CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece al campo de la biotecnología, específicamente a la biotecnología molecular ya que se refiere a una secuencia de ADN que pertenece al promotor Inducidle del gen OGPDH3, aquí denominado promotor CrGPDH3, aislado de la microalga verde Chlamydomonas rainhardtü útil para la regulación de la expresión génica y la expresión controlada de proteínas recombinantes en mlcroalgas y otros organismos fotosintéticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El mercado de las proteínas recombinantes asciende a 100 mil millones de dólares anuales (Walsh, 2010). En el 2012, el mercado de las proteínas recombinantes se cotizó en aproximadamente $63.6 mil millones de dólares, solamente en Estados Unidos, con una tasa de crecimiento de 18.3% con respecto al año 2011 (Aggarwal 2014), concluyendo que la demanda de estos productos irá en aumento en los próximos años. Actualmente las proteínas recombinantes forman parte de nuestra vida diaria y se han convertido en productos imprescindibles en diversos sectores de la industria, como el farmacéutico, el alimenticio, el energético y el textil, siendo los sistemas convencionales de expresión de proteínas recombinantes los cultivos de bacterias (Rosano y Ceccarelli 2014), levaduras (Celik y Calik 2012), células de insecto (Drugmand at al. 2012) y células de mamífero (Bandaranayake y Almo 2014). Por su parte, los cultivos de células vegetales y plantas transgénicas también están siendo utilizados para la producción de proteínas recombinantes debido a que ofrecen ventajas como mayor facilidad de cultivo y manejo, menores costos y tiempo de producción, y menor riesgo de contaminación con virus y pilones (Sack et al. 2015). El mercado de proteínas recombinantes va en crecimiento (Sánchez-Garda e# al. 2016) y se necesita explorar diversos sistemas de producción para cubrir la demanda de producto y que este producto pueda generarse de manera segura y económica. En este sentido, el cultivo de microalgas verdes ofrece ventajas adicionales, ya que puede brindar mayores rendimientos en menor tiempo y costos de producción más bajos, cultivos a gran escala y amigables con el ambiente, además de ser generalmente consideradas como organismos seguros (GRAS por las siglas en inglés de‘generally regarded as safe') (Corchero et al. 2013). Las microalgas forman parte de un diverso grupo de microorganismos fbtosintéticos y juegan un papel importante en la fijación del carbono y evolución del oxígeno. Estos organismos han llamado la atención por sus aplicaciones biotecnológicas e industriales (Specht et al., 2010). La microalga verde unicelular Chtamydomonas reinhardtii es un organismo que ha sido utilizado como modelo de estudio para el entendimiento de procesos biológicos tales como el metabolismo de ácidos grasos y el metabolismo del hidrógeno, fototaxis, ciclo arcediano, biología del cloroplasto, entre otros (Scranton et al., 2015). El cultivo de C. reinhardtii ha sido considerado un sistema atractivo para la producción de proteínas recombinantes debido a su cultivo fácil, su tasa de crecimiento rápido, factibilidad de manipulación génica (los genomas del núcleo, cloroplasto y mitocondria han sido completamente secuendados), además de ser considerado un microorganismo inocuo (GRAS) y tener gran capacidad de acumular biomasa (Ramos-Martínez et al., 2017). En términos de costo de producción de proteínas recombinantes, en el caso de la producción de la prote i na recombinante de la leche bovina amiloide A (MAA) en el cloroplasto de C. reinhardtii el costo de producción podría abatirse considerablemente con respecto al precio de venta del calostro bovino comercial (Gimpel et al., 2014), esto permite reconocer a los cultivos en microalgas como una excelente alternativa para la producción de proteínas recombinantes con una relación costo/beneficio satisfactoria con respecto a otros sistemas de expresión.

Actualmente, en C. reinhardtii, existe el interés de transformar su núcleo con el fin de expresar proteínas recombinantes, debido a que de esta forma se cuenta con la maquinaria para dar dirección de péptido serial, secreción de proteínas y para hacer procesos post- traduccionales complejos como en el caso de la glucosilación (dado que más del 70% de las proteínas terapéuticas son glucosiladas) (Scranton et al., 2015). Sin embargo, expresar proteínas recombinantes en el núcleo de C. reinhardtii ha sido más difícil que expresarlas en el cloroplasto, presentando baja acumulación de estas así como efectos de silenciamiento génico. Un punto clave para mejorar la expresión de proteínas en el núcleo de C. reinhardtii es la búsqueda de promotores que conduzcan una alta expresión génica sin ocasionar efectos tóxicos a la célula. En este sentido, C. reinhardtii cuenta con un sistema de expresión que contiene un promotor constitutivo ( HSP70A/RBCS2 ) disponible en el mercado y distribuido por la empresa Thermo Fisher ScientificP, empleado principalmente con fines de investigación. Asimismo, son pocos los promotores inducidles que se han estudiado y hasta donde se sabe no existe en el mercado un promotor ¡ndutible que conduzca una alta expresión de proteínas en el núcleo de esta microalga.

Una ventaja del uso de promotores inducibles para conducir la expresión de proteínas recombinantes en el núcleo de C. reinhardtii, es la posibilidad de controlar su expresión temporal evitando posibles efectos negativos en el metabolismo que afecten la multiplicación celular y la acumulación de biomasa y por tanto de la proteína recombinante.

Con respecto al estado del arte, los promotores inducidles que se han estudiado en esta microalga han sido muy pocos. Por ejemplo: NIT1 (Ohresser et al., 1997), el cual es un promotor inducido por la deficiencia de amoniaco en el medio de cultivo (TAP). Si bien, el amoniaco es un inductor que en cantidades pequeñas no es tóxico para la célula, presenta la desventaja de que se requieren de 24 horas para ser inducido y sus niveles de expresión son menores a lo observado en ei gen endógeno.

El promotor CA1 es inducido por bajas concentraciones de CO2, sin embargo sus inconvenientes son que los niveles de expresión de proteína máximos son alcanzados después de 48 horas de inducción y la cuantifi catión de la proteína reportera fue baja con respecto a su control (Villand et al., 1997). Para el caso del promotor FEA1 indudble por privación de hierro en el medio (TAP), reportado por Alien et al., 2007, aunque los niveles de expresión que se obtuvieron con este promotor fueron prometedores se requirieron de 96 horas de inducción para obtener estos niveles, lo cual en términos de tiempo y producción es significativamente limitante. El promotor HSP70A es inducido por choque térmico a una temperatura de 40°C por una hora (Schroda et al., 2000). Sin embargo, esta secuencia reguladora no conduce una alta expresión en genes de interés pos si sola, puesto que necesita la fusión de la secuenda del promotor basal del gen RBCS2 (el cual es constitutivo) para conseguir una alta expresión.

El promotor CYC6 reportado por Ferrante et al., 2008 y descrito en la patente

US20110033938 (A1), es inducido por la presencia de níquel y ausencia de cobre en el medio, observándose la desventaja de que la expresión condudda por este promotor es baja y altas concentraciones de éstos metales causa toxicidad sobre el crecimiento de C. reinhardtii, además de que el NiCh como inductor es de alto costo y su manejo puede ser muy tóxico para el ser humano.

