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Patent Searching and Data


Title:
IN-VITRO METHOD FOR DETERMINING A CELL TYPE OF A WHITE BLOOD CELL WITHOUT LABELING
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/175082
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to an in-vitro method for determining a cell type of a white blood cell in a biological sample without labeling, wherein a microscopy apparatus images the cell and physical parameters of the cell are ascertained from the image of the cell by means of an automated image analysis, wherein the cell type of the white blood cell is determined on the basis of the physical parameters and on the basis of principal component analysis parameters (PCA parameters), wherein the principal component analysis parameters comprise linear combinations of at least some of the physical parameters.

Inventors:
RICHTER, Lukas (Bügstraße 14, Hirschaid, 96114, DE)
UGELE, Matthias (Kiefernweg 6, Neumarkt, 92318, DE)
HAYDEN, Oliver (Isarstrasse 107, Moosburg, 85368, DE)
SCHMIDT, Oliver (Petra-Kelly-Weg 32, Erlangen, 91052, DE)
STANZEL, Manfred (Am Geißberg 7, Berching, 92334, DE)
WENIGER, Markus (Creußnerstr. 5, Nürnberg, 90409, DE)
Application Number:
EP2019/055965
Publication Date:
September 19, 2019
Filing Date:
March 11, 2019
Export Citation:
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Assignee:
SIEMENS HEALTHCARE GMBH (Henkestr. 127, Erlangen, 91052, DE)
International Classes:
G06K9/00; G01N33/49; G06K9/62
Domestic Patent References:
WO2015195609A12015-12-23
Foreign References:
EP3220130A12017-09-20
US8406498B22013-03-26
Other References:
YAMPRI P ET AL: "White Blood Cell Classification based on the Combination of Eigen Cell and Parametric Feature Detection", 2006 1ST IEEE CONFERENCE ON INDUSTRIAL ELECTRONICS AND APPLICATIONS, 1 May 2006 (2006-05-01), PISCATAWAY, NJ : IEEE SERVICE CENTER, US, pages 1 - 4, XP031026640, ISBN: 978-0-7803-9513-8, DOI: 10.1109/ICIEA.2006.257341
DER-CHEN HUANG ET AL: "A computer assisted method for leukocyte nucleus segmentation and recognition in blood smear images", JOURNAL OF SYSTEMS & SOFTWARE, vol. 85, no. 9, 8 April 2012 (2012-04-08), ELSEVIER NORTH HOLLAND, NEW YORK, NY, US, pages 2104 - 2118, XP028499919, ISSN: 0164-1212, [retrieved on 20120418], DOI: 10.1016/J.JSS.2012.04.012
"GLCM Texture: A Tutorial", March 2017, UNIVERSITY OF CALGARY
Attorney, Agent or Firm:
MAIER, Daniel (Postfach 22 16 34, München, 80506, DE)
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Claims:
Patentansprüche

1. In-vitro Verfahren zum markierungsfreien Bestimmen eines Zelltyps einer weißen Blutzelle in einer biologischen Probe, wobei eine Mikroskopiervorrichtung die Zelle abbildet und aus der Abbildung der Zelle mittels einer automatischen Bildana lyse physikalische Parameter der Zelle ermittelt werden, dadurch gekennzeichnet, dass

anhand der physikalischen Parameter und anhand von Hauptkom ponentenanalyse-Parametern ( PCA-Parametern) der Zelltyp der weißen Blutzelle bestimmt wird, wobei die Hauptkomponen- tenanalyse-Parameter Linearkombinationen wenigstens eines Teils der physikalischen Parameter umfassen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem bestimm ten Zelltyp der weißen Blutzelle um einen der folgenden

Haupttypen von weißen Blutzellen aus der Gruppe umfassend Mo nozyten, neutrophile Granulozyten, basophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten und Lymphozyten handelt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei es sich bei dem bestimmten Zelltyp um einen der Haupttypen von weißen Blutzellen und/oder einem Subtyp von weißen Blutzellen aus der Gruppe umfassend Myelozyten, Metamyelozyten, Promyelozy ten, Blästen, Megakaryozyten, Plasmazellen, atypische Lympho zyten und Sezary Zellen handelt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei anhand der Bestimmung des jeweiligen Zelltyps einer Vielzahl von weißer Blutzellen in einer Probe die jeweiligen Zellpopu lationen charakterisiert werden und anhand der vorliegenden Zellpopulationen bestimmt wird, ob eine akute myeloische Leu kämie (AML) , eine akute lymphatische Leukämie (ALL) , eine chronische myeloische Leukämie (CML) oder eine chronische lymphatische Leukämie (CLL) in dem Patient, von dem die Probe stammt, vorliegt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die physikalischen Parameter der Zelle Parameter aus der fol genden Gruppe umfassend umfasste Fläche der Zelle, Umfang der Zelle, Breite der Zelle, Höhe der Zelle, Verhältnis von Brei te und Höhe der Zelle, Ähnlichkeit der geometrischen Form der Zelle mit einem Kreis, durchschnittlicher Radius der Zelle, Varianz des Radius der Zelle, Bedeckungsgrad der Zelle, äqui valenter Durchmesser entsprechend der umfassten Fläche der Zelle, optisches Volumen der Zelle, maximale optische Höhe der Zelle, minimale optische Höhe der Zelle, durchschnittli che optische Höhe der Zelle, Varianz der optischen Höhe der Zelle, Bikonkavität der Zelle, Sphärizität der Zelle, Ver schiebung des Massenschwerpunkts der Zelle, Kontrast der Zel le, Verschiedenheit der Zelle, Homogenität der Zelle, Energie der Zelle, Entropie der Zelle umfassen.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,

wobei die Abbildung der Zelle ein Überlagern einer Objektwel le mit einer Referenzwelle, einem Aufnehmen eines resultie renden Interferogramms und/oder einer computerimplementierten mathematischen Rekonstruktion umfasst.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Mikroskopiervorrichtung um ein Mikroskop zur Durchführung von digitaler holographischer Mikroskopie (DHM) , Interferenzphasen-Mikroskopie oder quantitativer Phasen Mik roskopie handelt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die weißen Blutzellen in einer Durchflusszelle von der Mikro skopiervorrichtung abgebildet werden, wobei die Durchfluss zelle bevorzugt einen Kanal mit rechteckigem oder quadrati schem Querschnitt umfasst.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die weißen Blutzellen mittels laminarer Hüllströme, bevorzugt mittels vier lamina rer Hüllströme, fokussiert werden.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei vor der Abbildung der weißen Blutzellen mittels der Mikrosko piervorrichtung rote Blutzellen mittels selektiver Lyse aus der Probe entfernt werden.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren mit einer ungefärbten und/oder ungetrockneten Zelle durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend den folgenden Schritt:

- Phenotypisieren der Zelle mit einem Marker, und/oder

- Exprimieren eines vorbestimmten Rezeptors

zum weiteren Zuordnen der Zelle.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren anhand einer Vollblutprobe durchgeführt wird und/oder die biologische Probe Blutzellen, Monozyten, neutro phile Granulozyten, basophile Granulozyten, eosinophile Gra nulozyten und/oder Lymphozyten enthält.

14. Zellanalyseeinrichtung, die dazu eingerichtet ist, ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 durchzuführen.

15. Mikroskopiervorrichtung zum markierungsfreien Bestimmen eines Zelltyps einer Zelle einer biologischen Probe, umfas send eine Zellanalyseeinrichtung gemäß Anspruch 14.

