CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A presente invenção refere-se a levedura industrial geneticamente modificada LVY127 com a via oxi-redutiva de conversão de xilose, cassetes de expressão gênica, processo de obtenção de etanol 2G e uso da levedura LVY127.

[2] A invenção tem aplicação no setor de produção de etanol

2G.

FUNDAMENT0S DA INVENÇÃO

[3] Estados Unidos e Brasil são os dois principais produtores mundiais de etanol, responsáveis, respectivamente, por 40 e 27 bilhões de litros de etanol produzidos em 2009 (Perrone et al., 2010). O etanol pode ser produzido a partir de diferentes fontes de matórias-primas, como milho, beterraba, trigo, cana-de-açúcar, entre outros. O processo de produção de etanol no Brasil utiliza essencialmente a cana-de-açúcar como matèria-prima. A alta capacidade produtiva dessa cultura e as condições climáticas apropriadas para o seu plantio no pais permitiram a obtenção de um modelo de produção de baixo custo, tornando o Brasil uma referência mundial na produção de etanol.

[4] A obtenção de etanol se dá pela via fermentativa nc- interior de dornas onde são adicionados o mosto (caldo e melaço de cana-de-açúcar) e uma alta concentração de células de levedura (10-17% m/v). O caldo e melaço sflo usados como substratos e concentrações de etanol de 8-11% (v/v) sâo alcançadas em um período de 6-1 lhs a 32-35"C. Apôs a fermentação, todo o conteúdo é centrifugado e o mosto fermentado (vinho) segue para as torres de destilação. As células coletadas por centrifugação são tratadas com ácido sulfúrico e reutilizadas repetidamente em novos ciclos fermentativos _/ com pelo menos 2 fermentações por dia, em um periodo de 200-250 dias. O reciclo celular característico do processo brasileiro de produção de etanol utiliza uma alta concentração de células no inicio da fermentação contribuindo para um reduzido crescimento e alto rendimento em etanol (90-92% do rendimento teórico de conversão) (Basso et al., 2008) .

[51 As condições estressantes do processo de produção, como alta concentração de etanol, altas temperaturas, estresse osmótico, acidez e contaminação bacteriana, resultaram no isolamento de leveduras selvagens mais adaptadas e que substituíam as linhagens iniciadoras da fermentação em curtos períodos de 20-30 dias de reciclo celular (Siiva- Filho et al., 2005). Basso (2008) analisou 350 isolados quanto a características de interesse industrial desejáveis como floculaçao, rendimento, velocidade de fermentação, taxa de crescimento, capacidade de reciclo, produção de espuma e capacidade de implantação nas destilarias. Dentre as linhagens selecionadas, destacaram-se PE-2, CAT-1 e BG-1 por apresentarem um desempenho eficiente e & habilidade de competir com as leveduras nativas, sobrevivendo e dominando o processo de fermentação industrial. Em 2008, PE-2 e CAT-1 foram usadas em aproximadamente 150 destilarias, representando 60% do etanol produzido no Brasil (Basso et al., 2008). Tendo em vista seu alto desempenho fermentativo, as linhagens PE-2 e CAT-1 estão sendo estudadas mais profundamente a fim de se compreender as características que as diferenciam em relação ás demais em escala industrial. Argueso et al. (2009), ao observarem que os estoques comercialmente disponíveis da PE-2 apresentavam grande variedade de cariôtipos, selecionaram e caracterizaram uma colónia única, denominada JAY270. Análises moleculares mostraram que o genoma de PE-2 é altamente heterozigoto (2 SNPs/kb) , tanto estruturalmente quanto a nível de nucleotideos, apresentando polimorfismos estruturais entre cromossomos homólogos. A alta capacidade de adaptação de PE- 2 às condições estressantes impostas em uma dorna de fermentação está diretamente ligada a sua arquitetura genômica heterogénea, tornando tais cepas ideais para a criação de uma nova geração de organismos industriais, idealizados para as novas tecnologias de produção de etanol e outros processos biotecnológicos (Argueso & Pereira, 2010) .

[6] Cofatores desempenham um papel essencial em um grande numero de reações bioquímicas e na produção de diferentes compostos (Liu et al., 2006). Eles participam de uma série de funções fisiológicas, incluindo a regulação de metabolismo energético, ajuste do estado redox intracelular, controle do fluxo de carbono, atividade mitocondrial, regulação do ciclo celular e modulação da virulência. Em microrganismos, os cofatores NADH/NAD+ e NADPH/NADP+- estão envolvidos em 740 e 887 reaçóes bioquímicas e interagem com 433 e 462 enzimas, respectivamente (Chen et al., 2014). O NAD+ atua em oxidações, geralmente associadas a processos catabólicos, enquanto o NADPH é utilizado em reduções, geralmente associadas a processos anabólicos. As reações onde ocorre a incorporação de um ion hidreto pelo NAD+ (ou NADP+) a partir de um substrato reduzido, ou NADPH (ou NADH) doa um ion hidreto para um substrato oxidado são conhecidas como oxirredutases, também denominadas desidrogenases (Nelson & Cox, 2011) .