El promotor LHCBM9 recientemente evaluado por Sawyer et al., 2016, es una secuenda promotora inducida por privación de sulfates en el medio (TAP), con la limitante de que se requieren 48 de Inducción. La evaluadón de este promotor no es conduyente debido a que hasta el momento sus niveles de expresión bajo inducción solo han sido comparados con la cepa silvestre de Chlamydomonas reinhardtii y no con otros promotores.

El promotor LIP (Park et al., 2013; Baek et al., 2016), es una secuencia indudble por luz (solicitud de patente US 2015/0147782 A1) y ha presentado una mayor expresión comparada con el promotor comercial HSP70A/RBCS2 pero que presenta el inconveniente de que necesita una regulación especial para cambiar la intensidad de luz que requiere para ser indudble. El promotor HSP90B fue identificado recientemente pero aún se está estudiando su potencial aplicación como promotor indudble por choque térmico (Traewachiwiphak et al.

2018).

Sin embargo y debido a las desventajas que cada uno de esto» promotores presenta, ninguno de ellos se encuentra en el mercado como un promotor nuclear inducible capaz de conducir una alta expresión de proteínas recombinantes en C. reinhardtii que presente tasas de producción atractivas para la industria.

Por su parte, la enzima Glicerol-3-fosfato deshidrogenase (GPDH) está involucrada en la síntesis de glicerol y el metabolismo de los llpidos en levaduras y cataliza la conversión de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y NADH (Dinudeótldo de nicotinamida y adenina en su forma reducida) a glicerol-3-fosfato (G-3-P) y NAD+ (Dinucleótido de nicotinamida y adenina en su forma oxidada). A su vez, el G-3-P es utilizado en la célula como substrato para obtener gllcerol, o ser usado como precursor para desencadenar la ruta de los triacilglicóridos (TAGs) (Gancedo et al. 1968; Goshal et al. 2002; Vigeolas et al. 2007). Se han encontrado genes que codifican para enzimas GPDH en las m icroa Igas de agua salina

Dunaliella salina y Dunalliela virídis y se ha estudiado la relación entre la expresión de estos genes y la biosíntesis de glicerol en estas microalgas (He et al. 2007; 2009; Cai et al. 2013; Chen et al. 2011).

Con respecto a la microalga verde de agua dulce Chlamydomonas reinhardtil, se sabe que posee un mecanismo de defensa contra el estrés osmótico que consiste en la acumulación y excreción de glicerol, y se ha observado esta respuesta ante estrés osmótico por exposición a sales como NaCI y KCI (Husic y Tolbert 1986). En un estudio previo en nuestro laboratorio (Herrera-Valencia etal., 2012), se identificaron y caracterizaron en C. reinhardtii tres genes homólogos a genes que codifican para la enzima GPDH: CrGPDM, CrGPDH2 y CrGPDH3, todas estas secuencias mostraron una similitud significativa con los genes GPDH de la microalga Dunaliella salina y Dunaliella virídis. Usando un programa de predicción de péptidos señal, se encontró que únicamente CrGPDH2 y CrGPDH3 contienen en su extremo N-terminal un póptido señal de tránsito al cloroplasto, por lo que muy posiblemente correspondan a GPDHs con localización en este organelo. Con respecto a CrGPDHI, se sugiere que codifica para una proteína con localización citosólica. Mediante un análisis de RT-PCR se observó que la expresión de CrGPDH2 y CrGPDH3 era muy baja, tanto que para el CrGPDH3 es apenas detectable por etoctrofbresis en un gel de agarosa, pero que podía ser inducida con un tratamiento de 200 mM de NaCI por dos horas

(Herrera-Valencia et al. 2012). De ahí que surgió el interés de investigar el potencial del promotor de CrGPDH3 para conducir la expresión de genes recombinantes de manera indudble. En un estudio posterior realizado en nuestro laboratorio (Casais-Molina et al.,

2016), se hizo la caracterización funcional de CrGPDH2 y CrGPDH3 y se demostró que estos genes codifican para enzimas con actividad de GPDH y se sugirió que están involucrados en osmorregulación puesto que se observó que la expresión de estos genes puede ser inducida en un rango de tratamiento que va de 5 mM hasta 200 mM de NaCI y a un tiempo de exposición que va de 5 hasta los 120 minutos. Estos resultados, sugirieron que CrGPDH2 y CrGPDHS podrían estar involucrados en la acumulación de glicerol y TAGs en respuesta a condiciones de estrés osmótico y que estos juegan un papel importante para la supervivencia de C. reinhardtii bajo estas condiciones.

Ya se han mencionado las ventajas que presenta el contar con un promotor nuclear indudble que conduzca una alta expresión de proteínas de interés biotecn ológico en la microalga verde C. reinhardtii, pero además es deseable que el inductor de este promotor sea fácil de obtener, fácil de aplicar, de precio económico y que pueda ser usado en concentraciones bajas para evitar afectar al metabolismo celular. Es deseable que este promotor pueda ser usado para dirigir la expresión génica de manera controlada en microalgas verdes como la microalga verde C. reinhardtii y en otras microalgas, incluso en otras células vegetales. Los genes cuya expresión sea dirigida por este promotor pueden ser genes de importancia en investigación científica básica, para evaluar la función de genes en determinados fenómenos, rutas metabólicas o fenotipos por ejemplo, así como también genes de importancia biotecn ológica cuyas proteínas tengan aplicaciones en medicina humana o medidna veterinaria tales como vacunas, anticuerpos y otras proteínas terapéuticas y de diagnóstico, pero también otras proteínas de uso en alimentación humana y animal, tales como enzimas, o induso proteínas ricas en aminoáddos esenciales. En el estado del arte es conocido el uso del promotor viral constitutivo CaMV del virus del mosaico de la coliflor que ha sido utilizado exitosamente en células vegetales y microalgas

(Kumar et a/. 2004).

Con base en estos antecedentes, se realizó el estudio de la región promotora del gen

CrGPDH3 obteniendo el promotor que se describe en la presente invendón, el cual presenta con respedo a los promotores descritos anteriormente la ventaja de que es un promotor nuclear, regulado por indutíores fádles de obtener, de aplicar, de baja toxicidad y de bajo costo como el NaCI y otros que se describen en la presente invención. El promotor aquí descrito comprende tanto al promotor mínimo como a la región que confiere la indudbilidad, de igual manera se describe su capacidad para conducir la expresión de una proteína recombinante de manera indudble en organismos fotosintéticos, la cual por ejemplo, es significativamente mayor a la reportada para el promotor comercial

HSP70A/RBCS2.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invendón tiene como objeto proporcionar nuevas secuendas de nudeótidos y métodos para la reguladón de la expresión génica en organismos fotosintéticos. Las nuevas secuencias de nudeótidos corresponden al promotor inducidle del gen de la glicerol-3-fosfato deshidrogenase (CrGPDH3) aislado de la microalga verde

Chlamydomonas reinharútii (promotor CrGPDH3). Otro objeto de la presente invendón es proporcionar secuencias de nudeótidos funcionales comprendidas dentro de la secuencia del promotor indudble de CrGPDHS, las cuales son capaces de dirigir la expresión de una secuencia de nudeótidos unida operativamente a estas secuendas en células huésped.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una secuencia de nudeótidos que corresponde a un promotor mínimo, la cual tiene la capacidad de dirigir la expresión de una secuencia de nudeótidos unida operativamente a esta secuenda en células huésped.