Description:
Beschreibung

In-Vitro-Verfahren zum markierungsfreien Bestimmen eines Zelltyps einer weißen Blutzelle

Die Erfindung betrifft ein in-vitro Verfahren zum markie rungsfreien Bestimmen eines Zelltyps einer weißen Blutzelle in einer biologischen Probe unter Verwendung einer Mikrosko piervorrichtung .

Das Bestimmen von Zellen und deren Zuordnung zu einem Zelltyp ist von großer Bedeutung in der Zytologie. In beispielsweise einer hämatologischen Untersuchung werden zelluläre Blutkom ponenten, also Erythrozyten, Thrombozyten und weiße Blutzel len, bestimmt und quantifiziert. Eine Ermittlung der Leukozy tenanzahl („White Blood Count", WBC) sollte für eine umfang reiche Diagnostik die wesentlichen Populationen der weißen Blutzellen differenzieren können. Die weißen Zellen werden differenziert nach granulären Zellen (Neutrophilen, Eosino philen, Basophilen) und nicht-granulären Zellen (Lymphozyten, Monozyten) . Neben der Granularität unterscheiden sich die Zellen auch hinsichtlich der Fragmentierung des Zellkerns (ohne Fragmentierung: Mononukleare Zellen, also Lymphozyten und Monozyten; polymorphnukleare Zellen: Eosinophile, Baso phile und Neutrophile) und der Zellgröße. Für die Differen zierung der granulären Zellen, im Besonderen eosinophile und basophile Granulozyten, wird eine Färbung eingesetzt. Die Auswertung der Zellpopulationen erfolgt üblicherweise durch vollautomatisierte Hämatologie-Analysatoren oder durch Mikro skopie. Vollautomatisierte Analysatoren müssen die Populatio nen nach festgesetzten Algorithmen analysieren (mit Hilfe von z.B. Impedanz-, Streulicht- und Absorptionsmessungen). Dies führt jedoch oft dazu, dass zum Beispiel bei pathologischen Proben Fehlermeldungen angezeigt werden. Im nächsten Schritt erfolgt üblicherweise eine Mikroskopie als Validierungsmetho de für durch den Hämatologie-Analysator fehlerhaft bestimmte Zellen. Dieser Schritt ist aufwendig und kostenintensiv, da er neben Probenvorbereitung, Mikroskopie und weiteren manuell durchführbaren Arbeiten auch eine manuelle Bewertung erfor dert .

Blutbildveränderungen sind ein Begleitphänomen einer Vielzahl von Erkrankungen und leisten deshalb einen wichtigen diffe rentialdiagnostischen Beitrag. Das kleine Blutbild ist eine der häufigsten Laboruntersuchungen und umfasst u. a. die Hä moglobinbestimmung und die Ermittlung der Zellzahlen von Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten. Das große Blutbild beinhaltet zusätzlich das Differentialblutbild, zu dem auch die Leukozytendifferenzierung gehört.

Aufgrund der verwendeten Methoden (z.B. Mie Scattering) ist insbesondere für die Analyse der weißen Blutzellen eine auf wendige Probenvorbereitung (Zellen werden angefärbt bzw. par tiell lysiert) nötig. Im Falle von pathologischen Blutproben erfolgt die Probenpräparation, wie z.B. die Lyse, jedoch oft nur unzureichend und deshalb ist eine manuelle Untersuchung der Blutzellen durch z.B. Ausstrich und Färbung notwendig. Diese Methode ist jedoch nur qualitativ und kann aufgrund der geringen Zahl an ausgezählten Zellen (etwa 100 bis 200 Zellen pro Slide) für seltene weiße Blutzellen nur eingeschränkt verwendet werden. Für die Erstdiagnose pathologischer Proben wie z.B. Leukämien ist der Blutausstrich mit anschließender Färbung der Blutzellen jedoch momentan die Standardmethode.

Die mechanisierte Leukozytendifferenzierung im Vollblut kann z.B. mittels Widerstandsmessung, Konduktivmessung, Laser- Streulichtmessung, Durchflusszytometrie oder zytochemischer Peroxidasereaktion erfolgen. Dabei werden zunächst die Eryth rozyten lysiert und die Leukozyten in einer Durchflusszelle vereinzelt .

Um z.B. eine quantitative Blutzelldiagnostik durchzuführen, kann auf einen Hämatologie-Analysator verzichtet werden und stattdessen jede Einzelzelle mikroskopiert werden. Dies er laubt es, das Blutbild unabhängig von festgesetzten Auswerte algorithmen und Flags quantitativ zu bestimmen. Nachteil die- ses Ansatzes ist jedoch der geringere Probendurchsatz als bei einem Hämatologie-Analysator und der nach wie vor bestehende Aufwand, die Zellen auf Objektträgern zu immobilisieren und zu färben. Diese Färbungen haben zudem nur eine eingeschränk te Reproduzierbarkeit und zeigen eine hohe Abhängigkeit von Luftfeuchte, Färbungsdauer, Temperatur und mehr. Nachteil bei der reinen Mikroskopie ist es, die Zellvolumina zu quantifi zieren im Vergleich zu Durchflusszytometern eingesetzt bei Hämatologie-Analysatoren .

Für die Erstellung eines manuellen Blutbildes werden speziel le, auf die Analyse von Vollblut ausgelegte Färbetechniken, wie z. B. die Wright-Giemsa Färbung, verwendet. Dazu wird Vollblut auf einem Objektträger ausgestrichen und zur Erstel lung eines Differentialblutbildes, beispielsweise etwa 100 Leukozyten, in schwierigen Fällen gegeben falls etwa 3 mal 100 Zellen, ausgezählt.

Für die Erstdiagnose pathologischer Proben ist der Blutaus strich mit anschließender Färbung der Blutzellen die Stan dardmethode. Bei Leukämien können so anhand des Differential blutbildes durch charakteristisch vorkommende Zellpopulatio nen folgende Arten unterschieden werden: „akute myeloische Leukämie (AML)", „akute lymphatische Leukämie (ALL)", „chro nische myeloische Leukämie (CML) " und „chronische lymphati sche Leukämie (CLL)".

Aufgrund der geringen Statistik bei Blutausstrichen (etwa 100 bis 200 Zellen pro Slide) wird zu Verifizierung der Diagnose sowie zur genauen Bestimmung von Untertypen von Leukämien in der Regel Durchflusszytometrie verwendet. Dabei werden die weißen Blutzellen mit speziellen (Fluoreszenz-) Antikörpern markiert und die Differenzierung erfolgt über charakteristi sche Expressionsmuster die sich im Streubild wiederspiegelt. Zusätzlich kann bei komplizierten Fällen für eine genaue Di agnose eine Knochenmarkspunktion erforderlich sein. Der Einsatz von Farbstoffen zur Differenzierung von verschie denen (Blut-) Zellen wurde bereits in den 60er Jahren des 19. Jahrhunderts entwickelt. Gustav Giemsa entwickelte die nach ihm benannte Färbung ursprünglich zur Sichtbarmachung von Ma laria-Parasiten und anschließend modifiziert zur Färbung von Treponema pallidum, dem Erreger der Syphilis. Die heute ver wendete Wright-Giemsa Färbung erlaubt die Unterscheidung von weißen Blutzellen und stellt deshalb die Erstdiagnose für leukämische Erkrankungen dar.

