondere mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht, umfasst. Unter dem Begriff „mehrere Zellschichten" werden erfindungsgemäß mindestens zwei voneinander verschiedene Zellschichten, insbesondere 2 bis 20 voneinander verschiedene Zellschichten, verstanden. Das Vorliegen von verschiedenen Zellschichten in der Epidermis kann beispielsweise mit Hilfe eines Lichtmikroskops ermittelt werden. Es ist insbesondere bevorzugt, wenn das Epidermisäquivalent 2 bis 10 voneinander verschiedene Zellschichten aufweist, wobei mindestens eine dieser Zellschichten ausgewählt ist aus Stratum corneum, Stratum spinosum sowie Stratum granulosum.

Es hat sich erfindungsgemäß als vorteilhaft erwiesen, wenn das Epidermisäquivalent eine bestimmte Gesamtzellzahl an primären Keratinozyten enthält. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn das Epidermisäquivalent primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtzellzahl von 4x10 ⁵ bis 5x10 ⁶ , vorzugsweise von 5,5x10 ⁵ bis 4x10 ⁶ , insbesondere von 6,5x10 ⁵ bis 3,5x10 ⁶ , enthält. Epidermisäquivalente, welche die zuvor genannten Gesamtzellzahlen an primären Keratinozyten enthalten, weisen eine Differenzierung auf, welche der Differenzierung in der Epidermis der humanen Haut sehr ähnlich ist. Hierdurch wird gewährleistet, dass die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle die in-vivo Situation möglichst genau nachbilden.

Als vierten wesentlichen Bestandteil umfasst das erfindungsgemäße Vollhautmodell eine Basalmembran, welche sich zwischen dem Dermis- und dem Epidermisäquivalent befindet.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Basalmembran des Vollhautmodells bestimmte Proteine umfasst. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Basalmembran Proteine aus der Gruppe von Laminin, Collagen Typ IV sowie deren Mischung umfasst. Basalmembranen, welche die zuvor angeführten Proteine enthalten, führen zu einer besonders effektiven Verbindung zwischen dem Dermis- und dem Epidermisäquivalent und gewährleisten auf diese Weise eine gute Stabilität und Handhabbarkeit der erfindungsgemäßen Vollhautmodelle.

Die erfindungsgemäßen Vollhautmodelle enthalten bevorzugt 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente. Die Inkorporation der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente erlaubt eine verbesserte Wiedergabe der in-vivo Situation in der Humanhaut im Vergleich zu Vollhautmodellen, welche keine Schweißdrüsen oder Schweißdrüsenäquivalente enthalten. Die Inkorporation einer gleichen Anzahl an diskreten Schweißdrüsenäquivalenten erlaubt zudem die Herstellung von standardisierbaren Vollhautmodellen im Vergleich zu der Verwendung von Stanzbiopsien mit einer jeweils variierenden Anzahl an Schweißdrüsen in diesen Biopsien. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 2 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, vorzugsweise 5 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, bevorzugt 20 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, insbesondere 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, umfasst.

Die in dem erfindungsgemäßen Vollhautmodell enthaltenen diskreten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente können beispielsweise mittels der Hanging-Drop-Methode aus primären Schweißdrüsenzellen unter ausschließlicher Verwendung von in-vitro Methoden hergestellt werden. Hierzu werden zunächst Schweißdrüsen aus Hautbiopsien, insbesondere native ekkrine und/oder apokrine Schweißdrüsen aus Hautbiopsien, isoliert. Die Isolierung kann mittels enzymatischem Verdau der menschlichen Haut unter Verwendung einer Mischung aus 2 bis 3 mg/ml Collagenase II und 0,1 bis 0,2 mg/ml Thermolysin für 3 bis 6 Stunden bei 35 bis 40 °C, insbesondere bei 37°C, erfolgen. Durch Kultivierung der isolierten Schweißdrüsen können primäre Schweißdrüsenzellen gewonnen werden. Nach schonender Trypsinierung zur Ablösung der primären Schweißdrüsenzellen werden diese für 7 bis 28 Tage in Monolayer-Kulturen kultiviert und anschließend in einem Nährmedium aus DMEM und Ham ^' s F12 im Gewichtsverhältnis 3:1 , welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, suspendiert. Nach Einstellung einer Konzentration von 50 bis 250.000, insbesondere 400 bis 600 Zellen pro μΙ Medium werden 10 bis 100 μΙ, insbesondere 40 bis 60 μΙ dieser Suspension in hängendem Zustand in einer Hanging-Drop Multiwellplatte für 2 bis 7 Tage bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem C02-Gehalt 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, kultiviert, wodurch sich dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente ausbilden. Diese Äquivalente können sofort nach deren Ernte oder nach weiterer Kultivierung für 1 bis 6 Tage in das Vollhautmodell integriert werden. Die Ernte kann durch Zugabe von 70 bis 100 μΙ des zuvor beschriebenen Nährmediums erfolgen. Die Herstellung der in dem erfindungsgemäßen Vollhautmodell enthaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente ist in der deutschen Patentanmeldung DE 10 2015 222 279.9, eingereicht am 12. November 2015, beschrieben, deren gesamter Offenbarungsgehalt hiermit eingeschlossen ist.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in dem Dermisäquivalent enthalten. Die Inkorporation dieser Schweißdrüsenäquivalente in das Dermisäquivalent erlaubt eine bessere Nachstellung der in-vivo Situation. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn das Dermisäquivalent b) die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente umfasst. Durch Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in das Dermisäquivalent werden Zell-Zell-Interaktionen ermöglicht, welche auch in-vivo vorliegen und welche beispielsweise an Wundheilungsprozessen beteiligt sind.