[7] A nicotinamida adenina dinucleotideo (MAD+ em sua forma oxidada) e o seu análogo nicotinamida adenina nucleotideo fosfato (NADP+) são formados por dois nucleotideos ligados por seus grupos fosfato por meio de uma ligação fosfoanidrido. Ambas as coenzimas sofrera redução reversível do anel nicotinamida. A medida que uma molécula de substrato sofre oxidação (desidrogenação), liberando dois átomos de hidrogénio, a forma oxidada do nucleotideo (NAD+ ou NADP+) recebe um Ion hidreto (:H-, o equivalente a um próton e dois elètrons) , sendo transformada na sua forma reduzida (NADH ou NADPH) . 0 segundo próton removido do substrato é liberado no solvente aquoso (Nelson & Cox, 2011) .

[8] Em S. cezeviaiae há um aumento de complexidade em teimos de balanço entre a formação e consumo de cofatores, já que nao há atividade de uma transidrogenase que possa converter NADH diretamente em NADPH. Além disso, como o metabolismo é compartimentaiizado, n&o havendo fluxo de cofatores entre mitocóndria e citosol, a formação e consumo dos cofatores NADH e NADPH deve ser balanceada em cada compartimento, o que impõe restrições no fluxo de carbono. Assim sendo, devem existir mecanismos distintos para re-oxidar os cofatores no citosol e mitocóndria (Santos et al., 2004; Vemuri et al., 2006) .

[9] NADH é gerado primariamente no citosol pela glicòlise e na mitocóndria pelo ciclo do ácido cíclico (TCA) (Vemuri et al., 2006). No citosol, a glicose è oxidada usando NAD+ como cofator, o qual é simultaneamente convertido na sua forma reduzida, NADH, em quantidade equivalente. Sendo o NADH um cofator altamente utilizado em diversas reações metabólicas, qualquer alteração na taxa NADH/NAD+ leva A grandes alterações no metabolismo. O balanço NADH/NAD* è um fator importante na manutenção do fluxo glicolitico. Assim sendo, a depleção de NAD+ pode forçar o fluxo a cessar. A fim de aumentar a atividade glicolitica, o NADH produzido na glicòlise, oxidação de ácidos graxos e o ciclo de ácido cítrico deve ser oxidado a NAD* para alcançar um equilibrio redox (Liu et al., 2006).

[10] Existem, pelo menos, cinco mecanismos para reoxidaçâo do NADH em S. cerevisiae: fermentação alcoólica; produção de glicerol; oxidação de NADH intramitocondrial via NADH desidrogenase raitocondrial interna; e regeneração citosólica através de NADH desidrogenases mitocondriais externas ou via glicerol-3-fosfato, durante a respiração (Bakker et al., 2001) .

[11] A regeneração de NAD* a partir de NADH pela levedura pode ocorrer em aerobiose, na cadeia de transporte de elétrons, com oxigénio como aceptor final de elétrons e com a produção de grande quantidade de ATP. O NADH mitocondrial é oxidado por uma NADH desidrogenase mitocondrial interna ligada a membrana e codificada pelo gene NDI1. Ou pode acontecer sob condições anaeróbicas, na fermentação alcoólica, primariamente com o acetaldeido como aceptor de elétrons, em uma reaçao onde & álcool desidrogenase catalisa a oxidação da NADH a NAD ⁺ , com a produção de etanol e dióxido de carbono a partir de piruvato. O NADH citosólico é oxidado por duas NADH desidrogenases mitocondriais externas (citosólicas) ligadas a membrana, codificadas pelos genes NDE1 e NDE2 com sitios catalíticos em contato cora o citosol. Adicionalmente, glicerol-3-fosfato desidrogenases

(codificadas por GPD1 e GPD2) oxidam o NADH citosólico com concomitante formação de glicerol. Sob condições anaeróbicas, o NADH originado da produção de ácidos orgânicos, biomassa, entre outros, é re-oxidado a NAD* pela formação de glicerol, já que a respiração não è possível e a formação de etanol é um processo redox-neutro (Bro et al., 2006; Liu et al., 2006; Vemuri et al., 2006).

