【발명의 명칭】

심장 -얼굴 -피부 증후군의 유도 -만능 줄기세포 모델 및 이의 용도 【기술분야】

본 발명은 심장 -얼굴 -피부 증후군 (cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드름)의 유도 -만능 줄기세포 ( induced pkiripotent stem cel ls ; iPS)모델,이의 제조 방법， 및 상기 iPS 모델을 이용하는 CFC 신드롬의 신경학적 _ᅩ 발달 분석에 이용하는 용도에 관한 것이다.

【배경기술]

심장一얼굴一피부 증후군 (cardiofaciocutaneous syndrome , CFC 신드름)은 심장기형, 특징적 얼굴형태 피부이상 및 발달지연이 동반되는 유전 질환으로, 심장기형으로는 폐동맥 판막 협착증， 심방 또는 심실 중격 결손， 비후성 심근병증 부정맥이 있을 수 있으며， 얼굴형태는 상대적 대두증， 전두부 돌출， 옅은 눈썹, 안구 돌출의 특징을 보이고， 피부의 이상으로 건조증， 과각화증， 어린선， 습진 및 성긴 두피의 증상을 나타낸다( Roberts A et al . J Med Genet (2006) 43:833-42 ; Armour CM and Al lanson JE. J Med Genet (2008) 45:249-54) . CFC증후군은 누난 (Noonan)증후군과 임상 양상이 유사하며，코스텔로 (Costel lo) 증후군 및 레오파드 (LEOPARD) 증후군과 함께 누난 -관련 질환으로 분류된다. 최근, 상기 누난 증후군 및 누난 -관련 증후군의 원인 유전자로, PTPN11 , HRAS, KRAS, BRAF, MEK1 및 MEK2올 포함하는 RAS-MAPK (mi togen-act ivated protein kinase) 신호 전달 경로의 유전자가 보고되었으며， 상기 유전자돌의 변이로 인해 성장인자의 자극을 통한 세포의 성장 및 분화에 관련된 증상이 나타나는 것이 보고되었다. 이와 같은 유전자의 변이를 통한 누난 증후군 및 누난 -관련 증후군의 감별 및 진단에 대한 연구가 보고되었으나 (Jorge M et al . Horm Res (2009) 71 : 185-93) , CFC 신드롬이 상기 유전자의 변이와 관련된 구체적인 원인 또는 치료 방법에 대하여는 알려진 바가 없다. 누난 증후군 및 누난 -관련 증후군을 이해하기 위해， 다양한 방향에서 연구가 진행되고 있다. 이에 따라, 누난 증후군， NF1 증후군 및 레오파드 증후군에서 RAS— MAPK 신호 전달 경로의 ERK 단백질이 인산화 (phosphoylation)되는 p-ERK의 수준이 증가 되는 것이 보고되었다 (T Nakamura et al. PNAS (2009) , 106： 36, 15436-15441； Yuan Wang et al. cell (2012) 150：4816-830； X Carvajal-Vergara et al. Nature (2010) 465， 808-812) . 그러나， 누난 증후군 및 누난 -관련 증후군에 대한 치료제로서 pᅳ ERK를 직접적으로 표적하는 약물을 사용하는 경우에는 신호전달 경로가 직접적으로 차단되므로， 세포의 증식 (proliferation) 또는 세포 분화 (di f f erent iat ion)에서 다양한 부작용이 발생할 수 있을 것으로 예상되고 있어, p-ERK를 간접적으로 억제하기 위한 약물의 스크리닝의 개발이 요구되고 있다. 줄기세포 (stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 배아， 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있을 수 있으며, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능한 자가증식능 및 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성인 다분화능을 가진 세포를 말한다. 줄기세포는 분화 자극 (환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며， 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산 (self-renewal)할 수 있어 증식 (proli ferat ion; expansion)하는 특성이 있으며， 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성 (plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPS)를 포함하는 인간 다능성 줄기세포 (Human pluripotent stem cells; hPSCs)는 다양한 특정 세포 종류로 분화할 수 있는 능력올 가져, iPS를 시험관 내의 분화 시스템을 사용하였을 때， 면역 거부반웅의 낮은 위험도와 같은 치료 가능성 (therapeutic potential)뿐만 아니라， 기관 형성 (organogenesis)의 초기 발달 동안에 복합적 질병의 메커니즘을 이해하는데 효과적인 평가자로 알려져 있다 Muotri, A. . (2009) Epilepsy Behav 14 Suppl 1: 81-85； Marchetto, M. C. ' B. Winner, et al .

(2010) Hum Mol Genet 19(R1): R71-76). 따라서， 본 발명자들은 CFC 신드롬을 연구하기 위한 줄기세포 모델을 ^' 확립하기 위해 노력한 결과， CFC 신드름 환자의 섬유아세포로부터 CFC 신드롬 유래의 유도 -만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPS)및， 배상체의 발생 및 분화를 유도하였으며 , 상기 CFC신드름 유래의 iPS및 배상체는 깨어진 배상체 형태를 나타내고， 신경세포로의 분화능을 나타내지 않는 것을 확인하였으며 , p-ERK및 p-SMADl억제제를 처리하여 CFC신드롬 유래의 배상체를 유도한 결과， 상기 배상체는 정상적인 배상체 형태를 나타내며， 신경세포로 효과적으로 분화하므로， 본 발명의 유도 -만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPS)를 이용한 CFC 신드롬의 세포 모델링 방법은 CFC 신드롬의 치료제 후보물질 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 심장 -얼굴 -피부 증후군 (cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드롬) 환자의 세포와 동일한 특성을 유지하는 새로운 유도 -만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPS)을 제공하여， 이를 심장 -얼굴 -피부 증후군의 신경 발달 및 치료제 후보물질 스크리닝 방법올 위한 연구에 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】 . 상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은

i) 시험관 내 (/ w ^' /^)에서 심장 -알굴 -피부 증후군 ( cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드롬) 환자로부터 분리된 섬유아세포 (fibroblast)를 유도 -만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem cells; iPS)로 유도하는 단계; 및

ii) 상기 단계 i)에서 유도된 iPS를 수득하는 단계를 포함하는， 시험관 내에서 심장 -얼굴 -피부 증후군 iPS모델의 제조 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 상기 방법으로 제조된 심장 -얼굴 -피부 증후군 iPS 모델을 제공한다.

