RESUME DE L'INVENTION

La présente invention concerne un procédé in vitro de pronostic d'un cancer chez un sujet, ainsi que les kits et utilisations correspondants. Il est mis en œuvre une méthode fiable de pronostic de cancers associés à l'inflammation, notamment le cancer colorectal, le carcinome cutané et le cancer du poumon.

ART ANTERIEUR

Pour de nombreux cancers, une corrélation avec l'inflammation a été établie. Ainsi, l'inflammation, notamment les inflammations chroniques, est un facteur de risque bien connu de la tumorigénèse. C'est le cas notamment du cancer colorectal. Le cancer colorectal est l'une des formes de cancer les plus répandues. Les différents stades de développement du cancer colorectal sont classés selon la classification TNM, laquelle recense quatre stades différents, à savoir les stades I et II qui correspondent à un envahissement de plus en plus profond de la paroi du côlon et du rectum, le stade III qui correspond en outre à une atteinte des ganglions et le stade IV qui comprend en outre l'apparition de métastases.

Pour ce type de cancers, des méthodes pronostiques basées sur la réponse immunitaire observée chez les sujets malades ont été développées. Différents modèles ont été testés sur la souris, voire chez l'humain. Certains ont consisté notamment en l'analyse de différents échantillons biologiques (cellules épithéliales, cellules immunitaires, cellules hématopoïétiques, etc.) et la mise en œuvre de techniques de biologie moléculaire, d'immunohistologie et d'immunomarquage de marqueurs biologiques. Par exemple, la technique IHC (ImmunoHistoChimie) ou la technique FISH (fluorescence in situ hydridization ou hydridation in situ en fluorescence) sont couramment utilisées.

Les méthodes pronostiques peuvent être basées notamment sur l'identification et/ou l'analyse de « signatures » biologiques. Trois types de signatures peuvent être observées, à savoir la signature génétique (par exemple identification de mutations génétiques corrélées à une susceptibilité accrue au développement d'un type de tumeur), la signature transcriptomique ou transcriptionnelle (analyse du profil des ARN transcrits) et la signature protéique dite également signature fonctionnelle in vivo (analyse du profil d'expression de protéines). La tumorigénèse et l'inflammation sont intrinsèquement liées. Notamment, le rôle de l'inflammasome, et des molécules le composant, sur l'oncogenèse a été étudié. Ainsi, l'analyse de certaines molécules de l'inflammasome, impliquées dans les réactions inflammatoires aiguës ou chroniques, pourrait permettre de pronostiquer une tumeur chez un sujet, ou son stade de développement.

L'inflammasome est un complexe protéique multimérique cytoplasmique. Il est composé de plusieurs protéines, y inclus les Nod-Like receptors (NLR ou « nucleotide-binding domain, leucine-rich-repeat-containing proteins »). L'activation de l'inflammasome induit l'activation de protéines caspases pro-inflammatoires, par exemple la caspase-1, qui elles- mêmes induisent l'activation de cytokines pro-inflammatoires, par exemple interleukine-ΐβ (IL-Ιβ) et interleukine-18 (IL-18). L'IL-18 est une cytokine contribuant à la réparation de la barrière épithéliale. L'activation de l'inflammasome induit également la pyroptose, c'est-à- dire la mort cellulaire inflammatoire. Le polymorphisme de certaines molécules de l'inflammasome peut influencer la susceptibilité de certains sujets au développement de certaines formes de cancers, par exemple les molécules NLRP1, NLRP3 et AIM2.

Diverses études ont été publiées. Plusieurs d'entre elles sont rapportées dans la revue de R. Karki et al., Cancer Immunol Res ; 5(2) February 2017. Celles-ci ont généralement été réalisées à partir de modèles murins. Les résultats obtenus, et les conclusions tirées, sont parfois contradictoires pour une molécule donnée. Ainsi, suivant les conditions expérimentales, le modèle murin, etc., les effets observés peuvent varier pour les molécules NLRP1, NLRP3, NLRP6, NLRP12, NLRC3, NLRC4, NLRC5, NOD1, NOD2, ASC, AIM2, IL-18, IL-Ιβ, etc.

A titre d'exemple, l'article B. Hu et al., PNAS, December 14, 2014, vol. 107, no.50, 21635-21640 rapporte une étude menée sur la signature transcriptionnelle de NLRC4 et NLRP3 au niveau des cellules épithéliales et hématopoïétiques, et leur corrélation avec l'activation de la caspase-1 et la formation de cancers du côlon induits par l'inflammation. Il a été utilisé des modèles murins tels que Caspl ^{_ "} , NLRC4 ^{_ "} et NLRP3 ^{_ "} . Il était conclu notamment que la caspase-1 avait un rôle central dans la prévention de la formation de tumeurs du côlon induites par l'inflammation via la régulation de la réponse des cellules épithéliales aux dommages, ces effets étant médiés par l'inflammasome NLRC4. En comparaison, l'article I. C. Allen et al., J. Exp. Med., May 10, 2010, vol. 207, no.5, 1045-1056 rapporte une étude selon laquelle NLRP3 régulerait la tumorigénèse via le compartiment hématopoïétique/myéloïde. Il a été utilisé des modèles murins tels que Caspl ^{_ ~} , Pycard ^{_ ~} , NLRC4 ^{_ "} et NLRP3 ^{_ ~} . Il était conclu notamment que NLRP3 jouerait un rôle central dans l'atténuation de la colite aiguë et du cancer colorectal, alors que NLRC4 n'aurait pas de rôle significatif.

D'autres articles, dont notamment S. Normand et al., PNAS, June 7, 2011, vol.108, no.23, 9601-9606 et S. S. Seregin et al., Mucosal Immunol., March 2017, vol.10, no.2, rapportent des études menées sur l'expression de NLRP6 chez des sujets malades.

L'article R. Liu et al., Oncotarget, September 10, 2015, vol. 6, no.32, 33456-33469 rapporte, quant à lui, une étude comparant l'expression de gènes codant pour de multiples molécules (signature transcriptionnelle), à partir des échantillons répertoriés dans différentes bases de données. Les résultats les plus concluants ont été obtenus pour NLRP3, dont le niveau d'expression était systématiquement significativement réduit tant chez les sujets malades que chez les sujets sains. De même, des résultats concordants ont été obtenus pour NOD1 et NOD2, dont les niveaux d'expression des gènes codant étaient quasiment systématiquement significativement augmentés. A contrario, la variabilité des données collectées pour NLRC4, NLRP6 et AIM2 ne permettaient pas de tirer un enseignement particulier.

Ainsi, au vu de ces nombreuses études rapportées relatives aux inflammasomes, des résultats parfois différents, voire divergents ou contradictoires pour certaines molécules, ont été obtenus. Même si une certaine convergence de résultats a été relevée pour les molécules NLRP3, NOD1 et NOD2, les enseignements vis-à-vis des autres molécules sont plus difficiles à tirer.

