TUZIKOV ALEXANDR BORISOVICH (RU)
CHINAREV ALEXANDR ALEXANDROVICH (RU)
| WO2001002018A2 | 2001-01-11 | |||
| WO1998014215A2 | 1998-04-09 | |||
| WO2000055149A1 | 2000-09-21 |
| Формула изобретения 1. Со-ассоциат двух типов молекул, а именно гликопептида, выбранного из гликопептидов общей формулы (I): 6'SLN-nHHKep-Glym-NH-(CH2)4-NH-Glym-nHHKep-6'SLN (I), или их фармацевтически приемлемых солей, где m = 5 + 8; и пептида, выбранного из пептидов общей формулы (II): R-Glyn-NH-(CH2)4-NH-Glyn-R (II) или их фармацевтически приемлемых солей, где п = 4 + 6; R представляет собой Н, НООССН2СН2СО- или НОСН2СО-; причем молярное соотношение гликопептида и пептида в со-ассоциате составляет от 1 : 10 до 1 : 100. 2. Со-ассоциат по п.1 , в котором т=6, п=6. 3. Со-ассоциат по п.1 , в котором линкер представляет собой -С2.20алкил- необязательно замещенный, по меньшей мере, одной из групп С(О), NH и/или, по меньшей мере, одним геторатомом, выбранным из О и/или S. 4. Со-ассоциат по п.З, в котором линкер представляет собой -0-С2.3алкил-МН- С(0)-С1-5алкил-С(0)-; 5. Со-ассоциат по п.4, в котором линкер представляет собой -OCH2CH2CH2NHC(0)CH2CH2CH2CH2C(0)-. 6. Способ получения со-ассоциата по п.1 , включающий смешивание водных растворов гликопептида общей формулы (I) и пептида общей формулы (II) при температуре 60-80 °С в молярном соотношении гликопептида и пептида от 1 : 10 до 1 : 100, с последующим охлаждением до комнатной температуры. 7. Применение со-ассоциата по п. 1 в качестве ингибитора вируса гриппа человека. 8. Применение по п.7, в котором вирус гриппа человека характеризуется тем, что гемагглютинин вируса связывается с 6'SLN. 9. Применение по п.8, в котором тип вируса гриппа человека представляет собой А или В. 10. Применение по п.9, в котором подтип вируса гриппа человека типа А представляет собой Н1 или НЗ. 11. Применение со-ассоциата по п.1 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболевания, ассоциированного с вирусом гриппа человека. 12. Применение по п.1 1 , в котором вирус гриппа человека характеризуется тем, что гемагглютинин вируса связывается с 6'SLN. 13. Применение по п.12, в котором тип вируса гриппа человека представляет собой А или В. 14. Применение по п.13, в котором подтип вируса гриппа человека типа А представляет собой Н1 или НЗ. 15. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики заболевания, ассоциированного с вирусом гриппа человека, характеризующаяся тем, что она содержит терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного из со-ассоциатов по п.1. 16. Фармацевтическая композиция по п.15, в котором вирус гриппа человека характеризуется тем, что гемагглютинин вируса связывается с 6'SLN. 17. Фармацевтическая композиция по п.16, в котором тип вируса гриппа человека представляет собой А или В. 18. Фармацевтическая композиция по п.17, в котором подтип вируса гриппа человека типа А представляет собой Н1 или НЗ. 19. Фармацевтическая композиция по п.15, характеризующая тем, что заболевание представляет собой грипп. |
Область техники
Данное изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии и медицине и касается разработки и получения со-ассоциатов, состоящих из олигоглициновых молекул разного вида, обладающих высокой эффективностью в отношении ингибирования вируса гриппа.