또한， 본 발명은

i) 상기 iPS로부터 배상체 (embryoid body, EB) 또는 신경세포 (neuron)로 분화를 유도하는 단계 ; 및

ii) 상기 단계 i)에서 유도된 배상체 또는 신경세포에서 신경세포 분화 마커 발현 정도흩 분석하는 단계를 포함하는， iPS를 심장 -얼굴 -피부 증후군 모델로 사용하는 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은

i) 상기 iPS 모델， 또는 상기 iPS 모델로부터 분화된 배상체 또는 신경세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;

ii) 상기 단계 i)의 iPS모델, 배상체 또는 신경세포의 특성을 분석하는 단계; 및

iii) 상기 단계 Π)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는， 심장ᅳ얼굴 -피부 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된， 심장-얼굴—피부 증후군 iPS 모델와용도를 제공한다.

아울러， 본 발명은

0 상기 iPS로부터 배상체 (embryoid body, EB) 또는 신경세포 (neuron)로 분화를 유도하는 단계 ; 및

ii) 상기 단계 i)에서 유도된 배상체 또는 신경세포에서 신경세포 분화 마커 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는， iPS를 심장 -얼굴 -피부 증후군의 모델로 사용하는 용도를 제공한다. 【유리한 효과】

본 발명의 심장 -얼굴 -피부 중후군 (cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드름) 환자의 섬유아세포로부터 유래한 유도 -만능 줄기세포 (induced pluri otent stem cells; iPS)를 이용한 줄기 세포 모델은 깨어진 배상체 형택 및 신경계 세포로의 분화 여부를 효과적으로 확인할 수 있으므로， 상기 세포 모델은 심장 -얼굴 -피부 증후군의 신경 발달을 위한 분석 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 심장 -얼굴 -피부 증후군 (cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드름) 환자로부터 유래된 유도 -만능 줄기 세포 (induced pluri potent stem cells; iPS)에서 분화된 배상체 (embryonic body, EB)의 형태를 나타낸 도이다. 도 2는 CKHPS 유래의 배상체 (CFC-배상체)에서 PAX6, 0TX2 및 NCAD 유전자의 발현을 정상 대조군 (control)에 대한 상대적인 발현량 (relative expression)으로 나타낸 도이다.

도 3은 CFC— iPSC 유래의 신경세포 (CFO신경세포)에서 S0X2, NCAD 단백질 및 신경 로제트 (neural resette)의 발현을 면역형광염색을 통해 확인한 도이다.

도 4는 CFO신경세포에서 PAX6, S0X2 및 NCAD 단백질의 _ᅵ 발현을 웨스턴블럿 (western blotting)을 통해 확인한 도이다.

도 5는 CFC-배상체에서 p-SMADl, p-ERKl 및 p-ERK2 수준을 확인한 도이다.

도 6은 CFC-배상체에서 SMADl, ERK1및 ERK2의 인산화 정도를 상대적으로 비교하여 나타낸 도이다.

도 7은 p-ERK 억제제를 처리하여 분화된 CFC-배상체 (CFC2+U0126)에서 p-ERKl/2 및 p-SMADl의 수준 감소 효과를 확인한 도이다.

도 8은 p-SMADl을 감소하는 약물을 처리하여 분화된 CFC-배상체 (LDN 처리 CFC환자)의 형태를 확인한 도이다.

도 9는 p-SMADl을 감소하는 약물을 처리하여 분화된 CFC-배상체 (CFC2+LDN 및 CFC7+LDN)에서 PAX6' OTX2 및 NCAD유전자의 발현을 정상 대조군 (control) 및 무처리 대조군 (CFC2 및 CFC7)에 대한 상대적인 발현량 (relative expression)으로 나타낸 도이다.

도 10은 p-SMADl을 감소하는 약물을 처리하여 분화된 CFC-신경세포 (CFC 환자 + LDN)에서 S0X2, NCAD 단백질 및 신경 로제트 (neural resette)의 발현을 면역형광염색을 통해 확인한 도아다.

도 11은 p-SMADl을 감소하는 약물을 처리하여 분화된 CFC-신경세포에서 PAX6, S0X2 및 NCAD 단백질의 발현을 웨스턴블럿을 통해 확인한 도이다.

【발명의 실시를 위한 최선꾀 형태】

이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은

i) 시험관 내 (/? 에서 심장ᅳ얼굴 -피부 증후군 (cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드롬) 환자로부터 분리된 섬유아세포 (fibroblast)를 유도 -만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem cells; iPS)로 유도하는 단계; 및

ii) 상기 단계 i)에서 유도된 iPS를 수득하는 단계를 포함하는， 시험관 내에서 심장—얼굴 -피부 증후군 iPS 모델의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 심장-얼굴—피부 증후군의 iPSCs 모델을 제공한다.

상기 단계 i)의 유도는 0CT4ᅳ S0X2, KLF4 및 C-MYC를 포함하는 다분화능 마커 (pluripotent marker)의 이소성 발현 (ectopic expression)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 CFC 신드름 환자의 임상적인 증상 및 변이 유전자를 확인하였고 (표 1 참조)， 상기 환자의 섬유아세포로부터 ips(crc-ips)의 발생을 유도하였다.