Aún más otro objeto de la presente invendón consiste en proporcionar secuendas de nudeótidos que corresponde a la región que confiere la indudblidad al promotor CrGPDH3 las cuales pueden ser unidas operativamente al promotor que atañe la presente invendón o a otros promotores confiriéndoles la capacidad de dirigir la expresión indudble de una secuencia de nudeótidos unida operativamente a estas secuencias en células huésped.

Adicionalmente, otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar secuencias que permitan la elaboración de construcciones de ADN útiles para la reguladón de la expresión génica, que comprenden alguna de las siguientes secuencias: a) por la secuencia del promotor CrGPDH3, b) por la secuenda que corresponde al promotor mínimo de CrGPDH3, c) por alguna de las secuencias de nudeótidos que comprenden a la región que confiere indudbilidad unida operativamente al promotor mínimo de CrGPDH3, d) por alguna de las secuencias de nudeótidos de la región que confiere indudbilidad unida operativamente a un promotor heterólogo. Todas ellas capaces de dirigir la expresión indudble de un gen heterólogo en células de organismos fot osintéticos. Las realizaciones de la invención induyen vectores de expresión y células fotosintéticas que tienen incorporado en su genoma alguna de estas construcdones de manera estable.

Otro objeto consiste en proporcionar un método para expresar de manera selectiva y controlada una secuenda de nudeótidos en células fotosintéticas mediante la transformación nuclear de la célula con cualquiera de las construcdones de ADN descritas en la presente invendón y una secuencia de nudeótidos heteróloga de interés unida operativamente a la respectiva construcción (promotor), y en la cual dicho promotor inida la transcripción de manera ¡ndudble de dicha secuencia de nudeótidos en la célula mediante el uso de un Inductor. Este método es útil para la expresión de genes heterólogos con fines de investigación básica o con fines biotecnológicos como por ejemplo la producción de proteínas recombinantes en células huésped de organismos fotosintéticos. Aún más, otro objeto de la inventión es proporcionar las secuendas nudeotídicas correspondientes a los cebadores que permiten la identificación, el aislamiento y la donación del promotor CrGPDHS y las secuendas funcionales que de él se derivan.

Por último, otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para la producción de proteínas recombinantes en organismos fotosintéticos, cuya producción puede ser inducida por medios de fácil control, baja toxicidad y costo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra un esquema del promotor CrGPDH3 que corresponde al fragmento de

3012 pb denominado PromA, asi como a las secuendas fundonales que lo conforman.

Estas secuencias incluyen al promotor mínimo PromC con un tamafio de 938 pb; asi como a las secuencias que induyen la región de inducibilldad RIA1 con un tamafio de 1055 pb y

RIA3 con un tamafio de 577 pb. Asimismo se esquematizan las fusiones que permiten obtener a los promotores quiméricos RIA1/PromC y RIA3/PromC. En la figura se denota la ubicación y el tamafio del 5’UTR (+1 a +285), así como la ubicación en codón de inicio de la traducdón (+1). La figura 2 muestra la secuencia del promotor CrGPDH3 y algunos elementos en c/s putativos, mostrados en negritas, que fueron identificados con el programa Plantease y

PfantPAN. El sitio de inicio de la transcripción está denotado con +1 y el codón de Inicio de la traducción (ATG) está encerrado en un cuadro. La caja TATA (TATA-box) es un elemento perteneciente al promotor basal en el que se controlan los niveles de transcripción basal.

La caja CAAT (CATT-box) es un elemento encontrado comúnmente en promotores eucariotes y en regiones potenciadoras. Otros elementos de respuesta putativos están señalados con sus nombres correspondientes.

La figura 3 muestra un mapa del vector de transformación para C. reinhardtii (pSP124S) que contiene la construcción de expresión en la cual se insertaron las diferentes regiones del promotor CrGPDH3 evaluadas. Las regiones insertadas se indican con la flecha en la que el Promotor CrGPDH3 ( CrGPDH3 Prometer +5'UTR ) o alguna de las secuencias de nucleótidos comprendidas en el promotor o sus fusiones descritas en la presente invendón.

GUSPIus se refiere a la secuencia de nucleótidos del gen reportero que codifica para la enzima glucuronidasa, mientras que 3’UTR RBCS2 se refiere a la región 3‘ no tradudble del gen RBCS2 de C. reinhardtii. ble se refiere a que el plásmido contiene un gen de resistencia a espectinomidna que permite la selección de clonas de C. reinhardtii que han sido transformadas. Los sitios (te restricción están señalados con los nombres de las enzimas a las que corresponden: EcoRI, Sa/nHI, Nofi y Sad.

La figura 4 ¡lustra las delaciones progresivas que se hicieron al promotor CrGPDH3 con la finalidad de elucidar el promotor mínimo. Las deleciones son identificadas como PromA

(3012 pb, +285 a -2727), PromB (1979 pb, +285 a -1694), PromC (938 pb, +285 a -653), y

PromD (585 pb, +285 a -300). La flecha indica el sitio de ¡nido de la región 5 ^' UTR no tradudble del promotor (+285), el gen reportero GUSPIus y el terminador RBCS2.

La figura 5 muestra la imagen de un gel de agarosa con los resultados de la evaluadón de la expresión mediante la técnica de RT-PCR del gen GUSPIus en C. reinhardtii conducida por diferentes longitudes del promotor CrGPDH3: PromA, PromB, PromC y PromD. Los tratamientos con 0 y 100 mM de NaCI se aplicaron a los 7 dias de cultivo por dos horas.

En la imagen se muestra el amplicón esperado de 180 bp para GUSPIus. WT= Cepa silvestre; SP= vector de transformación pSP124S sin la construcdón de expresión; M= Marcador de peso molecular. También se muestra la expresión del gen CrGPDH3 nativo como control de que los tratamientos de NaCI fueron correctos, y la expresión del gen CrActin como control de que no hubo contaminación por ADN genómico en las muestras evaluadas.

La figura 6 ¡lustra las fusiones de diferentes regiones del promotor CrGPDH3 con el promotor mínimo (PromC). Los fragmentos RIA1 (-2727 a -1672), RIA2 (-2172 a -1672), RIA3 (-2727 a -2150) y RIA4 (-2400 a -1900) fueron amplificados usando cebadores específicos con el sitio de restricción EcoRV en el extremo 5‘ y EcoRI en el extremo 3’.

Para obtener las diferentes fusiones a evaluar, después de la digestión con estas enzimas los productos fueron ligados al vector pSP124S río arriba del promotor mínimo PromC,

GUSPIus y RBCS2. Cada construcción de expresión fue clonada en el vector de transformación y a cada plásmido se le denominó de acuerdo a la construcción contenida, por ejemplo pRIA1/PromC.

La figura 7 muestra una imagen del gel de agarosa con los resultados de la evaluación mediante RT-PCR de la expresión del gen GUSPIus conducida por las diferentes fusiones del promotor CrGPDH3 (RIA/PromC, RIA2/PromC, RIA3/promC, RIA4/PromC) en comparación con el promotor mínimo PromC. Los tratamientos de 0 y 100 mM de NaCI se aplicaron a los 7 dias de cultivo por dos horas. WT= Cepa silvestre; SP= vector vacío pSP124S; M= Marcador de peso molecular. También se muestra la expresión del gen nativo CrGPDH3 como control de que los tratamientos de NaCI fueron correctos, y la expresión del gen CrActin como control de que no hubo contaminación por ADN genómico en las muestras evaluadas.