Für eine genaue Bestimmung des Leukämie Immuno-Phänotyps wird standardmäßig Durchflusszytometrie ( fluorescence-activated cell sorting, FACS) verwendet. Hierbei wird eine Vielzahl von verschiedenen (Fluoreszenz-) Antikörpern verwendet, als Pro ben werden sowohl peripheres Blut als auch Knochenmarkproben Verwendet. Die Auswertung erfolgt mittels speziellen Program men zur Analyse von FACS Daten (z.B. Kaluza) . Dabei kann durch das Vorhandensein von Datenpunkten in vorher festgeleg ten Bereichen, die auch als „Gates" bezeichnet werden, eine Unterscheidung von unterschiedlichen Krankheitsbildern durch geführt werden. Eine färbungs-/markierungsfreie Unterschei dung der vier oben genannten Leukämieformen mit einer rein mikroskopischen Methode ist bisher nicht bekannt.

Aus der US 8406498 ist ein bildgebendes Duchlasszytometer be kannt, wodurch die Differenzierung der weißen Blutkörper di rekt bestimmt werden kann. Auch in diesem Fall kommt jedoch eine Färbung zum Einsatz, um insbesondere eosinophile und basophile Granulozyten zu unterscheiden. Somit ergeben sich auch hier die oben genannten Nachteile.

Eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist folglich das Bereitstellen eines effizienteren und robusteren Verfahrens zum Differenzieren von weißen Blutzellen, bei dem insbesonde re eine Färbung und/oder Markierung der Blutzellen nicht not wendig ist. Die Aufgabe wird von dem erfindungsgemäßen Verfahren, der er findungsgemäßen Zellanalyseeinrichtung und der Mikroskopier vorrichtung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Un teransprüche gegeben.

Das erfindungsgemäße in-Vitro-Verfahren zum markierungsfreien Bestimmen eines Zelltyps einer Blutzelle in einer biologi schen Probe wird mit Hilfe einer Mikroskopiervorrichtung und einer Zellanalyseeinrichtung durchgeführt. Eine Mikroskopier vorrichtung ist dabei ein Gerät, mit dem sehr kleine Objekte stark vergrößert betrachtet werden können, und umfasst bei spielsweise ein Lichtmikroskop, ein Rasterelektronenmikro skop, ein Phasenkontrastmikroskop, ein digitales holographi sches Mikroskop oder ein Mikroskop mit einem Ultra

schallsensor (z.B. ein akustisches Mikroskop). Die Mikrosko piervorrichtung bildet dabei die Zelle ab. Aus der Abbildung der Zelle werden mittels einer automatischen Bildanalyse phy sikalische Parameter der Zelle ermittelt.

Die Zellanalyseeinrichtung, also ein Gerät oder eine Geräte komponente, die zur elektronischen Datenverarbeitung geeignet ist und dazu eingerichtet ist, aus der Abbildung der Zelle mittels einer automatischen Bildanalyse physikalische Parame ter der Zelle zu ermittelt, führt ein wie folgt näher be schriebenes erfindungsgemäßes Verfahren durch.

Gegenstand der Erfindung ist ein in-vitro Verfahren zum mar kierungsfreien Bestimmen eines Zelltyps einer weißen Blutzel le in einer biologischen Probe, wobei eine Mikroskopiervor richtung die Zelle abbildet und aus der Abbildung der Zelle mittels einer automatischen Bildanalyse physikalische Parame ter der Zelle ermittelt werden, wobei anhand der physikali schen Parameter und anhand von Hauptkomponentenanalyse- Parametern ( PCA-Parametern) der Zelltyp der weißen Blutzelle bestimmt wird, wobei die Hauptkomponentenanalyse-Parameter Linearkombinationen wenigstens eines Teils der physikalischen Parameter umfassen. Bevorzugt wird der Zelltyp der weißen Blutzelle anhand von vorbestimmten Kriterien bezüglich der physikalischen Parame ter und der Hauptkomponentenanalyse-Parameter ( PCA-Parameter) bestimmt, wobei wenn die jeweiligen vorbestimmten Kriterien erfüllt sind, der entsprechende Zelltyp vorliegt.

Der Begriff „vorbestimmte Kriterien" bezieht sich auf ein Kriterium oder mehrere Kriterien, welche aufgrund von einem oder mehreren physikalischen und/oder Hauptkomponentenanaly- se-Parametern ( PCA-Parametern) bestimmt wird. Das jeweilige Kriterium wird dabei bevorzugt bestimmt auf der Basis eines Vergleichs zwischen entsprechenden Abbildungen von verschie denen, zu unterscheidenden weißen Blutzelltypen .

Das Verfahren erlaubt aufgrund des Verzichts auf ein Färbe verfahren einen hohen Probendurchsatz und eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung von Zellen. Dadurch wird ei ne Mikroskopie mit einem hohem Probendurchsatz ermöglicht und es kann auf herkömmliche Hämatologie-Analysatoren verzichtet werden .

Bevorzugt handelt es sich bei dem bestimmten Zelltyp der wei ßen Blutzelle um einen der folgenden Haupttypen von weißen Blutzellen aus der Gruppe umfassend Monozyten, neutrophile Granulozyten, basophile Granulozyten, eosinophile Granulozy ten und Lymphozyten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung des erfindungsgemä ßen Verfahrens handelt es sich bei dem bestimmten Zelltyp um einen der Haupttypen von weißen Blutzellen und/oder einem Subtyp von weißen Blutzellen aus der Gruppe umfassend

Myelozyten, Metamyelozyten, Promyelozyten, Blästen, Megakary- ozyten, Plasmazellen, atypische Lymphozyten und Sezary Zel len .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden anhand der Bestimmung des jeweiligen Zelltyps einer Vielzahl von weißer Blutzellen in einer Probe die jeweiligen Zellpopulati onen charakterisiert und anhand der vorliegenden Zellpopula tionen bestimmt, ob eine akute myeloische Leukämie (AML) , ei ne akute lymphatische Leukämie (ALL) , eine chronische myeloi sche Leukämie (CML) oder eine chronische lymphatische Leukä mie (CLL) in dem Patient, von dem die Probe stammt, vorliegt.

Bevorzugt umfassen die physikalischen Parameter der Zelle Pa rameter aus der folgenden Gruppe umfassend umfasste Fläche der Zelle (cellArea) , Umfang der Zelle (perimeter) , Breite der Zelle (width) , Höhe der Zelle (height) , Verhältnis von Breite und Höhe der Zelle (aspectRatio) , Ähnlichkeit der geo metrischen Form der Zelle mit einem Kreis (circularity) , durchschnittlicher Radius der Zelle (radiusMean) , Varianz des Radius der Zelle (radiusVariance) , Bedeckungsgrad der Zelle (solidity) , äquivalenter Durchmesser entsprechend der umfass ten Fläche der Zelle (equivalentDiameter) , optisches Volumen der Zelle (opticalVolume) , maximale optische Höhe der Zelle (opticalHeightMaximum) , minimale optische Höhe der Zelle (op- ticalHeightMinimum) , durchschnittliche optische Höhe der Zel le (opticalHeightMean) , Varianz der optischen Höhe der Zelle (opticalHeightVariance) , Bikonkavität der Zelle (biconcavi- ty) , Sphärizität der Zelle (sphericity) , Verschiebung des Massenschwerpunkts der Zelle (massCenterShift) , Kontrast der Zelle (contrast) , Verschiedenheit der Zelle (dissimilarity) , Homogenität der Zelle (homogeneity) , Energie der Zelle (ener- gy) , Entropie der Zelle (entropy) .

Bevorzugt sind die physikalischen Parameter der Zelle wie folgt definiert.

