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Title:
IN-VITRO METHOD AND KIT FOR THE DIAGNOSIS OF ACUTE CORONARY SYNDROME
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/095804
Kind Code:
A1
Abstract:
An in-vitro method and kit for the diagnosis of acute coronary syndrome is described. The method comprises providing a solid support (1) with at least one antibody (2), to which at least one cardiac troponin protein (3) from a specimen (4) is specifically bound, splitting the troponin protein (3) with an enzyme into at least one epitope fragment (6) bound to the antibody (2) and at least one non-epitope fragment (7), selecting the non-epitope fragment (7) specifically split by the enzyme and diagnosing acute coronary syndrome on the basis of the presence and/or absence of the enzyme-specific non-epitope fragment (7). A kit for the diagnosis of acute coronary syndrome and uses of at least one non-epitope fragment (7) of a cardiac troponin protein (3) specifically split by an enzyme are also described.

Inventors:
MÖCKEL MARTIN (DE)
PRZYBYLSKI MICHAEL (DE)
LADE OLIVER (DE)
RAUSCH SASKIA (DE)
Application Number:
PCT/EP2013/076824
Publication Date:
June 26, 2014
Filing Date:
December 17, 2013
Export Citation:
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Assignee:
SIEMENS AG (DE)
CHARITÉ UNIVERSITÄTSMEDIZIN BERLIN (DE)
International Classes:
G01N33/50; G01N33/53; G01N33/543
Domestic Patent References:
WO2010042126A12010-04-15
WO2002023191A12002-03-21
WO2010073182A12010-07-01
WO2002089657A22002-11-14
Foreign References:
US20050164317A12005-07-28
US20110129818A12011-06-02
Other References:
MARCUS MACHT ET AL: "Mass Spectrometric Mapping of Protein Epitope Structures of Myocardial Infarct Markers Myoglobin and Troponin T +", BIOCHEMISTRY, vol. 35, no. 49, 15 November 1996 (1996-11-15), pages 15633 - 15639, XP055109874, ISSN: 0006-2960, DOI: 10.1021/bi961727w
MARTIN MÖCKEL ET AL: "The acute coronary syndrome diagnosis and prognostic evaluation by troponin I is influenced by the test system affinity to different troponin complexes", CLINICA CHIMICA ACTA, vol. 293, no. 1-2, 1 March 2000 (2000-03-01), pages 139 - 155, XP055109723, ISSN: 0009-8981, DOI: 10.1016/S0009-8981(99)00244-2
Attorney, Agent or Firm:
SIEMENS AKTIENGESELLSCHAFT (DE)
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Claims:
Patentansprüche

1. In-vitro Verfahren zur Diagnose von akutem Koronarsyndrom umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen eines festen Trägers (1) mit mindestens einem Antikörper (2), an den mindestens ein kardiales Troponin-Protein (3) aus einer Probe (4) spezifisch gebunden ist;

b) Spalten des Troponin-Proteins (3) mit einem Enzym in mindestens ein an den Antikörper (2) gebundenes Epitop-

Fragment (6) und mindestens ein Nicht-Epitop-Fragment (7) ;

c) Auslesen des durch das Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragments (7), und

d) Diagnostizieren des akuten Koronarsyndroms anhand des

Vorliegens und/oder Fehlens des enzymspezifischen Nicht- Epitop-Fragments (7) .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt b) bei einer Temperatur von etwa 40°C bis etwa

55°C, vorzugsweise von etwa 50°C bis etwa 53°C, und/oder für etwa 2 Minuten bis etwa 10 Minuten, vorzugsweise etwa 3 Minuten bis etwa 5 Minuten, durchgeführt wird. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt b) das Epitop-Fragment (6) quantifi¬ ziert wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da- durch gekennzeichnet, dass das Troponin-Protein (3)

Troponin I und/oder Troponin T ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslesen des durch das En- zym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragments (7) mittels Massenspektrometrie erfolgt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein erster und ein zweiter Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten verwendet werden .

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Antikörper Troponin I und der zweite Antikörper Troponin T spezifisch bindet.

8. Kit zur Diagnose von akutem Koronarsyndrom umfassend einen festen Träger (1) mit mindestens einem ersten Antikörper und mindestens einem zweiten Antikörper, wobei die Antikörper jeweils unterschiedliche kardiale Troponin- Proteine spezifisch binden.

9. Verwendung von mindestens einem durch ein Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragment (7) mindestens eines kardialen Troponin-Proteins (3) zur Diagnose von akutem Koronarsyndrom.

10. Verwendung von mindestens einem durch ein Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragment (7) mindestens eines kardialen Troponin-Proteins (3) zum Nachweis von mindestens einer posttranslationalen Modifikation des Troponin-Proteins (3) .

Description:
Beschreibung

In-vitro Verfahren und Kit zur Diagnose von akutem Koronarsyndrom

Die Erfindung betrifft ein in-vitro Verfahren und ein Kit zur Diagnose von akutem Koronarsyndrom sowie verschiedene Verwendungen von mindestens einem durch ein Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragment mindestens eines kardialen Troponin-Proteins .

Als eine der häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen von großer medizinischer Bedeutung. Lebensbedrohliche Herz-Kreislauf-Erkrankungen werden unter dem Begriff akutes Koronarsyndrom zusammengefasst . Dazu zählt beispielsweise der Myokardinfarkt (Herzinfarkt) .

Bei einem Myokardinfarkt sterben Teile des Herzmuskels infol ¬ ge von Ischämie ab, die länger als 20 Minuten anhält. Die Ischämie wird in der Regel durch ein Blutgerinnsel in einem Herzkranzgefäß ausgelöst. Die absterbenden Herzmuskelzellen setzen bestimmte Proteine frei, die im Blut der Patienten nachgewiesen werden können. Dazu gehören kardiale Troponin- Proteine. Die in der BlutZirkulation von ischämischen Myo- kardinfarktpatienten mit akutem Koronarsyndrom auftretenden

Troponin-Proteine weisen spezifische posttranslationale Modi ¬ fikationen auf. Beispielsweise sind die 71 N-terminalen Aminosäuren von Troponin T und die 17 C-terminalen Aminosäuren von Troponin I im Serum der Patienten abgespalten. Als spezi- fische Modifikation von Troponin I im Serum von Myokardin- farktpatienten ist auch eine Veränderung des Phosphorylie- rungsstatus der Serinreste 23/24 von Troponin I bekannt.

Für die Diagnose von akutem Koronarsyndrom werden üblicher- weise Immunoassays verwendet, mit denen die Konzentration von Troponin I und Troponin T in der BlutZirkulation des Patienten bestimmt wird. Die Immunoassays sind sehr sensitiv, das heißt ein Patient mit akutem Koronarsyndrom wird mit hoher Wahrscheinlichkeit als solcher erkannt. Problematisch ist da ¬ gegen die sichere Identifizierung von Patienten mit unspezifischen klinischen Befunden und unspezifischen EKG- Veränderungen, die trotz akuter Brustschmerzen kein akutes Koronarsyndrom aufweisen. Da diese Patienten auch erhöhte Troponin-Werte im Blut aufweisen, werden sie mittels der Immunoassays fehlerhaft als Patienten mit akutem Koronarsyn ¬ drom diagnostiziert. Solche Fehldiagnosen, die aufgrund der geringe Spezifität der Immunoassays für die Diagnose von aku- tem Koronarsyndrom auftreten, stellen in der klinischen Praxis ein Problem dar. Ohne eine korrekte Diagnose können viele Patienten nicht optimal behandelt werden, so dass deren Hei ¬ lungschancen sinken. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie ein Kit bereit zu stellen, das eine spezifische Diagnose von akutem Koronarsyndrom ermög ¬ licht .

Die Aufgabe wird durch ein in-vitro Verfahren mit den Merkma ¬ len gemäß Anspruch 1 und ein Kit mit den Merkmalen gemäß An- spruch 8 gelöst.