La figura 8 muestra la imagen de una radiografía con el resultado del análisis por Southern blot de líneas transgénicas de C. minhardtíi transformadas con construcciones de expresión que contienen al gen GUSPIus siendo conducido ya sea por el promotor PromA, el promotor quimérico RIA3/PromC, y el promotor mínimo PromC. Se usó una sonda específica (fragmento de secuencia marcada) para detectar el gen GUSPIus. WT= Cepa silvestre; SP= vector vacío pSP124S; C+= DMA del plásmido de PromA (testigo positivo). Con este resultado se puede ver que se cuenta con tres lineas transgénicas diferentes: 1 ,

2 y 3 para cada promotor a evaluar (carriles), y cada línea tiene un número diferente de copias del gen insertado en su genoma, lo que se ve como bandas en cada carril, y que va de al menos una a cinco copias del gen. La figura 9 muestra el resultado del análisis cuantitativo de la actividad de la enzima glucuronidasa (GUS) en tres líneas transgénicas (1 , 2 y 3) de C. reinhardtü transformadas con las diferentes construcciones de expresión que contienen al gen GUSPIus conducido por las secuencias o fusiones del promotor CrGPDH3 evaluadas: PromA, RIA3/PromC y

PromC. HSP70A/RBCS2 corresponde a 3 líneas transgénicas (1 a 3) de C. reinhardtü transformadas con plásmidos que llevan construcciones de expresión que contienen al gen GUSPIus conducido por el promotor constitutivo HSP70A/RBCS2. Los tratamientos de 0 y 100 mM de NaCI por dos horas se aplicaron a los 7 días de cultivo y se realizó la medición de la actividad mediante un ensayo fluorimétrico. Cada valor es la media ± desviación estándar (n= 3). Letras diferentes indican diferencias significativas entre las medias (ANOVA de una vía, LSD de Fisher, P < 0.05).

La Figura 10 muestra los resultados de inducibilidad por diferentes inductores de la fusión

RIA3IPmmC con diferentes tratamientos a distintas concentraciones. Los tratamientos de

5 mM de NaCI y 100 mM de KCI se aplicaron a los 7 dias de cultivo por dos horas, a) Muestra un gel de agarosa donde se observa la expresión del gen reportero GUSPIus conducido por la fusión RIA3fPromC, asi como la expresión del gen nativo CrGPDH3 como control de que los tratamientos fueron correctos y el gen constitutivo CrActin como control de que no hubo contaminación por ADN genómico en las muestras evaluadas. TAP=Sin tratamiento; M= Marcador de peso molecular, b) Muestra el resultado del análisis cuantitativo de la actividad de la enzima glucuronidasa (GUS) conducida por la fusión R!A3/PromC. La medición de la actividad fue mediante un ensayo fluorimétrico. Cada valor es la media ± desviación estándar (n= 3). Letras diferentes indican diferencias significativas entre las medias (ANOVA de una vía, LSD de Fisher, P < 0.05). TAP=Sin tratamiento. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un promotor nuclear ¡ndudble aislado de la microalga verde de agua dulce Chlamydomonas rainhardtü (promotor CrGPDH3 ), el cual originalmente se encuentra conduciendo la expresión del gen CrGPDH3 que codifica para la enzima gliceroi 3-fosfato deshidrogenasa; este promotor representa una alternativa para la regulación de la expresión génica en organismos fotosintéticos, como por ejemplo las microalgas verdes como C. reinhardtii. La secuencia entera del promotor CrGPDH3 incluye la secuencia de la región 5’ no traducible (5 ^* UTR) del gen CrGPDH3 y es detallada en SEQ

ID NO: 1. Además, la presente invención incluye secuencias de nucleótidos que tienen al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: 1 ( PromA ) y que tienen la capacidad de dirigir la expresión inducidle de una secuencia de nucleótidos unida operativamente. De igual manera incluye un promotor mínimo ( PromC , SEQ. ID. NO: 2) y una región de indudbilidad que se encuentra tanto en la secuencia RIA1 (SEQ. ID. NO: 3), como en la secuencia RIA3

(SEQ. ID. NO: 4), con las que se pueden generar construcciones que mantienen su funcionalidad cuando alguna de estas secuencias es unida operativamente a un promotor, tal como sucede con la SEQ. ID. NO. 5 ( RIAIlPmmQ y con la SEQ. ID. NO: 6

(RIA3IPiOmC). Por tanto, la presente invención incluye secuencias de nucleótidos que tienen al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: 2, y con la SEQ ID NO: 4.

Obtención de secuencias para la regulación de la expresión génica La identificación y aislamiento de la secuencia de la región promotora del gen CrGPDH3 se realizó in silico basándose en los datos generados acerca de la clonación del gen CrGPDH3 (Herrera-Valencia et al. 2012; Casais-Molina at al. 2016) como se describe en el ejemplo 1.

Posteriormente se preparó un vector de expresión que contenía al gen reportero GUSPIus, tal como se describe en el ejemplo 2, en el cual se clonaron todos los fragmentos producto de los análisis de deledón del promotor CrGPDH3, y que sirvió como vector de transformación por biobalistica para la transformación de la microalga C. reinhardtii como se describe en el ejemplo 3. Una vez obtenidos cultivos de C. reinhardtii putativamente transformados, se realizaron los correspondientes análisis de expresión del gen reportero

GUSPIus mediante RT-PCR como se describe en el ejemplo 4. Teniendo identificada la secuencia promotora putativa del gen CrGPDH3, se amplificó partiendo de ADN genómico de C. reinhardtii mediante ollgonudeótidos cebadores específicos (disertados particularmente para este propósito), cuyas secuencias están descritas en el cuadro 1 y corresponden a la SEQ. ID. NO: 7 y SEQ. ID. NO: 8. Una vez amplificado éste se donó en un plásmido y se secuendó para verificar su integridad como se describe en el ejemplo 5.

El aislamiento, amplificatión, clonadón en vector de multiplicadón, secuenciadón y clonación en un vector de transformatión de las secuendas correspondientes al promotor

CrGPDH3, promotor mínimo y regiones de indudbilidad se realiza empleando el método que comprende los pasos siguientes: a) Extracdón de áddo nudeicos de C. reindhardtii.

b) Amplificadón mediante PCR usando ollgonudeótidos cebadores específicos de conformidad con el Cuadro 1.

c) Inserción del amplicón en un vector mediante una enzima de ligación y multiplicadón del plásmido resultante en cultivos de bacterias.

d) Extracdón y purificación del plásmido.

e) Secuenciadón y corrfirmadón de la integridad de la secuenda.

f) Clonadón de la secuenda en un plásmido de transformadón apropiado.

Cuadro 1. Secuendas de los ollgonudeótidos cebadores específicos empleados para amplificar la secuendas comes pendientes a la presente invendón.

En los ejemplos 5 y 7 se describe la obtención de las construcciones de expresión en pGR para el análisis de deledón que permitió la identificación tanto del promotor mínimo como de la región de inducibilidad mediante RT-PCR. El promotor CrGPDH3 ( PromA , SEQ. ID NO: 1) comprende un promotor mínimo identificado como SEQ. ID NO: 2, y una región que confiere inducibilidad al promotor, comprendida en cualquiera de las secuencias Identificadas como SEQ ID NO: 3 o SEQ. ID.

