Domaine technique de l'invention

L'invention concerne le domaine de la toxicologie et plus particulièrement le domaine des méthodes génotoxicologiques de laboratoire. L'invention concerne plus particulièrement une nouvelle méthode prédictive de la toxicité cellulaire après exposition à des agents chimiques cassants directement ou indirectement l'ADN (notamment certains métaux, les pesticides et certains principes actifs pour chimiothérapie) et qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques.

Etat de la technique

Des données de littérature de plus en plus nombreuses montrent que les cassures double-brin (CDB) sont les dommages de l'ADN les mieux corrélés à la létalité cellulaire et à la toxicité - si elles ne sont pas réparées - et à l'instabilité génomique et au risque de cancer - si elles sont mal réparées (Jeggo et Lobrich, « DNA double-strand breaks: their cellular and clinical impact ? », Oncogene 26(56) p.7717-7719 (2007) ; Joubert et al., « Radiation biology: major advances and perspectives for radiotherapy », Cancer Radiotherapy 15(5) p.348-354 (201 1 ). A l'origine établie pour les CDB radio-induites, une telle conclusion semble être valable pour tous les agents cassants de l'ADN. Dès lors, une évaluation du risque toxique et cancérogène basée sur la quantification des CDB et des fonctionnalités de leur voie de réparation apparaît comme prometteuse. Pourtant, la détermination des CDB et les modèles de réparation et signalisation qui les régissent sont encore loin de faire l'unanimité parmi les radiobiologistes et les génotoxicologistes. A l'inverse, certains travaux ont montré une corrélation quantitative entre le nombre de CDB non réparées et la radiosensibilité cellulaire des cellules humaines en utilisant la technique de l'immunofluorescence, et ont proposé un modèle moléculaire en opposition avec les paradigmes actuels (Joubert et al., « DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response : at least two différent assays to predict intrinsic radiosensitivity ? », Int.J. Radiation Biology 84(2), p.1 -19 (2008); Joubert, et al. (article précité de 201 1 )). Plus récemment, ce même groupe de chercheurs a montré des réponses spécifiques de certains tissus humains à des métaux (notamment Pb, Cd, Al) (Viau et al., « Cadmium inhibits non-homologous end-joining and over- activâtes the MRE11 -dépendent repair pathway », Mutation Research 654 p.13-21 (2008) ; Gastaldo et al., « Lead contamination results in late and slowly repairable DNA double-strand breaks and impacts upon the ATM-dependent signaling pathways », Toxicology Letters 173, p.201 -214 (2007) ; Gastaldo et al., « Induction and repair rate of DNA damage: A unified mode! for describing effects of externat and internai irradiation and contamination with heavy metals », J Theoretical Biology 251 p.68-81 (2008)).

Toxicité et cancer peuvent être les conséquences de différents agents externes tels que les agents physiques (rayons X, particules, UV, chaleur), les agents chimiques (agents alkylants, certains principes actifs utilisés en chimiothérapie, certains métaux), les agents biologiques (comme certains virus ou bactéries). Parmi ces facteurs de stress génotoxique les radiations ionisantes sont l'agent externe pour lequel les effets biologiques sont les mieux documentés (Thomas et al., « Impact of dose-rate on the low- dose hyper-radiosensitivity and induced radioresistance response », International Journal of Radiation Biology, 89(10) p813-822 (2013) ; Colin C. et al., « MRE11 and H2AX biomarkers in the response to low-dose exposure : balance between individual susceptibility to radiosensitivity and to genomic instability », International journal of low radiation, 8(2) p96-106 (201 1 )) ; Joubert A. et al., « Irradiation in présence of iodinated contrast agent results in radiosensitization of endothelial cells : conséquences for computed tomography therapy », International Journal of Radiation : Oncology Biology Physics, 62(5) p1486-1496 (2005). Toutefois, comme pour tous les autres facteurs de stress, l'histoire de l'estimation du risque toxique et cancérogène a montré que des modèles moléculaires et cellulaires de la réponse au stress doivent être validés et des paramètres clairement identifiés. Il apparaît également clair que le facteur individuel constitue un facteur majeur à prendre en compte mais pose à nouveau la pertinence des modèles considérés (Dorr and Hendry « Consequential late effects in normal tissues » Radiother Oncol. 61 (3):223-31 (2001 ) ; Granzotto A et al, "Individual susceptibility to radiosensitivity and to genomic instability: its impact on low-dose phenomena" Health Phys. 100(3):282 (201 1 )). Ainsi, un diagnostic fiable du risque lié à tout stress génotoxique nécessite donc de solides pré-données obtenues sur un nombre suffisant d'individus, de modèles cellulaires, avec des paramètres justifiés.