[12] Em S. cerevisiae, NADPH pode ser gerado, principalmente, nas reações catalisadas por duas desidrogenases na fase oxidativa das pentoses fosfato (ZWF1, glicose-6-Ρ desidrogenase e GND1, 6-fosfogluconato desidrogenase), na reação catalisada pela isocitrato desidrogenase NADP+ dependente (ΙΌΡ2) , na reação catalisada pela acetaldeido desidrogenase NADP* dependente (ALD6) e na reação catalisada pela enzima málica (MAE1) . De todas citadas acima, a via das pentoses fosfato representa a principal via de produção de NADPH na levedura (Santos et ai., 2004; Wang et ai., 2013) .

[13] A via das pentoses fosfato è controlada principalmente em nivel enzimático, com NADPH e ATP inibindo competitivamente a glicose-6-Ρ desidrogenase (ZNFD e 6- fosfogluconato desidrogenase (GNDl). A regulação coordenada dos genes envolvidos com o metabolismo de NADPH, incluindo a maioria dos genes da PPP, foi reportado sob condições de stress oxidativo. A ativacáo de genes dependentes de NADPH envolve STB5, responsável também por reprimir a expressão de PGI, que codifica a fosfoglicose isomerase na junção entre a via glicolitica e a da pentose fosfato. Esse fator de transcrição desempenha um papel fundamental no redirecionamento do fluxo de carbono para fornecer NADPH adicional em resposta a estresse oxidativo, por exemplo, além de ser responsável por manter o fluxo basal da PPP sob condições anaeróbicas (Celton et al., 2012b).

[14] Celton (2012) demonstrou que células de levedura respondem ao aumento da demanda de NADPH com o aumento do fluxo através das vias da pentose fosfato e de formação de acetato, o que corresponde a 80 e 20% da demanda de NADPH, respectivamente. Alguns genes da pentose fosfato são regulados positivamente com o aumento da demanda por NADPH. GNDl e SOL3 são induzidos quando uma concentração moderada de NADPH é necessária pela adição de acetoina. Quando essa demanda aumenta, dois genes da fase não oxidativa da pentose fosfato, TAL1 e TKL1 também são regulados positivamente (Celton et al., 2012a).

[15] O balanço redox ocorre quando a produção e o consumo de cofatores são aproximadamente iguais. Desbalancear o potencial oxi-redutivo pode causar prejuízos a célula, gasto de energia e carbono e prejudicar todo o metabolismo celular. A quantidade e disponibilidade de cofatores na célula pode se tornar um passo limitante, sendo essenciais em diversas reações metabólicas e na produção de diferentes compostos. Assim sendo, manipulações no balanço redox e na quantidade de cofatores produzidos pela célula pode ser uma poderosa ferramenta no melhoramento da performance fermentativa da levedura (Liu et al., 2006; Chen et al., 2014). O balanço redox pode ser regulado por diferentes abordagens, como regulação da via metabólica pelo ajuste da expressão dos genes, engenharia de proteínas envolvendo sitio de ligação aos cofatores, restruturação do genoma pela remoção de genes redundantes que utilizam cofatores, regeneração de coenziraas pela restruturação das rotas metabólicas, entre outros (Chen et al., 2014) .

[16] Além das alternativas descritas acima, um método passível de gerar avanços na produção de etanol por 5. cerevisiaet e que nflo envolve manipulação genética direta é a aplicação de uma corrente elétrica para estimular o metabolismo da levedura em fermentadores modificados com eletrodos, denominados reatores bioelétricos (Thrash and Coates, 2008) . Nesse reator modificado, microrganismos sâo cultivados em uma câmara contendo um eletrodo que recebe a corrente elétrica de um circuito acoplado a uma fonte, transferindo elétrons as células. Os elétrons recebidos pelas células podem, então, ser utilizados em reaçóes do metabolismo envolvendo redução de substratos, fornecendo poder redutor às células, diminuindo a geração de subprodutos e consequentemente aumentando a produção de etanol.

[17] o etanol de segunda geração ou etanol celulósico consiste na convers&o de polímeros que formam a parede celular vegetal em etanol. Estes polímeros constituem a celulose, hemicelulose e lignina, e sua hidrólise disponibiliza açúcares fermentesciveis, representados por he-foaes e pentosee, que podem ser convertidos a etanol por 5. cerevisiae. Hexoses são normalmente utilizadas por S. ceravlsiae. Porém, linhagens selvagens dessas leveduras não conseguem metabolizar as pentoses xilose e arablnose presentes na biornassa. Tendo em vista sua significativa parcela na constituição da biomassa, a completa utilização desses compostos aumentaria o rendimento e a viabilização do processo de produção de etanol de segunda geração.