Tel que souligné dans Lui et al., il y a un besoin d'identification de biomarqueurs fiables et de la mise à disposition de kits et méthodes pour le pronostic du cancer colorectal, ou d'autres cancers dont le développement est étroitement associé à l'inflammation, par exemple le cancer colorectal, le cancer du poumon ou le carcinome cutané, permettant d'aider le praticien à déterminer si le recours à une intervention chirurgicale est nécessaire, confirmer la nécessité de prescrire un traitement et/ou la nature du traitement, notamment un traitement adjuvant tel qu'une chimiothérapie, déterminer l'agressivité de la tumeur (pronostic), prévoir le taux de survie, stratifier les sujets à haut ou bas taux de rechute après chirurgie curative. De tels kits et méthodes sont une aide à la mise en œuvre des traitements et interventions au moment opportun, ni trop tôt ni trop tard, et permettent d'éviter notamment le recours à une chimiothérapie à un stade où elle ne serait pas nécessaire. En effet, la chimiothérapie est un traitement lourd, qui, outre le coût souvent élevé, et bien qu'indispensable au traitement des sujets malades et à l'évitement de la rechute des sujets en rémission, n'est pas exempte d'effets secondaires et nocifs pour les sujets traités. Or, de tels kits et méthodes ne sont utiles que s'ils sont fiables, c'est-à-dire s'ils reposent sur l'analyse de marqueurs biologiques, dont l'activité (par exemple l'expression protéique) est directement corrélée à un certain type de cancer et/ou à l'un de ses stades de développement. Or, pour ce qui est de l'inflammasome, vis-à-vis du cancer colorectal, mais également vis-à-vis du carcinome cutané et du cancer du poumon, les différences de résultats constatées dans les études référencées ci-avant ne permettent pas à l'homme du métier d'identifier les biomarqueurs biologiques qui permettraient la mise au point de tels kits et méthodes.

Ainsi, la mise à disposition de nouveaux outils d'analyse permettrait au praticien d'améliorer le pronostic du cancer de cancers associés à l'inflammation, notamment le cancer colorectal. De tels outils permettraient en outre d'améliorer la prise en charge du sujet malade et d'éviter la rechute de sujets en rémission. En effet, la pose d'un pronostic précis sera utile tant pour déterminer si le recours à une intervention chirurgicale est nécessaire et/ou si un traitement adjuvant tel une chimiothérapie devrait être prescrit, avant ou après une intervention chirurgicale. Enfin, un tel outil sera utile pour ménager les coûts associés au traitement du sujet malade ou au suivi du sujet en rémission.

OBJECTIFS DE L'INVENTION

La présente invention a pour objectif la mise en œuvre d'une méthode fiable de pronostic des cancers associés à l'inflammation, notamment le cancer colorectal, le carcinome cutané et le cancer du poumon ; en particulier le cancer colorectal.

Un autre objectif est la mise en œuvre d'une méthode fiable de pronostic du stade de développement du cancer colorectal, en particulier du stade TNM II du cancer colorectal.

Un autre objectif est la mise en œuvre d'une méthode fiable de pronostic du risque de rechute de sujets en rémission et/ou de sujets ayant subi une intervention chirurgicale après diagnostic d'un cancer colorectal.

Un autre objectif est la mise en œuvre d'une méthode fiable comme aide à la décision quant à la prescription d'un traitement adjuvant tel qu'une chimiothérapie à un sujet malade chez lequel un cancer colorectal au stade TNM II a été diagnostiqué. DEFINITIONS

Par « sujet », on entend tout être humain, enfant ou adulte. Ainsi, on peut distinguer les sujets sains, les sujets malades, les sujets en rémission et les sujets guéris. Les « sujets malades » sont les sujets pour lesquels l'un des cancers référencés ci-contre a été diagnostiqué, indépendamment de son stade de développement. Les « sujets sains » sont les sujets chez lesquels ledit cancer n'a pas été diagnostiqué. Les « sujets en rémission » sont des sujets dont, après un traitement curatif, le cancer est stabilisé ou ne réapparaît pas. La phase de rémission peut être plus ou moins longue selon les sujets et le type de cancer traité. Après la phase de rémission, sans rechute, les sujets sont considérés comme des « sujets guéris ».

Par « pronostic », on entend l'évaluation de la maladie quant à la susceptibilité de développer la maladie, et/ou quant à la susceptibilité d'évolution vers un stade/degré plus avancé, et/ou quant aux risques de complications et d'exacerbations, et/ou quant à son issue, etc. L'évaluation de l'évolution de la maladie correspond à l'analyse dans le temps de l'évolution de la maladie préalablement diagnostiquée ou pronostiquée. Un tel suivi dans le temps peut permettre de sélectionner, de valider et/ou d'adapter un traitement. Il permet également de déterminer l'intensité du suivi clinique nécessaire pour le sujet. Ce suivi permet de déterminer à tout moment si un traitement est nécessaire.

Par « stade TNM », on entend un stade déterminé au moyen de la classification TNM. Cette classification internationale est utilisée en routine clinique et permet de rendre compte du stade d'un cancer au moyen de trois critères - taille et/ou profondeur de la tumeur, atteinte ou non des ganglions lymphatiques et nombre de ganglions atteints, présence ou non de métastases. A titre d'illustration, la classification TNM du cancer colorectal comprend cinq stades. Par « cancer colorectal Stade 0 », on entend le stade auquel la tumeur est in situ, ce qui signifie qu'elle est très superficielle et qu'elle n'envahit pas la sous-muqueuse, que les ganglions lymphatiques ne sont pas atteints et qu'il n'y a pas de métastase à distance. Par « cancer colorectal Stade I », on entend le stade auquel la tumeur envahit la deuxième couche (sous-muqueuse) ou la couche musculaire (musculeuse) de la paroi du côlon ou du rectum, les ganglions lymphatiques ne sont pas atteints et il n'y a pas de métastase à distance. Par « cancer colorectal Stade II », on entend le stade auquel les cellules cancéreuses ont traversé plusieurs couches de la paroi du côlon ou du rectum, mais aucun ganglion n'est atteint et il n'y a pas de métastases. Par « cancer colorectal Stade III », on entend le stade auquel les cellules cancéreuses ont envahi les ganglions lymphatiques proches de la tumeur. Par « cancer colorectal Stade IV », on entend le stade auquel le cancer s'est propagé au-delà du côlon ou du rectum, vers des emplacements ou des organes éloignés, généralement le péritoine, le foie ou les poumons.