La littérature actuelle montre un nombre croissant d'études concernant les effets génotoxiques de certains métaux et métalloïdes (comme Al, Cd, U, As, Se et Sb) et de leurs formes nanoparticulaires associées (Polya et Charlet, « Increasing arsenic risk ? », Nature Geoscience 2, p.383-384 (2009); Akhter et al., « Cancer targeted metallic nanoparticle : targeting overview, récent advancement and toxicity concern », Curr. Pharm. Des. 17(18),p.1834-1850 (201 1 ); Almeida et al., « In vivo biodistribution of nanoparticles », Nanomedicine (Lond) 6(5), p.815-835 (201 1 ); Pereira et al., "Genotoxicity of uranium contamination in embryonic zebrafish cells", Aquatic Toxicology 109, p.1 1 -16 (2012) ; Pereira et al., "Comparative genotoxicity of aluminium and cadmium in embryonic zebrafish cells", Mutation Research 750, p.19-26 (2013)), notamment concernant l'exposition par l'eau et générée par l'industrie des semi-conducteurs, ainsi que des pesticides (Garaj-Vrhovac et Zeljezic, « Evaluation of DNA damage in workers occupationally exposed to pesticides using single-cell gel electrophoresis (SCGE) assay. Pesticide genotoxicity revealed by cornet assay », Mutation Research 469(2), p.279-285 (2000); Garaj-Vrhovac et al., « Efficacity of HUMN criteria for scoring the micronucleus assay in human lymphocytes exposed to a low concentration of p,p'-DDT », Braz J Med Biol Res 41 (6), p.473-376 (2008); Guilherme et al., « Différentiel genotoxicity of Roundup ® formulation and its constituents in blood cells of fish (Anguilla anguilla) : considérations on chemical interactions and DNA damaging mechanisms », Ecotoxicology 21 (5), p1381 - 90. (2012)). Or, ces deux types d'agents représentent clairement des enjeux sociétaux majeurs au vu du développement de l'industrie, de la pollution atmosphérique et du besoin d'augmentation des rendements agricoles. De fait, ils se trouvent également aux centres des préoccupations de santé et dans le cadre environnemental et dans le cadre du travail. La communauté scientifique suspecte que la toxicité de certains composants nanoparticulaires oxydés pourrait engendrer génotoxicité et carcinogénèse : la recherche sur les effets biologiques spécifiques des nanoparticules s'inscrit donc naturellement dans la programmation de recherches sur les conséquences humaines et environnementales d'une telle technologie.

On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celle des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité (dans le cas d'une exposition aux radiations ionisantes). Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue). On sait également que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise (« Inhérent cellular radiosensibility as a basic concept for human tumor radiotherapy », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 7, p.621 - 629 (1981 ) ; « Intrincsic radiosensitivity of human cell Unes is correlated with radioresponsiveness of human tumors : Analysis of 101 published survival curves », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 1 1 , p.1699-1707 (1985)). Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, on pense que la radiosensibilité découle d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu.

Ce qui est vrai pour la radiosensibilité l'est également pour la prédisposition au cancer, et plus particulièrement au cancer radioinduit. Ainsi, tout excès de dose biologique augmente à la fois le risque toxique et le risque carcinogène. Il serait donc utile de disposer d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer le risque et l'excès de dose biologique dû à l'exposition à des agents génotoxiques cassant l'ADN.

Dans le cadre de leur publications (Joubert et al., "DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response ; At least two différent assays to predict intrinsic radiosensitivity ?", paru dans Int. J. Radiât. Biol., vol. 84(2), p. 107-125 (2008)), une classification de la radiosensiblité humaine en 3 groupes a été proposée : Groupe I : radiorésistance et faible risque de cancer, Groupe II radiosensibilité modérée et haut risque de cancer ; Groupe III, hyper-radiosensibilité et haut risque de cancer. Cette classification est basée sur des critères moléculaires ; elle permet de décrire tous les cas de radiosensibilité humaine. Une telle classification qui prend en compte le facteur individuel n'existe pas pour le stress génotoxique engendré par des agents chimiques tels que les métaux et les pesticides.

Un certain nombre de documents décrivent les conditions dans lesquelles H2AX ou pH2AX est utilisée comme marqueur de la détection et la réparation de l'endommagement de l'ADN notamment lors de l'utilisation d'agents cassants. La demande de brevet WO 2014/152873 décrit une méthode de quantification de la génotoxicité de principes actifs utilisés en chimiothérapie par la quantification de l'expression de l'histone H2AX. La demande de brevet WO 2005/1 13821 décrit l'utilisation du marqueur pH2AX comme moyen de détection de cassures double brin de l'ADN dans des méthodes pour identifier les produits du tabac les moins toxiques. Dans ces méthodes, la fumée de tabac est mise au contact des cellules pendant une durée prédéterminée (15 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes ou une heure). La présence ou absence de foci pH2AX est vérifiée par immunofluorescence. Cependant cette méthode concerne un cocktail de produits chimiques dont on n'identifie pas l'agent cassant de manière exact.

La demande de brevet WO2005/1 13 821 (Vector Tobacco / New York Médical University) décrit l'utilisation du marqueur pH2AX pour détecter des cassures double-brin d'ADN et évaluer la toxicité du tabac. Une autre méthode qui utilise le niveau d'expression H2AX pour détecter des cassures double-brin d'ADN et évaluer l'efficacité d'un agent anticancer est décrite dans WO2014/152 873 (Pioma).

Malgré ce vaste état de la technique, la demanderesse constate qu'il n'existe pas de méthode de quantification de l'excès de dose biologique et du risque lié à l'exposition aux agents chimiques cassant l'ADN. Pour ces agents, le problème de fournir une méthode prédictive de la génotoxicologie individuelle reste donc sans solution opérationnelle. La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive du risque de toxicité lié à l'exposition aux agents chimiques cassant l'ADN.