Details to the definition of contrast and the 5 features which are extracted out of the gray level co-occurrence ma- trix can be found in "GLCM Texture : A Tutorial v. 3.0 March 2017" at the webpages of the University of Calgary under http : //www . fp . ucalgary . ca/mhallbey/tutorial . htm (Uri http://hdl.handle.net/1880/51900 ) .

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen können zusätzliche Informationen erfasst werden, welche in Abhängigkeit des Mirkroskopieverfahrens zusätzlich zur Verfügung stehen. Bei spielsweise kann die Intensitätsverteilung, ein Polarisati- ons- oder Fluoreszenzkontrast zusätzlich genutzt werden um eine bessere Differenzierung zu ermöglichen.

Bevorzugt umfassen die Hauptkomponentenanalyse-Parameter (PCA-Parameter) eins, zwei, drei vier oder fünf verschiedene Linearkombinationen von Parametern. Bevorzugt umfassen die Hauptkomponentenanalyse-Parameter (PCA-Parameter) Linearkombinationen der folgenden Parameter.

Wenigstens ein PCA-Parameter umfasst bevorzugt eine Linear kombination der Parameter cellArea, perimeter, width, height, aspectRatio, circularity, radiusMean, radiusVariance, solidi- ty, equivalentDiameter, opticalVolume, opticalHeightMaximum, opticalHeightMinimum, opticalHeightMean, opticalHeightVari- ance, biconcavity, sphericity, massCenterShift, contrast, dissimilarity, homogenity, energy, entropy.

Besonders umfassen die PCA-Parameter insgesamt sechs PCA- Parameter, wobei jeder der PCA-Parameter jeweils bevorzugt eine Linearkombination der Parameter cellArea, perimeter, width, height, aspectRatio, circularity, radiusMean, radius Variance, solidity, equivalentDiameter, opticalVolume, opti calHeightMaximum, opticalHeightMinimum, opticalHeightMean, opticalHeightVariance, biconcavity, sphericity, massCen- terShift, contrast, dissimilarity, homogenity, energy und entropy umfasst.

Bevorzugt umfassen die Hauptkomponentenanalyse-Parameter (PCA-Parameter) die folgenden Parameter Vall bis Val6.

Vall=- 0.2514235930087* ( (cell . cellArea- (42.9755016744) )/10.5788867263146)+- 0.249974748498971* ( (cell.perimeter- (24.576753500494 ))/3.20109088487221)+- 0.237593744589169* ( (cell.width- (7.35723468359436))/l.00790834623485)+- 0.241385243730167* ( (cell . height-

(7.28724864632538) )/l.00167379952967) +0.0500690750767191* ( (ce 11. aspectRatio-

(1.0727084035923))/0.0503940328943091)+- 0.0325934362800635* ( (cell . circularity- (0.879203898319695 ))/0.0171374141190303)+- 0.251748682215606* ( (cell . radiusMean- (3.67481430203961)) 70.47807494523509)+- 0.0358686373697572* ( (cell . radiusVariance-

(0.534334347573423) ) /0.135861132157575) +-

0.0713429028935052* ( (cell . solidity-

(0.973653367948167) ) /0.00642977966295229)+-

0.251801959117612* ( (cell . equivalentDiameter-

(7.33498993492049))/0.957125629695256)+-

0.271859966910455* ( (cell . opticalVolume- dO .9434893272532) ) /4.39789306763487) +-

0.264893256207984* ( (cell . opticalHeightMaximum-

(4.0508608252182))/1.13386516864492)+-

0.019499726282544* ( (cell. opticalHeightMinimum-

(0.917628988325119))/0.00943812184922224)+-

0.263403666244868* ( (cell . opticalHeightMean-

(2.56913326007255) )/0.578640046049587)+-

0.264398202286343* ( (cell . opticalHeightVariance-

(0.891494679587935) )/0.319599313085186)+0.0683113521964872* (( cell . biconcavity- (-

0.1590427888386) )/0.0878662330982137)+0.0532706264409643* ( (ce 11. sphericity-

(0.952179340809924) ) /0.0556215659482945) +- 0.135017569551957* ( (cell .massCenterShift- (0.321787377964238))/0.279787203971966)+- 0.23775558906941* ( (cell . contrast- (5.99415440523299) )/3.28737834908757)+- 0.245223436384692* ( (cell.dissimilarity-

(1.8261947255628) )/0.524533027046986)+0.241198017846531* ( (cel 1. homogenity-

(0.421196396914475) )/0.0787508131258171)+0.258958179846163* (( cell . energy-

(0.106234099933335) )/0.0303777835437848) +- 0.267352762571249* ( (cell.entropy- (4.85017551257248) ) /0.552270252441689)+0;

Val2=-0.168670616411677* ( (cell . cellArea- (42.9755016744) )/10.5788867263146)+- 0.205776175336618* ( (cell.perimeter- (24.576753500494)) 73.20109088487221)+- 0.186558934231474* ( (cell.width-

(7.35723468359436))/l.00790834623485)+-

0.183141003655306* ( (cell . height- il .28724864632538) ) /1.00167379952967) +-

0.0928942621464152* ( (cell. aspectRatio-

(1.0727084035923) )/0.050394032894309D+0.505899790631485* ((ce ll.circularity-

(0.879203898319695 ))/0.0171374141190303)+- 0.169985535864666* ( (cell. radiusMean- (3.67481430203961) )/0.47807494523509)+- 0.377167185427535* ( (cell . radiusVariance-

(0.534334347573423) )/0.135861132157575)+0.416007969970529* ( (c eil . solidity-

(0.973653367948167) ) /0.00642977966295229) +- 0.166991998607427* ( (cell. equivalentDiameter- (7.33498993492049))/0.957125629695256)+- 0.00731744872935898* ( (cell. opticalVolume-

(10.9434893272532) )/4.39789306763487)+0.106456651440064 *( (cel

I . opticalHeightMaximum-

(4.0508608252182) )/l.13386516864492 )+0.20085391219078* ( (cell. opticalHeightMinimum-

(0.917628988325119) )/0.00943812184922224) +0.122345079558179* ( (cell . opticalHeightMean-

(2.56913326007255) )/0.578640046049587)+0.101062869417052 * ( (ce

II . opticalHeightVariance-

(0.891494679587935) )/0.319599313085186)+0.217089205338001* ( (c eil . biconcavity- (-

0.1590427888386) )/0.0878662330982137) +- 0.0619295694253695* ( (cell. sphericity-

(0.952179340809924) )/0.0556215659482945) +0.0156956887744252 *( (cell . massCenterShift-

(0.321787377964238) )/0.279787203971966)+0.198114038338057* ( (c eil . contrast-

(5.99415440523299) )/3.28737834908757)+0.180425506176449* ( (cel 1. dissimilarity-

(1.8261947255628))/0.524533027046986) +- 0.135400526577736* ( (cell . homogenity- (0.421196396914475) ) /0.0787508131258171) +- 0.0267942709719767* ( (cell . energy-

(0.106234099933335) )/0.0303777835437848) +0.0722804026404807* ( (cell . entropy-

(4.85017551257248) )/0.552270252441689)+0;

Val3=-0.152245658793807* ( (cell . cellArea- (42.9755016744) )/10.5788867263146)+- 0.137744345235438* ( (cell .perimeter- (24.576753500494) ) /3.20109088487221)+- 0.139046382561896* ( (cell.width- (7.35723468359436) ) /l.00790834623485)+- 0.136640064377995* ( (cell . height-

(7.28724864632538) )/l.00167379952967) +0.143071973661924* ( (cel 1. aspectRatio-