[18] A engenharia metabólica de leveduras para introdução das vias metabólicas de consumo de xilose tem como foco duas vias principais: a via Xilcse Redutase - Xilitol Desidrogenase (XR-XDH) e a via Xilose Isomerase (XI) . A via XR-XDH, presente em micro-organismos eucariotos, consiste em duas reações de ozi-redução, onde a xilose é reduzida a xilitol pela ação da enzima xilose redutase (XR) , em uma reaçâo mediada por NADPH/NADH e em seguida, o xilitol e oxidado a xilulose por meio da enzima xilitol desidrogenase (XDH) , mediada exclusivamente por NAD*. A diferença de especificidade pelos cofatores gera o desbalanço redox. Para gerar NADPH para a reaçâo da xilose redutase, parte do carbono da xilose deve ser direcionado através da fase oxidativa da pentoses fosfato, envolvendo as reações de glicose-6-fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato. Apesar de permitir uma eficiente regeneração de NADPH, ocorre perda de carbono na forma de CO: o que impacte o rendimento de etanol a partir de xilose (van Maris et al., 2007).

[19] Em aerobiose, o NAD* è regenerado na cadeia respiratória, com o oxigénio como aceptor final de elétrons. Sob limitadas concentrações de oxigénio, a reoxidaçao do excesso de NADH, gerado através da reaçâo da xilitol desidrogenase, é realizada através de compostos mais reduzidos que a xilose, como xilitol e glicerol, subprodutos da fermentação. A produção do xilitol ocorre via xilose redutase, que devido a dupla especificidade pela coenzixna, pode usar também NADH. Como esse mecanismo envolve o consumo de uma xilose para cada NADH gerado, tem um alto impacto negativo no rendimento de etanol obtido a partir de xilose (Hahn-Hagerdal et al., 2001; Aguiar et al., 2002; Kuyper et al., 2004; van Maria et al., 2007).

[20] Apesar de S. cerevlsíae possuir os genes que codificam uma aldose redutase dependente da NADH IGRE3) e uma xilitol desidrogenase (Xyl2) _r eles n&o permitem seu crescimento eficiente em xilose. A superexpressâo desses genes usando promotores endógenos permitiu o crescimento em shakers, com taxa de crescimento de 0.01 h-1 em D-xilose e rendimento de xilitol de 55%. Sob condições anaeróbicas, essas linhagens foram incapazes de crescer (van Maris et al., 2007).

[21] A XR e XDH mais comumente usada em estudos envolvendo a via oxi-redutiva de conversão de xilose pertence a levedura Scheffersomyces stlpitis. Devido a preferência da XR de S. stipitis por NADPH, enquanto que a XDH produz apenas NADH, o acúmulo de xilitol resultante e o baixo rendimento de etanol tem sido atribuido a esse desbalanço de cofatores. Diversos estudos focaram em estratégias para resolver esse problema. Sitios de ligação aos cofatores em xiloses redutases são alvo de técnicas de engenharia de proteínas, visando aumentar a afinidade por NADH em relação a NADPH. Porém, o aumento da taxa de NADH/NADPH nesses estudos se deve a uma diminuição na eficiência catalítica de ligação ao NADPH pela XR, enquanto que o real aumento na afinidade de ligação ao NADH ó bem baixo (Liang et al., 2007; Watanabe et. al., 2007; Bengtsson et al., 2009; Runquist et al., 2010; Cai et al. , 2012) .

[22] Em uma abordagem similar, Watanabe (2005) alterou completamente a afinidade da enzima xilitol desidrogenase de 5. stípitls de NAD* para NADP' através de mutagênese sitio dirigida. As enzimas com duplas mutações (D207A/I203R e D207A/F209S) tiveram aumento na afinidade por NADP , mas a preferência por NAD+ ainda se mantinha superior. As enzimas com mutações triplas (D207A/I203R/F209S) e quádruplas (D207A/I208R/F209S/N211P.) mostraram valores maiores que 4500 vezes em kcat/Kra com NADP+ em relação a enzima selvagem, atingindo valores comparáveis ao kcat/Km com NAD+ em relação a enzima selvagem. Em estudo posterior, a enzima com a tripla mutação foi introduzida em uma linhagem de S. cerevisiae, substituindo a XDH selvagem de S. stipitis. A linhagem Y- ARSdR produziu 86% menos xilitol e consequentemente 41» mais etanol em relaç&o a linhagem parental (Watanabe et 2007) . A linhagem MA-N5 com a XOH mutante NADP+ dependente apresentou alto rendimento de 0.49 g/g a partir dos açúcares totais presentes hidrolisado lignocelulósico (Matsushika et al., 2009). Com a finalidade de melhorar o balanço de cofatcres nessas linhagens, Khattab (2013) utilizou estratégias de mutagénese sitio dirigida para produzir uma série de XR que utilizam unicamente NADPH, que ao ser oxidado, fornece NADP+ para a XDH NADP+ dependente. As linhagens resultantes apresentaram redução de xilitol de 34.4 a 54.7% em relação a linhagem controle, além de aumentos de 10 e 20% na produção de etanol em duas das linhagens construídas com as novas xiloses redutases.