Objets de l'invention

Les inventeurs ont constaté, et la méthode selon l'invention part de ce constat, que les cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont les dommages les plus prédictifs de la génotoxicité quand ils sont non-réparés d'une part, et de l'instabilité génomique quand ils sont mal réparés d'autre part. Dans le cadre de la présente invention les inventeurs ont découvert que les CDB sont prises en charge par le mode majoritaire de réparation dit de suture, et/ou par le mode minoritaire de réparation fautive dit de recombinaison MRE1 1 - dépendante. L'équilibre entre ces deux modes de réparation est contrôlé par la protéine ATM et constitue le facteur individuel. Le marqueur pH2AX indique un site de CDB reconnu par le mode de réparation par suture. Le marqueur MRE1 1 indique un site de CDB qui a été pris en charge par la réparation fautive MRE1 1 -dépendante. Le marqueur pATM renseigne sur l'activation de la voie de suture par phosphorylation de H2AX et l'inhibition de la voie MRE1 1 -dépendante. Les inventeurs ont par ailleurs observé un transfert des formes cytoplasmiques de la protéine ATM dans le noyau cellulaire à la suite d'un stress de type oxydatif, et notamment à la suite d'un stress induisant des CDB et produisant une oxydation dans le cytoplasme.

Les inventeurs ont montré que ces modèles sont valables pour un grand nombre d'agents chimiques et biochimiques cassant l'ADN comme les métaux, les pesticides, les nanoparticules et certaines drogues chimiothérapeutiques.

Pour constater l'endommagement d'un ADN par une agression exogène génotoxique, il faut tenir compte :

d'une part, de l'état spontané de l'ADN,

d'autre part, de son état stress-induit.

Par ailleurs, après l'exposition à un stress génotoxique, il faut tenir compte de la réparation de l'ADN, dont la cinétique dépend de la nature du stress mais aussi potentiellement de la nature du tissu impacté. On sait par ailleurs que l'efficacité et la rapidité de la réparation de l'ADN varie d'un individu à l'autre, et qu'il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une sensibilité exceptionnelle.

Enfin, afin de mieux appréhender les différences inter-individuelles, il faut construire un système basé sur une dose biologique ou une concentration de référence pour mieux quantifier les phénomènes à partir d'une même base.

Selon l'invention le problème est résolu par une méthode basée sur :

(i) La préparation d'un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules non transformées, prélevées sur un individu, par exemple de cellules issues de biopsies de peau de l'individu concerné mais aussi de cellules témoins dites de référence considérées comme résistantes au stress cassant considéré (ex : cellules d'individu Groupe I) ;

La détermination d'une concentration de référence après exposition de l'échantillon cellulaire issu des cellules de référence (Groupe I) au stress donné. A noter que cette étape peut avoir été déjà effectuée et être contenue dans une base de données du laboratoire inventeur ;

(iii) La définition d'un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines quiescentes ; (iv) Des tests fonctionnels de la reconnaissance, de la réparation et de la signalisation des CDB sur les cellules de l'individu considéré à la concentration de référence définie plus haut.

Les cellules témoins dites de référence sont des cellules considérées comme résistantes au stress cassant considéré, de préférence ce sont des cellules résistantes au stress induit par des agents chimiques et au rayonnement (ex : cellules d'individu Groupe I). On peut utiliser des cellules commerciales habituellement employées comme témoins dans des études de génotoxicité telles que, notamment, les lignées cellulaires 1 BR3 (Killalea et al., « Factors in post dialysis CAPD fluid affecting 3H cholestérol eïïlux from human skin fibroblasts », Biochemical Society Transactions 25 p123S (1997)), 149BR et MRC9 (Watanabe et al., « Comparison of lung cancer cell Unes representing four histopathological subtypes with gene expression profiling using quantitative real-time PCR », Cancer Cell International 10(2) p1 -12 (2010)). D'autres cellules telles que HF19, IMR90, 48BR, 70BR, 142BR, 155BR, et MRC5 peuvent être employées comme cellules témoins dites de référence.

Un premier objet de l'invention est donc un procédé pour prédire la sensibilité d'un individu envers un stress cassant l'ADN à partir d'un échantillon cellulaire issu de cellules

(de préférence de cellules de peau) prélevé sur l'individu et de la définition d'une concentration de référence à laquelle les expériences sont réalisées.

dans lequel procédé :

(Etape dite de définition des références)

(i) si la concentration de référence n'a pas été déjà déterminée pour l'agent chimique ou biochimique à étudier, on prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules dites de référence (groupe I de sensibilité) ; on applique plusieurs concentrations à l'intérieur d'une large gamme de concentration dudit agent cassant (ladite gamme de concentration allant par exemple du nM au mM) pendant une durée prédéterminée (de préférence 24h) sur cet échantillon cellulaire ; on procède à une immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au DAPI qui permet également sur le même échantillon cellulaire l'analyse de micronoyaux pour toutes les concentrations appliquées.

(ii) Soit le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé N _P H2Ax(t, C)), soit le nombre moyen de micronoyaux pour 100 cellules aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé N _M N(Î, C)), soit l'écart-type σ correspondant à l'erreur commises sur ces mesures respectives qui doivent être effectuées sur au moins 50 noyaux une fois (écart-type gaussien) ou 3 expériences indépendantes de 50 noyaux (écart-type de la moyenne).

La concentration de référence dite C _ref est la concentration qui donne :

N _P H2Ax(24h, C _ref ) + 2o = 2 ou bien N _MN (24h, C _ref ) + 2 σ = 2 % ; (Etape dite d'estimation du risque)

(iv) On prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules prélevées sur l'individu considéré. On applique à cet échantillon cellulaire la concentration de référence C _ref définie plus haut pendant une durée prédéterminée (de préférence 24 h). On procède ensuite à une détermination de l'immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au

DAPI.