In dem erfindungsgemäßen Vollhautmodell sind bevorzugt dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente enthalten, welche bestimmte Durchmesser aufweisen. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils einen Durchmesser von 100 bis 4.000 μιη, vorzugsweise von 100 bis 3.000 μιη, insbesondere von 200 bis 2.500 μιη, aufweisen. Die Angabe des Durchmessers bezieht sich hierbei auf den Durchmesser eines einzelnen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents. Der Durchmesser der kugelförmigen erfindungsgemäßen Schweißdrüsenäquivalente kann beispielsweise mittels mikroskopischer Vermessung unter Verwendung der Software„CellSens" durchgeführt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn die in dem erfindungsgemäßen Vollhautmodell enthaltenen Schweißdrüsenäquivalente frei sind von Matrixverbindungen und/oder Trägern. Unter Matrixverbindungen sind hierbei Verbindungen zu verstehen, welche zur Ausbildung räumlicher Netzwerke in der Lage sind. Hierunter fallen jedoch nicht die von den Zellen selbst produzierten und ausgeschiedenen Substanzen, welche zur Ausbildung räumlicher Netzwerke in der Lage sind. Weiterhin werden unter Trägern im Sinne der vorliegenden Erfindung selbsttragende Stoffe verstanden, welche als Unterlage bzw. Gerüst für die Schweißdrüsenzellen dienen können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils frei von Matrixverbindungen und/oder Trägern, insbesondere frei von Matrixverbindungen und Trägern, sind.

Unter dem Begriff „frei von" wird erfindungsgemäß verstanden, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente weniger als 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und/oder Trägern enthalten. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, wenn das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent 0 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugt 0 bis 0,2 Gew.-%, insbesondere 0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und Trägern enthält.

In diesem Zusammenhang ist es besonders vorteilhaft, wenn die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente frei sind von bestimmten Matrixverbindungen und Träger. Es ist daher bevorzugt, wenn das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent keine Matrixverbindungen und/oder Träger enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe von Collagenen, insbesondere Collagen Typ I und/oder Typ III und/oder Typ IV, Scleroproteinen, Gelatinen, Chitosanen, Glucosaminen, Glucosaminoglucanen (GAG), Heparinsulfatproteoglucanen, sulfatierten Glycoproteinen, Wachstumsfaktoren, vernetzten Polysacchariden, vernetzten Polypeptiden sowie deren Mischungen.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei den in dem erfindungsgemäßen Hautäquivalent enthaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten um Äquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse sind. Vollhautmodelle, welche derartige Schweißdrüsenäquivalente enthalten, sind besonders gut zur Identifizierung von schweißhemmenden Wirkstoffen für die in-vivo Anwendung beim Menschen geeignet.

Im Folgenden sind besonders bevorzugte erfindungsgemäße Vollhautmodelle beschrieben.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein in- vitro Vollhautmodell, umfassend

a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,

b) mindestens ein Dermisäquivalent

c) mindestens ein Epidermisäquivalent

d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,

dadurch gekennzeichnet, dass

das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.

Weiterhin ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein in-vitro Vollhautmodell, umfassend

a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,

b) mindestens ein Dermisäquivalent, wobei das Dermisäquivalent aus humanen primären Fibroblasten gebildet ist,

c) mindestens ein Epidermisäquivalent

d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,

dadurch gekennzeichnet, dass

das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.

Darüber hinaus ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ein in-vitro Vollhautmodell, umfassend a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,

b) mindestens ein Dermisäquivalent, wobei das Dermisäquivalent aus humanen primären Fibroblasten gebildet ist,

c) mindestens ein Epidermisäquivalent, wobei das Epidermisäquivalent aus humanen primären Keratinozyten gebildet ist und wobei das Epidermisäquivalent mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht umfasst

d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,

dadurch gekennzeichnet, dass

das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.

Zudem ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ein in-vitro Vollhautmodell, umfassend

a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,

b) mindestens ein Dermisäquivalent, wobei das Dermisäquivalent aus humanen primären Fibroblasten gebildet ist,

c) mindestens ein Epidermisäquivalent, wobei das Epidermisäquivalent aus humanen primären Keratinozyten gebildet ist und wobei das Epidermisäquivalent mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht umfasst

d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet und wobei die Basalmembran Proteine aus der Gruppe von Laminin, Collagen Typ IV sowie deren Mischung umfasst,

dadurch gekennzeichnet, dass

das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.

Schließlich ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ein in- vitro Vollhautmodell, umfassend a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,

b) mindestens ein Dermisäquivalent, wobei das Dermisäquivalent aus humanen primären Fibroblasten gebildet ist,

c) mindestens ein Epidermisäquivalent, wobei das Epidermisäquivalent aus humanen primären Keratinozyten gebildet ist und wobei das Epidermisäquivalent mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht umfasst

d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet und wobei die Basalmembran Proteine aus der Gruppe von Laminin, Kollagen Typ IV sowie deren Mischung umfasst,

dadurch gekennzeichnet, dass

das Dermisäquivalent b) 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 200 bis 2.500 μιη aufweisen und wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse sind.

Die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle weisen eine höhere Standardisierbarkeit und Verfügbarkeit auf wie die derzeit verwendeten Stanzbiopsien und besitzen eine größere Nähe zur in-vivo Situation als Vollhautmodelle, welche keine Schweißdrüsen und/oder Schweißdrüsenäquivalente enthalten. Weiterhin stellen diese Hautäquivalente eine kostengünstige Alternative zu in-vivo Studien am Menschen dar, da mittels dieser Vollhautmodelle die schweißhemmende Wirkung von Testsubstanzen untersucht werden kann, beispielsweise durch Vergleich der Genexpression bzw. Proteinexpression bei einer Stimulierung mit Acetylcholin (ACh) in An- und Abwesenheit einer bestimmten Testsubstanz. Die erfindungsgemäßen Vollhautmodelle simulieren die menschliche Haut in-vivo sowohl in ihrer Struktur als auch in ihrer histologischen Zusammensetzung, so dass die mit diesen Modellen erhaltenen Informationen gut auf den Menschen übertragbar sind und sich auch mit Daten für bereits in-vivo getestete Verbindungen vergleichen lassen.

Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen,

b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage,

d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,

e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,

wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt.

Unter dem Begriff „Suspension von schwer löslichem Collagen" wird erfindungsgemäß eine homogene Mischung von festem Collagen in einem Lösungsmittel, bevorzugt Wasser, verstanden. Zur Herstellung der homogenen Suspension können dem Fachmann bekannte Vorrichtungen, wie statische Mischer oder Ultra Turrex-Mischer, verwendet werden.

Weiterhin bedeutet der Begriff„Kultivieren" ein vorzugsweise in-vitro stattfindendes Aufrechterhalten der Lebensfunktionen von Zellen, insbesondere von Fibroblasten und Keratinozyten, in einer geeigneten Umgebung, beispielsweise unter Zu- und Abfuhr von Stoffwechseledukten und - Produkten, insbesondere auch unter Vermehrung der Zellen.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die in Verfahrensschritt a) bereitgestellte Suspension eine bestimmte Gesamtmenge an Collagen enthält. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält. Der Einsatz von Suspensionen mit den zuvor angeführten Gesamtmengen an Collagen führt zur Ausbildung von besonders stabilen Trägerschichten, so dass eine hohe Stabilität und gute Handhabbarkeit der aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden Vollhautmodelle gewährleistet ist.

Darüber hinaus hat es sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0, 1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist. Der Einsatz von Suspensionen mit den zuvor genannten pH-Werten führt zu der Ausbildung von besonders stabilen Trägerschichten.

Vor der Lyophilisierung in Verfahrensschritt b) wird die Collagensuspension bevorzugt in Behältnisse gegeben, deren Dimensionen denen der gewünschten Trägerschicht entsprechen. Im Rahmen des Verfahrens geeignete Behältnisse sind beispielsweise Kavitäten von Mikrotiterplatten. Zusätzlich ist es möglich, diese Behältnisse vor Zugabe der Collagensuspension mit geeigneten Agentien zu beschichten, um die Haftung der Trägerschicht an der Gefäßwand zu verbessern. Geeignete Agentien sind beispielsweise Gelatine, Polylysin, Fibrin bzw. Fibrinogen/Thrombin oder Fibronectin. Hierzu werden zunächst die inneren Gefäßwände mit den zuvor genannten Agentien benetzt und anschließend getrocknet, so dass eine Schicht der Agentien auf der inneren Gefäßfläche haften bleibt. Anschließend wird die Collagensuspension eingefüllt. Die in Verfahrensschritt b) durchgeführte Lyophilisierung erfolgt bevorzugt in diesen Gefäßen. Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Lyophilisierung mit einer bestimmten Kühlrate erfolgt. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt. Die langsame Abkühlrate führt zur Ausbildung eines Häutchens an der Oberfläche der lyophilisierten Trägerschicht, wobei das Häutchen an der Oberfläche Poren aufweist. Diese Poren bilden für die nachfolgende Besiedlung mit Fibroblasten besonders gute Bedingungen, da sie ein langsames Einwandern der Fibroblasten in die Trägerschicht fördern. Höhere Abkühlraten als die zuvor genannten führen hingegen zu einer Trägerschicht mit größeren Poren, welche die Fibroblasten in der gegebenen Kultivierungszeit nicht vollständig mit neusynthetisierter extrazellulärer Matrix ausfüllen können. Ausgesäte Fibroblasten können daher in diesen großen Poren aggregieren und ausdifferenzieren, wodurch die Schichtung und damit die Differenzierung der Dermis empfindlich gestört werden kann. Die zuvor angeführte Abkühlrate gewährleistet daher die Bereitstellung einer Trägerschicht, welche durch die Fibroblasten optimal besiedelt werden kann. Hierdurch wird eine ungestörte Differenzierung erreicht, welche auch derjenigen in der menschlichen Haut entspricht.

Falls als Trägersubstanz eine vernetzte Collagenmatrix verwendet werden soll, erfolgt die Vernetzung dieser Matrix nach der in Verfahrensschritt c) beschriebenen Lyophilisierung. Hierzu eignen sich insbesondere die zuvor im Zusammenhang mit dem ersten Erfindungsgegenstand beschriebenen Vernetzungsmittel. Besonders bevorzugt wird Glutaraldehyd zur Vernetzung eingesetzt. Durch die Vernetzung wird ein Schrumpfungsprozess der Vollhautmodelle während der Herstellung vermieden, so dass aufgrund der einheitlichen Größe und Beschaffenheit eine hohe Reproduzierbarkeit gewährleistet werden kann.