Par « échantillon biologique », on entend tout échantillon du corps humain, y inclus un échantillon de sang, un échantillon de plasma, un échantillon de sérum, un échantillon d'un autre liquide du corps humain (par exemple le liquide pleural, le liquide ascite, le liquide céphalo-rachidien), un échantillon tissulaire (par exemple biopsie ou pièce chirurgicale).

Par « biopsie », on entend tout prélèvement d'un fragment d'un organe, d'un tissu ou d'un compartiment. Par exemple, il peut être prélevé un fragment des tissus intestinaux, pulmonaires, cutanés, etc.

Par « marqueur biologique » ou « biomarqueur », on entend un indicateur d'un état physiologique ou pathologique déterminé, notamment une protéine dont l'expression - ou le niveau d'expression - est fonction d'un état physiologique ou pathologique déterminé.

Par « signature génétique », on entend un gène ou un ensemble de gènes dont la présence, l'absence ou les mutations sont caractéristiques d'un état.

Par « signature transcriptomique » ou « signature transcriptionnelle », on entend un gène ou un ensemble de gènes dont l'expression (par exemple expression à un temps déterminé et/ou expression dans un tissu) ou le niveau d'expression (par exemple une absence d'expression ou une surexpression) est caractéristique d'un état. La présente invention concerne notamment un procédé in vitro de pronostic par analyse de la signature transcriptionnelle.

Par « signature protéique » ou « signature protéomique », on entend un ensemble de protéines dont la présence, l'absence, l'expression ou le niveau d'expression est caractéristique d'un état. La présente invention concerne également, et de manière préférée, un procédé in vitro de pronostic par analyse de la signature protéique.

Par « protéine NLRC4 », on entend la protéine connue comme « NOD-like receptor family CARD domain-containing protein 4 », codée par le gène NLRC4. Le gène NLRC4 est référencé 58484 dans la base de données NCBI, a pour position 2p22.3 et comprend 11 exons. Ce gène est également connu sous une série de dénominations alternatives, notamment CLAN, IPAF, IFEC, CLAN1, CLANA, CLANB, CLANC, CLAND, FCAS4, CARD12 ou CLR2.1. Une séquence de référence de la protéine NLRC4 est la SEQJD1 (séquence de référence). La présente invention concerne la protéine NLRC4 SEQJD1, ainsi que ses variants. La protéine NLRC4 est un marqueur biologique des cancers associés à l'inflammation, notamment le cancer colorectal.

Par « protéine NLRP6 », on entend la protéine connue comme « NOD-like family pyrin domain containing 6 », codée par le gène NLRP6. Le gène NLRP6 est référencé 171389 dans la base de données NCBI, a pour position llpl5.5 et comprends 9 exons. Ce gène est également connu sous une série de dénominations alternatives, notamment AVR, NAVR, PAN3, NALP6, PYPAF5, CLR11.4 ou NAVR/AVR. Une séquence de référence de la protéine NLRP6 est la SEQJD2 (séquence de référence). La présente invention concerne la protéine NLRP6 SEQJD2, ainsi que ses variants. La protéine NLRP6 est un marqueur biologique des cancers associés à l'inflammation, notamment le cancer colorectal.

Par « protéine IL-18 », on entend la protéine connue comme « interleukin-18 », codée par le gène IL-18. Le gène IL-18 est référencé 3606 dans la base de données NCBI, a pour position llq23.1 et comprends 6 exons. Ce gène est également connu sous une série de dénominations alternatives, notamment IGIF, IL-18, IL-Ιγ, IL1F4. Une séquence de référence de la protéine IL-18 est la NP_001553.1 dans la base de données NCBI et correspond à la séquence de l'isoforme 1 de l'IL-18. La présente invention concerne la protéine IL-18, ainsi que ses variants. La protéine IL-18 est une cytokine pro-inflammatoire contribuant à la réparation de la barrière épithéliale.

Par « cytokératine », on entend un des constituants des filaments intermédiaires de kératine retrouvés spécifiquement dans les tissus épithéliaux. La cytokératine est un marqueur biologique des cellules épithéliales saines ou tumorales. Le marquage cytokératine utilisé dans la présente invention est un marqueur pan-cytokératine qui marque la majorité des cytokératines. Il s'agit d'un marquage réalisé par un anticorps utilisé en routine pour les marquages épithéliaux de cancers différents.

Par « variants », on entend une protéine comprenant, ou consistant en, une séquence d'acides-aminés ayant une identité d'au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'avec la séquence de référence. Lesdits variants peuvent comprendre des délétions, insertions et/ou substitutions d'acides aminés, par comparaison d'avec la séquence de référence. Lesdits variants incluent les variants alléliques, notamment les variants alléliques naturellement présents au sein d'une population. Lesdits variants incluent également les séquences homologues de synthèse ou d'origine non-humaines. Par « température ambiante », on entend une température comprise entre 18°C et 25°C, généralement d'environ 20°C.

Par le « test de double positivité », on entend le test permettant de déterminer que l'échantillon biologique testé est positif simultanément pour 2 biomarqueurs : NLRC4 et NLRP6, NLRC4 et IL-18, NLRP6 et IL-18.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de pronostic - ou procédé de stratification - d'un cancer associé à l'inflammation, notamment le cancer colorectal, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

- Mise à disposition d'un échantillon comprenant du tissu cancéreux épithélial,

Sélection de la zone tumorale épithéliale de l'échantillon,

Analyse quantitative des produits d'expression des gènes choisis parmi le groupe consistant en le gène NLRC4, le gène NLRP6, le gène IL-18 ou une de leurs combinaisons pour obtenir une valeur caractéristique desdits produits d'expression; - Comparaison de chacune des valeurs caractéristiques avec une valeur seuil prédéterminée,

Détermination du groupe de sujets auquel appartient le sujet.

Par « pronostic d'un cancer », on entend au moins une action parmi la détermination de la nécessité d'un recours à une intervention chirurgicale, la confirmation de la nécessité de prescrire un traitement, la détermination de l'agressivité de la tumeur, la prévision du taux de survie, la stratification des sujets à haut ou bas taux de rechute après chirurgie curative chez un sujet atteint dudit cancer ou sans chirurgie curative chez des patients atteint d'un cancer de stade IV.