[23] Diferente das abordagens descritas acima, que modificam racional ou aleatoriamente as enzimas da via de conversão de xilose, outras estratégias foram descritas na liter*cura onde ocorre alteração nas vias centrais de consumo de açúcares visando alteração e ajuste no balanço de cofatores. A diminuição da produção de NADPH pela inativação dos genes da fase oxidativa da via das pentoses fosfato, GND1, que codifica a 6-fosfogluconato desidrogenase ou ZWFl, que codifica a glicose 6-fosfato desidrogenase, resultou em linhagens com redução na produção de xilitol e aumento do rendimento de etanol obtido a partir de xilose. Porém, tais linhagens tiveram uma diminuição significativa na velocidade de consumo de xilose, explicado pela redução desse açúcar estar acontecendo mediada principalmente através de NADH, pela ação da enzima xilose redutase (XR) , com especificidade por ambos os cofatores. Outro fato observado foi o aumento da quantidade de acetato produzido, o que sugere que a produção de acetato a partir de acetaldeido se tornou a nova fonte de fornecimento de NADPH para a XP. (Jeppsson et ai., 2002; Cai et al., 2012) .

124] Para facilitar a regeneração de NADPH, a expressão de uma gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase de Kluyveromyces lactis NADP* dependente IGDP) , associada com a deleçâo de ZWF1 resultou em uma linhagem com maior rendimento de etanol a partir de xilose. A regeneração de NADPH através desse gene não está associada a produção de CO:, como acontece na via das pentoses fosfato, justificando a melhor performance em relação a linhagem que não possui o GOP expresso. Tal abordagem permite a criação de um sistema de regeneração de cofatores não ligado a perda de carbono através da produção de CO2, o que resulta em maior quantidade de etanol produzido (Verho et al., 2003) .

[25] Outra estratégia visando a introdução de uma via alternativa de re-oxidação de NADH foi através da introdução da rota alternativa da fosfocetolase, comumente encontrada em procariotos. A expressão heterôloga da fosfotransacetilase de Bacillus subtilis e da acetaldeido desidrogenase de iSntamoeba histolytica visa um desvio na via das pentoses fosfato, pela conversão de xilulose-5-Ρ em gliceraldeido-3-Ρ, que entra na via glicolitica, e acetil- P, que pode ser convertido pela fosfotransacetilase em acetil-CoA, o que é reduzido a acetaldeido pela acetaldeido desidrogenase, com a utilização de NADH como cofator. A introdução desses genes era S. cerevislae resultou em uma linhagem com aumento de 25% na produção de etanol, devido a uma menor formação do subproduto xilitol (Sonderegger et al., 2004}. [26] Apesar dos esforços em estratégias para regular e ajustar o balanço redox em linhagens contendo a via oxi- redutiva de conversão de xilose, outras razões desconhecidas, além do desbalanço redox, sâo responsáveis pela alta quantidade de xilitol produzindo e baixa produtividade de etanol em condições anaeróbicas de consumo de xilose. Outros esforços como o desenvolvimento de uma rede metabólica e regulatória, levando em conta todo o metabolismo redox da célula deve ser considerado para resolver esse problema (Cai et ai., 2012).

[27] Xiong, M. et a1.__0 documento refere-se à alteração da xylose reductase para aumentar a produção de etanol em Saccharomyces cezevisiae, mais especificamente na alteração da XR para ter maior afinidade por NADH ao invés de NADPH.

[28] Khathaab, 8.M.R. et al. 0 documento refere-se a produção de bioetanol usando combinações de Saccharomyces cezevisiae, Xilose redutase e Xilitol desidiogenase, mais especificamente na alteração sitio especifica da XR para ter afinidade apenas por NADPH.

[29] O documento US20130040353 refere-se á produção de etanol no meio de Saccharomyces cerevisiae e a alteração da XR para ter maior afinidade por NADH ao invés de NADPH.

[30] A presente invenção difere dos documentos apresentados acima, pois não faz alteração da sequência de XR. Foi utilizado uma XR que naturalmente já tem maior afinidade por NADH ao invés de NADPH, diminuindo o desbalanço redox e aumentando a produção de etanol.

[31] 0 documento americano US20120329104 refere-se a combinação de microorganismos para a produção de etanol e descreve a criação de uma linhagem utilizando a via oxi- redutiva de S. stipitls. Não foi utilizado nenhuma estratégia para regular o balanço redox da linhagem. Na presente invenção foi utilizada em uma linhagem industrial, mais tolerante a inibidores presentes no processo 2G e com características de interesse industrial. Aléia disso, foram empregadas diversas estratégias para regular o balanço redoz da linhagem e melhorar a produção de etanol. Os cassetes utilizados também apresentam diferenças em relação ao promotor e terminador, região de inserção e marcador utilizado.