Уровень техники
Вирусы гриппа способны быстро изменять собственную антигенную структуру, иногда даже в течение одного сезона. Благодаря этому они способны, во-первых, избегать действия иммунной защиты организма, а во-вторых, становятся резистентными к противогриппозным препаратам. Это касается всех существующих средств против гриппа, по какому бы механизму они ни действовали. В то же время, у вируса гриппа есть строго консервативный участок, который может быть мишенью для лекарственных средств - это рецептор-связывающий участок белка гемагглютинина (НА). Функция НА - узнавать и связываться с рецептором 6'SLN (б'-Sialyl-N-acetyllactosamine, 6'сиалил-(М- ацетиллактозамин)) на поверхности клеток-мишеней человека. Вирусу необходимо сохранять эту способность, в противном случае развитие инфекции не состоится. Важно отметить, что замены аминокислотных остатков в б'БЬЫ-узнающем участке гемагглютинина все-таки происходят, но только такие, которые не отменяют его связывание с трисахаридом 6'SLN. Когда с помощью рентгеноструктурного анализа с атомарным разрешением были изучены комплексы 6'SLN с разными НА вирусов гриппа человека, оказалось, что рецептор-связывающие участки белка гемагглютинина (НА) узнают не идентичные фрагменты трисахарида. Из этого следует два важных вывода. Во- первых, трисахарид 6'SLN нельзя заменить аналогом или миметиком - он не будет связываться со всеми вариантами НА; это подтверждается хорошо известным фактом, что до сих пор никому не удалось разработать препарат, действующий на самую привлекательную для терапии мишень вируса гриппа. Во-вторых, молекула природного трисахарида 6'SLN является идеальным блокатором для НА, так как все существующие и будущие варианты НА обязаны с ней связываться. Причина того, что лекарство на основе 6'SLN до сих пор не было создано, кроется в очень низком сродстве трисахарида 6'SLN к НА. В реальности, одна частица вируса связывается одновременно (кооперативно) с несколькими остатками 6'SLN на поверхности клетки, в результате чего сродство из слабого становится очень сильным. Поэтому полимерная форма 6'SLN (когда трисахарид ковалентно привязан к истинному полимеру в качестве боковой цепи) блокирует вирусы гриппа в -100-10000 раз сильнее, чем мономер 6'SLN [1 , 2, 4, 6]. Показана эффективность такого полимера для лечения зараженных мышей [5, 7]. В то же время, очевидно, что применение такого полимера для лечения людей невозможно. Поэтому вместо истинных полимеров были использованы молекулярные ассоциаты, так называемые тектомеры. Тектомеры формируются из нескольких сотен или тысяч молекул гликопептидов, каждая из которых состоит из двух участков: первый - это 6'SLN, а второй - олигогли иновый пептид, способный к ассоциации в воде [3]. Тектомеры блокируют вирус гриппа аналогично истинным полимерам, но обладают двумя неоспоримыми достоинствами: 1) имеют определенный состав; 2) биодеградируемы и нетоксичны.
Прототипом данного изобретения являются тектомеры, описанные в заявке РСТ/ЕР2000/006139 (WO200102018). Данные тектомеры не достигали той высокой активности, которая описана для истинных полимерных производных 6'SLN; причиной этого, как мы предположили, является слишком тесное расположение остатков 6'SLN относительно друг друга в ассоциате (тектомерной частице), около 5 А, что затрудняет взаимодействие НА с трисахаридом.
Поэтому существует необходимость создания новых эффективных ингибиторов вируса гриппа.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание новых эффективных ингибиторов вирусов гриппа человека, перспективных для применения в клинической практике.
Техническим результатом изобретения является разработка ингибиторов вирусов гриппа человека на основе со-ассоциатов, обладающих высокой блокирующей способностью в отношении вирусов гриппа и не оказывающих токсического воздействия на пациента.
Указанный технический результат достигается путем получения со-ассоциатов двух типов соединений, а именно, соединения общей формулы (I):
6'SLN-nHHKep-Gly m -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly m -nHHKep-6'SLN (I), где m - целое число от 5 до 8;
и соединения общей формулы (II):
R-Gly n -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly n -R (II),
где п - целое число от 4 до 6;
R представляет собой Н, НООССН 2 СН 2 СО-, или НОСН 2 СО-;
или их фармацевтически приемлемых солей,
причем молярное соотношение соединений (I) и (II) в со-ассоциате составляет от 1 : 10 до 1 :100.
В части вариантов изобретения со-ассоциаты характеризуются тем, что т=6, п=6. В некоторых других вариантах воплощения изобретения со-ассоциаты по изобретению характеризуются тем, что: линкер представляет собой -С 2 . 20 алкил-, необязательно замещенный, по меньшей мере, одной из групп С(О), NH и/или, по меньшей мере, одним геторатомом, выбранным из О и/или S.
В некоторых наиболее предпочтительных варинатах воплощения изобретения количество гетероатомов О и/или S составляет 0-5.
В части вариантов изобретения со-ассоциаты характеризуются тем, что:
линкер представляет собой -0-С 2 - 3 алкил-МН-С(0)-С1- 5 алкил-С(0)-.