따라서， 본 발명의 심장 -얼굴 -피부 증후군 iPS모델은 CFC신드름 환자의 세포와 동일한 특성을 유지하므로, 상기 iPSCs 모델의 제조 방법은 CFC 신드름의 신경 발달을 위한 분석 연구에 이용하는 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

또한， 본 발명은

0 상기 iPS로부터 배상체 (embryoid body, EB) 또는 신경세포 (neuron)로 분화를 유도하는 단계 ; 및

i i ) 상기 단계 i )에서 유도된 배상체 또는 신경세포에서 신경세포 분화 마커 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는, iPS를 심장 -얼굴 -피부 증후군 모델로 사용하는 방법올 제공한다.

상기 배상체는 하기 i ) 및 i i ) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다:

i ) 깨어진 배상체 형태; 및

i i ) PAX6, 0TX2 및 NCAI 포함하는 신경외배엽 (neuroectoderm) 마커 유전자 미발현.

상기 신경세포는 하기 i ) 및 i i ) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다:

i ) PAX6 , S0X2및 NCAD를 포함하는 신경세포 마커 단백질의 발현 감소; 및 i i ) 신경 로제트 (neural roset te) 형성 감소.

상기 유도는 자발적 (spontaneous)인 유도 또는 유도 물질의 첨가로 인한 직접적 (directed)인 유도 둘 중 어느 하나인 것이 바람직하며， 상기 유도 물질은 N2 또는 B27을 포함하는 신경 분화 촉진 물질인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 상기 유도 물질은 배지 내에서 5 내지 100 ng/ 인 것이 바람직하고, 구체적으로 10 내지 80 ng/n ^인 것이 더욱 바람직하며， 보다 구체적으로 20 ng/ 인 것이 가장 .바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에 있어서， 본 발명자들은 본 발명자들은 전분화능을 나타내도록 crc— ips로부터 배상체 (cFc-배상체) 분화를 유도한 결과, 분화 유도 개시 2 일후 CFC-배상체는 rr-배상체와 유사한 구 형태의 배상체를 형성하였으나， 유도 개시 4 일후에는 더 이상 구의 형태를 나타내지 않고 깨지는 형태를 나타내고 (도 1참조) , 신경외배엽 유전자인 PAX6,

0TX2및 AC Z¾¾ 7;V유전자의 발현이 WT-배상체와 비교하였을 때 현저하게 낮은 발현 양상을 나타내는 것을 확인하였다 (도 2 참조) .

또한， 본 발명자들은 CFC-배상체로부터 신경세포 (Neuron)로 분화를 유도하여 확인한 결과， CFC-신경세포에서 PAX6 , S0X2 및 NCAD의 발현이 현저하게 감소하며 (도 4 참조)， 신경 로제트 (neural roset te)의 형태가 나타나지 않아 (도 3 참조)， iPS의 초기 발생시 신경외배엽 분화의 이상으로 인해 CFC신드롬 환자에서 정신지체가 일어나는 것을 확인하였다.

또한， 본 발명자들은 CFC-iPS 및 배상체로부터 뉴런으로의 분화 효율을 증가하기 위해서 CFC-배상체를 분화하는 동안에 p-ER 의 억제제인 U0126 또는 p-SMADl를 감소하는 약물인 LDN193189을 처리한 결과， U0126 또는 LDN193189을 처리하지 않고 분화를 유도한 CFC-배상체에 비하여 p-ERK 및 p-SMADl이 감소하는 것을 확인하였고 (도 5 내지 도 7 참조) , U0126 또는 LDN193189를 처리하여 분화를 유도한 CFCᅳ배상체에서 깨지지 않은 정상의 배상체 형태를 나타내고 (도 8 참조) , LDN193189를 처리하여 분화를 유도한 CFC—신경세포에서 NCAD, PAX6 및 S0X2 마커의 유전자 및 단백질 발현 수준이 현저하게 증가하여 정상 대조군과 유사하게 회복되었으며 (도 9 및 도 11 참조)， 신경 로제트의 형성이 회복되는 것을 확인하였다 (도 10 찰조) .

따라서 본 발명의 CFC 신드톰 환자 유래의 iPSCs 모델은 CFC 신드름 환자에서 나타나는 깨어진 배상체 형태 및 신경계 세포로의 분화 여부를 효과적으로 확인할 수 있으므로， 상기 iPSCs 모델은 심장ᅳ얼굴 -피부 증후군의 신경 발달을 위한 분석 연구에 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 i) 상기 iPS 모델， 또는 상기 iPS 모델로부터 분화된 배상체 또는 신경세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;

ii) 상기 단계 i)의 iPS 모델， 배상체 또는 신경세 i의 특성을 분석하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 심장 -얼굴 -피부 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 i)의 iPS모델꾀 특성은 iPS모델의 배상체 또는 신경세포로의 분화능을 분석하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 iii)의 배상체의 특성은 하기 a)내지 c)중 어느 하나 이상인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다;

a) 정상 세포의 배상체 형태;

b) PAX6, OTX2및 으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 신경 외배엽 마커 유전자의 발현; 및

c) p-SMADl, p-ERKl 또는 p-ERK2 단백질의 인산화 수준 감소.

상기 단계 i)의 신경세포의 특성은 하기 a) 내지 c) 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다;

a) PAX6, 0TX2 및 NCAD으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 신경 외배엽 마커 단백질 발현;

b) p-SMADl, p-ERKl 및 p-ERK2 단백질의 인산화 수준 감소; 및

c) 신경 로제트의 형성.