[32] Diante do exposto, seria útil se a técnica dispusesse de cassete de expressão e leveduras capazes de regular o balanço redoz: de uma linhagem industrial de S. cerevisiae, amplamente utilizada no setor de etanol 2G, contendo a via oxi-redutlva de consumo de xilose.

BREVE DISCRIÇÃO DA INVENCAO

[33] A presente invenção refere-se a levedura industrial geneticamente modificada LVY127 com a via oxi-redutiva de conversão de xilose, cassetes de expressão gênica, processo de obtenção de etanol 2G e uso da levedura LVY127.

[34] O cassete de expressão gênica 1 compreende:

- a xilose redutase (XR) de S. stipitis sob a açâo do promotor e terminador do gene que codifica 3-fosfoglicerato Quinase (PGK1) em S. cerevisiae;

- o gene URA3 de S. cerevisiae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sitios loxP em cada extremidade e na mesma orientação;

- gene xilitol desidrogenase (XDH) de S. stipitis sob a açao do promotor e terminador do gene que codifica a Gliceraldeido 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDHD em S. cerevisiae, clonados no vetor pRS304; e

- sequência de nucleotideos é representada peia SKQ ID NO:1.

[35] O cassete de expressão gênica 2 compreende:

- promotor (ADH1) e terminador (ADHD do gene que codifica a enzima xiluloquinase em S. cerevisiae;

- gene URA3 de S. cerevisiae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sitios loxP em cada extremidade e na mesma orientação; e - sequencia de nucleotideos representada pela SEQ ID NO:2.

[36] O cassete de expressão gênica 3 compreende:

- gene xilitol desidrogenase (XDH) de S. stlpitis sob a acão do promotor e terminador do gene que codifica a Gliceraldeido 3-Fosfato Desidrogenase/ isoenzima 1 (TDH1) em S. cerevisiae;

- gene URA3 de S. cerevlsiae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sitios loxP em cada extremidade e na mesma orientação; e

- sequência de nucleotideos ê representada pela SEQ AD NO:3.

[37] A levedura geneticamente modificada é a Saccharomyces cerevislae DSM32120.

[38] 0 processo de obtenção de etanol 2G é realizado com a levedura geneticamente modificada é a Sacchãromyces cerevísiae DSM32120.

[39] A levedura LVY127 (D8K32120) possui aplicação em qualquer processo que envolva o consumo de xilose.

BREVE DISCRIÇÃO DOS DESENHOS

[40] A Figura 1 representa o fluxograma do desenvolvimento da linhagem LVY127 (D8M32120) .

[41] A Figura 2 representa o gráfico que demonstra o consumo de xilose pela linhagem LVY127 (DSH32120) comparada com a linhagem selvagem derivada de PE-2.

[42] A Figura 3 representa o gráfico de desempenho fermentativo global da linhagem LVY127 (DSM32120) em meio contendo uma mistura de glicose e xilose como fontes de carbono. Os açúcares e principais produtos da fermentação estão discriminados na legenda.

[43] A Figura 4 representa o gráfico que demonstra a via metabólica representando o consumo de açúcares pela linhagem LVY127 (DSM32120), contendo as XP e XDH de S. stipitis.

[44] A Figura 5 representa o esquema representativo do plasmídeo pSsXRXDH, contendo as XR e XDH de 5. stipitis. O esquema foi construído utilizando o software SnapGene Viewer. o fragmento contendo os genes XR e XDH de 5. stipitis foi amplificado do vetor pSsXRXDH e utilizado paia a transformação de 5. cerevisiae.

DISCRIÇÃO DETALHADA DA INVENCAO

f45j A presente invenção refere-se a levedura industrial geneticamente modificada LVY127 com a via oxi-redutiva de conversão de zilose, cassetes de expressão gênica, processo de obtenção de etanol 2G e uso da levedura LVTí127.

[46] 0 cassete de expressão gênica 1 compreende:

- a xilose redutase (XR) de $. stipitis sob a açào do promotor e terrainador do gene que codifica 3-fosfoglicerato Quinase iPGKl) em S. cerevisiae;

- o gene URA3 de S. cerevisiae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sitios loxP em cada extremidade e na mesma orientação;

- gene xilitol desidrogenase (XDH) de S. stipitis sob a açâo do promotor e terminador do gene que codifica a Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDH1) em 5. cerevisiae, clonados no vetor pRS304; e

- sequência de nucleotideos é representada pela SEQ ID NO:1.

[47] 0 cassete 1 é flanqueado por regiões que apresentam homologia a 516pb do centrômero cinco de S. cerevisiae.