(v) On détermine alors sur ledit échantillon cellulaire N _pH 2Ax(24h, C _ref ) et Ν _Μ Ν(24ΙΙ,

(vi) Si pour l'échantillon cellulaire N _pH 2Ax(24h, C _ref ) < 2 ou bien Ν _Μ Ν(24ΙΙ, C _ref )≤ 2 % , alors le risque génotoxique est considéré comme faible et dit « de Groupe I »

(vii) Si pour l'échantillon cellulaire N _pH 2Ax(24h, C _reT ) >8 ou bien Ν _Μ Ν(24ΙΙ, C _reT ) > 10%, alors le risque génotoxique est considéré comme très élevé et dit « de Groupe III »

(viii) Pour tous les autres cas, le risque génotoxique est considéré comme intermédiaire et dit « de Groupe II ».

Un autre objet de l'invention est un procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissu prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, comprenant les étapes suivantes :

(a) On fixe une concentration de travail pour ledit au moins un agent chimique ou biochimique, ou pour des agents chimiques et/ou biochimiques compris dans ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques ;

(b) On prélève des cellules d'un tissu à évaluer d'un individu ;

(c) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ; (d) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa concentration de travail définie à l'étape (a), pendant une durée prédéterminée ;

(e) On détecte le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux, sachant que les étapes (b), (c), (d) et (e) doivent être exécutées l'une après l'autre, et que l'étape (a) doit être exécutée préalablement à l'étape (e).

Ledit agent chimique peut être, à titre d'exemple, un anion métallique ou non métallique, un cation non-métallique, un anion organique, un cation organique, un composé zwitterionique, un composé inorganique neutre ou non, un composé organique neutre ou non, un organo-métallique, un composé insoluble ; ledit agent chimique peut être présent par exemple sous forme dissout dans un milieu liquide (aqueux ou non-aqueux), sous forme de particules, sous forme de nanoparticules, fixé sur un membrane cellulaire, sous forme gazeuse. Ledit agent biochimique peut être, à titre d'exemple, un peptide (recombinant ou non), un anticorps, un antigène, un virus (désactivé ou non), un fragment de virus, un fragment cellulaire.

Avantageusement le procédé selon l'invention comprend en plus une étape (f) dans laquelle on détermine un score diagnostique qui représente ladite sensibilité dudit tissu à l'effet toxique cassant l'ADN dudit agent chimique ou biochimique ou de ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, en utilisant ledit nombre de cassures double brin de l'ADN (et/ou le nombre de micronoyaux) et ladite concentration de travail.

Selon l'invention, la détection des cassures double brin à l'étape (e) se fait avantageusement en utilisant une technique sélectionnée dans le groupe formé par l'immunofluorescence, l'examen cytogénétique, l'électrophorèse en champ puisé.

Dans un mode de réalisation on détecte à l'étape (e) au moins un biomarqueur sélectionné dans le groupe formé par : pH2AX, 53BP1 , Phospho-DNAPK, MDC1. De manière avantageuse on détecte le biomarqueur pH2AX, et de préférence le nombre et la taille des foci nucléaires dudit biomarqueur. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré on procède à une contre-coloration apte à localiser les noyaux cellulaires pour quantifier les micronoyaux (MN).

A l'étape (e) du procédé selon l'invention la concentration de travail est avantageusement une concentration de référence C _ref préalablement déterminée. Dans un mode de réalisation on détermine par immunofluorescence pH2AX le nombre de cassures double brin de l'ADN, et on détecte, après contre-coloration au DAPI, le nombre de micronoyaux (MN), et on détermine alors sur ledit échantillon cellulaire N _pH 2Ax(24h, C _ref ) et Ν _Μ Ν(24ΙΙ , C _ref ) ; si pour l'échantillon cellulaire N _pH 2Ax(24h, C _ref )≤ 2, ou bien si Ν _Μ Ν(24ΙΙ , C _ref )≤ 2 %, alors on conclut que le risque génotoxique est faible et/ou dit « de Groupe I » ; si pour l'échantillon cellulaire N _P H2Ax(24h, C _r e _f ) >8, ou bien Ν _Μ Ν(24ΙΙ, C _ref ) > 10%, alors on conclut que le risque génotoxique est très élevé et/ou dit « de Groupe III » ; pour tous les autres cas, on conclut que le risque génotoxique est intermédiaire et/ou dit « de Groupe II ».

A l'étape (e) du procédé selon l'invention la concentration de travail est avantageusement une concentration de référence C _ref préalablement déterminée. Cette détermination se fait avantageusement par un procédé dans lequel :

(i) on prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules dites de référence (Groupe I de sensibilité) et on le subdivise en plusieurs fractions ;

(ii) on applique plusieurs concentrations de l'au moins un agent chimique ou biochimique à tester, lesdites concentrations étant choisies à l'intérieur d'une gamme de concentration dudit agent chimique ou biochimique (ladite gamme de concentration allant par exemple du nM au mM) pendant une durée prédéterminée (de préférence 24h), sachant que chacune sur une fraction de cet échantillon cellulaire ;

(iii) on détermine pour chacune des fractions de l'échantillon cellulaire le nombre de foci au pH2AX par cellule et/ou le nombre de micronoyaux par cellule ;