NO: 4 (Figura 1). La presente invención incluye una fusión de SEQ. ID NO: 2 con SEQ. ID

NO: 3 o SEQ. ID NO: 4, las cuales son capaces de conducir la expresión inducidle de una secuencia de nucleótidos que ha sido unida operativamente a éstas en una célula huésped y que en este documento se identifican cano SEQ. ID. NO: 5 y SEQ. ID. NO: 6 respectivamente.

La SEQ. ID NO: 2 correspondiente al promota mínimo se puerto emplear de manera individual ya que tiene la capacidad de dirigir la expresión de una secuencia de nudeótidos unida operativamente, de manera constitutiva, como se describe en el ejemplo 6. Este promotor mínimo puede utilizarse para conducir la expresión de genes de interés en organismos fotosintéticos como C. rmnhardtii, con diversos propósitos que incluyen, pero no se limitan, a modular la expresión génica para observar un fenotipo determinado, alterar una ruta metabólica, producir una proteína recombinante de interés en investigación científica o con importancia en la industria biotecnológica.

Cualquiera de fas SEQ ID NO: 3 y SEQ. ID. NO: 4, correspondientes a la región de inducibilidad, se pueden emplear unidas operativamente a un promotor, ya sea el promotor mínimo de la presente invención (SEQ. ID NO: 2) (ejemplo 8) o a algún otro promota heterólogo para conferirte inducibilidad y aumentar sus niveles de expresión con diversos· propósitos que incluyen, pero no se limitan, a modular la expresión génica para observar un fenotipo determinado, alterar una ruta metabólica, producir una proteína recombinante de interés en investigación científica o con importancia en la industria biotecnológica.

La SEQ ID NO: 5 y la SEQ. ID. NO: 6, correspondientes al promotor mínimo (SEQ ID NO: 2) fusionado respectivamente a la región de inducibilidad SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 se puede emplear para dirigir la expresión de una secuencia de nudeótidos unida operativamente, para conferirle inducibilidad y con altos niveles de expresión, con diversos propósitos que induyen pao no se limitan a modular la expresión génica para observar un fenotipo determinado, alterar una ruta metabólica, producir una proteína recombinante de interés en investigación científica o con importancia en la industria biotecnológica. Cabe señalar que las SEQ ID NO: 5 (1999 pb) y SEQ ID NO: 6 (1521 pb) fueron fusionadas añadiéndole a cada una de las secuencias a fusionarse la secuencia del sitio de restricción correspondiente a la enzima EooRI (podiendo haber sido alguna otra enzima de restricción apropiada), por lo que cada fusión contiene en su interior la secuencia GAATTC en el sitio de unión del promotor quimérico.

Cada una de las secuencias y construcciones descritas anteriormente fueron identificadas y diseñadas mediante una estrategia de donación de las secuendas correspondientes al promotor CrGPDH3, utilizando enzimas de restricción. En una primera etapa se identificó el promotor mínimo tal y como se describe en los ejemplos 5 y 6, en una segunda etapa se identificaron las regiones de inducibilidad las cuales se probaron elaborando construcciones con el promotor mínimo (ejemplos 7 y 8). La presente invención comprende aquellas diferentes modalidades o fusiones para obtener promotores quiméricos que incluyan alguna de las secuencias aqui descritas.

Además, se comparó el desempeño del promotor CrGPDH3 {PromA), el promotor quimérico ( RIA3IPmmC ), y el promotor mínimo (PromC) con respecto al promotor comercial constitutivo HSP70A/RBCS2 mediante un ensayo cuantitativo de la adividad de la proteína reportera GUSPIus (ejemplos 9 y 10), resultando que PromA y RIA3/PmmC muestran un mejor desempeño que el promotor HSP70A/RBCS2, un promotor ampliamente usado y de alto valor comercial, lo que apoya el uso de los promotores descritos en la presente invendón para la producción de proteínas recombinantes con fines de investigación básica así como su uso en la industria de producción de proteínas recombinantes de interés socioeconómico.

Finalmente, el promotor quimérico RIA3fPromC es capaz de conducir la expresión del gen reportero GUSPIus de manera similar al promotor nativo en condiciones de 5 mM de NaCI o 100 mM de KCI, y cuando se evalúa la actividad de la proteína GUSPIus de estas mismas muestras, se observa que los niveles son similares a cuando se usa 100 mM de NaCI (ejemplo 11). Lo anterior indica la versatilidad del promotor y la ventaja económica que su uso puede representar, ya que se usa como tratamiento una sal de bajo costo a una concentración de apenas 5 mM para un desempeño apropiado y deseable.

Una vez que la cepa de C. rainhardtii o cualquier otro organismo fotosintético que se encuentre transformado con una de las construcciones que contienen al promotor de CrGPOH3 o alguna de las secuencias correspondientes a la presente invención, esta cepa puede ser utilizada para producir, extraer y purificar la protelna recombinante de interés. En el caso de una cepa transformada de C. reinhardtii ésta se puede mantener por alrededor de dos meses en platos de Petri en medio TAP sólido a 25 ± 2 °C en un ciclo de fotoperiodo de 16/8 h luz/oscuridad, o en viales con medio TAP sólido a 16 °C por hasta seis meses. Para obtener la protelna recombinante de interés, se transfiere una pequeña porción del cultivo (por ejemplo: una colonia) de la cepa de interés del medio sólido a 50 mL de medio TAP liquido en un matraz de 200 mL. Una vez que el cultivo alcanza el final de la fase exponencial de crecimiento, la cual puede ser transcurridos siete días en las condiciones de cultivo básales, a 25 ± 2 °C en un ciclo de fotoperiodo de 16/8 h luz/oscuridad, se agrega el inductor, que puede ser una sal inorgánica, preferentemente a una concentración menor a 200 mM, por citar un ejemplo, se puede usar NaCI en un rango de concentración (como ejemplo pero no limitativo) que puede ir de 5 a 200 mM, o bien usando KCI a una concentración por ejemplo, pero no limitativa, de 100 mM como se describe en el ejemplo 11. A partir de por ejemplo dos horas de cultivo en estas condiciones ya se puede detectar la actividad de la proteína de interés y por tanto su acumulación en la cepa antes mencionada. A partir de este cultivo es posible extraer y purificar la protelna de interés de acuerdo a protocolos ya bren conocidos en la literatura. También se puede optar por hacer el escalamiento del cultivo, para lo cual una vez que el cultivo haya alcanzado el final de la fase exponencial de crecimiento, la cual puede ser transcurridos siete días en las condiciones de cultivo básales, a 25 ± 2 ^e C en un ciclo de fotoperfodo de

16/8 h luz/oscuridad, éste se inocularla en un volumen cada vez mayor, y dependiendo del contenedor o biorreactor, o forma de cultivo, puede llegar a ser de por ejemplo, pero no limitativamente, hasta los 100 000 L.

El proceso general para llevar a cabo la producción de proteínas recombinantes en un sistema que emplee el promotor o las secuencias objeto de la presente invención consiste en las etapas de: a) Introducir alguna de las secuencias o construcciones descritas en la presente invención en un organismo adecuado para la expresión de proteínas recombinantes.

b) Cultivar el organismo en condiciones óptimas para su multiplicación.

c) Inducir la producción de proteínas mediante la adición de un inductor, el cual se selecciona de las sales inorgánicas como NaCI y KCI, en concentraciones menores a 200 mM.

d) Extraer la proteína del medio de cultivo.

e) Purificar la proteína.