또한, 본 발명은

i) 상기의 iPS 모델에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계:

ii) 상기 단계 i)의 iPS 모델로부터 배상체로 분화를 유도하는 단계: iii) 상기 단계 Π)의 유도된 배상체에서 하기 a) 내지 c) 중 어느 하나 이상을 분석하는 단계:

a) 배상체의 형태; b) 신경 외배엽 마커 유전자 발현; 및

c) p-SMADl , p-ERKl 또는 p-ERK2수준; 및

iv) 상기 단계 iii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는， 심장-얼굴—피부 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은

i) 상기 iPS모델로부터 배상체로 분화를 유도하는 단계:

ii) 상기 단계 i)의 유도된 배상체에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계:

iii) 상기 단계 ii)의 처리된 배상체에서 하기 a) 내지 c) 중 어느 하나 이상을 분석하는 단계 :

a) 배상체의 형태;

b) 신경 외배엽 마커 유전자 발현; 및

c) p-SMADl, p-ERKl또는 p-ERK2수준; 및

iv) 상기 단계 iii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는， 심장ᅳ얼굴 -피부 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 iv)의 비교는 무처리 대조군에 비해 깨어진 배상체 형태로부터 정상 세포의 형태로 회복 효과를 나타내는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

상기 신경 외배엽 마커 유전자는觸, 및 NCA 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 상기 단계 iv)의 비교는 무처리 대조군에 비해 상기 신경 외배엽 마커 유전자의 발현이 증가하는 효과를 나타내는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 iv)의 비교는 무처리 대조군에 비해 p-SMADl, p-ERKl 및

P-ERK2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인산화 수준 감소 효과를 ^■ 나타내는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것이 바람직하며， 구체적으로 p-SMADl의 인산화 수준 감소 효과를 나타내는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것이 보다 바람직하나， 이에 한정되지 않는다 .

본 발명의 CFC 신드름 환자의 섬유아세포로부터 유래한 유도 -만능 줄기세포를 이용한 줄기 세포 모델은 깨어진 배상체 형태 및 신경계 세포로의 분화 여부를 효과적으로 확인할 수 았으므로， 상기 세포 모델은 CFC 신드롬의 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은

i) 상기 iPS모델에 피혁 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계:

ii) 상기 단계 i)위 iPS모델로부터 신경세포로 분화를 유도하는 단계: iii) 상기 단계 ii)의 유도된 신경세포에서 하기 a) 내지 c) 중 어느 하나 이상을 분석하는 단계 :

a) 신경 외배엽 마커 단백질 발현;

b) p-SMADl , p-ERKl 및 p-ERK2수준; 및

c) 신경 로제트의 형성; 및

iv) 상기 단계 iii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는， 심장-얼굴-피부 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

아을러， 본 발명은

i) 상기 iPS모델로부터 신경세포로 분화를 유도하는 단계:

ii) 상기 단계 0의 유도된 신경세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계:

iii) 상기 단계 ii)의 처리된 신경세포에서 하기 a) 내지 c) 중 어느 하나 이상을 분석하는 단계 :

a) 신경 외배엽 마커 단백질 발현;

b) p-SMADl, p-ERKl 및 p-ERK2 수준; 및

c) 신경 로제트의 형성; 및

iv) 상기 단계 iii)의 분석한 결과를 무처리 대조군과 비교하는 단계를 포함하는， 심장ᅳ얼굴 -피부 증후군의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 신경 외배엽 마커 단백질는 PAX6, 0TX2 및 N 카데린 (N Cadher in, N CAD)인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 상기 단계 iv)의 비교는 무처리 대조군에 비해 상기 신경 외배엽 마커 단백질의 발현이 증가하는 효과를 나타내는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 iv)의 비교는 무처리 대조군에 비해 p— SMADl , p-ERKl 및 P-ERK2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인산화 수준 감소 효과를 나타내는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것이 바람직하며, 구체적으로 p-SMADl의 인산화 수준 감소 효과를 나타내는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 iv)꾀 비교는 무처리 대조군에 비해서 신경 로제트의 형성이 증가하는 효과를 나타내는 피검화합물 또는 조성물을 선별하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 CFC 신드름 환자의 섬유아세포로부터 유래한 유도 -만능 줄기세포를 이용한 줄기 세포 모델은 깨어진 배상체 형태 및 신경계 세포로의 분화 여부를 효과적으로 확인할 수 있으므로， 상기 세포 모델은 CFC 신드름의 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된， 심장 -얼굴 -피부 증후군 iPS 모델의 용도를 제공한다.

아울러, 본 발명은

i ) 상기 iPS로부터 배상체 (embryoid body, EB) 또는 신경세포 (neuron)로 분화를 유도하는 단계； 및

i i ) 상기 단계 i )에서 유도된 배상체 또는 신경세포에서 신경세포 분화 마커 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는， iPS를 심장 -얼굴 -피부 증후군의 모델로 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 CFC 신드롬 환자의 섬유아세포로부터 유래한 유도 -만능 줄기세포를 이용한 줄기 세포 모델은 깨어진 배상체 형태 및 신경계 세포로의 분화 여부를 효과적으로 확인할 수 있으므로， 상기 세포 모델은 CFC 신드름의 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 꾀해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 심장 -얼굴 -피부 증후군 (cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드름)의 임상적 증상및 원인 유전자변이의 확인

<1-1> CFC신드름환자의 임상적 증상의 확인

CFC신드롬 환자의 임상적인 증상을 확인하기 위하여， CFC신드름 환자를 선별하여 임상적 증상을 확인하였다.

구체적으로， 서울 아산병원 (Asan medi cal center , 한국)에서 CFC 신드름 환자 (C. J . Y)가 연결되었으며， 하기 [표 1]에서 나타난 바와 같은 CFC 신도롬의 대표적 증상이 나타나는 것을 확인하였다 (표 1) .

【표 1】

CFC 신드롬 환자의 임상적 증상 확인

<1-2> CFC신드롬환자의 원인 유전자변이 확인 CFC 신드름의 원인이 되는 유전자 변이를 확인하기 위하여, RAS-MAPK에 관여하면서 CFC 신드름 관련 유전자로 알려져 있는 BRAF 유전자의 서열을 CFC 신드름 환자의 섬유아세포 (fibroblast)로부터 확인하였다.