(1.0727084035923))/0.0503940328943091)+- 0.311832846414789* ( (cell . circularity- (0.879203898319695 ))/0.0171374141190303)+- 0.158405722299146* ( (cell. radiusMean-

(3.67481430203961) )/0.47807494523509)+0.2147365796495 *( (cell. radiusVariance-

(0.534334347573423) )/0.135861132157575) +- 0.290348831318269* ( (cell . solidity- iO .973653367948167) ) /0.00642977966295229) +- 0.160436060932553* ( (cell. equivalentDiameter- (7.33498993492049) )/0.957125629695256)+- 0.0283231756746574* ( (cell. opticalVolume-

(10.9434893272532) )/4.39789306763487)+0.108904826169979* ( (cel

I . opticalHeightMaximum- (4.0508608252182) ) /l.13386516864492) +- 0.0541041915771913* ( (cell. opticalHeightMinimum- (0.917628988325119) )/0.00943812184922224) +0.0482898928982701* ( (cell.opticalHeightMean-

(2.56913326007255) )/0.578640046049587)+0.0740565216581285* ( (c eil . opticalHeightVariance-

(0.891494679587935) )/0.319599313085186)+0.33268062359036* ( (ce

II . biconcavity- (- 0.1590427888386) )/0.0878662330982137)+- 0.486496428597712* ( (cell . sphericity-

(0.952179340809924) )/0.0556215659482945)+0.404071847572092* (( cell . massCenterShift-

(0.321787377964238) )/0.279787203971966)+0.200214346124148* ( (c eil . contrast-

(5.99415440523299) )/3.28737834908757)+0.168546834749071* ( (cel

I . dissimilarity-

(1.8261947255628))/0.524533027046986)+- 0.114748435539571* ( (cell . homogenity- (0.421196396914475) )/0.0787508131258171) +- 0.0143576741936659* ( (cell . energy-

(0.106234099933335) )/0.0303777835437848) +0.070606562249387* (( cell . entropy-

(4.85017551257248) ) /0.552270252441689)+0;

Val4 =- 0.261610677611746* ( (cell . cellArea- (29.4395201580311) )/5.11005121908855)+- 0.261094203446583* ( (cell .perimeter- (20.4714469010994 ))/l.73763119886254)+- 0.222861676546857* ( (cell.width- (6.12959751130435) )/0.59548518687133) +- 0.229916753106545* ( (cell.height-

(6.05150421944159) )/0.591609173525849)+0.011807520590896* ( (ce

II . aspectRatio-

(1.0869912949338) )/0.0546526376570488) +0.0262225683553752 *((c ell.circularity-

(0.876941946272043) )/0.0179521439605036)+- 0.261160667395425* ( (cell . radiusMean- (3.05876819557268) )/0.255900843697689)+- 0.0941868494695694* ( (cell. radiusVariance- (0.516064433989357) )/0.111459058693624)+- 0.0110718002570505* ( (cell . solidity- (0.971597800798176) )/0.00720404258117219)+- 0.260831711849364* ( (cell . equivalentDiameter- (6.10101233363755) )/0.511139800830794)+- 0.283417789826245* ( (cell.opticalVolume- (5.49637143295321)) 71.39356683120867)+- 0.28041071625337* ( (cell . opticalHeightMaximum-

(2.78997632108204) )/0.357459556742829)+0.00345191681990364* (( cell . opticalHeight

Minimum- (0.916982544759395 ))/0.0114607243403515)+- 0.267687084654929* ( (cell . opticalHeightMean- (1.90610826785609) ) /0.176319079561605)+- 0.279755464234688* ( (cell . opticalHeightVariance- (0.531938907690763) )/0.107019179729975)+0.121035300134979* ( (c eil . biconcavity- (-

0.11874291555068) )/0.0878957408234967)+- 0.0161513556541555* ( (cell . sphericity- (0.955634909899621))/0.04264168644697)+- 0.107830413342139* ( (cell .massCenterShift- (0.205413097350611) )/0.143266493406051) +- 0.216912000881217* ( (cell . contrast- (2.94739193186445))/0.852979848483421)+- 0.233161325461211* ( (cell . dissimilarity-

(1.31231869619681) )/0.185666125635144)+0.222121616068744* ( (ce 11. homogenity-

(0.499177299392145) )/0.043929343763229)+0.237462579736086* ( (c eil . energy-

(0.141919956703913) )/0.0213959679195142)+- 0.268766115142943* ( (cell.entropy- (4.20317134129727) ) /0.263391471017291)+0;

Val5=0.277185206648515* ( (cell.cellArea-

(29.4395201580311) )/5.11005121908855)+0.289025861167001* ( (cel 1. perimeter-

(20.4714469010994) )/l.73763119886254)+0.27869771372156* ( (cell . width-

(6.12959751130435) )/0.59548518687133)+0.226791977731385* ( (cel 1. height-

(6.05150421944159) )/0.591609173525849)+- 0.0154016557869195* ( (cell. aspectRatio- (1.0869912949338) )/0.0546526376570488) +- 0.104962015198417* ( (cell.circularity-

(0.876941946272043) )/0.0179521439605036) +0.280118171306254* (( cell . radiusMean- (3.05876819557268) )/0.255900843697689)+0.122071737825644* ( (ce 11. radiusVariance-

(0.516064433989357) ) /0.111459058693624) +- 0.0757806415365649* ( (cell . solidity-

(0.971597800798176) )/0.00720404258117219) +0.279776181994244* ( (cell . equivalentDiameter-

(6.10101233363755) )/0.511139800830794 )+0.127079667257615* ((ce 11. opticalVolume-

(5.49637143295321))/1.39356683120867)+- 0.166674686515488* ( (cell. opticalHeightMaximum- (2.78997632108204) )/0.357459556742829) +- 0.0801206102287044* ( (cell. opticalHeightMinimum- (0.916982544759395) )/0.0114607243403515) +- 0.13904585273397* ( (cell. opticalHeightMean- (1.90610826785609) )/0.176319079561605) +- 0.157320201651437* ( (cell. opticalHeightVariance- (0.531938907690763) )/0.107019179729975)+- 0.0137496049824385* ( (cell.biconcavity- (-0.11874291555068) ) /0.0878957408234967) +- 0.0124754663656207* ( (cell.sphericity- (0.955634909899621) ) / 0.04264168644697) +- 0.00354707655665248* ( (cell .massCenterShift- (0.205413097350611) ) /0.143266493406051) +- 0.337317104471527* ( (cell.contrast- (2.94739193186445) )/0.852979848483421)+- 0.351605489070963* ( (cell.dissimilarity-

(1.31231869619681) )/0.185666125635144)+0.324115001671015* ((ce 11. homogenity-

(0.499177299392145) )/0.043929343763229)+0.20286086484872* ((ce 11. energy-

(0.141919956703913) )/0.0213959679195142)+- 0.208528317348662* ( (cell.entropy- (4.20317134129727)) /0.263391471017291) +0;

Val6=-0.0822117013411024* ( (cell . cellArea- (29.4395201580311) )/5.11005121908855) +- 0.0136983441801879* ( (cell .perimeter- (20.4714469010994 ))/l.73763119886254)+- 0.0421965767155267* ( (cell.width- (6.12959751130435) ) / 0.59548518687133) +- 0.0105097694602176* ( (cell . height-

(6.05150421944159) )/0.591609173525849)+0.0829553453256781* ( (c eil . aspectRatio-