Die Gewinnung und Kultivierung der zur Herstellung des Dermisäquivalents eingesetzten Fibroblasten erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden. Bevorzugt werden Fibroblasten einer geeigneten Passage, insbesondere der dritten oder vierten Passage, in einer Zellkulturflasche vorkultiviert und unmittelbar vor deren Einsatz durch Trypsinierung vom Boden abgelöst. Als Nährmedium zur Kultivierung der Fibroblasten kann beispielsweise DMEM, welches 10 Gew.-% FCS enthält, eingesetzt werden. Es hat sich erfindungsgemäß als vorteilhaft herausgestellt, wenn zur Herstellung des Dermisäquivalents bestimmte Gesamtkonzentrationen an Fibroblasten verwendet werden. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x10 ⁵ bis 2x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x10 ⁵ bis 1x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x10 ⁵ bis 7x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x10 ⁵ bis 5, 5x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, verwendet werden. Als Medium wird bevorzugt ein DMEM-Medium, welches 10 Gew.-% FCS enthält, eingesetzt. Zur weiteren Stabilisierung kann dem Kulturmedium zusätzlich humanes Fibronection und/oder Laminin zugegeben werden. Bei Fibronection handelt es sich um in Fibroblasten produzierte Struktur- bzw. Adhäsionsproteine, deren Funktion in-vivo in der Bindung anderer Makromoleküle, beispielsweise Collagen, und in der Anheftung von Zellen an Nachbarzellen besteht. Laminin ist ein Protein der Basalmembran, an das Zellen adhärieren können. Durch die Zugabe von Fibronection und/oder Laminin zum Kulturmedium wird die Bindung der Fibroblasten an die Trägerschicht sowie untereinander verstärkt. Der Einsatz der zuvor genannten Gesamtkonzentrationen stellt eine ausreichende Besiedelung der Trägerschicht mit den Fibroblasten sicher. Die Zellzahl der primären Fibroblasten kann beispielsweise unter Verwendung einer klassischen Zählkammer sowie Trypanblau bestimmt werden. Hierzu wird die Suspension von kultivierten primären Fibroblasten unverdünnt mit einer Trypanblau-Lösung versetzt und die Anzahl der Zellen in den entsprechenden Eckquadraten bestimmt. Aus diesen Werten wird das arithmetische Mittel gebildet. Unter Berücksichtigung des Volumens der Zählkammer, dem Verdünnungsfaktor und dem Kammerfaktor wird aus diesem Mittelwert die Zellzahl pro ml bzw. μΙ bestimmt. Die in Verfahrensschritt c) verwendete Zellzahl bezieht sich hierbei auf die Zahl der lebenden Zellen (Lebendzahl).

Die Kultivierung der in Verfahrensschritt c) auf die Trägerschicht aufgebrachte Fibroblasten erfolgt bevorzugt in einer Submers-Kultur. Hierunter wird die Kultivierung von mit Nährlösung bedeckten Fibroblasten verstanden. Durch Veränderung der Kultivierungsbedingungen oder durch Zugabe von chemischen Substanzen, wie Ceramiden und Vitamin C, zum Medium kann zusätzlich eine Barrierefunktion erzeugt werden. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Kultivierung der primären Fibroblasten, insbesondere der humanen primären Fibroblasten, in Schritt c) über einen Zeitraum von 8 bis 25 Tagen, vorzugsweise von 10 bis 22 Tagen, bevorzugt von 1 1 bis 20 Tagen, insbesondere von 12 bis 18 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt.

Die Gewinnung und Kultivierung der zur Herstellung des Epidermisäquivalents eingesetzten Keratinozyten erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden. Bevorzugt werden Keratinozyten der ersten und/oder zweiten Passage in einer Zellkulturflasche unmittelbar vor deren Einsatz durch Trypsinierung vom Boden abgelöst. Als Nährmedium zur Kultivierung der Fibroblasten kann beispielsweise eine Mischung aus DMEM und Ham ^' s F12, welche 1 bis 30 Gew.-% FCS sowie weitere Serumprodukte und Additive enthält, eingesetzt werden. In Verfahrensschritt d) erfolgt die Aufbringung von Keratinozyten auf das in Verfahrensschritt c) herstellte Dermisäquivalent. Auch hier hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Keratinozyten in einer bestimmten Gesamtkonzentration eingesetzt werden. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn in Schritt d) primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtkonzentration von 1 ,5x10 ⁵ bis 1x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 2,5x10 ⁵ bis 9x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 3,5x10 ⁵ bis 7x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4x10 ⁵ bis 5x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, verwendet werden. Der Einsatz der zuvor genannten Gesamtkonzentrationen stellt eine ausreichende Besiedelung des Dermisäquivalent mit den Keratinozyten sicher. Die Zellzahl kann dabei wie zuvor im Zusammenhang mit der Zellzahl der Fibroblasten beschrieben ermittelt werden.

Die in Verfahrensschritt d) aufgebrachten Keratinozyten werden bevorzugt für eine bestimmte Zeit in einer Submers-Kultur kultiviert. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Kultivierung der primären Keratinozyten, insbesondere der humanen primären Keratinozyten, in Schritt d) in einer Submers-Kultur über einen Zeitraum von 1 bis 8 Tagen, vorzugsweise von 1 bis 6 Tagen, bevorzugt von 1 bis 4 Tagen, insbesondere von 1 bis 2 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt. Besonders bevorzugt erfolgt die Aussaat der Keratinozyten auf die Trägerschicht in einem Zellkulturmedium, besonders bevorzugt DMEM/F12- Medium, welches etwa 1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums, fötales Kälberserum (FCS), NCS, definiertes Serum oder Serumersatzprodukte und verschiedene Additive enthält, welche die Proliferation und Differenzierung der Zellen fördern. Anschließend wird die Trägerschicht mit DMEM-Medium, enthaltend insbesondere EGF aus der Maus oder auch vergleichbare Präparate aus anderen Tieren, epidermalen Wachstumsfaktor (hEGF) (z.B. in einer Konzentration von 0,2 igl\ Medium), und beispielsweise 0,8 mM CaCb, überschichtet und einer vorzugsweise 1 - bis 8-tägigen Submers-Kultur unterworfen.

Eine vollständige Differenzierung der Keratinozytenschichten wird durch Kultivierung der Keratinozyten an der Medium-Luft-Grenze erreicht. Diese Art der Kultivierung wird auch als Airlift- Kultur bezeichnet, wobei als Kulturmedium DMEM ohne hEGF und BPE (bovine pituitary extract) eingesetzt wird. Unter einer„Airlift-Kultur" wird eine Kultur verstanden, bei welcher die Höhe des Nährmediumspiegels genau auf die Höhe des Dermisäquivalents abgestimmt ist, während die durch die Keratinozyten ausgebildeten Zellschichten über dem Nährmediumspiegel liegen und vom Nährmedium nicht bedeckt werden, d. h. die Kultivierung erfolgt an der Grenzschicht Luft- Nährmedium, wobei die Versorgung der Kulturen von unten her erfolgt. Dazu werden die Modelle aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatte gehoben und auf Filterpapiere gesetzt, welche auf metallenen Abstandshaltern in Petrischalen ruhen. Das Medium wird in den Petrischalen so hoch eingefüllt, dass es das Filterpapier nicht vollständig bedeckt, dass aber ein Flüssigkeitskragen um die Basis der Hautmodelle vorhanden ist (auch als Air-Liquid-Interface bezeichnet). Während der Kultivierung an der Luft-Nährmediumgrenze bildet sich ein hauttypisches Epidermisäquivalent aus. Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium- Grenze über einen Zeitraum von 8 bis 35 Tagen, vorzugsweise von 9 bis 30 Tagen, bevorzugt von 10 bis 20 Tagen, insbesondere von 10 bis 13 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt.