EJEMPLOS

Ej mplo 1. Selección y aislamiento de una secuencia putativa de la región promotora del gen CiGPDH3.

Con la finalidad de seleccionar una secuencia putativa de la región promotora del gen

&GPDH3, se eligió una región de 3012 pb rio arriba del codón de inicio de la traducción (ATG) del gen CiGPDH3 como región promotora putativa, la cual incluye una secuencia de

2727 pb río arriba del sitio de inicio de la transcripción (+1) y la región 5’ no traducible (5’

UTR) (+285 pb) de OGPDH3 (Casais-Molina et al. 2016). A esta secuencia se le llamó

PromA (Fig.1) que contiene los 3012 pb y corresponde a la SEQ ID NO. 1. PromA se amplificó mediante PCR usando los oligonucleótidos cebadores descritos en el cuadro 1, mediante los cuales se les añadieron en sus extremos los sitios de restricción EcoRly BamHI, se clonaron en el vector pGEM-T Easy y se confirmó la integridad de las secuencias donadas mediante secuendadón. Todas las secuendas fueron editadas usando el programa Lasergene versión 7.2 (DNA-STAR). La secuenda PromA fue analizada usando los programas de bases de datos PLANTCARE y PlantPAN para la identifi catión de elementos de respuesta en cis putativos (Fig.2). La secuenda PromA aislada en este apartado se utilizó para los análisis de delación que se realizaron posteriormente.

Ejemplo 2. Preparación del vector para donar las construcciones de expresión.

Para preparar el vector que se usó para insertar cada construcdón de expresión y transformar las microalgas, se siguió el siguiente procedimiento. Primeramente, la secuencia codificante del gen reportero GUSPIus™ ( GUSPIus ) se amplificó mediante PCR del pCAMBIA 1305.1 (Cambia) usando otigonudeótidos específicos, denominados GusplusORF F [5’ ACT GGATCCAACAAT GGT AG AT CT GAGGGTAAATTT C 3'] y GusplusORF R [5‘ TGCGCGGCCGCTCACACGTGATGGTGATGGTGATG 3’j. mediante los cuales se les añadió en sus extremos los sitios de restricdón EcoRI y BamHI, se donaron en el vedor pGEM-T Easy y se confirmó la integridad de las secuendas donadas mediante secuendadón. Posteriormente, esta secuenda fue clonada en pSP124S

(Lumbreras et al. 1998) obtenido del Chlamydomonas Resource Center, y ahora a este nuevo plásmido se le llamó pG. La región 3' no traducible (3* UTR) del gen RBCS2 se usó como terminador y fue obtenido del pHsp70A/RbcS2-cEpo (Heitzer y Zschoemig 2007,

Chlamydomonas Resource Center) mediante una estrategia de enzimas de restricdón usando las enzimas Notl y Sacl y ligado rio abajo de GUSPIus en pG, generando de esta forma el vedor de expresión denominado pGR (Fig. 3).

Ejemplo 3. Transformación de C. reinhardtii mediante biobalísica.

La transformación nuclear de C. reinhardtii se realizó mediante bioballstica (bombardeo de micropartículas). Las células de C. reinhardtii se cultivaron en 50 mi de TAP hasta alcanzar el final de la fase ejq»nendal, fueron colectadas por centrifugación y 4 * 10 ⁷ células fueron plaqueadas en platos de Petri con 25 mL de medio TAP sólido. Los reactivos y micropartículas fueron preparadas como se ha descrito por Daniell et al. (2005) usando 10 mg de DMA plasmídico y 0.5 mg de micropartículas de oro de 0.6 mg (Bio-Rad). Para el bombardeo se utilizó una cámara de biobalística PDS-1000/He (Bio-Rad) usando los parámetros de bombardeo para algas y los ajustes especificados por el proveedor. Después del bombardeo, las células fueron almacenadas en la obscuridad por 24 h, después de lo cual fueron colectadas y transferidas a medio TAP sólido fresco suplementario con 25 mg de zeoclna (Invitrogen, USA) como agente de selección. Las colonias resistentes a zeocina, y por tanto putativamente transformadas, comenzaron a aparecer después de 7 a 10 días. Ejemplo 4. Análisis de expresión del gen reportero GUSPIus mediante RT-PCR.

Con el fin de identificar al promotor mínimo, y la región de inducibilidad del promotor

CrGPDH3, se realizó una estrategia que incluyó el análisis de la expresión del gen reportero

GUSPIus mediante la técnica de RT-PCR. Los experimentos se realizaron de la siguiente forma: se seleccionaron al azar nueve colonias resistentes a zeocina procedentes del bombardeo, y por tanto putativamente transformadas; cada colonia fue cultivada por separado en 3 mL de medio TAP por siete días, después de lo cual aproximadamente 50 pL de cada cultivo se transfirieron por separado a medio TAP sólido y se almacenaron para posteriores usos. El resto de los cultivos se mezclaron y homogeneizaron en un solo matraz

Erienmeyer y luego se dividieron en cantidades iguales en dos matraces. Cada matraz recibió un tratamiento diferente. Por ejemplo, un matraz recibió en tratamiento de 100 mM de NaCI por 2 h mientras el otro recibió agua destilada como testigo.

Para el análisis que permitió determinar la inducción del promotor CrGPDH3 con diferentes inductores, los experimentos se realizaron de la siguiente forma: se inocularon 10,000 células/mL en diferentes matraces y fueron cultivadas hasta el final de la frise exponencial, entonces un matraz recibió el tratamiento de 5 mM de NaCI y otro el de 100 mM de KCI por

2 h, mientras que otro matraz recibió agua destilada como control. Las células fueron colectadas por centrifugación, congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a - 80°C hasta su uso. El RNA total se extrajo como se describe en Herrera-Valenda et al. (2012).

La expresión de GUSPIus se evaluó mediante RT-PCR. La primera cadena de cDNA se sintetizó usando 8 mg de RNA total y 200 U de transcriptasa reverse SuperScript II (Invitrogen, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para los análisis de PCR se usaron 200 pM de cada dNTP, 0.2 pM de cada oligonudeótido cebador (GusPlus159 F [5’

ACGTGGAGATTCCGAATGTC 3 ] y GusPlus159 R [5' TGTTGATGAGGAACTTGCCG 31),

5 mL de cada dilución de cDNA (1 :5), 1.5 pM de MgCla, 1 X de amortiguador de PCR y 1 U de Taq DMA polimerasa (Invitrogen) en un volumen final de 50 mL. La PCR se realizó con las condiciones de cidaje siguientes: 95 °C por 3 min, y entonces 40 cidos de 95 °C por 30 s, 68 °C por 60 s, y 72 °C por 1 min, en un termoddador C1000 (BioRad). La expresión del gen nativo de CrGPDHS se usó como testigo positivo para el tratamiento de NaCI, como se describe en Herrera-Valenda et al. (2012). El gen CrGPDH3 nativo se usó como testigo para indicar que se usaron cantidades similares de RNA como plantillas y el gen constitutivo CrActin como testigo de que no hubo contaminación por DMA genómico, como se describe en Herrera-Valenda (2012).