Das erfindungsgemäße in-vitro Verfahren zur Diagnose von aku ¬ tem Koronarsyndrom umfasst die Schritte: Bereitstellen eines festen Trägers mit mindestens einem Antikörper, an den min- destens ein kardiales Troponin-Protein aus einer Probe spezifisch gebunden ist, Spalten des Troponin-Proteins mit einem Enzym in mindestens ein an den Antikörper gebundenes Epitop- Fragment und mindestens ein Nicht-Epitop-Fragment , Auslesen des durch das Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop- Fragments, und Diagnostizieren des akuten Koronarsyndroms an ¬ hand des Vorliegens und/oder Fehlens des enzymspezifischen Nicht-Epitop-Fragments .

Der Begriff „akutes Koronarsyndrom" bezeichnet eine lebensbe- drohliche Herz-Kreislauf-Erkrankung, beispielsweise einen

Myokardinfarkt, mit Symptomen, die länger als 20 Minuten an ¬ halten . Für das erfindungsgemäße Verfahren wird zunächst ein fester Träger mit mindestens einem Antikörper bereitgestellt, an den mindestens ein kardiales Troponin-Protein aus einer Probe spezifisch gebunden ist. Der Antikörper ist auf dem Träger immobilisiert und bindet spezifisch an ein oder mehrere kar ¬ diale Troponin-Proteine .

Der Begriff „kardiales Troponin-Protein" bezeichnet ein

Troponin-Protein, das bei Auftreten einer Schädigung des Her- zens in das Blut freigesetzt wird. Zu den kardialen Troponin- Proteinen zählen Troponin I, Troponin T und Troponin C, wobei kardiales Troponin I und kardiales Troponin T speziell im Herzmuskel exprimiert werden. Der Begriff „Troponin-Protein" umfasst alle Isoformen des Troponin-Proteins , das heißt so- wohl nicht modifizierte als auch posttranslational modifi ¬ zierten Formen des Troponin-Proteins. Der Begriff

„posttranslationale Modifikation" bezeichnet jede Modifikati ¬ on eines Proteins, die nach seiner Translation am Ribosomen statt findet. Posttranslationale Modifikationen sind bei- spielsweise die Phosphorylierung und/oder Oxidation von

Aminosäureresten und/oder die Deletion von Aminosäuren oder Aminosäureabschnitten .

Die Bindung des Antikörpers an das kardiale Troponin-Protein beruht auf einer spezifischen nicht-kovalenten Wechselwirkung des Antikörpers mit bestimmten Aminosäureabschnitten des Troponin-Proteins, den sogenannten Epitopen. Der Begriff „Epitop" bezeichnet einen kurzen Aminosäureabschnitte eines Proteins von etwa 5 bis etwa 20 Aminosäuren, der als spezifi- sehe Bindungsstelle für einen Antikörper fungiert.

Der Begriff „Probe" bezeichnet eine Probe von beispielsweise Blut oder Serum eines Patienten, bei dem vorzugsweise ein Verdacht auf akutes Koronarsyndrom besteht.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das Troponin-Protein mit einem Enzym in mindestens ein an den Antikörper gebundenes Epitop-Fragment und mindestens ein Nicht-Epitop-Fragment ge- spalten. Durch die Bindung an den Antikörper sind etwaige Schnittstellen des Enzyms, die innerhalb der Epitope liegen, nicht zugänglich und werden vor der enzymatischen Spaltung geschützt. Das Troponin-Protein wird daher nur an den

Schnittstellen des Enzyms, die für eine enzymatische Spaltung zugänglich sind, gespalten. Der Begriff „Epitop-Fragment" bezeichnet ein Fragment des Troponin-Proteins , das mindestens ein Epitop des Troponin-Proteins aufweist, an das der Anti ¬ körper gebunden ist. Das Epitop-Fragment des Troponin- Proteins bleibt daher bei der enzymatischen Spaltung des

Troponin-Proteins an den Träger gebunden. Der Begriff „Nicht- Epitop-Fragment" bezeichnet ein Fragment des Troponin- Proteins, das keine Bindungsstelle für den Antikörper auf ¬ weist und dadurch bei der Spaltung des Troponin-Proteins mit einem Enzym von dem Träger gelöst wird.

Die Anzahl der Epitop-Fragmente hängt vom verwendeten Anti ¬ körper ab. Wenn der Antikörper beispielsweise nur ein Epitop des Troponin-Proteins bindet, kann bei der Spaltung durch das Enzym ein einziges Epitop-Fragment am Träger verbleiben. Der Antikörper kann aber auch zwei oder mehr Epitope des

Troponin-Proteins binden, so dass durch die enzymatische Spaltung des Troponin-Proteins zwei oder mehr als zwei

Epitop-Fragmente entstehen.

Die Anzahl der Nicht-Epitop-Fragmente hängt von der

posttranslationalen Modifikation des Troponin-Proteins und von dem verwendeten Enzym ab. Wenn die Troponin-Isoform beispielsweise nur eine Schnittstelle für das Enzym aufweist, die außerhalb der Epitope liegt, dann entsteht bei der enzym ¬ spezifischen Spaltung ein einziges Nicht-Epitop-Fragment. Die Anzahl der Nicht-Epitop-Fragmente hängt weiter davon ab, wie viele Schnittstellen des Enzyms durch die Bindung an den Antikörper geschützt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform spaltet das Enzym das Troponin-Protein in etwa 10 bis etwa

100 Nicht-Epitop-Fragmente, beispielsweise in etwa 50 oder in etwa 75 Nicht-Epitop-Fragmente. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird in einem nächsten Schritt das durch das Enzym spezifisch gespaltene Nicht-Epitop- Fragment ausgelesen. Der Begriff „Auslesen" bezeichnet jede Art der Charakterisierung des Nicht-Epitop-Fragments. Das Nicht-Epitop-Fragment kann beispielsweise durch die Bestim ¬ mung seiner Länge, seiner Masse und/oder seiner

Aminosäuresequenz charakterisiert werden. Für das Auslesen können gängige Verfahren der Peptidanalyse verwendet werden. Beispielsweise können chromatographische Verfahren wie Rever- se-Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) zur Bestimmung der Hydrophobizität des Nicht-Epitop-Fragments und/oder Edman-Abbau zur Identifizierung der

Aminosäuresequenz des Nicht-Epitop-Fragments eingesetzt wer ¬ den. Das Auslesen des Nicht-Epitop-Fragments erfolgt vorteil- haft mittels Massenspektrometrie .

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Diagnosti ¬ zieren des akuten Koronarsyndroms anhand des Vorliegens und/oder Fehlens des enzymspezifischen Nicht-Epitop- Fragments. Aufgrund der posttranslationalen Modifikation des Troponin-Proteins in der BlutZirkulation, die spezifisch bei myokardialer Ischämie auftritt, entstehen bestimmte Nicht- Epitop-Fragmente nur bei Vorliegen der Formen des Troponin- Proteins, welche durch Nicht-Koronarsyndrome hervorgerufen werden, bzw. nur bei Vorliegen von akutem Koronarsyndrom. Die Nicht-Epitop-Fragmente weisen somit ein krankheitsspezifi ¬ sches Muster auf, anhand dessen das akute Koronarsyndrom di ¬ agnostiziert werden kann. Liegt eine Schnittstelle des Enzyms zum Beispiel in einem Bereich eines Troponin-Protein, das bei akutem Koronarsyndrom von dem Protein abgespaltenen wird, so wird das Nicht-Epitop-Fragment, das durch Spalten des Enzyms an dieser Schnittstelle entsteht, nur bei den Formen des Troponin-Proteins auftreten, welche durch Nicht- Koronarsyndrome hervorgerufen werden, während es bei Vorlie- gen des akuten Koronarsyndroms fehlt. Die posttranslationale Abspaltung bestimmter Aminosäureabschnitte der Troponin- Proteine bei akutem Koronarsyndrom führt weiterhin dazu, dass bei der Spaltung an einer bestimmten Schnittstelle Nicht- Epitop-Fragmente entstehen, deren Länge sich zwischen der nicht durch Koronarsyndrom hervorgerufenen und der durch Koronarsyndrom modifizierten Form des Troponin-Proteins unterscheidet. Anhand des Auslesen solcher Nicht-Epitop-Fragmente kann das akute Koronarsyndrom ebenfalls diagnostiziert wer ¬ den .

Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr spezifisch, so dass Patienten mit akutem Koronarsyndrom von Patienten mit anderen Ursachen für erhöhte Troponin-Werte im Blut unterschieden werden können. Dies ermöglicht eine spezifische Diagnose von akutem Koronarsyndrom und somit die sichere Identifizierung von betroffenen Patienten. Indem das Verfahren sicher stellt, dass Personen, die trotz erhöhter Troponin-Werte im Blut nicht an akutem Koronarsyndrom erkrankt sind, auch als solche erkannt werden, werden Fehldiagnosen und damit verbundene Fehlbehandlungen dieser Patienten vermieden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der feste Träger ei- ne Chromatographiesäule, beispielsweise eine Sepharosesäule .

In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt b) bei einer Temperatur von etwa 40°C bis etwa 55°C, vorzugsweise von etwa 50°C bis etwa 53°C, und/oder für etwa 2 Minuten bis etwa 10 Minuten, vorzugsweise etwa 3 Minuten bis etwa 5 Minuten, durchgeführt. Das Spalten des Troponin-Proteins mit einem En ¬ zym kann beispielsweise dadurch besonders schnell erfolgen, dass Mikrosäulen verwendet werden, auf denen das Enzym auf einer großen Oberfläche verteilt ist. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das Troponin-Protein bei einer er ¬ höhten Temperatur besonders effizient durch ein Enzym gespalten werden kann. Eine erhöhte Temperatur bedeutet, dass die Temperatur höher als etwa 37°C ist. Das Spalten des Troponin- Proteins kann beispielsweise bei etwa 40°C oder bei etwa 53°C erfolgen. Die Temperatur wird vorzugsweise in Abhängigkeit der Thermostabilität und der Aktivität des verwendeten Enzyms gewählt. Durch die erhöhte Temperatur wird die enzymatische Spaltung des Troponin-Proteins und somit auch das Verfahren insgesamt beschleunigt. Das Spalten des Troponin-Proteins er ¬ folgt vorzugsweise in etwa 3 Minuten, etwa 5 Minuten oder et ¬ wa 8 Minuten. Durch die Spaltung des Troponin-Proteins in nur etwa 2 Minuten bis etwa 10 Minuten ist das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere für den Einsatz im klinischen Umfeld geeignet, da es eine schnelle und spezifische Diagnose von akutem Koronarsyndrom ermöglicht. Somit können lebenswichtige therapeutische Maßnahmen frühzeitig eingeleitet werden, wo ¬ durch sich die Heilungschancen der Patienten verbessern.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach Schritt b) das Epitop-Fragment quantifiziert. Das Epitop-Fragment kann für die Quantifizierung beispielsweise durch Behandeln des Trägers mit Trifluoressigsäure von dem Antikörper gelöst werden. Durch die Quantifizierung des Epitop-Fragments wird die Kon ¬ zentration aller Formen des Troponin-Proteins in der Probe bestimmt. Diese Troponin-Konzentration ist ein wertvoller klinischer Parameter, der neben diagnostischen Zwecken auch für die Abschätzung des Risikos, mit der die Erkrankung fort- schreitet oder zu weiteren Komplikationen führt, von Bedeutung ist. Beispielsweise steht die Troponin-Konzentration mit der Größe eines Myokardinfarkts und mit der Überlebensrate nach einem Infarkt in Zusammenhang. Somit kann die Quantifizierung des Epitop-Fragments für die Feindiagnose von akutem Koronarsyndrom beitragen. Die Quantifizierung des Epitop- Fragments kann mittels üblicher Verfahren der

Peptidquantifizierung durchgeführt werden, beispielsweise mit Massenspektrometrie . In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Troponin-Protein Troponin I und/oder Troponin T. Troponin I und Troponin T sind spezifische Marker im Blut bzw. im Serum von Patienten mit einer Myokardschädigung . Für beide Troponin-Proteine sind spezifische posttranslationale Modifikationen beschrieben, die bei Myokardinfarkt auftreten. Daher sind Troponin I und/oder Troponin T zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Auslesen des durch das Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragments mittels Massenspektrometrie . Die Massenspektrometrie ist ein hochempfindliches Verfahren zur Charakterisierung von Protei- nen und Peptiden, mit dem die Masse jedes Nicht-Epitop- Fragments ermittelt werden kann. Sind die Schnittstellen des verwendeten Enzyms im Troponin-Protein bekannt, so kann die Masse dem enzymspezifischen Nicht-Epitop-Fragment zugeordnet werden. Außerdem erlaubt die Masse des Nicht-Epitop-Fragments einen Rückschluss auf dessen Aminosäuresequenz. Dadurch kann das Vorliegen und/oder Fehlen enzymspezifischer Nicht-Epitop- Fragmente mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Das Auslesen der Nicht-Epitop-Fragmente kann beispielsweise mit MALDI-MS (Matrix-unterstützte Laser-DeSorption/ Ionisation

Massenspektrometrie) und/oder ESI-MS (Elektronenspray- Ionisation Massenspektrometrie) durchgeführt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte a) bis c) des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Affinitäts- Massenspektrometrie durchgeführt. Dabei wird eine Affinitäts ¬ chromatographie zum Bereitstellen des Träger mit dem an den Antikörper gebundenen Troponin-Protein mit einer

Massenspektrometrie zum Auslesen des durch das Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragments kombiniert. Die Af- finitäts-Massenspektrometrie ist einfach zu standardisieren und ermöglicht eine effiziente Durchführung des erfindungsge ¬ mäßen Verfahrens .

In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach Schritt b) das durch das Enzym spezifisch gespaltene Nicht-Epitop-Fragment quantifiziert. Die Quantifizierung des Nicht-Epitop-Fragments ergibt die Konzentration der jeweiligen posttranslational mo ¬ difizierten Form des Troponin-Proteins in der Probe. Die Quantifizierung kann beispielsweise mittels

Massenspektrometrie durchgeführt werden. Aus der Konzentrati ¬ on der einzelnen modifizierten Troponin-Formen können Informationen über den Krankheitsverlauf und/oder die Schwere des akuten Koronarsyndroms abgeleitet werden. Somit liefert die Quantifizierung des Nicht-Epitop-Fragments einen wertvollen klinischen Parameter für die Feindiagnose von akutem Koronarsyndrom. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Quantifizieren des Nicht-Epitop-Fragments unter Verwendung des gleichen Verfahrens, mit der das Nicht-Epitop-Fragment auslesen wird. Dadurch kann das Nicht-Epitop-Fragment auf ef ¬ fiziente und kostengünstige Weise identifiziert und quantifi- ziert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Während polyklonale Antikörper aufgrund ihrer Herstellung ein Gemisch von Antikörpern darstel- len, die an unterschiedliche Epitope des Troponin-Proteins binden, erkennt ein monoklonaler Antikörper im Optimalfall ein spezifisches Epitop des Troponin-Proteins. Der monoklona ¬ le Antikörper wird vorteilhaft so ausgewählt, dass er nicht an Aminosäureabschnitte des Troponin-Proteins bindet, in de- nen posttranslationale Modifikationen auftreten können. Dadurch wird sicher gestellt, dass alle Isoformen des Troponin- Proteins an den Antikörper binden, insbesondere auch

posttranslational modifizierte Formen, denen bestimmte

Aminosäureabschnitte fehlen.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden ein erster und ein zweiter Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten verwendet. In diesem Fall sind zwei verschiedene kardiale Troponin-Proteine aus der Probe an den Träger gebunden, die zusammen in einem Verfahrensdurchlauf zur Diagnose von akutem Koronarsyndrom herangezogen werden. Dadurch wird die Spezifität der Diagnose erhöht.