구체적으로, 병원의 임상연구 윤리 심의위원회의 심사를 통과한 후， 상기 실시예 <1-1>에서 선별한 CFC 환자로부터， 환자와 법적 대리인의 동의를 얻어 국소 마취 후 펀치 생검법 (punch biopsy method)으로 피부 조직 생검을 수행하여 CFC환자의 진피 (dermal)조직올 수득하였다. 그런 다음， 상기 수득한 진피 조직에서 섬유아세포를 분리하여 10%소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS; GIBC0 사， 미국)， 0.05 / H 아스코르브산 (ascorbic acid), 0.3 g/mi L-글루타민 (L-glutamin; GIBC0 사， 미국)， 3.7 mg/m^ 탄산수소나트륨 (sodium bicarbonate, NaHC0 ₃ ) 및 100 U/i 페니실린 (penici 11 in; GIBC0 사， 미국)을 포함하는 둘베코 변이된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eaglet medium, DMEM; GIBC0 사， 미국)에서 배양하였다. 배양 후， 세포 상층액 100 ^을 조직 배양 풀레이트 (tissuecultureplate)에 접종한 후， 5%이산화탄소 조건의 37 ^° C에서 3 시간 동안 유지한 다음， 배양 배지를 2 ml> 첨가한 후 1 주일 간 세포 배양하여 섬유아세포의 생존력 (viability) 및 증식 (proliferation)을 확인하였다. 그런 다음, 상기 수득한 섬유아세포로부터 유전체 DNA(genomic DNA, gDNA)를 추출하고， 정방향 프라이머 (BRAFᅳ F; 서열번호 1: 5'- ACAAGAGAGTAGATACGTCAGriTC-3') 및 역방향 프라이머 (BRAF_R; 서열번호 2: 5'-TGGTAGGTAG MGAGATATTTTTGG-3')를 사용하여 BRAF 유전자의 염기 서열을 확인하였다. 대조군으로는 인간 피부 섬유아세포 (CRL-2097; 미국 세포주 은행 (American Type Culture Collection; ATCC：)， 미국)를 상기와 동일한 방법을 수행하여 ^ 유전자의 염기 서열을 확인하였으며, 이를 야생형 (wild type; WT)으로 하여 CFC 환자의 유전자 서열과 비교하였다.

그 결과, CFC 환자의 유전자에서 c.770A>G 미스센스 (missense) 변이가 존재하여， 이로 인해 BRAF 단백질에서 Gln257Arg의 아미노산 변이가 나타나는 것을 확인하였다. ^{^} <실시예 2> CFC 환자 유래의 유도 -만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cel ls; iPS) 및 배상체 (embryoid body, EB)의 분화유도

<2-l> CFC환자로부터 iPS발생 유도

본 발명의 실시예를 수행하기 위하여, 다분화능 마커 (pluripotent marker)인 0CT4, S0X2, KLF4및 OMYC를 이용한 이소성 발현 (ectopi c expression) 방법 (Takahashi， K et al , Cel l 131(5)： 861-872, 2007)을 통해 CFC 환자의 섬유아세포 ( f ibroblast )로부터 CFC 유궤의 iPS CFOiPS)의 발생을 유도하였다. 구체적으로， 상기 실시예 <1-2>에서 수득한 CFC 환자의 섬유아세포 (CFC-섬유아세포)로부터 0CT4, S0X2, KLF4및 C-MYC를 이용한 이소성 발현 방법으로 CFOiPS의 발생올 유도하였다.

<2-2> CFC-iPS로부터 배상체 분화유도

시험관 내 ( / ? 에서 CFC-iPS의 전분화능 (pi ur i potency)를 확인하기 위하여， CFC-iPS로부터 배상체 (EB)를 형성하도록 분화를 유도하였다. 구체적으로， 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 발생을 유도한

CFC-iPS의 집락 (colony)를 맥클래인 조직 절편기 (McClain t issue chopper )를 사용하여 4 등분하였다. 상기 4 등분한 CFC-iPS는 초-저 부착 배지 (ul tra-low attachment dish)에 뿌려 10% 혈청 대체물 (serum replacement , SR)을 포함하는 DMED/F12배지인 배상체 분화 배지 (embryo i d body di f ferent i at i on media) 5 m£에 재 -현탁하고, 4 일간 현탁 배양하여 CFC-iPS 유래의 배상체 (CFCᅳ배상체)로 분화를 유도하였다. 유도 개시 후 2 및 4 일에 CFC-배상체를 수득하여 위상차 현미경으로 세포의 형태를 확인하였다. 정상 대조군으로 WT-iPS를 상기와 동일한 방법으로 배양하여 WT-iPS 유래의 배상체 (WT-배상체)로 분화를 유도하였다.

그 결과， 도 1에서 나타난 바와 같이 분화 유도 개시 2 일후

CFC-배상체는 WT-배상체와 유사한 구 형태의 배상체를 형성하였으나， 유도 개시 4 일후에는 더 이상 구의 형태를 나타내지 않고 깨지는 형태를 나타내는 것을 확인하여 (도 1)， 이를 통해 CFC-iPS가 CFC-배상체를 형성하는 분화 과정에서 손상되는 것을 확인하였다.