Ejemplo 6. Obtención de las construcciones de expresión en pGR para el análisis de deledón que permitió la confirmación de la fundonalidad del promotor CrGPDH3 y la identificadón del promotor mínimo mediante RT-PCR. Con el objetivo de identificar la región que contiene al promotor mínimo y evaluar su indutibilidad, se generaron deteciones seriales a partir de PromA (SEQ ID NO. 1 ), siendo estas denominadas PromB (-1694 a +285), PromC (-653 a +285) y PromD (-300 a +285)

(Fig. 4). Todos los fragmentos fueron amplificados mediante PCR utilizando oligonucteótidos específicos para cada uno (Cuadro 2), integrándoles los sitios de restricción EcoRV y EcoRI en los extremos 5’ y 3‘ respectivamente. Finalmente, los productos de la amplificación fueron donados al vector p-GEM-T-Easy (Promega) y la identidad de las secuendas fue verificada por secuenciadón (Macrogene Corp.). Posteriormente, cada fragmento fue clonado en el vector de expresión pGR, río arriba del gen reportero GUSPIus, obteniendo de esta forma plásmidos con las respectivas construcciones de expresión (Fig. 4).

Cuadro 2. Secuencias de los oligonudeótidos cebadores que se utilizaron para el análisis de detedón que permitió la confirmación de la funcionalidad del promotor CrGPDH3 y la identificadón del promotor mínimo mediante RT-PCR.

Ejemplo 6. Análisis de deledón para la confirmadón de la fondonalidad del promotor

CrGPDH3 y la identificación del promotor mínimo mediante RT-PCR. Con el fin de evaluar cuál o cuáles de los fragmentos descritos en el ejemplo 5 (Fig.4) era capaz de conducir la expresión del gen reportero GUSPIus de manera inducibte, se obtuvieron varios cultivos bombardeados mediante blobalística con los plásmidos que contenían las respectivas construcciones de expresión descritas en el ejemplo 5 y que contenían los diferentes fragmentos del promotor CrGPDH3: PromA, PromB, PromC, PromD (Fig.4). Se seleccionaron al azar nueve colonias resistentes a zeodna procedentes del bombardeo, y por tanto putativamente transformadas, y se realizó el análisis que permitió la identificación del promotor mínimo, de acuerdo a lo descrito en el ejemplo 4.

Como se puede observar en la Figura 5, el resultado de este análisis nos permitió determinar que la secuencia que seleccionamos como promotor putativo de CrGPDH3, PromA, fue capaz de conducir la expresión del gen reportero GUSPIus de manera similar al promotor nativo, bajo tratamiento de 100 mM de NaCI, mientras que no se observó amplicón (banda) alguno en el tratamiento sin NaCI. Por otra parte, el fragmento de PromB no dio resultado positivo. Estos resultados también permitieron identificar a PromC como el promotor mínimo de CrGPDH3, ya que fue el fragmento más corto en el que aún se observó una expresión constitutiva del gen reportero GUSPIus, aunque se observó cualitativamente un nivel mucho menor de expresión comparado con PromA, así como una ligera Inducción en el tratamiento de 100 Mm de NaCI. Por otra parte, PromD no dio resultado positivo (Fig. 5). Finalmente, todos estos resultados sugirieron que la región de inducibilidad debía encontrarse río arriba de PromB, en una región entre -2727 y -1694 (Fig. 4).

Ejemplo 7. Obtención de las construcciones de expresión en pGR para el análisis de deleción que permitió la identificación de la región de inducibilidad mediante RT-PCR.

Con el objeto de mapear la región que contiene los elementos que le confieren la inducibilidad al promotor CrGPDH3, se amplificaron una serie de fragmentos a partir de la secuencia de PromA: RIA1 (-2727 a -1672), RIA2 (-2172 a -1672), RIA3 (-2727 a -2150) y

RIA4 (-2400 a -1900) (Fig. 6). Todos los fragmentos fueron amplificados mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos para cada uno (Cuadro 3), integrándoles los sitios de restricción EcoRV y EcoRI en los extremos 5‘ y 3’, respectivamente. Finalmente, los productos de la amplificación fueron clonados al vector p-GEM-T-Easy (Promega) y la identidad de las secuencias fue verificada por secuenciadón (Macrogene Corp.).

Posteriormente, cada fragmento fue clonado en pPromC (plásmido que contiene la secuencia PtomC), rio arriba del promotor mínimo PromC, obteniendo de esta forma las construcciones de expresión para el análisis de delación que permitió la identificación de la región de inducibilidad del promotor. Las construcciones se denominaron entonces

RIA1/PromC, RIA2/PromC, RIA3/PromC y RIA4/PromC.

Cuadro 3. Secuencias de los oligonudeótidos cebadores que se utilizaron para el análisis de deledón que permitió la identificación de la región de inducibilidad del promotor

CrGPDHS mediante RT-PCR.

Nombre Secuencia Sitio de

restricción (5' to 3')

RIA1 F EcoRV

RIA1 R TACGAATTCGCACTGGATGCTTAAGACTTGC EcoRI

RIA2 F TATG AT AT CGAAT C AC AGCTT G AGAAT AC EcoRV

RIA2 R EcoRI

RIA3 F TAAGATATCTGTCGCAATTCACACATCCAC EcoRV

RIA3 R CTAGAATTCTATGCCTAACGCCCATGCTCGG EcoRI

RIA4 F EcoRV

RIA4 R CTTGAATTCCTGTCAAAATAAAGCGCCTGTCA EcoRI

Ejemplo 8. Análisis de delación para la identificación de la región de inducibilidad del promotor mediante RT-PCR. Con la finalidad de evaluar cuál o cuáles de los fragmentos descritos en el ejemplo 7 (Fig.

6) era capaz de conducir la expresión del gen reportero GUSPIus de manera inducible, se obtuvieron varios cultivos bombardeados mediante bioballstica con los plásmidos que contenían las respectivas construcciones de expresión descritas en el ejemplo 7 y que contenían las diferentes fusiones de los fragmentos de PromA con PromC. RIA1/PromC, RIA2/PromC, RIA3ZPromC y RIA4/PromC (Fig. 6). Se seleccionaron al azar nueve colonias resistentes a zeocina procedentes del bombardeo, y por tanto putativamente transformadas, y se realizó el análisis que permitió la identificación de la región de inducibilidad, siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 4. Como se puede observar en la Figura 7, el resultado de este análisis nos permitió determinar que las fusiones R!A1/PromC y RIA3/PromC fueron capaces de conducir la expresión del gen reportero

GUSPIus de manera similar al promotor nativo, bajo tratamiento de 100mM de NaCI, mientras que no se observó amplicón (banda) alguno en el tratamiento sin NaCI. Estos resultados permitieron identificar la región de inducibilidad del promotor CrGPDH3, en la región de 577 pb de RIA3 entre -2727 y -1672 (Fig. 6), región también incluida en RIA1 y, por lo tanto, también en cualquier delación entre RIA1 y RIA3.

Ejemplo 9. Análisis por Southern blot para identificar líneas transgénicas de C. minhardtii.