(iv) On détermine :

o le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé N _pH 2Ax(t, C)), (cette détermination se faisant de préférence par immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au DAPI),

o le nombre moyen de micronoyaux pour 100 cellules aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé N _MN (t, C)),

o l'écart-type σ sur ces mesures respectives, sachant que ces mesures sont effectuées de préférence sur au moins 50 noyaux une fois (écart- type gaussien) ou sur 3 expériences indépendantes de 50 noyaux (écart-type de la moyenne),

o la concentration de référence dite C _ref en tant que la concentration qui donne : N _pH 2Ax(24h, C _ref ) + 2o = 2 ou bien N _MN (24h, C _ref ) + 2o = 2 %. Avantageusement, les cellules dites de référence sont choisies parmi les lignées cellulaires HF19, IMR90, 48BR, 70BR, 142BR, 155BR, et MRC5, 1 BR3, 149BR et MRC9 et plus particulièrement parmi les lignées cellulaires 1 BR3, 149BR et MRC9. Dans un mode de réalisation du procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissue prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques :

(i) on isole et/ou amplifie des cellules issues dudit tissue prélevé, ces cellules amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ;

(ii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement N _pH 2Ax(t) lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état non exposé à ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) et au moins un temps d'observation t4 après la mise en contact dudit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa concentration de travail pendant une durée prédéterminée (cette mise en contact étant appelée ici « exposition génotoxique »);

(iii) on détermine le groupe de sensibilité de l'échantillon à l'exposition génotoxique, en utilisant au moins les nombres moyens N _pH 2Ax(t) ; t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ;

Dans un mode de réalisation on détermine en plus sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de micronoyaux observés aux temps t pour 100 cellules [en %] (ce nombre moyen étant appelé N _M N(t)), les temps t étant au moins tO (non exposé à une dose biologique absorbée D) et t4 après exposition avec une dose biologique absorbée D. Dans cadre de la présente invention, le critère de Groupe peut être défini selon des critères cliniques : Groupe I = absence de signes cliniques ; Groupe II = présence de signes cliniques ; Groupe III = effet létal. Description des figures

La figure 1 (A), (B) et (C) montre l'évolution du nombre de foci pH2AX 24 h après la mise en contact de l'échantillon cellulaire avec du glyphosate (CAS n° 1071 -83-6) à une concentration donnée en fonction de cette concentration en glyphosate pour les lignées fibroblastiques 1 BR3 (figure 1 (A)), 149BR (figure 1 (B)) et 04PSL (figure 1 (C)).

La figure 2 (A), (B) et (C) montre l'évolution du nombre de foci pH2AX 24 h après la mise en contact de l'échantillon cellulaire avec du 5FU à une concentration donnée en fonction de cette concentration en 5FU pour les lignées fibroblastiques MRC9 (figure 2 (A)), 03HLS (figure 2 (B)) et GM02718 (figure 2 (C)).

Description détaillée

Nous décrivons ici un mode de réalisation avec plusieurs variantes qui convient pour un patient humain.

1 . Préparation de l'essai Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prélevées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d'analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d'infection éventuelle du patient par HIV ou hépatite C pour que lesdits opérateurs puissent prendre les mesures appropriées de sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la culture cellulaire.

Puis, l'opérateur prélève au patient un échantillon de tissu servant à la préparation de l'échantillon cellulaire. De préférence il lui prélève par biopsie un échantillon de peau ; ce prélèvement peut se faire avantageusement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique ». L'échantillon de tissu est placé dans du milieu DMEM+20% (sérum de veau fétal stérile). L'échantillon de tissu est transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, sachant que l'échantillon ne doit pas rester plus de 38 h à la température ambiante.

L'étape suivante représente l'isolation et /ou l'amplification du tissu prélevé.

Dans un mode de réalisation, dès réception, l'échantillon de tissu (typiquement la biopsie) est établi sous la forme d'une lignée cellulaire amplifiable sans agent de transformation virale ou chimique suivant une procédure ancillaire et bien connue des laboratoires de culture, comme le souligne la publication d'EIkind et al. « The radiobiology of cultured mammalian cells », Gordon and Breach (1967). Dès que le nombre de cellules est suffisant (typiquement après 1 à 3 semaines), les premières expériences sont réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. On prépare un échantillon cellulaire : Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles sont contaminées avec des métaux ou des pesticides ou tout autre agent chimique ou biochimique cassants pour l'ADN à différentes concentrations. Une autre partie n'est pas contaminée; elle représente l'état spontané. Pendant la contamination, les cellules restent dans l'incubateur de culture à 37°C.

Pour les cellules contaminées, on acquiert des caractéristiques correspondant à l'état après un temps d'incubation avec l'agent chimique ou biochimique cassant l'ADN. Lesdites caractéristiques sont représentées par les foci correspondant au marqueur pH2AX. Les cellules sur lamelles de verre sont ensuite fixées, lysées et hybridées. La procédure suivante, connue en tant que telle (Bodgi et al, « A single formula to describe radiation-induced protein relocalization: towards a mathematical définition of individual radiosensitivity », J Theor Biol. 21 p 333:135-45.2013) :

les cellules sont fixées dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgCI ₂ , 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule i-Oct-C ₆ H ₄ - (OCH ₂ CI-l2) _x OH avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1 , fourni par exemple par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture sont lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additionné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par exemple par Sigma Aldrich) et a été suivi par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX sont utilisés à une concentration de 1 :800. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souris ou TRITC anti-lapin (1 :100, fournis par exemple par Sigma Aldrich) sont effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes. On a traité des lamelles de verre avec du Vectashield™ contenant du DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole) pour marquer le noyau. La coloration avec du DAPI permet aussi, de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase Gi (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase S (noyaux avec de nombreux foci pH2AX), en phase G ₂ (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et métaphases (chromosomes visibles).