Die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem Verfahrensschritt c) und/oder d) eingebracht. Die Einbringung der Schweißdrüsenäquivalente in Verfahrensschritt c) während der Herstellung des Dermisäquivalents ist erfindungsgemäß bevorzugt, da hierdurch die in-vivo Situation sehr gut nachgestellt werden kann. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in Schritt c) erfolgt, wobei die primären Fibroblasten, insbesondere die humanen primären Fibroblasten, mit den dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten vermischt und anschließend auf die in Schritt b) herstellte Trägerschicht aufgebracht werden.

Es kann erfindungsgemäß jedoch auch vorgesehen sein, die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente während Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens einzubringen. Es ist daher erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt, wenn die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in Schritt d) erfolgt, wobei 1 bis 3 Stunden vor Aufbringung der primären Keratinozyten, insbesondere humanen primären Keratinozyten, die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente ausgesät werden. Unter dem Begriff „Aussähen" ist hierbei die Aufbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente auf die Oberfläche des Dermisäquivalents zu verstehen.

Erfindungsgemäß erfolgt in den zuvor genannten Verfahrensschritten c) und/oder d) die Einbringung von 1 bis 100 diskreten Schweißdrüsenäquivalenten mit jeweils einer Zellzahl von 500 bis 500.000 Zellen sowie einem Durchmesser von 100 bis 6.000 μιη. Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn eine größere Anzahl an Schweißdrüsenäquivalenten mit einem geringen Durchmesser in die Vollhautmodelle eingebracht wird. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn in Schritt c) und/oder in Schritt d), insbesondere in Schritt c), 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 500 bis 2.500 μιη eingebracht werden.

Im Folgenden sind besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von in-vitro Vollhautmodellen beschrieben. Bei diesen Verfahren handelt es sich bevorzugt um Verfahren, bei welchen alle Verfahrensschritte ausschließlich unter Verwendung von in-vitro Methoden durchgeführt werden.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst: a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,

b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension,

c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage,

d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,

e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,

wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,

b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, wobei die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,

e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,

wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,

b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, wobei die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, wobei zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x10 ⁵ bis 2x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x10 ⁵ bis 1 x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x10 ⁵ bis 7x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x10 ⁵ bis 5,5x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, verwendet werden,

d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,

e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,

wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt. Darüber hinaus ist eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,

b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, wobei die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, wobei zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x10 ⁵ bis 2x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x10 ⁵ bis 1 x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x10 ⁵ bis 7x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x10 ⁵ bis 5,5x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, verwendet werden,

d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen, wobei in Schritt d) primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtkonzentration von 1 ,5x10 ⁵ bis 1x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 2,5x10 ⁵ bis 9x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 3,5x10 ⁵ bis 7x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4x10 ⁵ bis 5x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, verwendet werden,

e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,

wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt.

Schließlich ist eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,

b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, wobei die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, wobei zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x10 ⁵ bis 2x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x10 ⁵ bis 1 x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x10 ⁵ bis 7x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x10 ⁵ bis 5,5x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, verwendet werden,

d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen, wobei in Schritt d) primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtkonzentration von 1 ,5x10 ⁵ bis 1x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 2,5x10 ⁵ bis 9x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 3,5x10 ⁵ bis 7x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4x10 ⁵ bis 5x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, verwendet werden,

e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,

wobei die Einbringung von 50 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) erfolgt.

In den zuvor beschriebenen Verfahren zur Herstellung von in-vitro Vollhautmodellen werden bevorzugt dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse eingebracht.

Die erfindungsgemäßen Verfahren weisen den Vorteil auf, dass zur Herstellung der in-vitro Vollhautmodelle keinerlei Verwendung von in-vivo Methoden erforderlich sind. Folglich können diese Modelle auch zur Testung von Substanzen verwendet werden, welche zur kosmetischen Anwendung vorgesehen sind. Weiterhin erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine kostengünstige Herstellung von standardisierten Modellen, welche in Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten eingesetzt werden können. Zudem resultiert dieses Herste II verfahren in Vollhautmodellen, welche unterschiedlich differenzierte Zellenschichten aufweisen und Schweißdrüsenspezifische Marker exprimieren, so dass eine gute Übertragbarkeit der mit diesen Modellen generierten in-vitro Daten auf die in-vivo-Situation ermöglicht wird.

Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen Gesagte.