В некоторых конкретных вариантах изобретения линкер представляет собой -OCH 2 CH 2 CH 2 NHC(0)CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 C(0)-. Технический результат, а именно, максимальная вирус-ингибирующая активность со-ассоциатов по изобретению, достигается также посредством оптимизации структуры ингибитора по двум направлениям. Первое - это соотношение гликопептида общей формулы (I) и пептида общей формулы (II) в со-ассоциатах, второе - величины п и т (длина глициновых фрагментов), определяющие способность к ассоциации. Кроме того, указанный технический результат достигается посредством разработки способа получения вышеуказанных со-ассоциатов, включающего смешивание водных растворов гликопептида общей формулы (I) и пептида общей формулы (II) при температуре 60-80 °С в молярном соотношении гликопептида и пептида от 1 : 10 до 1 : 100, с последующим охлаждением до комнатной температуры.
Настоящее изобретение также относится к применению со-ассоциатов по изобретению в качестве ингибиторов вирусов гриппа человека. Причем вирусы гриппа человека характеризуются тем, что гемагглютинин вируса связывается с 6'SLN, в частности, типы вируса, в отношении которых могут использоваться со-ассоциаты по изобретению, представляют собой А или В. Причем, в некоторых вариантах изобретения, подтип вируса гриппа человека типа А представляет собой Н1 или НЗ.
Кроме того, изобретение относится к применению со-ассоциатов по изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом гриппа человека.
Изобретение также включает фармацевтические композиции для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусами гриппа человека, содержащие терапевтически эффективное количество со-ассоциатов по изобретению.
Подробное описание изобретения
Определения (термины)
Хаотропный агент - вещество, способное разрушать водородные например роданид-анион или мочевина. Ассоциат (со-ассоциат) - физически устойчивый (то есть, тот, который можно надежно обнаруживать физическими методами) при рассматриваемой температуре комплекс одинаковых (ассоциат) или разных (со-ассоциат) малых молекул, не соединенных между собой ковалентными связями.
Тектомер - ассоциат (см. выше), сформированный из олигоглицинов линейной или разветвленной структуры.
Смешанный тектомер - со-ассоциат (см. выше), сформированный из олигоглицинов линейной или разветвленной структуры.
Термин «алкил» в настоящем документе относится к алкильным группам, обычно имеющим от двух до двадцати, предпочтительно от двух до пяти атомов углерода. Например, «алкил» может означать этил, н-пропил, н-бутил и т.д. Термин С 2 -4 алкил означает алкил, содержащий от 2 до 4 атомов углерода, и включает С 2 , С 3 , С 4 -алкильные группы. Термин «алкил» в настоящем документе означает неразветвленные алкильные группы.
Вирус гриппа - в настоящем документе означает любой штамм вирусов гриппа человека, гемагглютинин которых связывается с 6'SLN. То есть любой тип вирусов гриппа человека, выбранного из типов А или В. В частности, любой тип вируса гриппа человека типа А, который имеет подтип Н1 или НЗ, определяющийся антигенностью поверхностного белка гемагглютинина; при этом подтип вируса, определяющийся поверхностным белком нейраминидаза, может быть любым. Вирусы человеческого гриппа С и птичьи вирусы не имеются в виду в настоящем документе.
Линкер - молекулярный фрагмент, соединяющий два функциональных фрагмента биоконъюгата (гликопептида), в данном случае фрагмента, ответственного за связывание с вирусом, и фрагмента, ответственного за ассоциацию. Линкер существенно не влияет на свойства биоконъюгата, поэтому его стремятся сделать максимально простым. Так как свойства линкера может выполнять бесконечное разнообразие молекулярных фрагментов, его сложно дефинировать в виде химической формулы, и поэтому целесообразно использовать термин "линкер" как заменитель химической формулы.
Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к таким солям, которые, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д., и отвечают разумному соотношению пользы и риска. Примерами фармацевтически приемлемых нетоксичных солей могут служить соли, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная, бромоводородная, фосфорная, серная и хлорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, малеиновая, винная, янтарная, лимонная или малоновая кислоты.. Описание рисунков
Рисунок 1 - Схема образования гипотетических ассо иатов (гипотетических гликотектомеров), состоящих из гликозилированных производных двухантенных олигогли иновых пептидов (гликопептидов) 6'SLN-nHHKep-Gly5-NH-(CH 2 )4-NH-Gly 5 -nHHKep- 6'SLN;
Рисунок 2 - Схема образования ассоциатов (тектомеров), состоящих из сукцинильных производных двухантенных олигоглициновых пептидов Suc-Gly 5 -NH-(CH 2 ) 4 - NH-Gly 5 -Suc;
Рисунок 3 - Схема образования со-ассоциатов (смешанных тектомеров), состоящих из 6'SLN-nHHKep-Gly5-NH-(CH 2 )4-NH-Gly 5 -nHHKep-6'SLN и Suc-Gly 5 -NH-(CH 2 ) 4 - NH-Glys-Suc.