148] 0 cassete de expressão gênica 2 compreende:

- promotor [ADHD e terminador (ADH1) do gene que codifica a enzima xiluloquínase de S. cerevisiae;

- gene URA3 de S. cerevisiae, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sitios loxP em cada extremidade e na mesma orientação; e

-sequência de nucleotideos è representada pela SEQ AD NO:2.

[491 Para a construção do micro-organismo DSM 32120 a primeira inserção do cassete 2 ocorreu a 288 pb do centrômero dois e a segunda cópia está a 228 pb do centrômero oito. 150] O cassete de expressão gênica 3 compreende: - gene xilitol desidrogenase (XDH) de S. stipltls sob a acSo do promotor e terminador do gene que codifica a Giiceraldeido 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 ( TDH1) em s. cerevisiãe;

- gene URA3 de S. cerevisiãe, juntamente com seu promotor e terminador, flanqueado por dois sitios loxP em cada extremidade e na mesma orientação; e

- sequência de nucleotideos é representada pela SEQ AD NO:3.

[51 ] 0 cassete 3 refere-se â segunda cópia do gene que codifica a xilitol desidrogenase inserido a 454 pb do centrômero três.

[52] A levedura geneticamente modificada é a Saccharomyces cerevisiãe DSM32120.

[53 ] As etapas da construção da LVY127 (DSM32120) envolveram a inserção de 1 cópia do gene que codifica a xilose redutase (XP.) de S. stipitis, 2 cópias do gene que codifica a xilitol desidrogenase (XOH) de S. stipitis, deleção da aldose redutase GRE3 e inserção de 2 cópias de XKS1 (Figura 1) .

[54] Para construção da linhagem LVY127 (DSM32120) fermentadora de xilose, foi utilizado um esporo da linhagem industrial PE-2, amplamente utilizada na indústria de etanol de primeira geração. A linhagem PE-2 apresenta alta performance fermentativa e é altamente tolerante a diversos estresses do processo industrial, se tornando uma plataforma robusta para a introdução da via de conversão de xilose.

[55] Os genes que expressam as enzimas XR e XDH de 5. stipitis foram cionados, respectivamente, sob a ação dos promotores PGK1 e TDH1, e inseridos a 516 pb do centrômero cinco, resultando na linhagem LVY103. A linhagem era capaz de consumir toda a xilose presente em meio de cultivo, produzindo etanol. Porém, utilizando apenas essas modificações, a maior parte da xilose foi convertida em xilitol. A superexpressão do gene XKSl sob açâo do promotor ADR1 deu origem a linhagem LVY123 e permitiu uma melhora significativa de desempenho, alcançando rendimento de etanol de 34% a partir dos açúcares totais (sendo 51* o rendimento teórico), e rendimento de xilitol de 19% e glicerol de 5,5H. 0 cassete contendo o gene XKS1 foi inserido próximo ao centrômero dois.

[56] Per apresentar um rendimento ainda distante do teórico, o próximo passo desenvolvido foi o aumento do fluxo xilose à xilulose-5-Ρ, com a duplicação do número de cópias integradas dos genes XDH e XKS1 {inseridos próximo aos centrómeros três e oito, respectivamente), além da delecao do gene que codifica uma aldose redutase, GRE3. Esse gene tem a mesma função que a xilose redutase (XR) , realizando a redução da xilose a xilitol, utilizando exclusivamente NADPH como cofator. 0 gene XR de $. stipltis utilizado na transformação utiliza tanto NADPH como NADH, embora tenha uma maior afinidade pelo primeiro. A deleção do GRE3 é uma estratégia descrita que visa a diminuição de xilitol, visto que sua produção seria exclusivamente via XR de s. stipltis, o qual realiza a oxidação de NADH a NAD* permitindo o aumento do fluxo pela XDH NAD* dependente, próximo gene da via. A deleção do gene GRE3 (LVY124) e o aumento do número de cópias do XDH (LVY125) e XKS1 resultou na linhagem LVY127, objeto da presente invenção, que apresentou rendimento de etanol de 36% e diminuição nos rendimentos dos subprodutos xilitol t glicerol, com 8% e 8%, respectivamente.