<2-3> CFC-배상체의 분화능 확인

CFC-배상체의 분화능을 확인하기 위하여， CFC-iPS에서 신경외배엽 (ectoderm) 유전자인 PAX6, 0TX2 및 NCADHERINNCAD) mRNA의 전사 수준을 확인하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <2-2〉와 동일한 방법을 수행하여 CFCᅳ배상체로 분화를 유도하였다. 상기 유도 4일 후에 CFC-배상체를 수득하여， 트리졸 (TRIzol; Invitrogen, 미국)에 현탁하고 제조사의 프로토콜에 따라 CFC-배상체의 전체 RNA를 추출하였다.그런 다음，상기 추출한 RNA l/g을 M-MLV 역전사 합성효소 (M_MLV reverse transcriptase; Enzynomics, 미국)를 하기 [표 1]에 나타난 프라이머를 사용하여 ¾ (？， 0TX2 및 AC ^의 제 1 가닥 cDNA(first-strand cDNA)를 각각 합성하였다. 그런 다음, 하기 [표 1]에 나타난 프라이머를 사용하여 iCycler iQ5 실시간 검출 시스템 (iCycler iQ5 real-time detection system; Bio-Rad laboratories, 口 1국)으로 실시간 -PCR(realᅳ t ime PCR)을 수행하여 , CFC-iPS에서 PAX6, 0TX2 및 NCAD 유전자 각각의 상대적인 발현량을 확인하였다. 발현 수준을 보정하기 위한 대조군으로 유전자를 상기와 동일한 방법을 수행하여 발현량을 확인하였으며 , PAX6, 0TX2 및 NCAD 유전자 각각의 ᅀ Ct값은 GAPDH및 각각의 유전자의 Ct값의 차이로 계산하였다. 정상 대조군으로는 인간 피부 섬유아세포로부터 상기와 동일한 방법을 수행하여 야생형 -iPS(WT-iPS)의 발생을 유도한 후， PAX6, 및 v 4 ^유전자의 발현량을 확인하고，이를 CFC-iPS의 / /<5， 6> 및 v 9유전자의 발현량과 각각 비교하여 하기 [수학식 1]로 계산되는 발현 배수 (fold change)로 표현하였다.

【표 2】

본 발명에서 사용한 프라이머의 서열 PAX6 PAX6—F 5 ' -TGGGCGCAGACGGGATGTAT-3 ' 서열번호 3

PAX 5 ' -CGTAGGTTGCCCTGGCACCG-3 ' 서열번호 4 ·

NCAD NCAD_F 5 ' -GATATGCTTCAACACGCTTT-3 ' 서열번호 5

NCAD_R 5 ' -CCMGATAATAAAATCGCTCCAT-3 ' 서열번호 6

0TX2 0TX2_F 5 ' -ATGCGAGAGGAGGAGGTGGCACT-3 ' 서열번호 7

0TX2_R 5 ' -GTTG TGCTGTTGTTGGCGG-3 ' 서열번호 8

【수학식 1]

발현 배수 _{= 2} "(S ACt ^ᅵ CACt)

SACt : CFC— iPS에서 각각의 유전자의 ACt 값; 및

CACt : WT-iPS에서 각각의 유전자의 ACt 값.

그 결과， 도 2에서 나타난 바와 같이 CFC-배상체에서 PAX6 , 0TX2및 NCAD 유전자의 발현이 WT-배상체와 비교하였을 때 현저하게 낮은 발현 양상을 나타내는 것을 확인하였다 (도 2) .

<실시예 3> crc-유래의 신경세포 분화 확인

<3-1> CFC-배상체로부터 신경세포 (neuron)로의 분화유도

CFC-배상체가 분화능을 나타내지 않는 것을 구체적으로 확인하기 위하여， CFC-배상체를 신경세포쪽으로 분화도록 유도하여 S0X2 및 N CADHEIN(N CAD) 단백질의 세포 내 발현을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-2>과 동일한 방법을 수행하여 CFC-배상체로 분화를 4 일간 유도하고， 상기 CFC-배상체에 신경분화촉진물질인 N2 및 B27 첨가제를 포함하는 DMEM/F12인 신경 분화 배지 (neuronal di f ferent iat ion media)를 첨가한 매트리겔 TM이 코팅된 디쉬에 상기 CFC-배상체를 5 일간 부착 배양하여，총 9일간 배양하여 CFC- i PS로부터 분화된 신경세포 ( CFC-신경세포)를 수득하였다. 그런 다음， 상기 수득한 CFC-신경세포에 4% 포름알데히드 ( formaldehyde)를 처리하여 실은에서 30분간 고정하고， 0. 1%트윈 20(Tween 20)을 포함하는 PBS(PBST)로 3 회 세척한 후， 0. 1% 트리톤 X-100(tr i ton X-100)을 처리하여 세포막에 투과성 (Permeabi 1 i ty)를 부여하였다. 처리 후， 상기 처리한 세포를 PBST로 3 회 세척하고， 3% 소 특이적 알부민 (bovine specific albumin)을 첨가하여 1 시간 동안 상온에서 차단 (Mocking)한 다음， 1차 항체로 항 -N-CADHERIN 마우스 항체 (and— N— CADHERIN mouse antibody; cell signaling Technologies ^λ \, 미국) 및 항 -S0X2토끼 항체 ( ant i -S0X2 rabbit anti body； BD Tr ansduc t i on Labor at ories 미국)를 처리하여 4°C에서 밤새 배양하고 PBST로 세척하였다. 세척 후， 알렉사 플루오르 488(Alexa Fluor 488) 또는 알렉사 플루오르 594(Alexa Fluor 594)가 결합된 2차 항체 (Invitrogen, 미국)를 처리하여 1 시간 동안 배양하여 CFOiPS를 면역형광염색하였다. 그런 다음， 발현의 정도를 대조하기 위해 4'6-디아미디노 -2-페닐인돌 (4'6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)을 처리하여 세포의 핵을 염색하여, 형광 현미경 (fluorescence microscope; olympus, 일본) 또는 자이스 LSM 510 공초점 현미경 (Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하여 S0X2 및 NCAD단백질의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 NCAD의 발현이 S0X2에 둘러싸여 장미꽃의 형태를 나타내는 신경 로제트 (neural rosette)와 형태가 야생형-신경세포에서 나타나는 반면， CFC-신경세포에서는 S0X2 및 NCAD의 발현이 현저하게 감소하여 상기 신경 로제트의 형태가 나타나지 않는 것을 확인하였다 (도 3). <3-2> CFC-신경세포의 신경세포 마커 단백질의 발현량 비교