Рисунок 4. Профили элюции растворов, содержащих 6'SLN-nHHKep-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -
NH-Gly 6 -nnHKep-6'SLN (А) и смесь 6'SLN-nHHKep-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -nHHKep-6'SLN с
Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -Suc в соотношении 1 : 10 (В);
наполнитель TSK-4000, колонка 7.5x300 мм, элюция - 0.2 М NaCI, 1 мл/мин,
линкер -OCH 2 CH 2 CH 2 NHC(0)CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 C(0)-.
Рисунок 5. Изображение, полученное с помощью атомно-силовой микроскопии
(АСМ): смешанный тектомер (со-ассоциат), адсорбированной на поверхности слюды; состав со-ассоциата - 6'SLN-nHHKep-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -nHHKep-6'SLN и Suc-Gly 6 -NH- (CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -Suc, соотношение 1 :10; высота - 85 А; диаметр ~ 500 нм,
линкер -OCH 2 CH 2 CH 2 NHC(0)CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 C(0)-.
Подробное раскрытие изобретения
Со-ассоциаты по изобретению состоят из олигоглициновых молекул разного вида. Первая молекула со-ассоциата - это гликопептид: олигоглицин с терминацией 6'SLN, отвечающий за связывание с вирусом гриппа. Второй компонент со-ассоциата по изобретению - пептид с олигоглициновыми антеннами - играет роль «разбавителя», то есть способен образовывать смешанные ассоциаты с первой молекулой, но не содержит объемного заместителя, мешающего связыванию со-ассоциата с НА (Рисунок 3).
Было показано, что производные пептида с олигоглициновыми антеннами по изобретению (R-Gly n -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly n -R) ассоциируют в водных растворах (Рисунок 2), что подтверждается данными аналитической гель-хроматографии. Образующиеся ассоциаты (тектомеры) могут быть обратимо разрушены при нагревании, под действием кислот и хаотропных агентов (данные светорассеяния). Методом Раман-спектроскопии продемонстрировано, что ассоциация сопровождается образованием структуры полиглицин -II: спектр водного раствора Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -Suc содержит характерные полосы поглощения (884, 1 382, 1 424, 1 654 см "1 ). Методом атомно-силовой микроскопии (ACM) было показано, что адсорбированные на поверхности слюды тектомеры Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 )4-NH-Gly 6 -Suc представляют собой плоские двумерные образования с планарными размерами 50-500 нм и высотой 50 А.
В отличие от производных пептида с олигоглициновыми антеннами, гликопептиды с олигоглициновыми антеннами с терминацией 6'SLN, 6'SLN-nHHKep-Gly m -NH-(CH 2 ) 4 -NH- Gly m -nnHKep-6'SLN, не способны к образованию тектомеров в индивидуальной форме. Это объясняется стерическими препятствиями ассоциации со стороны объемной углеводной группы (Рисунок 1), что подтверждается данными аналитической гель-хроматографии (Рисунок 4 А - детектируются только отдельные мономеры). Однако неожиданно оказалось возможным получить тектомеры смешанного состава, состоящие из молекул 6'SLN-nHHKep-Gly m -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly m -nHHKep-6'SLN и R-Gly n -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly n -R. Для этого водный раствор R-Gly n -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly n -R в течение короткого времени нагревают при 70°С с целью разрушения содержащихся в нем тектомеров. К нагретому раствору добавляют раствор, содержащий расчетное количество 6'SLN-nHHKep-Gly m -NH-(CH 2 ) 4 -NH- Gly m -nnHKep-6'SLN, после чего полученный раствор охлаждают до комнатной температуры. В результате смешивания указанных выше растворов происходит процесс реассоциации R-Gly n -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly n , в ходе которого молекулы гликопептидов включаются в состав вновь образующихся тектомеров (Рисунок 3). Образование смешанных тектомеров (со-ассоциатов) подтверждается данными аналитической гель- хроматографии (Рисунок 4 В, - большая часть соединений детектируется в составе со- ассоциатов) и АСМ (Рисунок 5 - видна обширная плоская супрамолекулярная структура в одну молекулу толщиной и в несколько сотен молекул в латеральных направлениях).