Les inventeurs ont développé une méthode pronostique des cancers associés à l'inflammation, notamment le cancer colorectal, par la sélection de multiples facteurs nécessaires à l'obtention de résultats fiables et reproductibles. Ainsi, les inventeurs ont démontré qu'une telle méthode pouvait être développée par la prise en compte des facteurs suivants : la signature biologique à sélectionner en raison de son impact pronostic fort et de sa relevance clinique, les échantillons biologiques à prélever, les cellules et compartiments à analyser. La sélection attentive de ces facteurs est une condition nécessaire à l'obtention d'une méthode qui soit fiable et reproductible. De façon inattendue, il a été démontré par les inventeurs que l'expression des biomarqueurs selon l'invention est prédictive au niveau des cellules épithéliales du tissu cancéreux. A contrario, l'expression desdits biomarqueurs au niveau des cellules stromales n'est pas prédictive, même si elle peut être modifiée dans les tissus cancéreux. Ainsi, tel que explicité ci-contre, les inventeurs ont démontré qu'une méthode pronostique fiable pouvait être développée en prélevant des échantillons des tissus cancéreux épithéliaux, par exemple des pièces chirurgicales, du sujet malade ou en rémission, en analysant dans la zone tumorale épithéliale, c'est-à-dire au niveau des cellules épithéliales tumorales, la signature protéique de deux marqueurs biologiques spécifiques des inflammasomes NLRC4 et NLRP6 seul ou en combinaison, ainsi que la signature protéique de l'IL-18 seul ou en combinaison avec NLRC4 et/ou NLRP6.

En outre, les analyses de la signature protéique de NLRC4, de NLRP6, et d'IL-18 menées par les inventeurs ont permis d'établir leur intérêt comme biomarqueurs du cancer colorectal, et d'autres formes de cancers associés à l'inflammation également, pour un pronostic fiable et reproductible. Cela est surprenant au vu des différents résultats, parfois divergents, rapportés dans de précédentes études. En effet, les études réalisées par les inventeurs ont mis en avant que l'expression de NLRC4 et de NLRP6 - protéines impliquées dans l'homéostasie tissulaire - était corrélée à la survie des sujets. De la même manière, l'expression d'IL-18 est également corrélée à la survie des sujets. Cette corrélation a été observée pour NLRC4, NLRP6 et IL-18 pris individuellement et, de manière d'autant plus significative, pour n'importe laquelle de leurs combinaisons (NLRC4/NLRP6, NLRC4/IL18, NLRP6/IL18 ou NLRC4/NLRP6/IL18). Les analyses quantitatives des produits d'expression de NLRC4, NLRP6 et d'IL-18 sont donc complémentaires. Leur combinaison permet d'affiner le pronostic du cancer, et de mieux stratifier notamment les sujets sur le pronostic. A contrario, aucune corrélation statistiquement significative avec la survie des sujets n'a été démontrée pour d'autres protéines des inflammasomes, notamment les protéines NLRP1, NLRP3, AIM2 et ASC.

Ainsi, les résultats collectés par l'analyse quantitative des produits d'expression des gènes NLRC4, NLRP6 et IL-18 au niveau de la zone tumorale épithéliale d'un échantillon ont un facteur pronostic fort, contrairement aux analyses quantitatives de produits d'expression d'autres gènes NLR et/ou au niveau des cellules immunitaires. Enfin, les inventeurs ont confirmé que la signature protéique de NLRC4 et NLRP6 permettait un pronostic fiable du cancer colorectal seulement si celle-ci était analysée dans la zone tumorale épithéliale, et non dans les zones épithéliales saines ou au niveau d'autres types de cellules telles que les cellules stromales, les cellules immunitaires ou les cellules hématopoïétiques. La sélection spécifique des produits d'expression analysés et de leur compartimentalisation permet présentement la mise en œuvre d'un procédé in vitro de diagnostic présentant une grande fiabilité en termes de survie des sujets.

L'étape de mise à disposition d'un échantillon comprenant du tissu cancéreux épithélial peut consister en la mise à disposition d'une pièce opératoire, collectée lors d'une opération chirurgicale, ou le résultat d'une biopsie, pratiquée sur un sujet. La mise à disposition comprend en outre la préservation et la préparation dudit échantillon. La préservation peut comprendre une étape de fixation au formol, suivie d'une étape d'inclusion dans de la paraffine, avant conservation préférentiellement à température ambiante. La préparation de l'échantillon peut comprendre une étape de découpe au microtome et dépose sur lame. Les sections découpées au microtome ont généralement une épaisseur moyenne comprise entre 2μιη et 5μιη, préférentiellement d'environ 3μιη. Ledit échantillon est généralement préparé peu avant l'analyse des produits d'expression des gènes.

Lesdits produits d'expression des gènes sont les ARNm, produits de la transcription des gènes NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18 ; ou les protéines NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18, produits de la traduction desdits ARNm. Lorsque les produits d'expression des gènes sont les ARNm, produits de la transcription des gènes NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18, on parle alors de signature transcriptionnelle. Alternativement, lorsque les produits d'expression des gènes sont les protéines NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18, produits de la traduction desdits ARNm, on parle de signature protéique.

Les protéines NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18 peuvent être analysées par une technique d'immunomarquage, préférentiellement d'immunofluorescence. La technique d'immunomarquage peut être mise en œuvre par utilisation d'un anticorps anti-NLRC4, d'un anticorps anti-NLRP6, d'un anticorps anti-IL-18 ou leur combinaison. Ces anticorps vont se fixer de manière spécifique à la protéine cible. Par exemple, des anticorps spécifiques anti- NLRC4 sont disponibles sous la dénomination commerciale abll5537 (ABCAM). Des anticorps spécifiques anti-NLRP6 sont disponibles sous la dénomination commerciale ABF29 (Merck). Des anticorps spécifiques anti-IL-18 sont disponibles sous la dénomination commerciale PACO0010763 (OZYME). En outre, outre l'utilisation d'un anticorps primaire (anticorps spécifique anti-NLRC4, d'un anticorps spécifique anti-NLRP6, d'un anticorps spécifique anti-IL-18 ou leur combinaison), la technique d'immunomarquage peut être mise en œuvre par utilisation d'un anticorps secondaire. Cet anticorps secondaire va se fixer de manière spécifique aux anticorps primaires. Lorsqu'il est mis en œuvre une technique d'immunofluorescence, l'anticorps secondaire peut comprendre un groupement fluorescent.

Les ARNm, produits de la transcription des gènes NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18, peuvent être analysés par une technique de PCR quantitative avec une phase de sélection des cellules épithéliales dans le lysat total ou d'hybridation in situ en fluorescence (technique de FISH ARN). L'hybridation in situ en fluorescence est une technique de biologie moléculaire d'hybridation in situ utilisant des sondes marquées à l'aide d'un marqueur fluorescent et utilisées sur des coupes de microscopie. Les ARNm, produits de la transcription des gènes NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18, peuvent être analysés par des sondes ARN spécifiques.

La sélection de la zone tumorale épithéliale peut être mise en œuvre par marquage de l'échantillon à la cytokératine. La cytokératine est un marqueur biologique des cellules épithéliales saines ou tumorales sans discrimination. Après marquage à la cytokératine, il peut être utilisé un masque permettant de sélectionner les zones marquées avec la cytokératine. Il peut s'agir notamment d'un masque appliqué en termes de traitement d'images.