In einer bevorzugten Ausführungsform bindet der erste Anti- körper spezifisch Troponin I und der zweite Antikörper bindet spezifisch Troponin T. Dadurch sind sowohl Troponin I- als auch Troponin T-Proteine an den Träger gebunden. Beide

Troponin-Proteine weisen bei Vorliegen des akuten Koronarsyn- droms ischämisch bedingte posttranslationale Modifikationen auf. Das Auslesen der Nicht-Epitop-Fragmente von sowohl

Troponin T als auch Troponin I ermöglicht es daher, das akute Koronarsyndrom mit einer hohen Spezifität zu diagnostizieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Muster, die beim Auslesen mehrerer Nicht-Epitop-Fragmente von mindestens zwei unterschiedlichen Troponin-Proteinen wie beispielsweise

Troponin I und Troponin T erhalten werden, einer zugrundelie- genden Erkrankung zugeordnet. Die krankheitsspezifischen Muster, die als Troponin-Fingerprints bezeichnet werden, entste ¬ hen aufgrund der unterschiedlichen posttranslationalen Modifikationen der Troponin-Proteine, die bei verschiedenen Herz- Kreislauf-Erkrankungen auftreten. In einer besonders bevor- zugten Ausführungsform wird der Troponin-Fingerprint für die Zuordnung der zugrundeliegenden Erkrankung mit der Konzentration der einzelnen modifizierten Troponin-Formen kombiniert, die durch die Quantifizierung der Nicht-Epitop-Fragmente ge ¬ wonnen wird. Durch die Troponin-Muster bzw. -Fingerprints wird die Diagnose von akutem Koronarsyndrom um die Identifi ¬ zierung der konkreten zugrundeliegenden Erkrankung erweitert. Dadurch wird die Spezifität der Diagnose erhöht und die Fest ¬ stellung einer geeigneten Behandlungsstrategie vereinfacht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym eine

Protease. Die Protease wird so ausgewählt, dass sie das

Troponin-Protein an mindestens einer Schnittstelle spaltet. Vorteilhaft wird eine Protease eingesetzt, deren Schnittstel ¬ le oder Schnittstellen in dem Troponin-Protein bekannt sind, wie beispielsweise Trypsin oder Chymotrypsin . Dadurch wird das nachfolgende Auslesen des durch das Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragments erleichtert. Trypsin bei ¬ spielsweise spaltet Proteine nach den Aminosäuren Lysin und Arginin .

Bei der enzymatischen Troponin-Spaltung ist es möglich, dass das Enzym jedes an den Träger gebundene Troponin-Protein an jeder zugänglichen, das heißt nicht durch die Antikörperbin- dung geschützten, Schnittstelle spaltet. Die meisten Enzyme spalten jedoch nicht jedes Troponin-Protein an jeder möglichen Schnittstelle. Vielmehr kommt es vor, dass das Enzym in einem Teil der Proteine einzelne oder mehrere zugängliche Schnittstellen auslässt. Das Ausmaß dieses Auslassens von

Schnittstellen hängt vor allem von der Enzymaktivität ab und kann durch die Bedingungen der Troponin-Spaltung wie beispielsweise Dauer, pH-Wert und/oder Temperatur beeinflusst werden. Wenn das Enzym in einem Teil der Troponin-Proteine einzelne oder mehrere Schnittstellen auslässt, entstehen zu ¬ sätzlich zu den Fragmenten, die durch Spaltung der Troponin- Proteine an zwei benachbarten Schnittstellen gebildet werden, auch längere Epitop- und Nicht-Epitop-Fragmente. Je mehr Schnittstellen das Enzym auslässt, umso größer ist die Anzahl der möglichen Nicht-Epitop-Fragmente. Mit der steigenden An ¬ zahl an Nicht-Epitop-Fragmenten erhöht sich die Komplexität des Ausleseschrittes. Außerdem kann der Nachweis bestimmter Nicht-Epitop-Fragmente durch eine hohe Anzahl an Nicht- Epitop-Fragmenten erschwert werden. Die Bedingungen der

Troponin-Spaltung werden daher vorzugsweise so gewählt, dass das Enzym höchstens zwei aufeinanderfolgende Schnittstellen auslässt. Dadurch können die Nicht-Epitop-Fragmente effizient ausgelesen und das Vorliegen und/oder Fehlen von Nicht- Epitop-Fragmenten kann auf einfache Weise detektiert werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym Chymotrypsin . Chymotrypsin spaltet Proteine nach den Aminosäuren Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, Leucin und Methio- nin. Bei der Spaltung von Troponin I oder Troponin T mit Chymotrypsin entstehen mehrere Nicht-Epitop-Fragmente, die nur bei der nicht durch Koronarsyndrom hervorgerufenen, nicht oder anders modifizierten Form des Troponin-Proteins vorlie ¬ gen, und somit bei akutem Koronarsyndrom fehlen. Zusätzlich werden Nicht-Epitop-Fragmente erzeugt, die nur bei ischämisch posttranslational modifizierten Troponin-Isoformen auftreten. Dadurch, dass bestimmte chymotrypsinspezifische Nicht-Epitop- Fragmente nur bei der nicht durch Koronarsyndrom hervorgeru ¬ fenen Form oder nur bei der durch Koronarsyndrom modifizier- ten Form des Troponin-Proteins entstehen und somit bei der jeweiligen anderen Form fehlen, wird die Diagnose von akutem Koronarsyndrom erleichtert, was zu der hohen Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens beiträgt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Kit zur Diagnose von akutem Koronarsyndrom umfassend einen festen Träger mit mindestens einem ersten Antikörper und mindestens einem zweiten Antikörper, wobei die Antikörper jeweils unter- schiedliche kardiale Troponin-Proteine spezifisch binden. So ¬ mit werden zwei verschiedene kardiale Troponin-Proteine an den Träger gebunden, die zusammen zur Diagnose von akutem Koronarsyndrom herangezogen werden. Dadurch wird eine hohe Spezifität der Diagnose erreicht.

In einer bevorzugten Ausführungsform bindet der erste Antikörper spezifisch Troponin I, und der zweite Antikörper bindet spezifisch Troponin T. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem durch ein Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragment mindestens eines kardialen Troponin- Proteins zur Diagnose von akutem Koronarsyndrom. Das Nicht- Epitop-Fragment wird vorteilhaft so ausgewählt, dass es ein Nicht-Epitop-Fragment ist, das nur bei enzymatischer Spaltung einer ischämisch posttranslational modifizierten Form des Troponin-Proteins entsteht. Anhand des Vorliegens dieses Nicht-Epitop-Fragments wird das akute Koronarsyndrom diagnos ¬ tiziert .

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Verwendung von mindestens einem durch ein Enzym spezifisch gespaltenen Nicht-Epitop-Fragment mindestens eines kardialen

Troponin-Proteins zum Nachweis von mindestens einer

posttranslationalen Modifikation des Troponin-Proteins. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die posttranslationale Modifikation des Troponin-Proteins eine Abspaltung von N- terminalen oder C-terminalen Aminosäureabschnitten, wie sie bei Troponin-Proteinen im Blut von Myokardinfarktpatienten auftreten. Das Nicht-Epitop-Fragment kann nicht nur zum Nach ¬ weis einer bekannten posttranslationalen Modifikation des Troponin-Proteins verwendet werden, sondern auch zur Identi- fizierung und Charakterisierung von neuen posttranslationalen Modifikationen des Troponin-Proteins eingesetzt werden.

Im Folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand einer schematischen Zeichnung dargestellt.