Как уже отмечалось выше, максимальная вирус-ингибирующая активность может быть достигнута посредством оптимизации структуры ингибитора по двум направлениям. Первое - это соотношение пептид/гликопептид, второе - величины п и т (длина глицинового фрагмента), определяющие способность к ассоциации. Так в частности, соотношение пептид/гликопептид равное 100, учитывая плоскую архитектуру со- ассоциатов, означает дистанцирование остатков 6'SLN примерно в 10 раз по сравнению с гипотетическим «неразбавленным» ассоциатом гликопептида. Такое расположение соответствует расстоянию между соседними остатками лиганда (6'SLN) примерно 50 А (10 x 5, где 5 А - это расстояние между цепями в упаковке «полиглицин-Н»). Расстояние 50 А соответствует расстоянию между углевод-связывающими центрами в тримере гемагглютинина. Таким образом, «разбавление» гликопептида пептидом увеличивает расстояние между остатками 6'SLN в со-ассоциате, благодаря чему гемагглютинин беспрепятственно связывается со своим лигандом. Более того, при оптимальном расстоянии (то есть соотношении пептид/гликопептид) между лигандами, связывание гемагглютинина соответствует природному процессу. Кроме того, «разбавление» в 100 раз дорогого компонента дешевым уменьшает стоимость единицы массы препарата. Помимо этого, указанные значения m и п по изобретению (то есть длина олигоглицинового фрагмента в молекулах пептида и гликопептида в со-ассоциатах) позволяют получить оптимальные структуры со-ассоциатов, обладающие наибольшей ингибирующей активностью.
Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученных в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области. Сущность изобретения поясняется рисунками.
Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.
Получение соединений по изобретению
Общая схема синтеза компонентов со-ассоциатов
Прежде всего, синтезируют пептиды, состоящие из тетраметилендиамина и двух присоединенных к нему олигоглициновых антенн, H-Glyn-NH-(CH 2 )4-NH-Glyn-H, п = 2, 4 и 6. Далее получают производные пептидов, у которых с концами олигоглициновых антенн связаны полярные группы, такие как остатки янтарной кислоты (Sue), либо трисахаридные группы, такие как Νβυ5Αοα2-6Θ8ΐβ1 -4ΘΙοΝΑοβ- (6'SLN). Синтез указанных соединений осуществлялся в соответствии со Схемой 1.
Схема 1. Общая схема синтеза двухантенных олигогли инов, сук инильных производных и гликопептидов на их основе (Вое- mpem-бутилпероксикарбонил, ONp - 4- нитрофенил, ONSu - Ν-гидроксисук инимидил, Sue - сук инил, ДМСО - диметилсульфоксид, NEt 3 - триэтиламин, многоточие на схеме означает, что данная совокупность операций проводится несколько раз).
Синтез индивидуальных гликопептидов, содержащих 6'SLN, подробно описан в [8, 9].
Примеры синтеза индивидуальных пептидов по изобретению, а также получения со-ассоцатов приведены ниже.
Пример 1. Синтез Suc-GIVfi-NH-fCHpb-NH-GIVg-Suc, ди-литиевая соль.
К интенсивно перемешиваемой суспензии 100 мг (92 мкмоль) диамина TFAx H-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 2 -NH-Gly 6 -HxTFA в 5 мл 6М LiCI порциями (3 χ 20 мг), через интервалы ~ 12 ч, добавляли янтарный ангидрид. Через 48 ч реакционную смесь разбавили водой в два раза, нанесли на колонку с гелем Sephadex LH-20 (25- χ 400 мм) и хроматографировали, элюируя смесью 0.05 М ΝΗ 3 в MeCN/H 2 0, 1 : 1. Фракции, содержащие продукт, упарили, остаток суспендировали в 10 мл Н 2 0 и лиофилизовали. Продукт получили в виде бесцветного порошка.
Выход продукта - 85,8 мг (87%); м.п. >250 °С (с разл.), ТСХ: Я, 0.3 (MeOH/MeCN/1 М Ру АсОНводн., 2:1 :1 ). 1 H ЯМР (CF 3 COOD, 30 °С): 4.56-4.40 (м, 24Н, 12хСН 2 Gly), 3.84 (с, 4Н, 2xCH 2 NH кор), 3.20-3.12, 3.10-3.02(2м, 2х2Н, 2хСН 2 СО).