L'acquisition des résultats est effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus par exemple). La lecture peut être directe (typiquement par comptage des foci sur au moins 50 cellules en G ₀ /Gi pour chaque point) ou par logiciel d'analyse d'image dédié, ou encore sur un microscope automatisé ; de préférence les méthodes par logiciel ou microscope automatisé sont calibrées avec des déterminations manuelles.

Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, au moins 3 séries d'expériences (exposition) indépendantes sont effectuées et la moyenne de chacun des nombres de foci pour les temps définis est calculée.

2. Détermination des paramètres biologiques et cliniques

2.1 Généralités et marqueurs utilisés

L'invention est basée entre autres sur l'utilisation de données acquises pour un des deux marqueurs pH2AX sur des cellules non-contaminées (état spontané) et contaminées. La méthode est basée sur l'étude du marquage par ce marqueur pour une durée de contamination donnée : on marque les échantillons après un laps de temps déterminé à compter de l'arrêt de la contamination, et on étudie leur immunofluorescence.

Les moyennes obtenues pour chaque point et chaque dose avec chaque marqueur sont calculées avec les erreurs écart-types de la moyenne (appelé « SEM ») vu que l'échantillonnage est n=3 (pas d'écart-type gaussien de type « standard error SE »). pH2AX désigne les formes phosphorylées en sérine 439 du variant X de l'histone H2AX qui marque, selon les constatations de la demanderesse, le nombre de cassures double- brin de l'ADN (CDB) qui sont reconnues par le mode de réparation majoritaire et fidèle, la suture. Le marqueur pH2AX est essentiellement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaire, et seuls le nombre et la taille de ces foci nucléaires seront analysés.

La contre-coloration au DAPI (un marqueur d'ADN connu de l'homme du métier) permet de localiser le noyau pour situer la localisation cytoplasmique ou nucléaire pour quantifier les micronoyaux, qui sont des marqueurs cellulaires complémentaires aux données sur les foci.

2.2 Paramètres biologiques et cliniques

On définit et détermine comme indiqué : - N _P H2Ax(t), les nombres moyens de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX aux temps d'observations tO (non contaminé) et t4 sachant que la détermination du paramètre N _pH 2Ax(t) est obligatoire dans le cadre de la méthode selon l'invention,

- le nombre de micronoyaux observés spontanément (à t = tO, i.e. sans contamination) ou à t = t4 après contamination pour 100 cellules (en %).

Le procédé selon l'invention montre que la sensibilité tissulaire à un métal donné varie en fonction du tissu d'intérêt. Par exemple des astrocytes contaminés avec 100 μΜ d'aluminium présentent moins de cassures (cellules HA, 2 foci de H2AX) comparés à des cellules endothéliales pour la même concentration (cellules HMEC, 3,7 foci de H2AX) (cf tableau 1 ). De plus, pour certains métaux, les inventeurs ont montré qu'il existait une correspondance entre l'échelle unique de toxicité proposée et certains signes cliniques décrits par exemple dans le cas du plomb (saturnisme) ou dans le cas du cadmium (maladie d'Itai-ltai) (cf tableau 3).

Le procédé selon l'invention permet de montrer également que des cellules contaminées avec du cuivre présentaient pour la plus forte concentration testée (1 mM) un nombre de cassures de l'ADN visualisées par des foci de H2AX allant de 2 à 21 foci selon le type cellulaire testé (cf. tableaux 1 et 2).

On note que le procédé selon l'invention est tellement sensible qu'il permet de caractériser l'impact sur un tissu d'agents chimiques cassant l'ADN dans des concentrations très faibles, qui sont de l'ordre de grandeur des valeurs limites réglementaires pour certains agents chimiques dans l'eau potable ; ces valeurs limites sont par exemple de l'ordre de 2 mM (2 mg/L) pour le cuivre, 200 μΜ pour l'aluminium, 5 μΜ pour le cadmium, 10 μΜ pour le Pb.

2.3 Evaluation prédictive

Elle vise la prédiction de paramètres cliniques à partir des données biologiques mesurées.

Un diagnostic quantitatif directement issu de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques reliant les scores ; celui-ci concerne le critère suivant :

(i) La classification du patient dans un Groupe I, Il ou III (critère appelé GROUPE) :

La définition des groupes de sensibilité (GROUPE) aide le médecin à déterminer à partir des scores selon l'invention et du tableau clinique du patient des analogies avec des syndromes génétiques connus. Ces groupes ont été définis initialement dans la publication de Joubert et al. (Int. J. Radiât. Biol. 84(2), p. 107-125 (2008), citée ci-dessus.

Selon la présente invention, on considère que : Si pour l'échantillon cellulaire N _pH 2Ax(24h, C _re f) <= 2 ou bien Ν _Μ Ν(24ΙΙ, C _re f) <= 0,5%, de préférence Ν _Μ Ν(24ΙΙ, C _re f) <= 1 % et encore plus préférentiellement Ν _Μ Ν(24ΙΙ, C _re f) <= 2%, alors le risque génotoxique est considéré comme faible et dit « de Groupe I »

Si pour l'échantillon cellulaire N _pH 2Ax(24h, C _re f) >8 ou bien Ν _Μ Ν(24ΙΙ, C _re f) > 10%, alors le risque génotoxique est considéré comme très élevé et dit « de Groupe III »

Pour tous les autres cas, le risque génotoxique est considéré comme intermédiaire et dit « de Groupe II ». Exemples

