本发明是关于 FAM3B基因的抑制剂、 细胞、 载体和组合物及抑制方法以及预防和 / 或治疗疾病的方法和该抑制剂在制药中的应用 ， 更确切地说， 本发明涉及一种 FAM3B 基因的抑制剂、 含有该抑制剂的细胞、 含有该抑制剂的载体、 含有该抑制剂的抑制剂组 合物、抑制 FAM3B基因的表达或抑制 FAM3B基因产物的促进脂质生成活性的方法， 预 防和 /或治疗由 FAM3B基因表达介导的疾病、 以及所述抑制剂在制备用于预防和 /或治疗 由 FAM3B基因表达介导的疾病的药物中的应用。 背景技术

脂肪肝又称肝内脂肪变性， 是指由各种原因引起的肝细胞内脂肪蓄积过多 的病变。 脂肪 含量超过肝重量 （湿重） 的 5% (最高可达 40%-50%)， 或在组织学上超过肝实质 30%时 称为脂肪肝。 脂肪肝可由多种疾病和原因导致， 最常见的诱因为肥胖、 酒精中毒、 糖尿 病， 此外还包括营养失调、 药物中毒、 妊娠等。 随着人们物质生活水平的不断提高， 饮 食结构和生活方式的改变， 脂肪肝的发病率逐年升高， 已达到平均人口的 10%， 在肥胖、 嗜酒和糖尿病人群中可高达 50-60%。 以往认为脂肪肝为良性病变， 进展缓慢。 但是近年 研究发现约 25%的患者发生肝脏纤维化， 1.5-8%的患者发展为肝硬化。 而非酒精性脂肪 肝患者有 20%进展为肝硬化， 其中 30-40%死于肝相关性疾病， 部分发生亚急性肝衰竭和 肝癌。 因此脂肪肝的防治对阻止慢性肝病进展和改善 预后十分重要。

目前， 对脂肪肝的防治尚无有效药物， 在临床治疗中， 仍以去除病因、 积极治疗原 发病和坚持合理饮食制度为主， 而药物仅起辅助作用。 常用药物主要针对降血脂、 肝细 胞保护等方面， 缺乏直接作用于肝脏脂质沉积的有效治疗手段 。

另一方面， 随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变。 以及社会老龄化进程的加 快，高脂血症的发生率不断提高并已成为一种 常见病和多发病。调查显示，我国约有 9000 万人患有高血脂。 高血脂已成为中、 老年人的常见病， 而由此引发的各种心脑血管病已 成为威胁中、 老年人生命的主要的祸首。

血脂主要是指血清中的胆固醇和甘油三酯。 高血脂是各种原因导致的血浆中胆固醇 和 （或） 甘油三酯水平升高的一种疾病， 是引发和加重动脉粥硬化的病理基础及导致动 脉样硬化、 心绞痛、 心肌梗死、 脑梗塞及肾损害等动脉栓塞性疾病而独立危害 因素。 一 般可将高脂血症简单分为高胆固醇血症、 高甘油三酯血症和混合型高血脂症。 我国人群 的膳食是以高糖低脂为特点， 有调查表明， 糖占总热量 76-79%, 脂肪仅占 8. 4-10. 6%, 而高脂血症的发生率达 11%, 以内源性高甘油三酯血浆为最多见。饮酒对血 浆甘油三酯水 平也有明显影响。 在敏感的个体， 即使中等量饮酒亦可引起高甘油三酯血症。 酒精可增 加体内脂质的合成率， 减少氧化脂肪酸的比例， 并增加酯化脂肪酸的比例。 此外， 酒精 还可降低脂蛋白酯酶的活性， 而使甘油三酯分解代谢减慢。

血脂是人体中的一种重要物质， 有许多重要的功能， 但是不能超过一定的范围。 如 果血脂过多， 容易造成"血稠"， 在血管壁上沉积， 形成动脉粥样硬化斑块， 血管壁增厚， 血管内膜变得粗糙， 管腔狭窄， 使血管腔内容易产生血栓， 甚至堵塞管腔。 若发生于冠 状动脉内， 可致心肌供血不足， 发生心绞痛， 甚至心肌梗死， 如果发生在肾脏， 可引起 肾动脉硬化， 肾功能衰竭。 此外， 高血脂可引发高血压， 诱发胆结石、 胰腺炎、 加重肝 炎等疾病。 最近的研究表明， 高甘油三酯血症是冠心病的独立危险因素。 高甘油三酯血 症与冠心病死亡或心血管事件 （心绞痛、 心肌梗塞） 之间直接相关， 或者在伴有低 HDL- 胆固醇水平时直接相关， 或者在伴有低 HDL-胆固醇水平时使这一相关性加强。 高甘油三 酯血症是脂蛋白代谢异常的反映， 往往伴有 HDL水平下降和小的致密的 LDL水平升高。 小的致密的 LDL有强的致动脉粥样硬化作用。 此外， 高甘油三酯血症时， 往往还伴有高 胰岛素血症、 胰岛素抵抗和高凝状态。 极高浓度的 TG还可以导致急性胰腺炎