Ein dritter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen in- vitro Vollhautmodells in der Kosmetik und der Körperpflege, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung von kosmetischen Wirkstoffen, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung und/oder Verminderung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch. Wie bereits zuvor ausgeführt, kann dieses Vollhautmodell als in-vitro Modell zur Ermittlung des Einflusses von Testsubstanzen auf die Schweißdrüsen im Bereich der Kosmetik und insbesondere der Körperpflege eingesetzt werden. Aufgrund der hohen Standardisierbarkeit sowie der guten Simulation der in-vivo-Situation können die erfindungsgemäßen Vollhautmodelle insbesondere zur Auffindung neuer schweißhemmender Wirkstoffe verwendet werden. Das erfindungsgemäße Vollhautmodell eignet sich insbesondere zur Produktprüfung, beispielsweise im Hinblick auf die Wirksamkeit, unerwünschte Nebenwirkungen, beispielsweise Reiz-, Toxizitäts- und Entzündungswirkungen, allergieauslösende Wirkungen oder Verträglichkeit von Substanzen. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Vollhautmodell auch für Studien zur Resorption, zum Transport und/oder zur Penetration von Substanzen sowie zur Wundheilung verwendet werden. Weiterhin können an diesem Modell die Auswirkungen von äußeren Umwelteinflüssen, wie Strahlung, Wärme, Radioaktivität, elektrische Felder oder dergleichen, auf die Haut untersucht werden. Die Wirkung derartiger Einflüsse kann beispielsweise durch Auswertung der Genexpression, des Stoffwechsels, der Proliferation, der Differenzierung sowie der Reorganisation der Zellen ermittelt werden. Auch kann es vorgesehen sein, das erfindungsgemäße in-vitro Vollhautmodell mit Mikroorganismen, insbesondere pathogenen Mikroorganismen, wie Pilzen, Bakterien und Viren, zu besiedeln, um Infektionsprozesse und deren Heilung zu studieren.

Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodells in vorzugsweise automatisierten Screeningverfahren, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung und/oder Verminderung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch.

Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodells zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung und/oder Verminderung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.

Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte.

Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein System, insbesondere Testsystem, umfassend ein erfindungsgemäßes in-vitro Vollhautmodell.

Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte.

Zusammenfassend wird die vorliegende Erfindung insbesondere durch nachfolgende Punkte charakterisiert:

1. In-vitro Vollhautmodell, umfassend

a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix

b) mindestens ein Dermisäquivalent

c) mindestens ein Epidermisäquivalent

d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,

dadurch gekennzeichnet, dass

das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen

Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.

2. In-vitro Vollhautmodell nach Punkt 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix ein schwer lösliches Collagen, insbesondere ein schwer lösliches Collagen aus Sehnen von Pferden, Schweinen oder Rindern, umfasst.

3. In-vitro Vollhautmodell nach einem der Punkte 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix ein lyophilisiertes schwer lösliches Collagen, insbesondere ein lyophilisiertes schwer lösliches Collagen aus Sehnen von Pferden, Schweinen oder Rindern, umfasst.

4. In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an Collagen, insbesondere lyophilisiertem schwer löslichem Collagen, von 0,5 bis 5,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,8 bis 3,5 Gew.-%, bevorzugt von 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält. In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist.

In-vitro Vollhautmodell nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet dass die Vernetzung der Collagenmatrix mittels eines chemischen Vernetzungsmittels aus der Gruppe von Glutaraldehyd, p-Benzochinon, Dimehtyladipimidat, Dimethylpimelinidat, Dimethylsuberimidat, 1 ,4-Phenylendiisothiocyanat, Polyoxyethylen-bis-(imidazolyl carbonyl), bis[Polyoxyethylen- bis(imidazolyl carbonyl)] und Suberinsäure-bis(N-hydroxysuccinimidester), 1-Ethyl-3-(3- dimethyl aminopropyl)-carbodiimid, Enzymen sowie deren Mischungen, insbesondere Glutaraldehyd, erfolgt.

In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent aus primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, gebildet ist.

In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtzellzahl von 5x10 ⁵ bis 6x10 ⁶ , vorzugsweise von 6x10 ⁵ bis 5x10 ⁶ , insbesondere von 7x10 ⁵ bis 4x10 ⁶ , enthält.

In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Epidermisäquivalent aus primären Keratinozyten, insbesondere humanen primären Keratinozyten, gebildet ist.

In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Epidermisäquivalent mehrere voneinander verschiedene Zellschichten, insbesondere mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht, umfasst.

In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Epidermisäquivalent primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtzellzahl von 4x10 ⁵ bis 5x10 ⁶ , vorzugsweise von 5,5x10 ⁵ bis 4x10 ⁶ , insbesondere von 6,5x10 ⁵ bis 3,5x10 ⁶ , enthält.

In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Basalmembran Proteine aus der Gruppe von Laminin, Collagen Typ IV sowie deren Mischung umfasst.

In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 2 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, vorzugsweise 5 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, bevorzugt 20 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, insbesondere 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, umfasst.

In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent b) die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente umfasst. In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils einen Durchmesser von 100 bis 4.000 μιη, vorzugsweise von 100 bis 3.000 μιη, insbesondere von 200 bis 2.500 μιη, aufweisen. In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils frei von Matrixverbindungen und/oder Trägern, insbesondere frei von Matrixverbindungen und Trägern, sind.

In-vitro Vollhautmodell nach Punkt 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrixverbindungen und/oder Träger ausgewählt sind aus der Gruppe von Collagenen, insbesondere Collagen Typ I und/oder Typ III und/oder Typ IV, Scleroproteinen, Gelatinen, Chitosanen, Glucosaminen, Glucosaminoglucanen (GAG), Heparinsulfatproteoglucanen, sulfatierten Glycoproteinen, Wachstumsfaktoren, vernetzten Polysacchariden, vernetzten Polypeptiden sowie deren Mischungen.

In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse sind. Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen,

b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension,

c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,

e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,

wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt. Verfahren nach Punkt 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält.

Verfahren nach einem der Punkte 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0, 1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist. Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt.

Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x10 ⁵ bis 2x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x10 ⁵ bis 1x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x10 ⁵ bis 7x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x10 ⁵ bis 5, 5x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, verwendet werden. Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der primären Fibroblasten, insbesondere der humanen primären Fibroblasten, in Schritt c) über einen Zeitraum von 8 bis 25 Tagen, vorzugsweise von 10 bis 22 Tagen, bevorzugt von 1 1 bis 20 Tagen, insbesondere von 12 bis 18 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt. Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtkonzentration von 1 ,5x10 ⁵ bis 1x10 ⁶ Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 2,5x10 ⁵ bis 9x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 3,5x10 ⁵ bis 7x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4x10 ⁵ bis 5x10 ⁵ Zellen pro ml Medium, verwendet werden.

Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der primären Keratinozyten, insbesondere der humanen primären Keratinozyten, in Schritt d) in einer Submers-Kultur über einen Zeitraum von 1 bis 8 Tagen, vorzugsweise von 1 bis 6 Tagen, bevorzugt von 1 bis 4 Tagen, insbesondere von 1 bis 2 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt.

Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 8 bis 35 Tagen, vorzugsweise von 9 bis 30 Tagen, bevorzugt von 10 bis 20 Tagen, insbesondere von 10 bis 13 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt.

Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in Schritt c) erfolgt, wobei die primären Fibroblasten, insbesondere die humanen primären Fibroblasten, mit den dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten vermischt und anschließend auf die in Schritt b) herstellte Trägerschicht aufgebracht werden.

Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in Schritt d) erfolgt, wobei 1 bis 3 Stunden vor Aufbringung der primären Keratinozyten, insbesondere humanen primären Keratinozyten, die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente ausgesät werden.

Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) und/oder in Schritt d), insbesondere in Schritt c), 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente mit einer Zellzahl von jeweils 50 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 500 bis 2.500 μιη eingebracht werden.

31. Verwendung des in-vitro Vollhautmodells nach einem der Punkte 1 bis 18 in der Kosmetik und der Körperpflege, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung von kosmetischen Wirkstoffen, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung und/oder Verminderung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch.

32. Verwendung eines in-vitro Vollhautmodells nach einem der Punkte 1 bis 18 in vorzugsweise automatisierten Screeningverfahren, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung und/oder Verminderung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch.

33. Verwendung eines in-vitro Vollhautmodells nach einem der Punkte 1 bis 18 zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung und/oder Verminderung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.

34. System, insbesondere Testsystem, umfassend ein in-vitro Vollhautmodell nach einem der Punkte 1 bis 18.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken: Beispiele:

1.1 Isolation der Schweißdrüsen

Die nativen Schweißdrüsen wurden aus humanen Gewebeproben, sogenannten Biopsien gewonnen, welche aus plastischen Operationen von Patienten stammen, die der Verwendung des Materials zu Forschungszwecken zugestimmt haben. Das verwendete Gewebe wurde bei Oberarmstraffungen und Gesichtsstraffungen entnommen. Hieraus wurden die ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen aus dem Achselbereich isoliert.

Hierzu wurde die jeweilige Biopsie in kleine Stücke zerteilt und danach in Stücke von maximal ca. 1 cm x 1 cm geschnitten wurde. Anschließend erfolgte der Verdau der Haut mit einem Gemisch aus gleichen Teilen Collagenase II (5 mg/ml) und Thermolysin (0,25 mg/ml) bei 37 °C im Brutschrank für ca. 3,5 bis 5 Stunden, bis das Bindegewebe fast vollständig verdaut war. Diese Mischung wurde anschließend bei 1200 rpm für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen, um die Enzymlösung sowie das überschüssige Fett zu entfernen. Das entstandene Pellet wurde in DMEM- Lösung aufgenommen und die Lösung in eine Petrischale überführt. Anhand einer Mikrokapillare wurden intakte Schweißdrüsen unter einem Binokular isoliert und in frisches DMEM-Medium überführt.

1.2 Kultivieren der isolierten nativen Schweißdrüsen

Die in Schritt 1.1 isolierten Schweißdrüsen wurden in Collagen-I beschichtete Kulturflaschen gegeben und anschließend 25 ml Nährmedium hinzugefügt. Nach Kultivierung für 7 bis 21 Tage im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die auswachsenden Schweißdrüsenzellen abgelöst und auf Collagen-I beschichteten Kulturflaschen erneut bis zur Konfluenz kultiviert (Monolayer-Kultur der primären Schweißdrüsenzellen).

Die Zusammensetzung des eingesetzten Nährmediums ist wie folgt:

1 .3 Herstellung der Zellpräparation und der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente

Nach Bestimmung der genauen Zellzahlen der obigen Monolayer-Kulturen der primären Schweißdrüsenzellen wurden diese unter Verwendung des obigen Nährmediums auf eine Zellzahl von 10 bis 5.000 Zellen pro μΙ eingestellt und anschließend je 50 μΙ dieser Zellsuspension mittels des„SureDrop® Inlef'-Einführsystems in Wells einer„GravityPLUS®"-Einsaatplatte (jeweils Firma Inshpero AG, Schweiz) überführt. Die Kultivierung erfolgt bei 36 bis 38 °C und einem C02-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre. Nach 1 bis 3 Tagen werden jeweils 40 Vol.-% des Mediums in den Wells der„GravityPLUS®"- Einsaatplatte durch frisches Nährmedium ersetzt. Nach 3 bis 5 Tagen Kultivierung werden die SD- Schweißdrüsenäquivalente durch Zugabe von 50 bis 200 [iL Nährmedium geerntet und in eine „GravityTRAP®"-Platte (Firma Insphero AG, Schweiz) überführt. Vor der Ernte wird die „GravityTRAP®"-Platte mit 60 bis 100 [iL Keratinozyten-Medium mithilfe einer Multikanalpipette angefeuchtet, um die Bildung von Luftblasen zu minimieren und den Verlust der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente zu vermeiden. Nach der Ernte wird die Platte für 1 bis 5 Minuten bei 100 bis 300 xg zentrifugiert, um Luftblasen zu entfernen.