Exemple 1

1 . Détermination, sur des lignées fibroblastiques témoins, de la concentration de référence du glyphosate (agent chimique)

Des fibroblastes témoins commerciaux 1 BR3 et 149BR ont été amplifiés suivant les préconisations du fournisseur (SIGMA-ALDRICH) jusqu'à obtention du nombre de cellules témoins souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles a ensuite été mise en contact avec le milieu à tester comprenant du glyphosate (CAS n° 1071 -83-6) à une concentration donnée comme présentée dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1

Détection du nombre de foci pH2AX 24h après la mise en contact des cellules fibroblastiques témoins 1 BR3, 149 BR et des cellules 04PSL avec du glyphosate en fonction de la concentration en glyphosate employée

5

Après la mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. 24h après la mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée comme présenté dans le tableau 1 , le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX a été acquis. L'acquisition 10 des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en G ₀ /Gi pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ).

Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base 15 d'un diagnostic, 3 séries d'expériences indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (« SEM » ou o) de chacun des nombres de foci acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du glyphosate à une concentration donnée a été calculé et présenté dans le tableau 1 .

Ainsi, pour les échantillons cellulaires témoins de peau 1 BR3 et 149BR (cf. tableau 1 ), la 20 concentration de référence a été déterminée. Cette concentration de référence a été définie comme étant la concentration qui donne : N _pH 2Ax(24h, C _ref ) + 2o = 2 où σ correspond à l'écart-type des mesures du nombre de foci pH2AX acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du glyphosate à une concentration donnée, ces mesures étant réalisées sur 3 expériences indépendantes de 50 cellules (écart-type 25 de la moyenne). La figure 1 représente l'évolution du nombre de foci pH2AX acquis par cellule, 24h après la mise en contact des cellules témoins 1 BR3 (cf. figure 1 (A)) et 149 BR (cf. figure 1 (B)) avec du glyphosate en fonction de la concentration en glyphosate employée. La concentration C _ref définie par N _pH 2Ax(24h, C _ref ) + 2o = 2 pour les 2 lignées cellulaires témoins 149BR et 1 BR3 est de 100 μΜ.

2. Préparation de l'essai (lignée cellulaire 04PSL)

Un échantillon cellulaire de peau d'un patient a été prélevé par biopsie via la méthode de « punch dermatologique » connue de l'homme du métier. L'échantillon cellulaire a ensuite été placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau fetal stérile. L'échantillon cellulaire a ensuite été transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, afin que l'échantillon ne reste pas plus de 38 h à la température ambiante.

Dès réception, l'échantillon cellulaire issu de la biopsie a été établi sous la forme d'une lignée cellulaire 04PSL amplifiable suivant une procédure bien connue des laboratoires de culture et de l'homme du métier : en utilisant notamment la dispersion trypsique les cellules sont à nouveau diluée dans du milieu renouvelé et ainsi de suite jusqu'à obtention du nombre de cellules souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules de la lignée 04PSL ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles a ensuite été mise en contact avec du glyphosate à une concentration de 100 μΜ. A titre de vérification, une autre partie de ces lamelles a été mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée (cf. tableau 1 , figure 1 (C)).

Après la mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. 24h après la mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée comme présenté dans le tableau 1 , le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX a été acquis. L'acquisition des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en G ₀ /Gi pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ).

Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, 3 séries d'expériences indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (« SEM » ou o) de chacun des nombres de foci acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du glyphosate à une concentration donnée a été calculé et présenté dans le tableau 1 et sur la figure 1 (C). 3. Détermination du risque génotoxique de la lignée cellulaire 04PSL

A une concentration de glyphosate de 100 μΜ, le nombre de foci pH2AX obtenu pour la lignée cellulaire 04PSL est environ de 7 ; ce chiffre valide l'équation 2 < N _pH 2Ax(24h) < 8. Par conséquent, pour la lignée cellulaire 04PSL, le risque génotoxique lié au glyphosate est de « groupe II » ou dit intermédiaire. La lignée 04PSL est chimiosensible.

Exemple 2

1 . Détermination, sur des lignées fibroblastiques témoins, de la concentration de référence de la drogue chimiothérapeutique 5FU (agent chimique) Des fibroblastes témoins commerciaux MRC9 ont été amplifiés selon les préconisations du fournisseur (SIGMA-ALDRICH) jusqu'à obtention du nombre de cellules témoins souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles a ensuite été mise en contact avec le milieu à tester comprenant du 5FU à une concentration donnée comme présentée dans le tableau 2 ci- après.

Tableau 2

Détection du nombre de foci pH2AX 24h après la mise en contact des cellules fibroblastiques témoins MRC9 et des cellules GM02718 et 03HLS avec du 5FU en fonction de la concentration en 5FU employée

Après la mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. 24h après la mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée comme présenté dans le tableau 2, le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX a été acquis. L'acquisition des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ). Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, 3 séries d'expériences indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (« SEM » ou o) de chacun des nombres de foci acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du 5FU à une concentration donnée a été calculé et présenté dans le tableau 2. Ainsi, pour les échantillons cellulaires témoins MRC9 (cf. tableau 2, figure 2 (A)), la concentration de référence a été déterminée. Cette concentration de référence a été définie comme étant la concentration qui donne : N _pH 2Ax(24h, C _re f) + 2o = 2 où σ correspond à l'écart-type des mesures du nombre de foci pH2AX acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du glyphosate à une concentration donnée, ces mesures étant réalisées sur 3 expériences indépendantes de 50 cellules (écart-type de la moyenne).