La sélection de la zone tumorale épithéliale peut en outre être mise en œuvre par un second marquage nucléaire de l'échantillon. Le marquage nucléaire peut être un marquage de l'échantillon au 4',6-diamino-2-phénylindole, communément dénommé DAPI. Le marquage nucléaire permet d'éliminer un éventuel bruit de fond dû par exemple à la présence de globules rouges. La sélection de la zone tumorale épithéliale peut donc être optimisée par la mise en œuvre d'un double marquage à la cytokératine et au 4',6-diamino- 2-phénylindole permettant d'analyser uniquement le niveau d'expression des gènes NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18 dans les cellules nucléées (grâce au marquage au 4',6-diamino-2- phénylindole) de la zone épithéliale tumorale (grâce au marquage à la cytokératine).

L'analyse des produits d'expression des gènes NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18 permet d'obtenir une valeur caractéristique pour chacun de ces produits d'expression. Lorsqu'il est mis en œuvre notamment une méthode d'immunofluorescence, lesdites valeurs caractéristiques obtenues sont des intensités de fluorescence. Ces valeurs sont exprimées en unité relative de fluorescence (RFU).

Après détermination de la valeur caractéristique des produits d'expression des gènes analysés, ladite valeur caractéristique est comparée à une valeur prédéterminée. Dans un mode préférentiel de l'invention, le produit d'expression du gène choisi est la protéine NLRC4 et la valeur seuil prédéterminée est 15,67565 RFU. Dans un autre mode préférentiel de l'invention, le produit d'expression du gène choisi est la protéine NLRP6 et la valeur seuil prédéterminée est 11.466567 RFU. Dans un autre mode préférentiel de l'invention, le produit d'expression du gène choisi est la protéine IL-18 et la valeur seuil prédéterminée est 7.70055 RFU. Dans un mode très préférentiel, lorsque les produits d'expression des gènes choisis sont la protéine NLRC4 et la protéine NLRP6 sont tous deux analysés, les valeurs seuils prédéterminées sont respectivement 15,67565 RFU et 11.466567 RFU. Dans un autre mode préférentiel de l'invention, les produits d'expression des gènes choisis sont la protéine NLRC4 et la protéine IL-18 et les valeurs seuils prédéterminées sont respectivement 15,67565 RFU et 7.70055 RFU. Dans un autre mode préférentiel de l'invention, le produits d'expression des gènes choisis sont la protéine IL-18 et la protéine NLRP6 et les valeurs seuils prédéterminées sont respectivement 7.70055 RFU et 11.466567 RFU. Dans un mode très préférentiel, les produits d'expression des gènes choisis sont la protéine NLRC4, la protéine NLRP6 et la protéines IL-18 valeurs seuils prédéterminées sont respectivement 15,67565 RFU, 11.466567 RFU et 7.70055 RFU. En effet, sans vouloir être lié par aucune théorie, il semblerait que la position par rapport à la valeur seuil soit corrélée au pronostic de survie (ou autre). Les mesures cliniques et biologiques sont exprimées en moyennes (déviation standard) ou médianes (range) pour les variables continues, ou en nombres (pourcentages) pour les variables catégorielles. Les courbes ROC obtenues (pour « receiver- operating characteristics ») et les aires sous la courbe permettent d'évaluer l'efficacité de NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18 à prédire le décès des sujets. Présentement, la significativité statistique a été définie par une p-value inférieure à 0.04, et les analyses ont été analysées grâce au logiciel STATA 13.1 (StatCorpLP, Collège Station, Texas, USA).

La comparaison des valeurs caractéristiques des produits d'expression avec les valeurs seuil prédéterminées permet de déterminer le groupe auquel le sujet appartient. Lorsque la valeur caractéristique obtenue est supérieure à la valeur seuil de référence, le sujet est considéré comme positif. A contrario, lorsque la valeur caractéristique obtenue est inférieure à la valeur seuil de référence, le sujet est considéré comme négatif. Si au moins deux produits des gènes sont analysés - à savoir NLRC4/NLRP6, NLRC4/IL-18 ou NLRP6/IL-18 - lorsque chacune des deux valeurs caractéristiques obtenues est supérieure à la valeur seuil de référence, le sujet est considéré comme double positif. En revanche, lorsque chacune des deux valeurs caractéristiques obtenues est inférieure à la valeur seuil de référence, le sujet est considéré comme double négatif. La détermination du groupe auquel appartient le sujet permet de poser le pronostic. En effet, les sujets double positifs ont un pronostic qui est meilleur que les double négatifs mais aussi meilleur que les sujets lorsqu'ils ne sont pas stratifiés sur ces marqueurs. A l'inverse, les sujets double négatifs ont un pronostic inférieur aux double positifs mais aussi inférieur au pronostic des sujets non stratifiés sur ces marqueurs. Cette stratification a permis de distinguer un troisième groupe de sujets dont l'une des deux valeurs caractéristiques obtenues est inférieure et l'autre supérieure à la valeur seuil de référence. Ces sujets ont un pronostic intermédiaire, c'est-à-dire avec un pronostic meilleur que les double négatifs mais moins bon que les double positifs. De la même manière, si trois produits des gènes sont analysés, à savoir NLRC4, NLRP6 et IL-18, les sujets triples positifs ont un pronostic qui est meilleur que les triples négatifs.

Selon un second aspect, la présente invention concerne un kit de pronostic - ou kit de stratification - d'un cancer chez un sujet, ledit kit comprenant :

- au moins un premier anticorps spécifique de la zone tumorale épithéliale à analyser;

- au moins un second anticorps spécifique des protéines NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18. Ledit kit de pronostic est utile pour l'analyse de la signature protéique d'un échantillon de tissu cancéreux épithélial.

Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un kit de pronostic - ou kit de stratification - d'un cancer chez un sujet, ledit kit comprenant :

- un réactif adapté à la détermination du niveau d'expression des gènes NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18dans un échantillon de tissu cancéreux du compartiment épithélial.

Ledit kit de pronostic est utile pour l'analyse de la signature transcriptionnelle d'un échantillon de tissu cancéreux épithélial. Ledit réactif peut être des amorces de qPCR pour amplifier de façon quantitative les ARNm NLCR4, NLRP6 et/ou IL-18 ou des sondes de FISH ARN. Selon un quatrième aspect, la présente invention concerne l'utilisation des produits d'expression des gènes NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18 dans un échantillon de tissus cancéreux épithéliaux comme biomarqueurs du pronostic du cancer.

Selon un cinquième aspect, la présente invention concerne l'utilisation des produits d'expression des gènes NLRC4, NLRP6 et/ou IL-18 dans une zone tumorale épithéliale d'un échantillon comprenant un tissu cancéreux épithélial pour le pronostic du cancer.

DESCRIPTIF DES FIGURES

La figure 1 est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal de stade l-ll, de stade III et de stade IV (trois groupes) en fonction du temps (mois), sans stratification sur l'un des biomarqueurs précédents (NLRC4 ou NLRP6).