CFC-신경세포에서 신경세포 마커 단백질의 발현이 감소하는 것을 전체적으로 확인하기 위하여， CFC-신경세포에서 PAX6, S0X2 및 NCAD의 발현을 웨스턴블럿 (western blot)을 수행하여 확인하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 수득한 CFC-신경세포를 수독하여， 100 jg/n 라이소좀 ( lysome) , 10 g/ i 아프로티닌 (aprotinin) 및 10 ug/ml 류펩틴 (Leupeptin)를 포함하는 EBC 완충용액 (50 mM트리스 -염산 pH 8.0, 300 mM NaCl 및 0.5%NP40; 시그마-알드리치 사， 미국)에 상기 세포를 재—현탁 (re-suspension)하였다. 상기 재-현탁한 세포는 얼음 위에서 1 초 동안 3 내지 5회 초음파로 파쇄한 후， 4°C및 16， 100 Xg에서 5 분간 원심 분리하여 세포의 단백질을 포함하는 상층액을 수득하고， 상기 단백질의 농도를 브레드-포드 분석 (brad-ford assay)로 확인하였다. 그런 다음， 각각의 세포로부터 수득한 상층액을 25% 글리세롤 (glycerol), 2%도데실 황산 나트륨 (sodium dodecyl sulfate, SDS), 14.4 mM -머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol) 및 0.1% 브로모페놀 블루 (bromophenol blue)를 포함하는 60 mM 트리스ᅳ염산 완충용액 (Tris-HCl buffer; pH 6.8)로 희석하여 2 내지 3 분간 가열하였다. 상기 가열한 단백질은 100 kDa 이하 및 이상의 분자량을 나타내는 단백질을 분리하기 위하여 10¾ 및 0 SDS-PAGE gel에서 각각 분리하고, 니트로셀를로오즈 막 (nitrocellulose membrane)으로 이동하여 4¾스킴 밀크 (skim milk) 또는 5%소혈청알부민 (bovine serum alburai, BSA)로 차단하였다. 차단 후， 상기 막에 1차 항체로 항 PAX6 마우스 항체 (Millipore사)， 항— S0X2토끼 항체 (Cell signaling Technologies사， 미국)， 또는 항 -N-카데린 마우스 항체 (anti-N-CADHERIN. mouse antibody; BD Transduction Laboratories, 미국)를 각각 처리하여 4°C에서 밤새 배양하고， TBST로 세척하여， 염소 (goat)로부터 유래한 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 항—토끼 IgG (H+L) 2차 항체 (Goat ant i -Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate; Thermo scientific사, 미국)를 2차 항체로 하여 4%스킴밀크를 포함하는 TBST와 함께 막에 처리하여 한 시간 동안 배양하여 웨스턴블럿 (western blot)을 수행하였다.

그 결과， 도 4에서 나타난 바와 같이 야생형 -신경세포에 비해, CFC-신경세포에서 PAX6, S0X2 및 NCAD의 발현이 현저하게 감소하여 (도 4), iPS의 초기 발생시 신경외배엽 분화의 이상으로 인해 CFC 신드름 환자에서 정신지체가 일어나는 것을 확인하였다.

<실시예 4> CFC-iPS및 배상체로부터 신경세포로의 분화효율증가유도

<4-1> CFC-iPS및 배상체의 p-SMADl발현 수준의 확인

CFC-iPS및 배상체로부터 뉴런으로와분화 효율을 증가하기 위해서， 정상 iPS 및 배상체에서 뉴런으로의 분화를 방해하는 것으로 보고된 바 있는 SMAD1 및 SMAD2의 인산화 (phosphorylation)수준을 확인하였다 (Stuart M Chambers et. al, Nature Biotechnology 27， 275ᅳ 280 (2009)).

구체적으로， 상기 실시예 <2— 2>과 동일한 방법을 수행하여 분화한 CFC-배상체를 수득하여， 상기 실시예 <3— 2>와 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 수행하여 CFO배상체에서 SMADl, p-SMADl, ERKl, p-ERKl, ERK2 및 p-ERK2의 발현을확인하였다.상기 웨스턴블럿을 위하여， 1차 항체로 토끼 유래 항 -Smadl 항체 (제품번호: #9743S; Cell signaling 사, 미국)， 토끼 유래 항 -p-smadl/5(S463/465)항체 (제품번호: #951 IS; Cell signaling사， 미국)ᅳ 토끼 유래 p44/42 MAPK(ERK) 항체 (제품번호: #9102; Cell signaling사， 미국) 또는 토끼 유래 p-p44/42 MAPK(T202/Y204)(p-ERK) 항체 (제품번호: #4370S; Cell signaling 사， 미국)을 사용하였고， 2차 항체로 염소 (goat)로부터 유래한 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 항 -토끼 IgG (H+L) 2차 항체 (Goat ant i -Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate； Thermo scientific사，미국)를 사용하였다.상기 확인한 SMADl, p-SMADl, ERKl, p-ERKl, ERK2 및 p-ERK2와 발현의 발현량은 픽셀 강도 (intensity)를 측정하는 프로그램인 이미지 J(ImageJ)를 이용하여 밴드의 강도를 수치화한 뒤， 그 값을 비교해 p-SMADl/SMADl, p-ERKl/ERKl, p-ERK2/ERK2로 계산하여， SMADl, ERK1 및 ERK2의 인산화 정도를 정상 대조군과 비교하였다.

그 결과， 도 5 및 도 6에서 나타난 바와 같이 CFC 환자 유래의 배상체에서 p-SMADl, p-ERKl 및 p-ERK2의 수준이 증가하는 것을 확인하였다 (도 5 및 도 6).