(1.0869912949338) )/0.0546526376570488) +- 0.601802580015178* ( (cell.circularity- (0.876941946272043) )/0.0179521439605036) +- 0.0832961277585592* ( (cell. radiusMean-

(3.05876819557268) )/0.255900843697689)+0.312125036264253* ( (ce 11. radiusVariance-

(0.516064433989357) ) /0.111459058693624) +- 0.548644911166917* ( (cell . solidity- (0.971597800798176) )/0.00720404258117219) +- 0.0887226111099722* ( (cell. equivalentDiameter- (6.10101233363755) )/0.511139800830794)+- 0.065558074724381* ( (cell. opticalVolume-

(5.49637143295321) )/l.39356683120867 )+0.00635200779277076* ( (c eil . opticalHeight

Maximum- (2.78997632108204) )/0.357459556742829)+- 0.208242751746043* ( (cell . opticalHeightMinimum- (0.916982544759395 ))/0.0114607243403515)+- 0.052855467177894* ( (cell. opticalHeightMean-

(1.90610826785609) )/0.176319079561605) +0.0139425503541623* ( (c eil . opticalHeightVariance-

(0.531938907690763) )/0.107019179729975)+0.0212708260463394* (( cell . biconcavity- (-

0.11874291555068) )/0.0878957408234967)+- 0.281890905467496* ( (cell.sphericity-

(0.955634909899621) )/0.04264168644697) +0.258391327626016* ((ce 11.massCenterShift-

(0.205413097350611) )/0.143266493406051) +0.0744517932956948* (( cell . contrast-

(2.94739193186445) )/0.852979848483421) +0.0587637354201565 * ( (c eil . dissimilarity-

(1.31231869619681) )/0.185666125635144) +- 0.0404667518409852* ( (cell . homogenity- (0.499177299392145) ) /0.043929343763229)+- 0.0159289744001* ( (cell . energy-

(0.141919956703913) )/0.0213959679195142) +0.0247292136860108* ( (cell . entropy-

(4.20317134129727) )/0.263391471017291) +0;

Bevorzugt umfasst die Abbildung der Zelle ein Überlagern ei ner Objektwelle mit einer Referenzwelle, ein Aufnehmen eines resultierenden Interferogramms und/oder eine computerimple mentierte mathematische Rekonstruktion.

Besonders vorteilhaft ist dabei die Anwendung der digitalen holographischen Mikroskopie, da sie erlaubt die Phaseninfor mation des Objekts quantitativ zu erfassen. Gemäß einer wei teren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Abbildung der weißen Blutzelle daher mittels digitaler holographischer Mikroskopie, Interferenzphasenmikroskopie und/oder quantitativer Phasenmikroskopie ermittelt. Diese Mikroskopiemethoden ermöglichen eine besonders hohe axiale Auflösung, d.h. in Richtung der optischen Achse des Mikro skops. Eine digitale holographische Mikroskopie ermöglicht eine Auflösung von bis zu lnm in z-Richtung. Dies entspricht einer Präzision die um einen Faktor 100-1000 höher liegt als mit anderen bekannten lichtmikroskopischen Verfahren (z.B. konfokales Mikroskop) . Aufgrund der präzisen Ermittlung des Höhenprofils ist somit eine genauere Bestimmung des Zelltyps möglich .

Bevorzugt handelt es sich bei der Mikroskopiervorrichtung so mit um ein Mikroskop zur Durchführung von digitaler hologra phischer Mikroskopie (DHM) , Interferenzphasen-Mikroskopie o- der quantitativer Phasen Mikroskopie.

Bevorzugt werden die weißen Blutzellen in einer Durchfluss zelle von der Mikroskopiervorrichtung abgebildet, wobei die Durchflusszelle bevorzugt einen Kanal mit rechteckigem oder quadratischem Querschnitt umfasst. Bevorzugt werden die weißen Blutzellen mittels laminarer Hüllströme, bevorzugt mittels vier laminarer Hüllströme, fo kussiert .

Bevorzugt werden vor der Abbildung der weißen Blutzellen mit tels der Mikroskopiervorrichtung rote Blutzellen mittels se lektiver Lyse aus der Probe entfernt.

Ein weiterer Vorteil wird erzielt, wenn das Verfahren mit ei ner oder mehreren ungefärbten und/oder ungetrockneten Zellen durchgeführt wird. Da die Vitalität der Zellen durch das er findungsgemäße Verfahren nicht beeinträchtigt wird, können die durch das Verfahren bestimmten Zellen nach Abschluss des Bestimmungsverfahrens für Folgeanalysen weiterverwendet wer den .

Das erfindungsgemäße Verfahren kann gemäß einem weiteren Aus führungsbeispiel ein Phänotypisieren der Zelle mit einem Mar ker und/oder das Exprimieren eines vorbestimmten Rezeptors zum weiteren Zuordnen der Zelle umfassen. Dies ermöglicht ei ne weitergehende molekularbiologische Untersuchung der be stimmten Zelle.

Eine besondere Relevanz erhält das erfindungsgemäße Verfah ren, wenn es gemäß einer weiteren Ausführungsform anhand ei ner Vollblutprobe durchgeführt wird und/oder die biologische Probe Blutzellen, Monozyten, neutrophile Granulozyten, baso phile Granulozyten, eosinophile Granulozyten und/oder Lympho zyten enthält. Dies findet vor allem bei der Bestimmung eines Blutbildes in der Hämatologie Anwendung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zellanaly seeinrichtung, zum Beispiel umfassend einen Mikrochip oder einen Mikrocontroller, die dazu eingerichtet ist, eine oder mehrere der oben beschriebenen Ausführungsformen des erfin dungsgemäßes Verfahren durchzuführen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Mikroskopier vorrichtung zum markierungsfreien Bestimmen eines Zelltyps einer weißen Blutzelle einer biologischen Probe, umfassend eine erfindungsgemäße Zellanalyseeinrichtung.

Vorzugsweise umfasst die Mikroskopiervorrichtung ein digita les holographisches Mikroskop.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Bestimmen des weißen Blutzelltyps ein Be stimmen eines Zellstadiums der Zelle umfassen, insbesondere zum Differenzieren eines Zellalters, eines physiologischen oder morphologischen Zustands der Zelle oder eines Aktivi tätszustands der Zelle. Dies ermöglicht ein Aufnehmen einer Bildsequenz von z.B. Aktivierungsvorgängen einer Zelle.

Die digitale holographische Mikroskopie (DHM) , auch Interfe renzphasenmikroskopie genannt, zeichnet sich dadurch aus, dass sie sowohl die Intensität als auch die Phase eines Ob jekts quantitativ in einer Aufnahme erfassen kann. Dafür wird nicht, wie in der Mikroskopie üblich, eine Intensitätsvertei lung aufgenommen, welche sich durch Absorption und Streuung von Licht am Objekt ergibt, sondern eine Wellenfront, welche sich aus der Überlagerung einer Objekt- und einer Referenz welle ergibt. Daraus kann mit Hilfe eines Computers die In- tensitäts- und Phaseninformation des Objekts rekonstruiert werden .