La figure 2a est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRC4 dans les cellules épithéliales saines et dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal (tous stades).

La figure 2b est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRP6 dans les cellules épithéliales saines et dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal (tous stades).

La figure 3a est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal (tous stades) en fonction du temps simples négatifs NLRC4 ^" et simples positifs NLRC4 ⁺ (deux groupes) en fonction du temps (mois).

La figure 3b est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal (tous stades) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en deux groupes : simples négatifs NLRP6 ^" et simples positifs NLRP6 ⁺ .

La figure 3c est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal (tous stades) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en deux groupes : simples négatifs IL-18 ^" et simples positifs IL-18 ⁺ .

La figure 4a est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal (tous stades) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en quatre groupes : doubles positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ^" /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ^" et doubles négatifs NLRC4 /NLRP6 ^" . La figure 4b est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal (tous stades) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en quatre groupes : doubles positifs NLRC4 ⁺ /IL-18 ⁺ , simples positifs NLRC4 / IL- 18 ⁺ , simples positifs NLRC4 ⁺ / IL-18 et doubles négatifs NLRC4 / IL-18 ^" .

La figure 4c est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal (tous stades) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en quatre groupes : doubles positifs NLP6 ⁺ /IL-18 ⁺ , simples positifs NLP6 ^" / IL- 18 ⁺ , simples positifs NLP6 ⁺ / IL-18 ^" et doubles négatifs NLP6 ^" / IL-18 .

La figure 4d est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal (tous stades) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en deux groupes : triples positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ⁺ /IL-18 ⁺ , et triples négatifs NLRC4 /NLRP6 /IL-18 ^" .

La figure 5 est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal de stade II (envahissement colique) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en cinq groupes : doubles positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ^" /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ^" , doubles négatifs NLRC4 ^"

/NLRP6 ^" , les quatre groupes ensemble.

La figure 6 est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal (stade III - envahissement ganglionnaire) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en quatre groupes : doubles positifs

NLRC4 ⁺ /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ^" /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ^" , doubles négatifs NLRC4 /NLRP6 ^" , les quatre groupes ensemble.

La figure 7 est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal (stade IV - envahissement à distance) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en cinq groupes : doubles positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ^" /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ^" , doubles négatifs NLRC4 ^"

/NLRP6 ^" , les quatre groupes ensemble.

La figure 8 est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal de stade I ou de stade II (envahissement isolé de la paroi colique) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en cinq groupes : doubles positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ^" /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ^" , doubles négatifs NLRC4 /NLRP6 ^" , les quatre groupes ensemble La figure 9 est une représentation graphique du pourcentage de survie de sujets malades ayant un cancer colorectal de stade III ou de stade IV (envahissement extra-colique) en fonction du temps (mois), lesdits sujets étant répartis en cinq groupes : doubles positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ^~ /NLRP6 ⁺ , simples positifs NLRC4 ⁺ /NLRP6 ^" , doubles négatifs NLRC4 /NLRP6 ^" , les quatre groupes ensemble.

La figure 10 est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRC4 dans les cellules épithéliales saines et dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal (tous stades) dans un TMA commercial (C02161, USBiomax).

La figure 11 est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRC4 dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal en fonction du stade TNM dans un TMA commercial (C02161, USBiomax).

La figure 12 est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRC4 dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal en fonction de l'histologie dans un TMA commercial (LC1923, USBiomax).

La figure 13 est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRC4 dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal en fonction du grade tumoral (USBiomax).

EXEMPLES

Prélèvements des échantillons de tissus épithéliaux intestinaux chez les sujets malades Les échantillons tumoraux correspondent à des prélèvements biopsiques réalisés lors d'une coloscopie, ou de pièces entières obtenues au cours d'une intervention chirurgicale.

Préparation et préservation des échantillons

Dans l'heure suivant le prélèvement, afin d'éviter le temps d'ischémie froide, il est procédé à une évaluation de l'état frais (pesée, mesures, photographies, etc.). Les échantillons sont ensuite fixés en formol neutre tamponné à 10%. La durée de fixation est fonction de la taille de la tumeur. Par exemple, le temps de fixation est de quelques heures pour les biopsies et entre 8h et 72h pour les prélèvements plus volumineux. Les prélèvements sont ensuite analysés macroscopiquement avant d'être inclus en paraffine (blocs). Les blocs de paraffine sont conservés à température ambiante. Les lames sont coupées juste avant marquage et également conservées à température ambiante. Des sections de 3μιη sont réalisées au microtome et déposées sur lames pour les marquages.

Marquage des protéines NLRC4 des échantillons

Le marquage de N LRC4 et N LRP6 est réalisé sur deux lames différentes, en raison d'une différence de pH pour les solutions de démasquage et de l'utilisation d'un anticorps secondaire différent.

Déparaffinage et réhydratation - Les lames sont chauffées au moins 10min à au moins 58°C, jusqu'à disparition de la paraffine autour du tissu. Ensuite, les lames sont plongées dans une série de plusieurs bains consécutifs, afin de dissoudre le reste de paraffine, comme suit : 3 x 5mn xylène / 2 x 5mn alcool absolu / 1 x 5mn éthanol 95% / 1 x 5mn éthanol 70% / 1 x 5mn eau distillée.

Démasquage antigénique - Les lames sont plongées dans une solution tampon citrate (DAKO target retrieval pH 9, S236784, Agilent, Vf 500mL). La solution est portée à ébullition pendant 20min par utilisation d'un micro-ondes, puis laissée à refroidir à température ambiante. La lame est ensuite lavée pendant 5 min dans une solution PBS IX stérile pour ramener à un pH neutre, avant d'essuyer l'excédent en PBS.

Blocage des sites antigéniques - Une goutte de solution de BSA 5% (dilution dans du PBS IX ; Vf 300 à 400μί par lame selon la taille du tissu) est déposée sur la lame, de sorte à délimiter le tissu. La goutte doit être bombée. La lame est laissée à reposer à température ambiante pendant 10min, avant élimination de l'excédent, et essuyage du pourtour de la lame pour redélimiter le tissu.

Marquage avec l'anticorps primaire - I l est préparé l'anticorps primaire anti-NLRC4 (Abcam AB115537 ; dilution 1/200) dans une solution DAKO diluent (S202230 ; Agilent) pour un volume final de Vf 300 à 400μί par lame selon la taille du tissu. La solution de l'anticorps primaire est déposée sur la lame, avant de la laisser reposer pendant lh à température ambiante dans une chambre opaque et humidifiée. La lame est ensuite lavée trois fois pendant 5min dans une solution de PBS IX.