MALDI-TOF: 1070.8 [М + ]; Найдено, %: С 42.54, Н 5.37, N 20.82; Рассчитано для Сз б Н й гЫгМмОго, %: С 42.62, Н 5.27, N 20.93.
Пример 2. Получение со-ассоциата
6'SLN-nHHKep-Glv R -NH-(CH ? ) 4 -NH-Glv R -nHHKep-6'SLN и Suc-Gly R -NH-(CH ? ) 4 -NH-Gly R -Suc. соотношение 1 :5, линкер = -OCH ? CH ? CH ? NHC(0)CH ? CH ? CH ? CH ? C(Q)-. Раствор 100 мкмоль Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 )4-NH-Gly 6 -Suc в 1 мл дистиллированной воды (рН около 6) или в буфере PBS (натрий-фосфатный буфер) (рН около 7) в течение 1 - 2 мин нагревают до температуры +60 °С (результат был одинаковым в температурных пределах 60-80 °С). К полученному нагретому раствору добавляют раствор 20 мкмоль 6'SLN-nHHKep-Gly 6 -NH-(CH 2 )4-NH-Gly 6 -nHHKep-6'SLN в дистиллированной воде (1 мл) при температуре от +60 °С (результат был одинаковым в температурных пределах +60-80 °С), после чего полученный раствор охлаждают до комнатной температуры в течение 10-20 минут; полученный со-ассо иат хранят при +4 °С и используют без дальнейших манипуляций, кроме разбавления.
Пример 3. Получение со-ассоциата
6'SLN-nHHKep-Glv R -NH-(CH -NH-Glv R -nHHKep-6'SLN и Suc-Gly R -NH-(CH -NH-Gly R -Suc. соотношение 1 :10. линкер = -OCH ? CH ? CH ? NHC(0)CH ? CH ? CH ? CH ? C(Q)-. Раствор 200 мкмоль Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 )4-NH-Gly 6 -Suc в 1 мл дистиллированной воды (рН около 6) или в буфере PBS (рН около 7) в течение 1 -2 мин нагревают до температуры +60 °С (результат был одинаковым в температурных пределах 60-80°С). К полученному нагретому раствору добавляют раствор 20 мкмоль 6'SLN-nnHKep-Gly 6 -NH- (CH 2 )4-NH-Gly 6 -nHHKep-6'SLN в дистиллированной воде (1 мл) при температуре от +60 °С (результат был одинаковым в температурных пределах +60-80 °С), после чего полученный раствор охлаждают до комнатной температуры в течение 10-20 минут; полученный со-ассоциат хранят при +4 °С и используют без дальнейших манипуляций, кроме разбавления.
Пример 4. Получение со-ассоциата
6'SLN-nHHKep-Glv R -NH-(CH -NH-Glv R -nHHKep-6'SLN и Suc-Gly R -NH-(CH -NH-Gly R -Suc. соотношение 1 :20. линкер = -OCH ? CH ? CH ? NHC(0)CH ? CH ? CH ? CH ? C(Q)-. Раствор 200 мкмоль Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 )4-NH-Gly 6 -Suc в 1 мл дистиллированной воды (рН около 6) или в буфере PBS (рН около 7) в течение 1-2 мин нагревают до температуры +60 °С (результат был одинаковым в температурных пределах 60-80 °С). К полученному нагретому раствору добавляют раствор 10 мкмоль 6'SLN-nnHKep-Gly 6 -NH- (CH 2 )4-NH-Gly 6 -nMHKep-6'SLN в дистиллированной воде (1 мл) при температуре от +60 °С (результат был одинаковым в температурных пределах +60-80 °С), после чего полученный раствор охлаждают до комнатной температуры в течение 10-20 минут; полученный со-ассоциат хранят при +4 °С и используют без дальнейших манипуляций, кроме разбавления.
Способ терапевтического применения со-ассоциатов
Предмет данного изобретения также включает введение субъекту, нуждающемуся в соответствующем лечении или профилактике, терапевтически эффективного количества со-ассоциата по изобретению. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается такое количество со-ассоциата, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение (профилактику). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.
Со-ассоциат по изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая со- ассоциат, может быть введен в организм пациента в любом количестве и любым путем введения, эффективным для лечения или профилактики заболевания.
После смешения со-ассоциата с конкретным подходящим фармацевтически допустимым носителем в желаемой дозировке, композиции, составляющие суть изобретения, могут быть введены в организм человека или других животных перорально, парентерально, местно и т.п.
Введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, неделю (или любой другой временной интервал), или время от времени. Кроме того, со-ассоциат может вводиться в организм пациента ежедневно в течение определенного периода дней (например, 2-10 дней), а затем следует период без приема со-ассоциата (например, 1 -30 дней).
В том случае, когда со-ассоциат по изобретению используется как часть режима комбинированной терапии, доза каждого из компонентов комбинированной терапии вводится в течение требуемого периода лечения. Соединения, составляющие комбинированную терапию, могут вводиться в организм пациента как единовременно, в виде дозировки, содержащей все компоненты, так и в виде индивидуальных дозировок компонентов. Фармацевтические композиции
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат соединения по изобретению (или пролекарственную форму или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента совместно с со-ассоциатами, составляющими суть данного изобретения, и которые не разрушают фармакологической активности этого со-ассоциата, а также являются нетоксичными при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.
Фармацевтические композиции, заявляемые в данном изобретении, содержат со- ассоциаты совместно с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать в себя любые растворители, разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, смазочные материалы и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Материалы, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают, но не ограничиваются, моно- и олигосахариды, а также их производные; желатин; тальк; эксципиенты, такие как какао-масло и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, сафроловое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые смазочные вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, разделительные жидкости, пленкообразователи, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.
Предметом данного изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, состав которых оптимизирован для определённого пути введения в организм в терапевтически эффективной дозе, например, для введения в организм орально, местно, пульмональным, например, в виде ингаляционного спрея, или внутрисосудистым способом, интраназально, подкожно, внутримышечно, а также инфузионным способом, в рекомендованных дозировках.
Лекарственные формы данного изобретения могут содержать составы, полученные методами использования липосом, методами микрокапсулирования, методами приготовления наноформ препарата, или другими методами, известными в фармацевтике. При получении композиции, например в форме таблетки, активное начало смешивают с одним или несколькими фармацевтическими эксципиентами, такими как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, кремнезем, аравийская камедь, маннит, микрокристаллическая целлюлоза, гипромеллоза или аналогичные соединения.
Таблетки можно покрыть сахарозой, целлюлозным производным или другими веществами, подходящими для нанесения оболочки. Таблетки могут быть получены различными способами, такими как непосредственное сжатие, сухое или влажное гранулирование или горячее сплавление в горячем состоянии.
Фармацевтическую композицию в форме желатиновой капсулы можно получить, смешивая активное начало с растворителем и заполняя полученной смесью мягкие или твердые капсулы.
Для введения парентеральным путем используются водные суспензии, изотонические солевые растворы или стерильные растворы для инъекций, которые содержат фармакологически совместимые агенты, например пропиленгликоль или бутиленгликоль.
Характеристика биологической активности со-ассоциатов
Противовирусная активность индивидуального гликопептида 6'SLN-nnHKep-Gly 6 - NH-(CH 2 )4-NH-Gly 6 -nnHKep-6'SLN, а также со-ассоциатов (смешанных тектомерных форм) различного состава по изобретению была изучена in vitro в тесте по ингибированию связывания фетуина с вирусом гриппа, адсорбированным на поверхности полистирольных планшетов (методика проведения данного эксперимента описана в US5571836, W098/14215). Так, в частности, в таблице 1 представлены результаты ингибирующей активности со-ассоциатов гликопептида 6'SLN-nHHKep-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH- Gly 6 -nnHKep-6'SLN и пептида Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 )4-NH-Gly 6 -Suc с различным соотношением пептида и гликопептида.
Таблица 1. Относительная активность ингибиторов вируса гриппа A/H1 N1/NIB/23/98M-MA.
со-ассоциат 6'SLN-nMHKep*-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -nMHKep*-6'SLN и 700 Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -Suc, соотношение 1 :10
со-ассоциат 6'SLN-nHHKep*-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -nHHKep*-6'SLN и 1 000 Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -Suc, соотношение 1 :20
Suc-Gly 6 -NH-(CH 2 ) 2 -NH-Gly 6 -Suc 0
[6'SLN- nMHKep * -Gly 7 -NHCH 2 ] 4 C 100
* линкер = -OCH 2 CH 2 CH 2 NHC(0)CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 C(0)-.