La figure 2 représente l'évolution du nombre de foci pH2AX acquis par cellule, 24h après la mise en contact des cellules témoins MRC9 (cf. figure 2 (A)) avec du 5FU en fonction de la concentration en 5FU employée. La concentration C _re f définie par N _pH 2Ax(24h, C _re f) + 2o = 2 pour la lignée cellulaire témoin MRC9 est de 30 μΜ.

2. Préparation de l'essai (lignées cellulaires GM02718 et 03HLS)

La lignée cellulaire GM02718 a été amplifiée suivant les préconisations du fournisseur (Coriell Institute) jusqu'à obtention du nombre de cellules souhaité.

Pour la lignée 03 HLS, un échantillon cellulaire de peau d'un patient a été prélevé par biopsie via la méthode de « punch dermatologique » connue de l'homme du métier. L'échantillon cellulaire a ensuite été placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau fetal stérile. L'échantillon cellulaire a ensuite été transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, afin que l'échantillon ne reste pas plus de 38 h à la température ambiante.

Dès réception, l'échantillon cellulaire issu de la biopsie a été établi sous la forme d'une lignée cellulaire 03HLS amplifiable suivant une procédure bien connue des laboratoires de culture et de l'homme du métier : en utilisant notamment la dispersion trypsique les cellules sont à nouveau diluée dans du milieu renouvelé et ainsi de suite jusqu'à obtention du nombre de cellules souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant pour ces deux lignées, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules de la lignée GM02718, respectivement 03HLS ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles a ensuite été mise en contact avec du 5FU à une concentration de 30 μΜ. A titre de vérification, une autre partie de ces lamelles a été mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée (cf. tableau 2, cf. figure 2 (B) pour la lignée cellulaire GM02718, respectivement figure 2 (C) pour la lignée cellulaire 03HLS).

Après la mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. 24h après la mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée comme présenté dans le tableau 2, le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX a été acquis. L'acquisition des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ).

Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, 3 séries d'expériences indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (« SEM » ou o) de chacun des nombres de foci acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du 5FU à une concentration donnée a été calculé et présenté dans le tableau 2 et sur la figure 2 (B) pour la lignée cellulaire GM02718, respectivement figure 2 (C) pour la lignée cellulaire 03HLS.

3. Détermination du risque génotoxique de la lignée cellulaire GM02718,

respectivement 03HLS

A une concentration de 5FU de 30 μΜ, le nombre de foci pH2AX obtenu pour la lignée cellulaire GM02718, respectivement 03HLS est environ de 2,38 respectivement 2,59 foci ; ce chiffre valide l'équation 2 < N _pH 2Ax(24h) < 8. Par conséquent, pour la lignée cellulaire GM02718, respectivement 03HLS, le risque génotoxique lié au 5FU est de « groupe II » ou dit intermédiaire. Les lignées GM02718 et 03HLS sont chimiosensibles.

Autres exemples

Les tableaux qui suivent résument les résultats de nombreuses expériences qui ont été exécutées tel que décrit dans la partie « Description détaillée » ci-dessus. Dans les tableaux 3 et 4, « pH2AX » correspond au nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX, 24 heures après la mise en contact de l'échantillon cellulaire avec l'agent chimique à la concentration C (N _pH 2Ax(24h, C)), et où "Micronoyaux » correspond au nombre moyen de micronoyaux observés pour 100 cellules 24h après la mise en contact de l'échantillon cellulaire avec l'agent chimique à la concentration C (Ν _Μ Ν(24ΙΙ, C)).

Tableau 3 : Détection du nombre de foci pH2AX et du nombre de micronoyaux 24h après la mise en contact de cellules 04PSL, 01 PAU, 08HNG, 1 BR3 avec un agent cassant de type pesticide (Glyphosate, Permethrine, Thiobendazole, PCP, Atrazine) en fonction de la concentration en pesticide employée

Concentration [μΜ]

Lignée Agent Cassant Marqueurs 0 0,01 0,1 0,3 1 10 20 30

1 BR3 micronoyaux 1 5 6 13,5 15 40

Atrazine

pH2AX 1 1 ,3 1 ,8 3,1 3,5 Tableau 4 : Détection du nombre de foci pH2AX et du nombre de micronoyaux 24h après la mise en contact des lignées cellulaires témoins du système nerveux Ha (cellules astrocytaires), Hah (cellules astrocytaires hippocampiques) et Hasp (cellules astrocytaires moelle épinière ) avec un composé métallique (AICI ₃ , Cu, CuCI ₂ , CuS0 ₄ , Pb(N0 ₃ ) ₂ , CdCI ₂ , 5 Cd-acétate ou du Cd-acetate-citrate) en fonction de la concentration dudit composé métallique employée

Les données expérimentales présentées dans le tableau 4 ci-dessus ont été utilisées pour déterminer la concentration de référence C _re f notamment pour du Pb(N0 ₃ ) ₂ (C _re f < 1 μΜ) et du CdCI ₂ (C _re f = 10 μΜ). Ces données ont été corrélées aux signes cliniques observés et présentés dans le tableau 5 ci-après, notamment pour du Pb(N0 ₃ )2 et du CdCI ₂ .

Tableau 5: Exemples numériques de correspondance entre l'échelle unique de toxicité

'invention et les signes cliniques correspondants

Où le critère GROUPE est défini comme suivant : GROUPE I = absence de signes cliniques GROUPE I I = présence de signes cliniques GROUPE I I I = effet létal