Diese Mikroskopie-Methode eignet sich für die Untersuchung von biologischen Proben, da diese ohne weitere Probenvorbe reitung im Wesentlichen transparent sind für sichtbares Licht und damit in einem herkömmlichen Mikroskop einen geringen Kontrast aufweisen. Durch die Aufnahme der Phaseninformation ist es möglich, die Morphologie der Zelle sehr präzise zu er fassen und mit Hilfe dieser Information eine Differenzierung der Zelle vorzunehmen. Gegenüber herkömmlichen Phasenkontrastmikroskopen, welche üblicherweise durch einen Phasenring im Objektiv und eine Ringblende im Kondensor realisiert werden, bietet die DHM den Vorteil, dass die Phase quantitativ bestimmt werden kann. Entsprechend spricht man auch von quantitativer Phasenkon- trastmikroskopie . Erst durch die Quantifizierung der Phase wird eine reproduzierbare Rekonstruktion des Höhenprofils des Objekts ermöglicht und erst dadurch kann eine automatisierte Bestimmung des Zelltyps erfolgen.

Es ist darauf hinzuweisen, dass die Phasenverschiebung des Lichts, von der optischen Weglänge durch das Objekt bestimmt ist, d.h. sowohl die geometrische Dicke des Objekt als auch der Brechungsindex spielt dabei eine Rolle. Um ein echtes ge ometrisches Höhenprofil aus der Phaseninformation zu erhalten muss der Brechungsindex der Probe bekannt sein. Im bevorzug ten Anwendungsfall der Mikroskopie von Zellen kann man jedoch von einem weitestgehend konstanten und bekannten Brechungsin dex ausgehen, wodurch die Phaseninformation direkt in ein Hö henprofil umgerechnet werden kann. Alternativ kann die Pha seninformation bei verschiedenen Wellenlängen aufgenommen werden und dadurch der Einfluss des Brechungsindex herausge rechnet werden.

Weiterhin ist zu beachten, dass die Phaseninformation nur auf einen Phasenwinkel von 360° eindeutig bestimmt ist. Eine ge messene Phasenverschiebung von beispielsweise 10° kann in Wirklichkeit einer Phasenverschiebung von 370°, 730°, usw. entsprechen. Der Eindeutigkeitsbereich ist demnach auf die Wellenlänge des Lichts beschränkt. Diese Limitierung ist im gewählten Anwendungsfall bei der mikroskopischen Betrachtung von Zellen ebenfalls vernachlässigbar, da biologische Zellen keine steilen Flanken aufweisen und somit die Phasenwerte der benachbarten Pixel als Anschlussbedingung zur Verfügung ste hen .

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann eine gegenwärtig angewendete Vorgangsweise zum Erstellen eines Differenzial- blutbilds markierungsfrei durchgeführt werden. Eine beispiel hafte Vorgehensweise zum Erstellen eines Differenzialblut bilds umfasst zum Beispiel das Ermitteln einer Zellgröße, ei nes Reifungszustandes der Zelle, also eines Alters der Zelle, ein Kernplasmaverhältnis, das Erfassen von Zytoplasmaein schlüssen und das Erfassen einer chromatinen Struktur.

Die Interferenzphasenmikroskopie, auch digitale holografische Mikroskopie (DHM) genannt, zeichnet sich dadurch aus, dass sie sowohl eine Intensität als auch eine Phase eines Objektes quantitativ in einer Aufnahme erfassen kann. Dafür wird nicht, wie in der Mikroskopie üblich, ein Abbild des Objekts erfasst, sondern eine Wellenfront, welche sich aus der Über lagerung einer Objekt- und einer Referenzwelle ergibt. Daraus kann mit Hilfe einer Zellanalyseeinrichtung, zum Beispiel ei nes Computers, eine Intensitäts- und Phaseninformation des Objekts rekonstruiert werden.

Diese Mikroskopie-Methode eignet sich für eine Untersuchung von biologischen Proben, da diese ohne weitere Probenvorbe reitung im Wesentlichen transparent sind für sichtbares Licht und damit in einem herkömmlichen Mikroskop einen geringeren Kontrast aufweisen. Durch die Aufnahme der Phaseninformatio nen ist es möglich, die Morphologie der Zelle sehr präzise zu erfassen und mit Hilfe dieser Informationen eine Differenzie rung der Zelle vorzunehmen.

Eine Differenzierung von zum Beispiel weißen Blutkörperchen basierend auf zum Beispiel einer rekonstruierten Phaseninfor mation von mehreren Zellen kann ausgeführt werden, ohne dass eine Färbung der Zellen nötig ist und dass dadurch mit fri schen, nicht getrockneten Zellen gearbeitet werden kann.

Dadurch werden unnötige Artefakte, welche durch unterschied liche Handhabung der Proben während des Trocknens und Färbens entstehen, vermieden. Die Bilder sind dabei reproduzierbarer und leichter durch eine automatische rechnergestützte Bild verarbeitung unterscheidbar. Die Anzahl der Prozessschritte wird minimiert. Dadurch werden Kosten und Zeit eingespart und eine zuverlässige und schnellere Diagnostik ermöglicht.

In der Pre-Analytik kann so gegenüber der Hämatologie- Analysatoren auf den Einsatz von zum Beispiel Rounding Buf fers verzichtet werden (das heißt hochverdünnte SDS- Pufferlösung) . Eine solche würde zum Aufrunden von Zellen führen, die zwar für die Streulichtmessung beim Durchflusszy- tometer geeignet ist, aber gleichzeitig zu Artefakten führt.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen noch einmal durch konkrete Ausführungsbeispiele näher erläutert. Die gezeigten Beispiele stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar. Es zeigen:

FIG 1 eine Übersichtsansicht für AML Probe,

FIG 2 eine Übersichtsansicht für CML Probe,

FIG 3 eine Übersichtsansicht für ALL Probe,

FIG 4 eine Übersichtsansicht für CLL Probe,

FIG 5 eine Übersichtsansicht für OMF Probe,

FIG 6 eine Übersichtsansicht für gesunder Probe, es sind jeweils PCA-Parameter aufgetragen.

Weiter zeigen:

FIG 7 Charakteristische Streumuster für Myeloblas ten- und Lymphoblasten-Gates von AML Probe,

FIG 8 Charakteristische Streumuster für Myeloblas ten- und Lymphoblasten-Gates von CML Probe,

FIG 9 Charakteristische Streumuster für Myeloblas ten- und Lymphoblasten-Gates von ALL Probe,

FIG 10 Charakteristische Streumuster für Myeloblas ten- und Lymphoblasten-Gates von CLL Probe,

FIG 11 Charakteristische Streumuster für Myeloblas ten- und Lymphoblasten-Gates von OMF Probe, FIG 12 Charakteristische Streumuster für Myeloblas ten- und Lymphoblasten-Gates von gesunder Pro be .

Weiter zeigen:

FIG 13 Unterscheidung von Monozyten,

FIG 14 neutrophilen Granulozyten,

eosinophilen Granulozyten,

FIG 15 basophilen Granulozyten,

Lymphozyten,

FIG 16 eosinophilen Granulozyten,

Promyelozyten,

Blästen,

Megakaryozyten,

FIG 17 Metamyleozyten anhand charakteristischer Streumuster in definierten Berei chen („Gates") . Es sind jeweils PCA-Parameter (Val-X) bzw. eine Kombination aus physikalischen und PCA-Parametern aufge tragen .

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen In-Vitro-Verfahrens kann ein markierungsfreies Bestimmen eines Zelltyps einer weißen Blut zelle in einer biologischen Probe erfolgen. Markierungsfrei bedeutet hier, dass die Zellen nicht durch beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe oder radioaktive Partikel markiert wer den müssen. Eine biologische Probe kann dabei beispielsweise eine Probe tierischer oder menschlicher Blutzellen umfassen. Vorzugsweise handelt es sich dabei um eine Vollblutprobe, die zum Beispiel Blutzellen 10, z.B. Leukozyten, eosinophile Gra nulozyten oder basophile Granulozyten umfasst.