Как следует из данных, приведенных в таблице, антивирусная активность неассоциирующего в водных растворах индивидуального гликопептида б'БЬЫ-линкер- Gly 6 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -nnHKep-6'SLN лишь ненамного превышает активность мономерного 6'SLN. Наблюдавшееся увеличение активности, по-видимому, определяется возможностью бидентантного взаимодействия молекул гликопептида с поверхностью вируса. В то же время, антивирусная активность со-ассоциатов гораздо выше: они подавляют взаимодействие фетуина с вирусом гриппа уже в микромолярных концентрациях (1С 50 ~0.1 -10 мкмоль), являясь на 2-3 порядка более мощными ингибиторами, чем мономерный 6'SLN, а также на порядок активнее тетраантенного аналога [3], способного к ассоциации без наличия "разбавителя".
Следует обратить внимание на необычный характер зависимости антивирусной активности со-ассоциатов от их состава, а именно на увеличение активности при формальном снижении содержания гликопептида в со-ассоциате. Этот эффект связан с тем, что при "разбавлении" гликопептидов негликозилированными пептидами уменьшаются стерические препятствия для включения молекул 6'SLN-nnHKep-Gly 6 -NH- (CH 2 ) 4 -NH-Gly 6 -nnHKep-6'SLN в состав ассоциата (тектомера). Кроме того, при "разбавлении" достигаются более благоприятные плотность и распределение 6'SLN-rpynn на поверхности частицы со-ассоциата с точки зрения взаимодействия с вирусом. Дальнейшее "разбавление" (когда соотношение мономеров гликопептид/пептид в составе со-ассоциата превышает 1 : 100) приводит к снижению активности, отнесенной как к мольной, так и к весовой концентрации со-ассоциатов.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения. Библиографический список: N.V.Bovin, A.S.Gambaryan. Rational Design of an Anti-Adhesion Drug for Influenza. In: Combating the Threat of Pandemic Influenza: Drug Discovery Approaches Paul F. Torrence (Editor) Wiley, ISBN: 978-0-470-1 1879-5 October 2007. A.S.Gambaryan, A.B.Tuzikov, A.A.Chinarev, L.R.Juneja, N.V.Bovin, M.N.Matrosovich. Polymeric inhibitor of influenza virus attachment protects mice from experimental influenza infection. Antiviral Res., 55, 201 -205 (2002). A.B.Tuzikov, A.A.Chinarev, A.S.Gambaryan, V.A.OIeinikov, D.V.KIinov, N.B.Matsko, V.A.Kadykov, M.A.Ermishov, I.V.Demin, V.V.Demin, P.D.Rye, N.V.Bovin. Polyglycine II nanosheets: Supramolecular antivirals? ChemBioChem, 4, 147-154 (2003). N.V.Bovin, A.B.Tuzikov, A.A.Chinarev, A.S.Gambaryan. Multimeric glycotherapeutics: new paradigm. Glycoconjugate J., 21 , 471 -478 (2004). A.S.Gambaryan, E.Y.Boravleva, T.Y.Matrosovich, M.N.Matrosovich, H.D.KIenk, E.V.Moiseeva, A.B.Tuzikov, A.A.Chinarev, G.V.Pazynina, N.V.Bovin. Polymer-bound 6' sialyl-N-acetyllactosamine protects mice infected by influenza virus. Antiviral Res., 68, 1 16-123 (2005). A.B.Tuzikov, A.S.Gambaryan, L.R.Juneja, N.V.Bovin. Conversion of complex oligosaccharides into polymeric conjugates and their anti-influenza virus inhibitory potency. J. Carbohydr. Chem., 19, 1 191 -1200 (2000). G.Pazynina, A.Tuzikov, A.Chinarev, P.Obukhova, N.Bovin. Simple stereoselective synthesis of a2-6 sialooligosaccharides. Tetrahedron Lett., 43, 801 1 -8013 (2002). P.A.Chugunov, A.A.Chinarev, A.B.Tuzikov, A.A.Formanovsky, V.V.Prokhorov, A.S.Gambaryan, N.V.Bovin. Monosialoside with multimer-like anti-influenza potency. Mendeleev Communs., 19, 62-63 (2009). S.V.Tsygankova, A.A.Chinarev, A.B.Tuzikov, N.Severin, A.A.Kalachev, J.P.Rabe, A.S.Gambaryan, N.V.Bovin. Biantennary oligoglycines and glyco-oligoglycines self- associating in aqueous medium. Beilstein J. Org. Chem., 10, 1372-1382 (2014). Doi 10.3762bjoc. 10. 140.
Next Patent: METAL FRAME FOR A CAST-IN-SITU REINFORCED CONCRETE COLUMN