<4-2> CFC-배상체의 분화시 p-ERK억제에 따른 p-SMADl수준의 변화 확인 CFO배상체에서 증가된 p-SMADl의 수준이 p-ERK와 연관되었는지 확인하기 위하여, 배상체 분화 동안에 p-ERK의 억제제인 U0126을 첨가하였다. 구체적으로 5 μΜ

1， 4-디아미노 -2， 3-디시아노 -1 ,4-비스 (2-아미노페닐티올)부타디엔 ( 1， 4-diamino- 2 , 3-d i cy ano- 1 , 4-b i s ( 2-am i nopheny 11 h i o ) but ad i ene , U0126) , 100 nM 6-(4-(2- (피페리딘 -1-일)에록시 )페닐 )-3- (피리딘 -4-일)피라졸로 [ 1， 5-a]피리미 ¾ (6-(4-(2-(piperidin-l-yl )ethoxy)phenyl ) ^~ 3-(pyr idin-4-yl )pyrazolo[l ,5-a] pyr imidine , LDN193189) 및 10% SR을 포함하는 DMED/F12에서， 상기 실시예 <2— 2>과 동일한 방법을 수행하여 CFC-배상체의 분화를 유도하였다. 그런 다음， 상기 실시예 <3-2>와 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 수행하여 CFC-배상체에서 SMAD1 , p-SMADl , ERK1 , p-ERKl , ERK2 및 p-ERK2의 발현을 확인하였다.

그 결과， 도 7에서 나타난 바와 같이 U0126 또는 LDN193189를 처리하지 않： [L 분화를 유도한 CFC-배상체에 비하여 , U0126 또는 LDN193189를 처리하여 분화를 유도한 CFC-배상체에서 p-ERK의 수준이 감소하였고， 이에 따라 P-SMAD1의 수준도 감소하는 것을 확인하였다 (도 7) .

<실시예 5> p-SMADl 억제에 따른 CFC신드름 환자의 치료 효과확인

<5-1> CFC-배상체의 분화시 p-SMADl 억쎄에 따른 CFC-배상체 형태 확인 p— ERK와 연관된 p-SMAI)l올 억제하였을 때 CFC 신드름 환자에서 나타나는 증상의 완화 효과를 확인하기 위하여， CFC-배상체 분화시에 p-SMADl를 감소하는 약물인 LDN193189를 처리하였다.

구체적으로， 100 nM LDN193189 및 10% SR을 포함하는 DMED/F12에서， 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법올 수행하여 CFC-배상체의 분화를 유도하였다. 유도 개시 후 4 일에 CFC-배상체 * 수득하여 위상차 현미경으로 배상체의 형태를 확인하였다. 정상 대조군으로 -iPS를 상기와 동일한 방법으로 배양하여 WTᅳ iPS 유래의 배상체 (WT-배상체)로 분화를 유도하였다.

그 결과， 도 8에서 나타난 바와 같이 LDN193189를 처리하지 않고 분화를 유도한 CFC-배상체에 비하여， LDN193189를 처리하여 분화를 유도한 CFC-배상체 (LDN-CFC-배상체)의 형태가 깨지지 않고 정상적인 구의 형태를 유지하는 것을 확인하였다 (도 8) .

<5-2> p-SMADl 억제에 따른 CFC-배상체의 분화능 확인 p-SMADl을 억제하였을 때 CFC-배상체의 분화능이 회복되는 것을 확인하기 위하여， LDN-CFC-배상체에서 신경외배엽 (ectoderm) 유전자인 PAX6 , 0TX2 및 NCADHERIN mRNA의 전사 수준을 확인하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 LDN-CFC-배상체를 수득하여， 상기 실시예 <2ᅳ3>과 동일한 방법을 수행하여 상기 LDN-CFC-배상체에서 PAX6 , 0TX2및 NCADHERIN유전자 각각의 상대적인 발현량을 확인하였다.

그 결과， 도 9에서 나타난 바와 같이 정상 대조군과 비교하였을 때，

LDN193189를 처라하지 않고 분화를 유도한 CFC-배상체에서는 PAX6 , 0TX2 및 NCADHERIN 유전자의 발현 양상이 현저하게 감소한 반면， LDN-CFC-배상체에서는 PAX6 및 0TX2 유전자의 발현이 현저하게 증가하여 정상 대조군과 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인하였다 (도 9) .

<5-3> p-SMADl 억제에 따른 CFC-배상체로부터 신경세포로의 분화유도 p-SMADl을 억제하였을 때 CFC-배상체가 신경세포로 분화되는 것을 확인하기 위하여， LDN-CFC-배상체를 신경세포로 분화하여 신경 로제트의 형성을 확인하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법을 수행하여 LDN-CFC-배상체로 분화를 유도하고, 상기 LDN-CFC-배상체를 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법을 수행하여 신경세포로 분화하여 LDN— CFCᅳ배상체로부터 분화된 신경세포 (LDN-CFC-신경세포)를 수득하였다. 그런 다음， 상기 실시예 <3-1> 와 동일한 방법으로 면역형광염색하여 S0X2 및 NCAD 단백질의 발현을 확인하였고， 상기 실시예 <3-2>와 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 수행하여 NCAD, PAX6 및 S0X2 단백질 마커의 발현을 확인하였다.

그 결과， 도 10 및 도 11에서 나타난 바와 같이 정상 대조군과 비교하였을 때， LDN193189를 처리하지 않고 분화를 유도한 CFC-신경세포에서는 신경 로제트가 형성되지 않은 반면， LDN-CFC-신경세포에서는 신경 로제트의 형성이 회복되는 것을 확인하였으며 (도 10)， NCAD , PAX6및 S0X2단백질의 발현 수준이 현저하게 증가하여 정상 대조군과 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인하였다 (도 11) .