1 .4 Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells mit dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten in dem Dermisäquivalent

Die Herstellung der Trägerschicht, welche eine vernetzte Collagenmatrix umfasst, erfolgt analog dem in den Beispielen 1 und 2 auf den Seiten 22 und 23 der Offenlegungsschrift WO 2006/019147 A1 beschriebenen Verfahren. Nach Absaugen des Mediums wird auf diese in Mikrotiterplatten befindliche Trägerschicht 1 ml einer Mischung vorkultivierten Fibroblasten (6x10 ⁵ Fibroblasten pro ml Medium, als Medium wird DMEM mit 10 Gew.-% FCS, 100 U/ml Penicillin G, 25 μg/ml Gentamicin sowie 1 mM Ascorbyl-2-phosphat verwendet) mit 60 bis 100 der unter Punkt 1.3 herstellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente (Zellzahl pro Äquivalent ca. 25.000 Schweißdrüsenzellen) gegeben. Hierzu werden die in Kulturflaschen vorkultivierten Fibroblasten der dritten oder vierten Passage durch Zugabe eine Trypsinlösung vom Boden der Kulturflaschen gelöst, mit Medium gewaschen und abzentrifugiert. Nach Bestimmung der Zellzahl wird die Zellsuspension auf die zuvor angeführte Konzentration eingestellt und die zuvor genannte Anzahl an diskreten Schweißdrüsenäquivalenten zugegeben. Nach Aufbringung der Mischung aus Fibroblasten und Schweißdrüsenäquivalenten auf die Trägerschicht wird der Plattendeckel aufgelegt und die Platte für 16 Tage bei 37 °C und 5 % v/v CO2 submers inkubiert, wobei alle 3 Tage ein Mediumwechsel erfolgt. Nach 16 Tagen hat sich ein Dermisäquivalent ausgebildet, in welches die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente inkorporiert sind. Auf dieses Dermisäquivalent werden anschließend Keratinozyten ausgesät. Hierzu werden Keratinozyten der ersten oder zweiten Passage in Zellkulturflaschen mit unter Punkt 1.2 angeführten Nährmedium vorkultiviert und anschließend durch Zugabe einer Trypsinlösung vom Boden abgelöst. Nach Waschen mit Nährmedium und Abzentrifugieren wird die Zellzahl der Keratinozytensuspension auf 1 -6x10 ⁵ Keratinozyten pro ml Medium eingestellt. Aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatte, welche die Dermisäquivalente enthalten, wird das Medium so weit abgesaugt, dass die Oberfläche der Dermisäquivalente feucht bleibt. Anschließend wird 1 ml der zuvor herstellten Keratinozytensuspension zugegeben und der Plattendecken aufgelegt. Die Kultivierung in Submers-Kultur erfolgt für 2 Tage bei 37 °C und 5 % v/v CO2. Nach Ablauf der zwei Tage werden die Hautmodelle aus den Vertiefungen geholt und auf Filterpapiere gesetzt, welche auf metallenen Abstandshaltern in einer Petrischale liegen. Die Petrischale wird nun mit dem unter Punkt 1.2 angeführten Nährmedium soweit gefüllt, dass das Medium den oberen Rand des Filterpapiers erreicht und sich um die Basis der Hautmodelle verteilt. Die Oberfläche der Modelle ist hingegen nicht von Medium bedeckt (Airlift-Kultur). Nach Kultivierung für weitere 1 1 Tage als Airlift-Kultur werden die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle erhalten, welche eine vielschichtige Epidermis sowie eine verhornte Gewebeoberfläche ausgebildet haben.

1.5 Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells mit dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten in dem Epidermisäquivalent

Die Herstellung der Trägerschicht, welche ein Dermisäquivalent trägt, erfolgt analog dem in der Offenlegungsschrift WO 2006/018147 A1 auf den Seiten 22 bis 24 beschriebenen Beispielen 1 bis 3, wobei die Kultivierung der Fibroblasten für 16 Tage erfolgt ist. Auf dieses Dermisäquivalent werden die unter Punkt 1.3 hergestellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente gegeben, in dem diese in dem unter Punkt 1.2 beschriebenen Nährmedium suspendiert und diese Suspension anschließend auf das Dermisäquivalent aufgebracht wird. Nach 1 bis 2 Stunden erfolgt die Aussaat der Keratinozyten, wie unter Punkt 1 .4 beschrieben. Nach 1 Tag unter Submers-Bedingungen werden die Modelle in das Kulturformat des Air-Liquid-Interface umgesetzt und für weitere 1 1 Tage unter diesen Bedingungen kultiviert. Die auf diese Weise hergestellten in-vitro Vollhautmodelle weisen eine vielschichtige Epidermis sowie eine verhornte Gewebeoberfläche auf. 1.6 Analyse der in-vitro Vollhautmodelle

Zum Nachweis der Proteinexpression von Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteinen wurden Immunfluoreszenzfärbungen an histologischen Schnitten durchgeführt. Hierzu wurden die unter den Punkten 1 .4 und 1.5 hergestellten in-vitro Vollhautmodelle in 1 x 0.5 cm große Stücke zerschnitten und in Paraffin eingelegt oder mit Einbettmedium eingefroren. Anschließend wurden die Objekte nach einem Standard-Fluoreszenz Protokoll für histologische Schnitte (z.B. vom Hersteller Abcam, Cambridge/UK) geschnitten und angefärbt. Die angefärbten Proben können dann unter einem Fluoreszenz-Mikroskop oder einem Konfokalen Laser Scanning Mikroskop analysiert werden. Es konnten die folgenden, Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteine nachgewiesen werden: Carcinoembryonales Antigen (CEA), Alpha smooth muscle Actin (alpha-SMA), Muskarinischer Acetylcholinrezeptor M3 (M-ACh-R3), Natrium-Kalium-Chlorid Kotransporter 1 (NKCC1 ), Galanin Rezeptor 2 (GalR2). Die Expression von Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteinen in den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen zeigt, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in diesen Modellen ihre natürliche Funktion beibehalten haben. Daher können diese Modelle zur Untersuchung des Einflusses von Wirkstoffen auf die Schweißhemmung verwendet werden.