Examplo de concretizaçio

Linhagens utilizadas

[57] Para os experimentos de clonagem e multiplicação dos plasmideos foi utilizada a linhagem bacteriana de Escherichia coli DH5μ (Stratagene®) . Quando necessário, a linhagem foi ativada á 37 *c por esgotamento em meio de cultura LB (Luria-Bertaini) . Paza a construção das linhagens foi utilizada a cepa industrial de S. cerevisiae PE-2, mantida em meio YEPD. Construção do casete de expressao

[58] Para a construção dos cassetes foi utilizada a técnica descrita por Gibson et al. (2009), que consiste na fusão de fragmentos de DNA com um mix das enzimas T5 exonuclease, Taq ligase e DNA polimerase em uma única reaçâo. Para o processo de seleçâo, foi utilizado o sistema Cre/loxP (Gueldener et al., 2002). O gene URA3 foi amplificado por PCR, juntamente ao seu promotor e terminador, e foram adicionadas sequências loxP na mesma orientação/ nas duas extremidades, permitindo que esse marcador seja utilizado em os cassetes de transformação. Sequências de homologia ao local de inserção foram adicionadas nas extremidades dos cassetes.

Txmnmtormmçào dm lmvmdaxm m pxoemmmo dm seleçao

(59} A transformação de levedura for feita utilizando o método de acetato de litio descrito por Gietz e Schiestl (2007) . A linhagem utilizada para a transformação ê um esporo haplóide mat α derivado do diplóide S. cerevísiae PE-2. Para iniciar as introduções dos cassetes, a linhagem teve o gene URA3 removido para ser utilizado como marca auxotròfica. Os transformantes foram selecionados em meio YNB (sem uracila) . A retirada do marcador pode então ser realizada com o plasmideo pSH65 (Gueldener et al., 2002), que contém o gene que codifica a recombinase Cre sob a açâo do promotor induzivel por galactose.

Ensaio fermentativo

Cultivo em erlenmeyer

160] 0 ensaio fermentativo foi realizado em meio YPDX ⁽ 20 g/L de glicose e 50 g/L de xilose) em erlenmeyers de 125 ml e volume de trabalho de 80 ml, iniciando a cultura com GD de aproximadamente 1,0. A temperatura e velocidade de agitação foram mantidas constantes, respectivamente, em 30 °C e 80 rpm. Amostras foram retiradas para medir OD e para posterior análise por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) . Cultivo em biorreator [61] 0 ensaio fermentativo foi realizado em meio YPDX (20 g/L de glicose e 50 g/L de xilose) em biorreatores de 2,5 L de volume útil, Labfors (Infors HT) . O volume de trabalho utilizado foi de 1 L, com pH mantido constante durante o crescimento celular em 5, 5 pela adição de solução aquosa de NaOH 6 mols/L, iniciando a cultura com OD de aproximadamente 1/0. A temperatura e velocidade de agitação foram mantidas constantes em 30 ^e C e 150 rpm respectivamente. Para garantir o estado de anaerobiose, antes da inoculação, o meio de cultivo e a atmosfera do biorreator foram saturados com fluxo de nitrogénio gasoso de 3 LN/min (litros normais poz minuto) durante 10 minutos. Amostras eram retiradas para medir OD e para posterior análise por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) .

Quantificaçio dos produtos da fermentaçio

[62] A quantificação de glicose, xilose, zilitol, glicerol, ácido acético e etanol foi realizada por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (HPLC) utilizando o cromatógrafo Alliance HT (Waters) com detector de Índice de refração (Waters 2414). As amostras foram analisadas por HPLC-RI utilizando a coluna de exclusão iõnica HPX-87H (300mm κ 7,8mm, BioRadS») , aquecida em forno a 35 ^E C, H ₂ SO ₂ mM (pH 2,3) como fase móvel a uma vazão de 0,6 raL/min. Uma curva padrão com as concentrações conhecidas com compostos de interesse também foram analisadas pelo mesmo procedimento. As concentrações dos compostos nas amostras foram determinadas por comparação das áreas dos picos cromatográficos obtidos com as curvas de calibração. O crescimento da linhagem LVY127, modificada com as vias de conversão de xilose, objeto da presente invenção, foi comparado com a linhagem selvagem PE-2, identificada na figura 2 como WT ("wild-type") . 0 ensaio fermentativo foi conduzido em meio contendo uma mistura de glicose e xilose- nas concentrações de 10 e 30 g/L, respectivamente. A figura 2 demonstra que a linhagem LVY127 agora é capa: de consumir toda a xilose presente no meio, enquanto que a linhagem selvagem não foi capaz de consumir esse açúcar. 0 experimento foi conduzido em triplicata. A levedura LVY127 (D8M32120) possui aplicação em qualquer processo que envolva o consumo de xilose.

[63] A performance fermentativa da linhagem LVY127 (DSM32120) foi avaliada em condições semi-anaeròbicas em meio contendo xilose e glicose como fontes de carbono, iniciando com baixo volume de células com de

aproximadamente 1.0 (0.25 g DW/L) . A linhagem apresentou um rendimento de etanol de 36%, além de uma diminuição nos rendimentos dos subprodutos xilitol e glicerol em relação as linhagens predecessoras, com 6% e 8%, respectivamente.