In einem ersten experimentellen Beispiel erfolgt die Unter scheidung von AML, CML, ALL, CLL und OMF anhand der jeweili gen charakteristischen Streumuster. Fig. 1 bis Fig. 6 zeigen charakteristische Streumuster von AML (Fig .1 ) , CML (Fig. 2), ALL (Fig. 3), CLL (Fig. 4), OMF (Fig. 5) und gesunder Probe (Fig. 6) . „OMF" steht für Osteo myelofibrose, einer Unterart der Gruppe der Myeloproliferati ven Neoplasien (MPN) . Es werden die PCA-Parameter Val4 und Val5 (entsprechende Linearkombination siehe oben) für die Unterscheidung verwendet.

Die Unterscheidungskriterien für Proben von Patienten mit ei ner der verschiedenen Leukämien bzw. von gesunden Probanden lauten wie folgt.

Probe von gesundem Probanden: drei eindeutig separate Daten bereiche :

1. Bereich: Val4 400-650, Val5 = 200-500,

2. Bereich: Val4 600-750, Val5 = 400-600,

3. Bereich. Val4 700-850, Val5 = 250-400.

Probe von Patient mit AML : nur ein durchgehender Datenbe reich:

Val4 = 600-900, Val5 = 300-600.

Probe von Patient mit CML : zusammenhängender Datenbereich der sich in 3 Bereiche unterteilen lässt:

1. Bereich: kleine Population im Bereich von Val4 = 400-550, Val5 = 200-500,

2. Bereich: dominante Hauptpopulation im Bereich von Val4 = 500-700, Val5 = 200-500,

3. Bereich: kleine Population im Bereich von Val4 = 700-850, Val5 = 250-400.

Probe von Patient mit ALL: große Hauptpopulation mit 2 klei nen Nebenpopulationen:

1. Bereich: dominante Hauptpopulation im Bereich von Val4 = 700-850, Val5 = 300-500, 2. Bereich: kleine Population im Bereich von Val4 = 550-700,

Val5 = 300-450,

3. Bereich: kleine Population im Bereich von Val4 = 500-700, Val5 = 450-600.

Probe von Patient mit CLL: große Hauptpopulation mit einer kleinen Nebenpopulation:

1. Bereich: dominante Hauptpopulation im Bereich von Val4 = 650-900, Val5 = 300-500,

2. Bereich: kleine Population im Bereich von Val4 = 400-600, Val5 = 300-500.

Probe von Patient mit OMF: zusammenhängender Datenbereich der sich in 4 Bereiche unterteilen lässt:

1. Bereich: Val4 = 700-900, Val5 = 200-400,

2. Bereich: Val4 = 600-750, Val5 = 400-550,

3. Bereich: Val4 = 500-650, Val5 = 250-450

4. Bereich: kleine Population im Bereich von Val4 = 400-650,

Val5 = 450-700.

In einem zweiten experimentellen Beispiel erfolgt die Unter scheidung von AML, CML, ALL, CLL und OMF anhand der jeweili gen charakteristischen Streumuster.

Fig. 7 bis 12 zeigen charakteristische Streumuster von AML (Fig. 7), CML (Fig. 8), ALL (Fig. 9), CLL (Fig. 10), OMF (Fig. 11) und gesunder Probe (Fig. 12) . Es werden die PCA- Parameter Val3 und Val4 (entsprechende Linearkombination sie he oben) für die

Unterscheidung verwendet. Zwei große Bereiche werden defi niert :

1. Bereich: Val4 = 235-920, Val5 = 576-816 (= Gate „Myelo- blasts" (2 ) ) ,

2. Bereich: Val4 = 235-920, Val5 = 816-1015 (= Gate „Lympho- blasts" ( 1 ) ) . Die Unterscheidungskriterien für Proben von Patienten mit ei ner der verschiedenen Leukämien bzw. von gesunden Probanden lauten wie folgt.

Probe von gesundem Probanden: keine oder lediglich sehr ge ringe Anzahl an Datenpunkten in beiden Gates.

Probe von Patient mit AML : signifikante Population im 1. Be reich:

> 90% aller Datenpunkte im 1. Bereich,

< 10% aller Datenpunkte im 2. Bereich.

Probe von Patient mit CML : geringe Anzahl an Datenpunkten im 1. Bereich:

> 90% aller Datenpunkte im 1. Bereich,

< 10% aller Datenpunkte im 2. Bereich.

Probe von Patient mit ALL: signifikante Population erstreckt sich über 1. und 2. Bereich:

< 90% aller Datenpunkte im 1. Bereich,

> 10% aller Datenpunkte im 2. Bereich.

Probe von Patient mit CLL: signifikante Population im 2. Be reich:

< 10% aller Datenpunkte im 1. Bereich,

> 90% aller Datenpunkte im 2. Bereich.

Probe von Patient mit OMF: geringe Anzahl an Datenpunkten im 1. und 2. Bereich:

> 80% aller Datenpunkte im 1. Bereich,

< 20% aller Datenpunkte im 2. Bereich.

In einem dritten experimentellen Beispiel erfolgt die markie rungsfreie Unterscheidung der 5 Haupttypen der weißen Blut zellen sowie weiterer Subtypen. Fig. 13 bis 17 zeigen die markierungsfreie Unterscheidung der 5 Haupttypen der weißen Blutzellen sowie weiterer Subtypen anhand charakteristischer Streumuster in definierten Berei chen („Gates") . Die Abkürzung „E & N & IG" (12) steht für Eo- sinophile, Neutrophile und unreife Granulozyten (siehe Fig. 13). Bei den unreifen Granulozyten („immature granulocytes" ) handelt es sich in diesem Fall um Metamyelozyten und Myelozy ten. Die folgenden Bereiche werden für die Unterscheidung der Zelltypen definiert (angegeben sind jeweils die verwendeten Parameter und die X/Y Koordinaten der definierten Berei che (Gates ) ) :

1. Bereich = Gate „Monocytes" (3) : Zelltyp Monozyten werden wie folgt aufgrund der Werte von Val4 und Val5 unterschieden.

2. Bereich = Gate „Neutros" (4) : Zelltyp Neutrophile werden wie folgt aufgrund der Werte von Val4 und Val5 unterschieden.

3. Bereich = Gate „Eos" (5) : Zelltyp Eosinophile werden wie folgt aufgrund der Werte von Val4 und Entropy unterschieden.

4. Bereich = Gate ,,Basos"(6) : Zelltyp Basophile werden wie folgt aufgrund der Werte von Val4 und Val5 unterschieden.

5. Bereich = Gate ,,Lymphos"(7) : Zelltyp Lymphozyten werden wie folgt aufgrund der Werte von Val4 und Val5 unterschieden.

6. Bereich = Gate „Megakaryocytes" (8) : Zelltyp Megakaryozy- ten werden wie folgt aufgrund der Werte von Val3 und Entropy unterschieden .

7. Bereich = Gate „Promyelocytes" (9): Zelltyp Promyelozyten werden wie folgt aufgrund der Werte von Val3 und Entropy un terschieden .

8. Bereich = Gate „Myelocytes" (10) : Zelltyp Myelozyten wer den wie folgt aufgrund der Werte von EquivalentDiameter und Homogenity unterschieden.

9. Bereich = Gate „Metamyelocytes" (11): Zelltyp Metamyelozy ten werden wie folgt aufgrund der Werte von EquivalentDiame- ter und Homogenity unterschieden.