Marquage avec l'anticorps secondaire - I l est préparé l'anticorps secondaire anti-lapin (dilution 1/400) dans une solution DAKO diluent (S202230 ; Agilent) pour un volume finale de Vf 300 à 400μί par lame selon la taille du tissu. La solution de l'anticorps est déposée sur la lame, avant de la laisser reposer pendant lh à température ambiante dans une chambre opaque et humidifiée. La lame est ensuite lavée trois fois pendant 5min dans une solution de PBS IX.

Marquage nucléaire - Il est préparé l'anticorps de marquage nucléaire, à savoir du 4',6-diamino-2-phénylindole ou DAPI (2μg/μl). La solution est déposée sur la lame, avant de laisser reposer 10min à température ambiante. La lame est ensuite lavée trois fois pendant 5min dans une solution de PBS IX, avant de retirer complètement le PBS.

Montage des lames - I l est déposé trois points de 20μί de Fluoromount-G (Clinisciences, réf 0100-01) sur la lame sans mettre de bulles d'air, avant séchage à 4°C pendant la nuit.

Marquage des protéines NLRP6 des échantillons, et comarquage à la cytokératine

Déparaffinage et réhydratation - Un protocole identique à celui du marquage des protéines NLRC4 est mis en œuvre.

Démasquage antigénique - Les lames sont plongées dans une solution tampon citrate (DAKO target retrieval pH 6, S236994, Agilent, Vf 500mL). La solution est portée à ébullition pendant 20min par utilisation d'un micro-ondes, puis laissée à refroidir à température ambiante. La lame est ensuite lavée pendant 5min dans une solution PBS IX stérile pour ramener à un pH neutre, avant d'essuyer l'excédent en PBS.

Blocage des sites antigéniques - Un protocole identique à celui du marquage des protéines NLRC4 est mis en œuvre.

Marquage avec des anticorps primaires - I l est préparé l'anticorps anti-NLRP6

(Millipore ABF29 ; dilution 1/500) et l'anticorps anti-cytokératine (AE1/AE3 ; dilution 1/50) dans une solution DAKO diluent (S202230 ; Agilent) pour un volume final de Vf 300 à 400μί par lame selon la taille du tissu. La solution d'anticorps primaires est déposée sur la lame avant de la laisser reposer pendant lh à température ambiante dans une chambre opaque et humidifiée. La lame est ensuite lavée trois fois pendant 5min dans une solution de PBS IX.

Marquage avec les anticorps secondaires - I l est préparé l'anticorps secondaire antilapin pour NLRP6 (dilution 1/400) et l'anticorps secondaire anti-souris (dilution 1/400) dans une solution DAKO diluent (S202230 ; Agilent) pour un volume final de Vf 300 à 400μί par lame selon la taille du tissu. La solution d'anticorps secondaires est déposée sur la lame, avant de laisser reposer pendant lh à température ambiante dans la chambre opaque et humidifiée. La lame est ensuite lavée trois fois pendant 5 min dans une solution de PBS IX. Marquage nucléaire - Un protocole identique à celui du marquage des protéines NLRC4 est mis en œuvre.

Montage des lames - Un protocole identique à celui du marquage des protéines NLRC4 est mis en œuvre.

Marquage des protéines IL-18 des échantillons, et co-marquage à la cytokératine

Déparaffinage et réhydratation - Un protocole identique à celui du marquage des protéines NLRC4 est mis en œuvre.

Démasquage antigénique - Les lames sont plongées dans une solution tampon citrate (DAKO target retrieval pH 6, S236994, Agilent, V _f 500mL). La solution est portée à ébullition pendant 20min par utilisation d'un micro-ondes, puis laissée à refroidir à température ambiante. La lame est ensuite lavée pendant 5min dans une solution PBS IX stérile pour ramener à un pH neutre, avant d'essuyer l'excédent en PBS.

Blocage des sites antigéniques - Un protocole identique à celui du marquage des protéines NLRC4 est mis en œuvre.

Marquage avec des anticorps primaires - Il est préparé l'anticorps anti-NLRP6 (Ozyme

PACO 0010763 ; dilution 1/200) et l'anticorps anti-cytokératine (AE1/AE3 ; dilution 1/50) dans une solution DAKO diluent (S202230 ; Agilent) pour un volume final de V _f 300 à 400μί par lame selon la taille du tissu. La solution d'anticorps primaires est déposée sur la lame avant de la laisser reposer pendant lh à température ambiante dans une chambre opaque et humidifiée. La lame est ensuite lavée trois fois pendant 5min dans une solution de PBS IX.

Marquage avec les anticorps secondaires - Il est préparé l'anticorps secondaire antilapin pour IL-18 (dilution 1/400) et l'anticorps secondaire anti-souris (dilution 1/400) dans une solution DAKO diluent (S202230 ; Agilent) pour un volume final de V _f 300 à 400μί par lame selon la taille du tissu. La solution d'anticorps secondaires est déposée sur la lame, avant de laisser reposer pendant lh à température ambiante dans la chambre opaque et humidifiée. La lame est ensuite lavée trois fois pendant 5 min dans une solution de PBS IX.

Marquage nucléaire - Un protocole identique à celui du marquage des protéines NLRC4 est mis en œuvre.

Montage des lames - Un protocole identique à celui du marquage des protéines NLRC4 est mis en œuvre.

Analyse statistique de la survie des sujets en fonction du stade TNM de développement du cancer colorectal (cf. figure 1) La figure 1 montre une analyse de survie sur 105 sujets, stratifiés sur le stade TNM (stades localisés I et II (n=32) versus stades localement avancés III (n=33) versus stades métastatiques IV (n=20)). Les sujets atteints de maladies localisées ont un meilleur pronostic (survie médiane non atteinte) que les sujets avec une maladie localement avancée (survie médiane non atteinte) et que les sujets avec une maladie métastatique (survie médiane de 38.03 mois) (p<0.0001). Ceci est cohérent avec les données de la littérature.

Mesure du niveau d'expression de NLRC4 par immunoflorescence des échantillons marqués et comparaison entre les zones épithéliales tumorales et saines (cf. figure 2a)

La figure 2a montre une analyse sur 105 échantillons tumoraux et sains matchés (un tissu tumoral et un tissu sain correspondant pour chaque sujet). Il existe une diminution de l'expression de NLRC4 dans les cellules épithéliales tumorales par rapport aux cellules épithéliales saines (p<0.0001 ; valeur significativement différente / p<0.005).

Mesure du niveau d'expression de NLPR6 par immunoflorescence des échantillons marqués et comparaison entre les zones épithéliales tumorales et saines (cf. figure 2b)

La figure 2b montre une analyse sur 105 échantillons tumoraux et sains matchés (un tissu tumoral et un tissu sain correspondant pour chaque sujet). Il existe une diminution de l'expression de NLRP6 dans les cellules épithéliales tumorales par rapport aux cellules épithéliales saines (p<0.0001).