Figur 1 zeigt einen festen Träger 1, der von einer

Sepharosesäule gebildet wird und auf dessen Oberfläche mono ¬ klonale Antikörper 2 immobilisiert sind. Zunächst wird eine Probe 4 mit der Sepharosesäule in Kontakt gebracht. Die Probe 4 ist Serum eines Patienten mit Verdacht auf akutes Koronar ¬ syndrom und enthält neben den gewöhnlichen Serumproteinen kardiale Troponin-Proteine 3. Die Antikörper 2 auf der Säule binden spezifisch kardiales Troponin I. Somit binden die im Serum enthaltenen kardialen Troponin I-Proteine bei Kontakt mit der Säule an die Antikörper 2. Die Säule wird anschlie ¬ ßend mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, um ungebundene Proteine 5 von der Säule zu entfernen. In einem nächsten Schritt wird die Säule mit Chymotrypsin in Kontakt gebracht. Die Chymotrypsinspaltung wird für 5 Minuten bei

53°C durchgeführt, wobei Chymotrypsin das an die Säule gebun ¬ dene Troponin I spezifisch in mehrere Fragmente spaltet. Da ¬ bei sind diejenigen Schnittstellen von Chymotrypsin, die im Bereich der Bindungsstellen des Antikörpers 2 an Troponin I liegen, durch den Antikörper 2 vor einer Spaltung durch

Chymotrypsin geschützt. Troponin-Fragmente, die die Epitope umfassen, bleiben als Epitop-Fragmente 6 an die Antikörper 2 gebunden, während sich durch Chymotrypsin spezifisch gespaltene Nicht-Epitop-Fragmente 7 von der Säule lösen. Die Nicht- Epitop-Fragmente 7 können durch Waschen der Säule von dieser getrennt werden. Anschließend werden die Nicht-Epitop- Fragmente 7 mittels Massenspektrometrie analysiert, um spezi ¬ fische posttranslationale Modifikationen von Troponin I nach- zuweisen (nicht dargestellt) . Durch Behandeln der Säule mit Trifluoressigsäure werden die Epitop-Fragmente 6 von den An ¬ tikörpern 2 gelöst und zur Bestimmung der Troponin I- Konzentration im Serum verwendet (nicht dargestellt) .

Beispiele

Im Folgenden sind Beispiele für mittels Massenspektrometrie ausgelesene Nicht-Epitop-Fragmente der humanen kardialen Troponin-Proteine Troponin I und Troponin T gezeigt. Die Be ¬ dingungen wurden in allen Beispielen so gewählt, dass

Cystein-und Methioninreste in reduzierter Form vorliegen und bei der Troponin-Spaltung höchstens zwei Schnittstellen von dem Enzym ausgelassen werden. Die Massen der Nicht-Epitop- Fragmente sind in [M+H] + angegeben. In der ersten Spalte der Tabellen sind die Massen der Nicht-Epitop-Fragmente aufge ¬ führt, die bei Vorliegen der nicht modifizierten Form des jeweiligen Troponin-Proteins entstehen. In der zweiten Spalte der Tabellen sind die Massen der Nicht-Epitop-Fragmente auf- geführt, die bei Vorliegen einer posttranslational modifi ¬ zierten Form des jeweiligen Troponin-Proteins und damit bei Vorliegen des akuten Koronarsyndroms detektiert werden. In der dritten Spalte der Tabellen sind die Aminosäuresequenzen der Nicht-Epitop-Fragmente angegeben, die entweder nur bei der nicht modifizierten Form oder nur bei der modifizierten Form des Troponin-Proteins entstehen. Die Angaben der

Schnittstellen beziehen sich auf die Position der Aminosäuren in der nicht modifizierten Form des jeweiligen Troponin- Proteins, beginnend vom N-terminalen Ende des Proteins.

Beispiel 1: Troponin I

Bei Ischämie tritt eine C-terminal modifizierte Form von Troponin I auf, die am C-terminalen Ende um 17 Aminosäuren verkürzt ist. Als Antikörper wurde der anti-Troponin I Anti ¬ körper aus dem Siemens Immulite 2500 cTnl Kit (2nd generation assay, Siemens Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA) verwendet. Die Bindungsstelle des Antikörpers liegt im Abschnitt von Aminosäure 24 bis 40 des Troponin I- Proteins. Dieses Epitop des Troponin I-Proteins ist durch die Bindung an den Antikörper vor der Spaltung durch Chymotrypsin und/oder Trypsin geschützt. Aus Vorarbeiten ist bekannt, dass das N-terminale Methionin des Troponin I in der

massenspektrometrischen Analyse nicht detektiert wird.

Aminosäuresequenz der nicht modifizierten Form von Troponin I :

M ADGSSDAARE PRPAPAPIRR RSSNYRAYAT EPHAKKKSKI SASRKLQLKT LLLQIAKQEL EREAEERRGE KGRALSTRCQ PLELAGLGFA ELQDLCRQLH ARVDKVDEER YDIEAKVTKN ITEIADLTQK IFDLRGKFKR PTLRRVRI SA DAMMQALLGA RAKESLDLRA HLKQVKKEDT EKENREVGDW RK IDALSGMEGRKKKFES (SEQ ID NO: 1)

Die Aminosäuresequenz der C-terminal posttranslational modi ¬ fizierten Form von Troponin I ist unter SEQ ID NO: 2 gezeigt.

1. Spalten von Troponin I mit Chymotrypsin

Nicht mo ¬ di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

vo vo

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäuresequenz

3.888, 0501 3.888, 0501

3.770, 9493 3.770, 9493

3.505, 8622 RAHLKQVKKEDTEKENREVG

DWRKNIDAL (SEQ ID NO: 3)

3.381, 7767 3.381, 7767 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäuresequenz

3 .303, 6749 KQVKKEDTEKENREVGDWRK NIDALSGM

(SEQ ID NO: 4)

3 .270, 6964 3 .270, 6964

3 .028, 5810 KQVKKEDTEKENREVGDWRK NIDAL

(SEQ ID NO: 5)

2 .979, 5871 RAHLKQVKKEDTEKENREVG DWRK

(SEQ ID NO: 6)

2 .923, 5020 2 .923, 5020

2 .813, 4434 2 .813, 4434

2 .709, 4754 2 .709, 4754

2 .695, 3910 2 .695, 3910

2 .618, 4287 2 .618, 4287

2 .596, 3913 2 .596, 3913

2 .571, 3168 2 .571, 3168

2 .502, 3059 KQVKKEDTEKENREVGDWRK (SEQ ID

NO: 7)

2 .390, 3177 2 .390, 3177

2 .373, 1728 2 .373, 1728

2 .258, 3138 2 .258, 3138

2 .218, 1098 2 .218, 1098

2 .017, 0032 2 .017, 0032

1 .978, 1014 RKNIDALSGMEGRKKKF (SEQ ID NO:

8)

1 .901, 0684 1 .901, 0684

1 .785, 9314 1 .785, 9314 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäuresequenz

1.772, 9640 1.772, 9640

1.770, 0279 1.770, 0279

1.617, 8675 1.617, 8675

1.536, 8604 1.536, 8604

1.516, 7502 1.516,7502

1.383, 7049 SGMEGRKKKFES (SEQ ID NO: 9)

1.352, 7685 1.352,7685

1.330, 7953 1.330,7953

1.305, 6878 1.305, 6878

1.287, 6725 1.287, 6725

1.256, 7321 1.256, 7321

1.188, 6041 1.188, 6041

1.174, 6473 1.174, 6473

1.172, 6633 1.172, 6633

1.167, 6303 SGMEGRKKKF (SEQ ID NO: 10)

1.108, 6109 EGRKKKFES (SEQ ID NO: 11)

1.104, 5830 RKNIDALSGM (SEQ ID NO: 12)

1.102, 6843 1.102, 6843

1.059, 5793 1.059, 5793

1.055, 6459 1.055, 6459

1.046, 5299 1.046, 5299

944, 5523 944, 5523

942, 5618 942, 5618

892, 5363 892, 5363 Nicht mo- di

fi Modifi - zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäuresequenz

892, 4410 892, 4410

875, 4403 875, 4403

864, 4825 864, 4825

831, 4683 831, 4683

829, 4890 RKNIDAL (SEQ ID NO: 13)

829, 4778 829, 4778

804, 4032 804, 4032

777, 4141 777, 4141

735, 4148 735, 4148

724, 4100 724, 4100

715, 4712 715, 4712

706, 3770 706, 3770

688, 3512 688, 3512

636, 3715 636, 3715

614, 3984 614, 3984

602, 3872 602, 3872

587, 4126 587, 4126

575, 3221 575, 3221

536, 2715 536, 2715

519, 2708 519, 2708

507, 3038 507, 3038

502, 2871 502, 2871

496, 2990 496, 2990

474, 3286 474, 3286 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäuresequenz

464, 2503 464, 2503

462, 2381 462, 2381

444,2816 444,2816

375, 1874 375, 1874

361, 2445 361, 2445

332, 1816 332, 1816

331, 1976 331, 1976

303,2139 RK

294, 1118 SGM

261, 1445 261, 1445

260, 1605 260, 1605

260, 1605 260, 1605

247, 1288 247, 1288

245, 1859 245, 1859

235, 0924 ES

223, 1077 223, 1077

150,0583 150,0583

132, 1019 132, 1019

Durch die chymotrypsinspezifische Spaltung nach Aminosäure 190 entsteht bei der modifizierten Form von Troponin I ein Nicht-Epitop-Fragment aus zwei Aminosäuren RK mit der Masse 303,2139 [M+H] + . Bei der nicht modifizierten Form entsteht bei gleichzeitiger Spaltung nach Aminosäure 197, die in der modifizierten Form nicht existiert, ein Nicht-Epitop-Fragment aus sieben Aminosäuren mit der Sequenz RKNIDAL (SEQ ID NO: 13) und einer Masse von 829,4890 [M+H] + . Wenn keine Spaltung durch Chymotrypsin nach Aminosäure 190 erfolgt, aber an der kurz davor liegenden Schnittstelle nach Aminosäure 172, ent ¬ steht bei der modifizierten Form von Troponin I ein Nicht- Epitop-Fragment der Sequenz KQVKKEDTEKENREVGDWRK (SEQ ID NO: 7) mit der Masse 2.502,3059 [M+H] + . Bei der nicht modifizier ¬ ten Form entsteht bei gleichzeitiger Spaltung nach Aminosäure 197 dagegen ein Nicht-Epitop-Fragment der Sequenz KQVKKEDTEKENREVGDWRKNIDAL (SEQ ID NO: 5) mit der Masse 3.028,5810 [M+H] + . Wenn keine Spaltung nach den Aminosäuren 190 und 172, 171 erfolgt, entsteht durch Spaltung nach Amino ¬ säure 168 bei der modifizierten Form von Troponin I ein Nicht-Epitop-Fragment der Sequenz RAHLKQVKKEDTEKENREVG DWRK (SEQ ID NO: 6) (2.979,5871 [M+H] + ) und bei der nicht modifizierten Form ein Nicht-Epitop-Fragment der Sequenz RAHLKQVKKEDTEKENREVG DWRKNIDAL (SEQ ID NO: 3) (3.505,8622 [M+H] + ) .

2. Spalten von Troponin I mit Trypsin

Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

vo vo

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäuresequenz

3.209, 6670 3.209, 6670

3.023,5553 3.023,5553

2.817, 4498 2.817, 4498

2.681, 3650 2.681, 3650 Nicht mo- di

f i Modif i- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäure sequenz

2.604, 3272 2.604, 3272

2.360, 2424 2.360,2424

2.293, 2285 2.293, 2285

2.218, 2441 2.218,2441

2.169, 1873 2.169, 1873

2.090, 0849 2.090, 0849

2.076, 0252 2.076, 0252

2.075, 1495 2.075, 1495

2.037, 2430 2.037, 2430

2.032, 9868 E VGDWRKN I DAL S GME GR (SEQ ID

NO: 14)

1.933, 9838 1.933, 9838

1.902, 0411 1.902, 0411

1.890, 0331 1.890, 0331

1.859, 0102 1.859, 0102

1.762, 7990 1.762,7990

1.708, 8388 1.708, 8388

1.702, 9091 1.702, 9091

1.694, 8595 1.694, 8595

1.646, 8716 1.646, 8716

1.594, 8295 1.594, 8295

1.573, 8795 1.573, 8795

1.554, 9213 1.554, 9213

1.536, 8856 1.536, 8856 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o vo

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäuresequenz

1.510, 0090 1.510, 0090

1.447, 7395 1.447, 7395

1.444, 7139 1.444, 7139

1.418, 7420 KNIDALSGMEGRK (SEQ ID NO:

15) ; alternativ

NIDALSGMEGRKK (SEQ ID NO: 16)

1.415, 8342 1.415, 8342

1.381, 9141 1.381, 9141

1.380,7957 1.380,7957

1.366, 6485 1.366, 6485

1.290, 6470 KNIDALSGMEGR (SEQ ID NO: 17);

alternativ

NIDALSGMEGRK (SEQ ID NO : 18)

1.288, 6392 1.288, 6392

1.288, 6127 1.288, 6127

1.259, 7331 1.259, 7331

1.245, 6685 1.245, 6685

1.181, 6637 1.181, 6637

1.162, 5521 NIDALSGMEGR (SEQ ID NO: 19)

1.160, 5443 1.160, 5443

1.148, 5542 1.148, 5542

1.123, 6622 1.123, 6622

1.104, 5895 1.104, 5895

1.103, 6320 1.103, 6320 Nicht mo- di

f i Modif i - zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäure sequenz

1.103, 5439 1.103, 5439

1.102, 6843 1.102, 6843

1.074, 6014 1.074, 6014

1.073, 6690 1.073, 6690

1.066, 5779 1.066, 5779

1.053, 6752 1.053, 6752

1.020, 4592 1.020, 4592

989, 4898 989, 4898

966, 5479 966, 5479

951, 6098 951, 6098

931, 5207 931, 5207

917, 5679 917, 5679

899, 5924 899, 5924

889, 4526 889, 4526

849, 3697 849, 3697

848, 4988 848, 4988

823, 5148 823, 5148

798, 5057 798, 5057

789, 3849 789, 3849

761, 3576 761, 3576

760, 4424 760, 4424

749, 3675 749, 3675

738, 3668 738, 3668

732, 3886 732, 3886 Nicht mo- di

f i Modif i- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäure sequenz

702, 4005 702, 4005

674, 3468 674, 3468

663, 3824 663, 3824

647, 2995 647, 2995

642, 4045 642, 4045

638, 3508 KKFES (SEQ ID NO: 20)

633, 2838 633, 2838

629, 4344 629, 4344

624, 3576 624, 3576

621, 2726 621, 2726

547, 3198 547, 3198

546, 2994 546, 2994

510, 2558 KFES (SEQ ID NO: 21)

502, 3347 502, 3347

501, 3395 501, 3395

489, 2779 489, 2779

479, 2976 479, 2976

468, 2929 468, 2929

430, 2885 430,2885

418, 2045 418,2045

403, 3027 KKK

382, 1609 FES

374, 2398 374, 2398

361, 2081 361, 2081 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

I I Aminosäuresequenz

347,2289 347,2289

333, 1768 333, 1768

331, 2200 331, 2200

294, 1812 294, 1812

275,2077 275,2077

274, 1873 274, 1873

232, 1404 232, 1404

218, 1499 218, 1499

204, 1342 204, 1342

175, 1189 175, 1189

147, 1128 147, 1128

Durch die trypsinspezifischen Schnittstellen nach den Aminosäuren 192 und 193, die am C-terminalen Ende der verkürzten modifizierten Form von Troponin I liegen, entstehen Nicht- Epitop-Fragmente, die nur bei der nicht modifizierten Form des Proteins vorliegen. Diese Fragmente treten also nur bei Patienten auf, die kein akutes Koronarsyndrom haben. Ein Beispiel ist das Nicht-Epitop-Fragment der Sequenz

EVGDWRKNIDALSGMEGR (SEQ ID NO: 14) (2.032, 9868 [M+H] + ). Durch die Spaltung durch Trypsin an Schnittstellen, die in dem Abschnitt von Troponin I liegen, der bei der modifizierten Form fehlt, treten weitere Nicht-Epitop-Fragmente auf, die nur bei der nicht modifizierten Form des Proteins entstehen. Beispie- le für solche Fragmente sind KKFES (SEQ ID NO: 20) (638,3508 [M+H] + ) und KFES (SEQ ID NO: 21) (510, 2558 [M+H] + ).

Beispiel 2: Troponin T

Für Troponin T ist eine N-terminale posttranslationale Modi ¬ fikation beschrieben, die bei myokardialer Ischämie auftritt. Die modifizierte Form entsteht durch die Abspaltung der N- terminalen Aminosäuren 1 bis 71 von Troponin T. Als Antikör- per wurden der M7 Antikörper und der M11.7 Antikörper (beide Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland) verwendet. Die Bin ¬ dungsstellen der Antikörper liegen beim M7 Antikörper im Abschnitt von Aminosäure 125 bis 131 und beim M11.7 Antikörper im Abschnitt von Aminosäure 136 bis 147 des Troponin T- Proteins. Diese Epitope des Troponin T-Proteins sind durch ihre Bindung an die Antikörper vor der Spaltung durch Trypsin geschützt .