Con la finalidad de identificar líneas trangénicas que contengan cada una de las construcciones con los promotores que resultaron exitosos, se analizaron tres líneas bombardeadas que contenían ya sea PromA, RIA3/PromC o ProrrtC. Se incluyó una línea transformada con el vector pGR vacío (sin construcción) marcado como SP. Como control positivo se usó p PromA purificado (plásmido que contiene la secuencia promotora PromA), marcado como C+. El DMA genómico total se extrajo de 1 x 10® de células de C. minhardtii usando el estuche de extracción lllustra™ Nucleón Phytopure DMA Extraction system (GE

Healthcare). Se usaron aproximadamente 15 mg de DMA para digerir con las enzimas de restricción Psft y BamHI toda la noche a 37 °C, se separaron en un gel de agarosa al 1% usando como marcador 2-Log DMA marker (New England Biolabs) y posteriormente transferidos a una membrana de nylon como se describe en Sambrook y Russell (2001).

Se preparó una sonda de 159 pb mediante amplificación por PCR del gen GUSPIus marcado con digoxigenina usando un estuche de mareaje y detección DIG DMA (Roche). La hibridizadón se llevó a cabo de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Al final, como se presenta en la Figura 8, se pudieron identificar tres líneas transgénicas diferentes

(1 a 3) por cada promotor a evaluar, con diferentes copias de la construcción insertadas en su genoma, desde al menos una copia, hasta al menos cinco copias (bandas observadas en cada carril). Como se esperaba, en el control negativo (SP) no se observa banda alguna, mientras que en el control positivo (C+) se observa una sola banda del peso esperado).

Ejemplo 10. Ensayo cuantitativo de la actividad de GUSPIus. La actividad de la protelna reportera GUSPIus, nos permitió determinar de manera indirecta el desempeño de cada promotor que se evaluó en este estudio. Por tanto, con el fin de evaluar la actividad de la proteína reportera GUSPIus, se realizó el ensayo cuantitativo como se describe por Jefferson et al. (1987). Células de C. reinhardtii fueron cultivadas por

7 días (hasta el final de la fase de crecimiento exponencial), y posteriormente se aplicó el tratamiento correspondiente. En un ensayo se evaluaron tres réplicas biológicas de cada línea transgénica, en cada réplica biológica se evaluó el efecto de un tratamiento diferente.

Por ejemplo, un matraz recibió el tratamiento de 100 mM de NaCI por 2 h mientras el otro recibió agua destilada como testigo. En otro ensayo, también se evaluaron tres réplicas biológicas de cada linea transgénica, en cada réplica biológica se evaluó el efecto de un tratamiento diferente, pero en este caso un matraz recibió 5 mM de NaCI y otro 100 mM de

KCI por 2 h, mientras que otro matraz recibió agua destilada como testigo.

Aproximadamente 100 mg de peso fresco se colectaron de cada muestra y se congelaron en nitrógeno líquido. Las muestras congeladas se mezclaron con el amortiguador de extracción de GUS para los ensayos fluorométricos de GUS (50 mM de amortiguador de fosfato a pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% Tritón X-100, 0.1% SDS y 10 mM b-mercaptoetanol) y fueron lisadas por 1 min usando un politrón digital Ultra Turrax® T25 (IKA).

Posteriormente, las muestras fueron centrifugadas a 13,000 g por 20 min a 4 °C. El sobrenadante se usó para medir la concentración de proteina usando un estuche comercial, el Quick Start Brandford Protein Assay Kit 1 (BioRad) con suero albúmina como estándar. Se usaron 15 mg de extracto proteico el cual fue mezclado con el amortiguador del ensayo que contenía 1 mM de 4-metilumbeliferil-b-glucurónido (4-MUG) (Sigma-

Aldrich) a 37 °C. La reacción fúe terminada con la adición de 200 Mm NazCOs a una concentración final de 180 mM. La actividad de GUSPIus se midió determinando la fluorescencia en un Fluorómetro QuantiFluor™ Handheld (Promega). A una longitud de onda de excitación de 265 nm y una longitud de onda de emisión de 455 nm. La curva estándar fue creada usando 4-metilumbeliferona (4-MU) (Sigma-AkJrich). La actividad de GUSPIus se expresó en picomoles de 4-MU por microgramo de proteína por minuto.

Se realizó el análisis de la actividad de GUSPIus mediante fluorometrla en tres líneas transgénicas (cada una con tres réplicas biológicas) que contenían como promotor en sus construcciones de expresión ya sea a PromA, RIA3/PromC o PromC. Como se puede observar en la figura 9, tanto en las muestras de PromA como de RIA3/PmmC se pudo observar una actividad enzimática significativamente mayor (aproximadamente cuatro veces mayor) cuando fueron expuestas a 100 mM de NaCI que cuando no fue este el caso, aunque se observa una actividad enzimática basal de GUSPIus con estos promotores.

En la figura 9 también se pueden apreciar los niveles de actividad básales en las muestras de PromC, en las cuales se observa de forma cuantitativa un aumento pequeño, pero estadísticamente significativo cuando las muestras fueron expuestas a 100 mM de NaCI que cuando estuvieron a 0 mM de NaCI. Un resultado notable de este análisis fue que la actividad de GUSPIus fue significativamente mayor (alrededor del 40%) para las lineas transgénicas que contenían ya sea al promotor PromA o al promotor quimérico

RIA3/PromC en tratamiento de 100 mM de NaCI cuando fueron comparadas con tres líneas transgénicas (cada una con tres réplicas biológicas) que contenían como promotor en sus construcciones de expresión al promotor constitutivo comercial HSP70A/RBCS2 en condiciones básales. Como se esperaba no hubo actividad de GUSPIus detectabie en la muestra de la cepa silvestre (testigo negativo). Este análisis nos permitió comprobar la utilidad de las variedades del promotor CrGPDH3 para la producción de proteínas recombinantes, ya sea el PromA unido operativamente a un gen, o las regiones que confieren inducibilidad unidas ya sea a PromC o a algún otro promotor para hacerlo inducible y aumentar sus niveles de expresión, siendo que esto se puede traducir también en una elevada actividad enzimática.

Ejemplo 11. Inducción del promotor CrGPDH3 ( RIA3/PmmC ) con diferentes inductores.

Con el objetivo de investigar la versatilidad del promotor CrGPDH3 en cuanto los inductores que se pueden utilizar para iniciar la expresión del gen de interés, se seleccionó al promotor quimérico RIA3/PmmC para evaluar su desempefio en tratamientos de 5 mM de NaCI (a la que se induce el promotor nativo como menciona Casais-Molina et al. 2016) y 100 mM de KCI, que ha sido reportada como inductora de la síntesis de glicerol en la que está involucrada el gen CrGPDH3 (Casais-Molina et a/. 2016; Husic y Tolbert 1986). Como se puede observar en la figura 10 a, el promotor quimérico RIA3/PromC fue capaz de inducir la expresión de GUSPIus tanto a 5 mM de NaCI como a 100 mM de KCI de manera similar al promotor CrGPDH3 nativo. De igual forma, la actividad de GUSPIus tanto para el tratamiento de 5 mM de NaCI como de 100 mM de KCI fue similar entre ambos tratamientos

(figura 10 b) y se presentó de manera similar que cuando se usó 100 mM de NaCI en el ejemplo 10. Lo anterior indica que para la inducción de la expresión usando las variedades del promotor CrGPDH3 de la presente invención se podría usar un rango por ejemplo (pero no limitativo) de 5 a 200 mM de NaCI, así como otras sales como por ejemplo, pero no limitativo, KCI en rangos similares.