Mesure du niveau d'expression épithéliale de NLRC4 dans le tissu tumoral et le tissu sain (cf. figure 10)

La figure 10 est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRC4 dans les cellules épithéliales saines et dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal (tous stades) dans un TMA commercial (C02161, USBiomax, p<0.0001; valeur significativement différente / p<0.005).

Mesure du niveau d'expression de NLRC4 en fonction du stade TNM (cf. figure 11)

La figure 11 est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRC4 dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal en fonction du stade TNM dans un TMA commercial (C02161, USBiomax, p=0,0214, valeur significativement différente / p<0.005).

Mesure du niveau d'expression de NLRC4 en fonction de l'histologie (cf. figure 12) La figure 12 est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRC4 dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal en fonction de l'histologie dans un TMA commercial (LC1923, USBiomax, p<0,0001, valeur significativement différente / p<0.005).

Mesure du niveau d'expression de NLRC4 en fonction du grade tumoral (cf. figure 13)

La figure 13 est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence (RFU) de la protéine NLRC4 dans les cellules épithéliales tumorales d'échantillons prélevés chez des sujets atteints d'un cancer colorectal en fonction du stade TNM dans un TMA commercial (C02161, USBiomax, p=0,025, valeur significativement différente / p<0.005).

Analyse statistique du taux de survie des sujets malades (tous stades) en fonction du niveau d'expression de NLRC4 (NLRC4 ^" ou NLRC4 ⁺ ) et/ou NLRP6 (NLRP6 ^" ou NLRP6 ⁺ ) et/ou IL- 18 (IL-18 ou IL-18 ⁺ ) (cf. figures 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 5, 6, 7, 8, 9)

Les données cliniques sont récupérées à partir du dossier du sujet, par recueil notamment de différents éléments cliniques et histologiques. Pour chaque sujet, la survie est calculée comme étant le délai entre la date du diagnostic de cancer colorectal (souvent la date du résultat de l'analyse pathologique qui pose le diagnostic précis) et la date du décès ou la date des dernières nouvelles du sujet vivant.

De plus, des analyses avec courbes de ROC ont été réalisées sur notre cohorte, pour déterminer le seuil d'expression de NLRC4 et NLRP6 qui modifiait le pronostic des sujets (sur la survie globale). Ce seuil est très proche de la médiane des intensités de fluorescence pour la cohorte.

Les données sont analysées grâce au logiciel Graphpad version 6.07 (Graphpad Inc., San Diego, CA, USA). Les comparaisons de survie en fonction de l'expression du marqueur sont effectuées par la méthode du logrank, et les résultats sont considérés comme positifs si la p-value était strictement inférieure à 0.05.

Figure 3a : Chi ² = 8,726, df = 1, p = 0,0031, survie médiane de NLRC4 ^" = 60,03 mois

Figure 3b : Chi ² = 9,417, df = 1, p = 0,0021, survie médiane de NLRP6 ^" = 60,03 mois.

Figure 3c : Chi ² = 15,11, df= 1, p= 0.0001, survie médiane de IL-18 = 39,02 mois.

Figure 4a : Chi ² = 14,97, df = 1, p = 0,0001, survie médiane NLRC4 /NLRP6 ^" = 39 mois. Figure 4b : Chi ² = 21,35, df=3, p<0.0001, survie médiane de NLRC4 ^~ /IL-18 ^~ =38,03 mois,

NLRC4 ⁺ /IL-18 ^" = 93,195 mois. Figure 4c : Chi ² = 28,89, df=3, p<0.0001, survie médiane de NLRP6 ^~ /IL-18 ^~ =30,79 mois, NLRP6 ⁺ /IL-18 ^" = 83,18 mois.

Figure 4d : Chi ² = 27,89, df=4, p<0.0001, survie médiane de NLRC4 ^~ /NLRP6 ^~ /IL-18 ^~ =30,79 mois, 93,195 mois, NLRC4 ⁺ /NLRP6 /IL-18 ^" = 63,26 mois.

Figure 5 : Chi ² = 5,787, df = 2, p = 0,0554, survie médiane NLRC4 /NLRP6 ^" = 60,03 mois.

Figure 6 : Chi ² = 7,029, df = 4, p = 0,1343, survie médiane NLRC4 /NLRP6 ^" = 39,39 mois.

Figure 7 : Chi ² = 2,420, df = 4, p = 0,6591, survie médiane « tous » = 38,08 mois ; NLRC4 ⁺ /NLRP6 ⁺ = 15,74 mois ; NLRC4 ⁺ /NLRP6 ^" = 38,905 mois ; NLRC4 /NLRP6 ⁺ = 35,675 mois ; NLRC4 /NLRP6 ^" = 39,02 mois

Figure 8 : Chi ² = 5,293, df = 4, p = 0,2586, survie médiane NLRC4 /NLRP6 ^" = 60,03 mois

Figure 9 : Chi ² = 8,514, df = 4, p = 0,0745, survie médiane « tous » = 74,56 mois ; NLRC47NLRP6 ^" = 80,95 mois ; NLRC4 /NLRP6 ^" = 38,03 mois.

Conclusion quant à la performance du double marquage (test de double positivité)

Il a été réalisé un test de double positivité. Présentement, le test est « double positif » lorsque niveau d'expression des deux protéines NLRC4 et NLRP6 dans la zone épithéliale tumorale est significativement moindre que celui dans la zone épithéliale saine.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1

A partir de ces résultats, la spécificité et la sensibilité peuvent être calculées. La spécificité est la probabilité que le test soit négatif (donc que les protéines soient toujours exprimées) si le sujet a moins de risques de décéder. Ceci signifie que, par exemple, le comarquage selon la présente invention va permettre de mieux distinguer les sujets à bon pronostic qui n'auront pas besoin de chimiothérapie supplémentaire pour survivre. La sensibilité correspond à la probabilité que le test soit positif (donc que les protéines soient moins exprimées) si le sujet a plus de risques de décéder. La moins bonne sensibilité signifie que lorsque les deux marqueurs seront diminués, il sera difficile de dire si les sujets ont plus de risque de décéder et donc nécessitent une chimiothérapie ou pas (1 risque sur 2 de se tromper). Ceci permettrait quand même de mieux séparer les sujets et d'éviter probablement l'administration d'une chimiothérapie à des sujets qui n'en ont pas besoin.

Avec des valeurs seuil de 15,67565 pour NLRC4 et/ou 11,466567 pour NLRP6 e1 7.70055 pour IL-18, les valeurs de sensibilité et de spécificité suivantes ont été obtenues:

Tableau 2

Le test (double marquage NLRC4 et NLRP6 dans la zone épithéliale tumorale) présente une bonne performance, avec une bonne spécificité (82.6%) mais une sensibilité modérée (47.2%).