Aminosäuresequenz der nicht modifizierten Form von Troponin T:

MSDIEEVVEEYEEEEQEEAAVEEQEEAAEEDAEAEAETEETRAEEDEEEEEAKEAEDGPM EESKPKPRSFMPNLVPPKI PDGERVDFDDIHRKRMEKDLNELQALIEAHFENRKKEEEEL VSLKDRIERRRAERAEQQRIRNEREKERQNRLAEERARREEEENRRKAEDEARKKKALSN MMHFGGYIQKQAQTERKSGKRQTEREKKKKILAERRKVLAIDHLNEDQLREKAKELWQS I YNLEAEKFDLQEKFKQQKYEINVLRNRINDNQKVSKTRGKAKVTGRWK (SEQ ID NO: 22)

Die Aminosäuresequenz der In ¬ terminal posttranslational modi- fizierten Form von Troponin T ist unter SEQ ID NO: 23 ge- zeigt .

1. Spalten von Troponin T mit Chymotrypsin Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäuresequenz

7.934,2965 SDIEEVVEEYEEEEQEEAAV

EEQEEAAEEDAEAEAETEET RAEEDEEEEEAKEAEDGPME ESKPKPRSF (SEQ ID NO: 24)

7.197,0032 EEEEQEEAAVEEQEEAAEED

AEAEAETEETRAEEDEEEEE AKEAEDGPMEESKPKPRSFM PNL (SEQ ID NO: 25)

6.879,7228 MSDIEEVVEEYEEEEQEEAA

VEEQEEAAEEDAEAEAETEE TRAEEDEEEEEAKEAEDGPM

(SEQ ID NO: 26)

6.748,6823 SDIEEVVEEYEEEEQEEAAV

EEQEEAAEEDAEAEAETEET RAEEDEEEEEAKEAEDGPM

(SEQ ID NO: 27)

6.741,7830 EEEEQEEAAVEEQEEAAEED

AEAEAETEETRAEEDEEEEE AKEAEDGPMEESKPKPRSF

(SEQ ID NO: 28)

5.556,1688 EEEEQEEAAVEEQEEAAEED

AEAEAETEETRAEEDEEEEE AKEAEDGPM (SEQ ID NO: 29)

4. 441, 6065 4. 441, 6065

4. 169, 4217 4. 169, 4217

3. 956, 2165 3. 956, 2165

3. 892, 3155 3. 892, 3155

3. 660, 8405 3. 660, 8405 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäuresequenz

3.601, 0197 3.601, 0197

3.529, 8000 3.529, 8000

3.408, 9410 3.408, 9410

3.316, 8924 3.316, 8924

3.280, 8461 3.280, 8461

3.197, 6845 3.197, 6845

3.109, 6138 3.109, 6138

3.039,7861 3.039,7861

3.005,5625 3.005,5625

2.975, 5342 MPNLVPPKI PDGERVDFDDI HRKRM

(SEQ ID NO: 30)

2.844, 4937 PNLVPPKIPDGERVDFDDIH RKRM

(SEQ ID NO: 31)

2.840, 6190 2.840, 6190

2.712, 5240 2.712, 5240

2.520,3139 2.520,3139

2.213, 1196 2.213, 1196

2.200, 1244 2.200, 1244

2.022, 0614 2.022, 0614

2.020, 0934 2.020, 0934

1.923, 9996 MPNLVPPKI PDGERVDF (SEQ ID NO:

32)

1.911, 9705 1.911, 9705

1.900, 9399 1.900, 9399

1.794, 9748 1.794, 9748 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäuresequenz

1 .792, 9591 PNLVPPKI PDGERVDF (SEQ ID NO:

33)

1.659, 8523 EESKPKPRSFMPNL (SEQ ID NO:

34)

1.658, 8496 1 .658, 8496

1.602, 8333 1 .602, 8333

1.555, 8009 1 .555, 8009

1.550, 8325 1 .550, 8325

1.472, 7703 1 .472,7703

1.468, 7794 1 .468, 7794

1.454, 7638 1 .454, 7638

1.420, 8383 1 .420, 8383

1.383, 6790 1 .383, 6790

1.342, 5719 MSDIEEVVEEY (SEQ ID NO : 35)

1.341, 6685 1 .341, 6685

1.303, 6488 1 .303, 6488

1.284, 6582 1 .284, 6582

1.262, 7103 1 .262, 7103

1.226, 6528 1 .226, 6528

1.211, 5314 SDIEEVVEEY (SEQ ID NO: 36)

1.204, 6320 EESKPKPRSF (SEQ ID NO: 37)

1.172, 6157 1 .172, 6157

1.167, 5640 1 .167, 5640

1.078, 5415 1 .078, 5415

1.070, 5523 1 .070, 5523 Nicht mo- di

f i Modif i - zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäure sequenz

1.059, 5945 1.059, 5945

928, 4887 928, 4887

923, 4621 923, 4621

873, 5152 873, 5152

871, 5472 871, 5472

860, 4360 860, 4360

851, 4145 851, 4145

850, 4305 850, 4305

779, 3934 779, 3934

766, 3011 766, 3011

737, 3828 737, 3828

711, 2919 711, 2919

696, 3351 696, 3351

694, 3882 694, 3882

687, 3672 687, 3672

623, 3035 623, 3035

618, 2729 618, 2729

616, 3089 616, 3089

587, 3399 587, 3399

580, 2514 580, 2514

568, 3089 568, 3089

551, 2824 551, 2824

510, 2558 510, 2558

504, 2664 504, 2664 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäuresequenz

482, 1738 482, 1738

474,2381 MPNL (SEQ ID NO: 38)

434, 1856 434, 1856

375, 1874 375, 1874

351, 1333 351, 1333

343, 1976 PNL

331, 1976 331, 1976

318, 2023 318, 2023

303, 1451 303, 1451

296, 1241 296, 1241

247, 1288 247, 1288

246, 1448 246, 1448

205, 0971 205, 0971

150,0583 150,0583

147, 1128 147, 1128

Durch die chymotrypsinspezifische Spaltung nach Aminosäure 74 entsteht bei der modifizierten Form von Troponin T ein kurzes Nicht-Epitop-Fragment aus drei Aminosäuren der Sequenz PNL mit der Masse 343,1976 [M+H] + . Bei der nicht modifizierten Form des Troponin T-Proteins entsteht dagegen bei gleichzei ¬ tiger Spaltung nach Aminosäure 70 ein längeres Nicht-Epitop- Fragment mit der Sequenz MPNL (SEQ ID NO: 38) und der Masse 474,2381 [M+H] + . Erfolgt keine Spaltung durch Chymotrypsin nach Aminosäure 74, aber nach Aminosäure 87, so entsteht bei der modifizierten Form von Troponin T das Nicht-Epitop- Fragment der Sequenz PNLVPPKI PDGERVDF (SEQ ID NO: 33)

(1.792,9591 [M+H] + ), während bei der nicht modifizierten Form bei gleichzeitiger Spaltung nach Aminosäure 70 das Nicht- Epitop-Fragment der Sequenz MPNLVPPKI PDGERVDF (SEQ ID NO: 32) (1.923,9996 [M+H] + ) entsteht. Erfolgt weder eine Spaltung nach Aminosäure 74 noch nach Aminosäure 87, aber nach Amino ¬ säure 91, so entsteht bei der modifizierten Form von Troponin T ein Nicht-Epitop-Fragment der Sequenz PNLVPPKIPDGERVDFDDIH RKRM (SEQ ID NO: 31) (2.844,4937 [M+H] + ). Bei der natürlichen Form entsteht bei gleichzeitiger Spaltung nach Aminosäure 70 ein Nicht-Epitop-Fragment der Sequenz MPNLVPPKIPDGERVDFDDI HRKRM (SEQ ID NO: 30) (2.975,5342 [M+H] + ). 2. Spalten von Troponin T mit Trypsin

Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

vo vo

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäuresequenz

7.831,2366 MSDIEEVVEEYEEEEQEEAA

VEEQEEAAEEDAEAEAETEE TRAEEDEEEEEAKEAEDGPM EESKPKPR (SEQ ID NO: 39)

6.150,4589 MSDIEEVVEEYEEEEQEEAA

VEEQEEAAEEDAEAEAETEE TRAEEDEEEEEAK (SEQ ID NO : 40)

4.861,9646 MSDIEEVVEEYEEEEQEEAA

VEEQEEAAEEDAEAEAETEE TR (SEQ ID NO: 41) Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäuresequenz

4 .098, 8793 AEEDEEEEEAKEAEDGPMEE

SKPKPRSFMPNLVPPK (SEQ

ID NO: 42)

3 .477, 7140 EAEDGPMEESKPKPRSFMPN

LVPPKI PDGER (SEQ ID

NO: 43)

2 .988, 2898 AEEDEEEEEAKEAEDGPMEE SKPKPR

(SEQ ID NO: 44)

2 .810, 3851 EAEDGPMEESKPKPRSFMPN LVPPK

(SEQ ID NO: 45)

2 .794, 3980 SFMPNLVPPKI PDGERVDFD DIHR

(SEQ ID NO: 46)

2 .658, 3449 2 .658, 3449

2 .582, 3136 2 .582, 3136

2 .456, 2350 2 .456,2350

2 .438, 2067 2 .438,2067

2 .429, 2571 PNLVPPKI PDGERVDFDDIH R (SEQ

ID NO: 47)

2 .428, 2289 2 .428,2289

2 .383, 1816 2 .383, 1816

2 .310, 1118 2 .310, 1118

2 .300, 1339 2 .300, 1339

2 .168, 1458 2 .168, 1458

2 .079, 0756 2 .079, 0756

2 .040, 0508 2 .040, 0508

1 .992, 0872 1 .992, 0872 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäuresequenz

1.921, 0501 1 .921, 0501

1.911, 9559 1 .911, 9559

1.888, 9988 1 .888, 9988

1.852, 9560 1 .852, 9560

1.821, 9381 1 .821, 9381

1.820, 0137 1 .820, 0137

1.811, 9034 1 .811, 9034

1.796, 9363 SFMPNLVPPKIPDGER (SEQ ID NO:

48)

1.792, 9551 1 .792, 9551

1.724, 8611 1 .724, 8611

1.699, 7955 EAEDGPMEESKPKPR (SEQ ID NO:

49)

1.683, 8085 1 .683, 8085

1.663, 9125 1 .663, 9125

1.622, 8060 1 .622, 8060

1.596, 7661 1 .596, 7661

1.565, 8798 1 .565, 8798

1.560, 8605 1 .560, 8605

1.535, 8176 1 .535, 8176

1.438, 7689 1 .438, 7689

1 .431, 7954 PNLVPPKI PDGER (SEQ ID NO: 50)

1.331, 7416 1 .331, 7416

1.315, 7077 1 .315, 7077

1.307, 5121 AEEDEEEEEAK (SEQ ID NO: 51) Nicht mo- di

f i Modif i - zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäure sequenz

1.302, 7124 1.302, 7124

1.300, 6756 1.300, 6756

1.290, 7164 1.290, 7164

1.242, 6661 1.242, 6661

1.203, 6467 1.203, 6467

1.188, 5716 1.188, 5716

1.176, 6484 1.176, 6484

1.144, 5745 1.144, 5745

1.132, 6069 1.132, 6069

1.129, 6074 SFMPNLVPPK (SEQ ID NO: 52)

1.117, 5344 1.117, 5344

1.089, 5283 1.089, 5283

1.075, 5517 1.075, 5517

1.054, 5567 1.054, 5567

1.045, 5636 1.045, 5636

1.016, 4795 1.016, 4795

1.015, 5279 1.015, 5279

1.001, 5123 1.001, 5123

1.000, 5646 1.000, 5646

974, 5013 974, 5013

961, 5173 961, 5173

961, 4333 961, 4333

946, 5064 946, 5064

946, 4952 946, 4952 Nicht mo- di

f i Modif i - zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäure sequenz

945, 5628 945, 5628

918, 5003 918, 5003

906, 5043 906, 5043

885, 5628 885, 5628

860, 4584 860, 4584

857, 5567 857, 5567

844, 4635 844, 4635

818, 4002 818, 4002

816, 5050 816, 5050

805, 3322 805, 3322

790, 4053 790, 4053

779, 3934 779, 3934

775, 4784 775, 4784

764, 4665 PNLVPPK (SEQ ID NO: 53)

757, 4679 757, 4679

746, 4308 746, 4308

732, 3635 732, 3635

731, 3682 731, 3682

729, 4617 729, 4617

691, 3919 691, 3919

690, 3053 690, 3053

689, 3689 689, 3689

686, 3467 686, 3467

678, 3933 678, 3933 Nicht mo- di

f i Modif i - zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäure sequenz

660, 4151 660, 4151

631, 3886 631, 3886

617, 3253 617, 3253

601, 3668 601, 3668

590, 3620 590, 3620

575, 3623 575, 3623

563, 2970 563, 2970

533, 2678 533, 2678

532, 3453 532, 3453

475, 2874 475, 2874

461, 2830 461, 2830

447, 2674 447, 2674

432, 2565 432, 2565

419, 2612 419, 2612

417, 2204 417, 2204

407, 1959 407, 1959

404, 2503 404, 2503

403, 3027 403, 3027

403, 2663 403, 2663

403, 2299 403, 2299

402, 2572 402, 2572

333, 2132 333, 2132

333, 1921 333, 1921

303, 2139 303, 2139 Nicht mo- di

fi Modifi- zi zi

er er

te te

Fo Fo

rm rm

o o

n n

Tr Tr

op op

on on

in in

T T Aminosäuresequenz

294, 1812 294, 1812

291, 1663 291, 1663

289, 1619 289, 1619

276, 1666 276, 1666

276, 1554 276, 1554

275,2077 275,2077

246, 1560 246, 1560

218, 1499 218, 1499

204, 1342 204, 1342

175, 1189 175, 1189

147, 1128 147, 1128

Durch die trypsinspezifische Spaltung nach Aminosäure 78 ent ¬ steht bei der modifizierten Form von Troponin T ein Nicht- Epitop-Fragment mit der Sequenz PNLVPPK (SEQ ID NO: 53) und der Masse 764,4665 [M+H] + . Dieses Fragment entsteht nur bei der modifizierten Form von Troponin T, das heißt bei Vorliegen des akuten Koronarsyndroms. Bei der nicht modifizierten Form von Troponin T entsteht durch die trypsinspezifische Spaltung an der gleichen Position und gleichzeitiger Spaltung nach Aminosäure 68, die in der modifizierten Form nicht vorhanden ist, ein Nicht-Epitop-Fragment der Sequenz SFMPNLVPPK (SEQ ID NO: 52) und der Masse 1.129,6074 [M+H] + . Wird die Schnittschnelle bei Aminosäure 78 von der Protease ausgelas ¬ sen, aber nach Aminosäure 84 geschnitten, entsteht nur bei der modifizierten Form von Troponin T ein Nicht-Epitop- Fragment der Sequenz PNLVPPKI PDGER (SEQ ID NO: 50)

(1.431,7954 [M+H] + ), bei der nicht modifizierten Form dagegen bei gleichzeitiger Spaltung nach Aminosäure 68 ein Nicht- Epitop-Fragment der Sequenz SFMPNLVPPKIPDGER (SEQ ID NO: 48) (1.796,9363 [M+H] + ). Wird nach den Aminosäuren 78 und 84 nicht geschnitten, aber nach Aminosäure 92, entsteht bei der modifizierten Form von Troponin T ein Nicht-Epitop-Fragment der Sequenz PNLVPPKI PDGERVDFDDIH R (SEQ ID NO: 47)

(2.429,2571 [M+H] + ) und bei der nicht modifizierten Form bei gleichzeitiger Spaltung nach Aminosäure 68 ein Nicht-Epitop- Fragment der Sequenz SFMPNLVPPKIPDGERVDFD DIHR (SEQ ID NO: 46) (2.794, 3980 [M+H] + ).