血脂增高是一个缓慢的过程， 血脂的调节特别是消除血脂的不良影响也同样 需要一 个持续作用的过程， 因此患者应根据自身的不同情况， 选择疗效显著、 毒副作用小的降 脂药。 高血脂症的控制一般需要很长时间甚至终生进 行， 所需要费用相对昂贵， 而且目 前所有降脂药物具有一定的副作用。 目前常用的降脂药有他汀类药物， 贝特类药物， 胆 酸螯合剂， 烟酸和其他降脂药物。 高甘油三酯治疗以药物为主， 中药类降血脂药在降甘 油三酯方面的作用起着越来越重要的做用， 如君山第四代降脂宁颗粒因为效果确切， 副 作用小而在临床上使用的越来越广泛。

近些年来， 人们对 RNAi药物的研发热情空前高涨， RNAi药物在基因疾病、 肿瘤等 人类束手无策的疾病上显现出极大的应用前景 。 RNAi(RNA interference)即 RNA干扰， 是 与靶基因序列同源的双链 RNA所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现 象。 小分子干 扰 RNA (si NA)或小核酸是长度为 19-23个核苷酸的 RNA片段， 这些 RNA片断被证明为 RNA干扰所必需。 siRNA与细胞源性的相关酶和蛋白质共同形成 RNA诱导的沉默复合体 ( RNA-induced silencing complex, RISC )， 在 RNA干扰过程中， 双链 siRNA中的正义链被 排除出复合体， 反义链指导 RISC结合到靶 mRNA的相应位点， 然后由复合物中的核糖核 酸酶 III降解靶 mRNA， 从而关闭靶基因的表达。 RNA干扰现象不仅能提供一种经济、 快 捷、 高效的抑制基因表达的技术手段， 而且有可能在基因功能测定， 细胞信号传导通路， 基因治疗等方面开辟一条新思路。 与传统的小分子药物和抗体想比较， RNAi治疗有如下 优势： ( 1 )由于可以通过对靶基因序列合理的设计药物� �从靶标到药物的过程大大缩短。 ( 2 ) RNAi药物的合成路线基本相同。 （ 3 ) RNAi治疗能够锁定任何基因， 包括非药物 和非蛋白基因。 （4 ) RNAi药物具有高度特异性。 由于有以上优点， 已经有很多制药公 司开始研究开发 RNAi药物。目前针对脂肪肝和高血脂的 siRNA药物在国内外还未有报道， 因此， siRNA用于脂肪肝药物和降血脂药的开发将对脂� ��肝患者和高血脂症患者的预防 和治疗产生重大影响。 发明内容

FAM3B因子是一种在胰腺的胰岛 β细胞中特异性高表达的细胞因子。 人 FAM3B基因 在染色体上定位于 21q22染色体， 含有至少 8个外显子， 编码含 235个氨基酸的蛋白。 最初 于 2002年由美国科学家克隆得到， FAM3B是一种可能在糖尿病病理生理过程中发挥� ��用 的新细胞因子。

本发明人在研究糖尿病的病理过程中对 FAM3B因子进行了深入的研究，意外地发现， FAM3B因子除了可能在糖尿病病理生理过程中发� ��作用以外， FAM3B基因还在肝脏中弥 漫性表达， 说明 FAM3B基因可能在肝脏功能调节中发挥作用。

因此， 本发明人对 FAM3B基因进行了进一步的研究， 使用携带 FAM3B基因的腺病毒 处理野生型小鼠， 可观察到肝脏发生明显的脂肪性变化， 并且该肝脏切片的油红染色显 示出大量的脂肪聚积， 肝脏组织中甘油三酯、 胆固醇酯含量显著增加。 并且肝细胞系中 FAM3B基因的过表达增加了中性脂肪在肝细胞内� ��聚积。 由此可以看出， FAM3B因子可 能参与了脂肪肝形成的过程， 因此， FAM3B基因有可能是预防和 /或治疗脂肪肝的关键因 另一方面， 小肠粘膜在脂肪消化吸收后也可由甘油一酯合 成大量甘油三酯。 不论从 肠道吸收的食物脂类， 还是由肝脏合成的脂类以及脂肪组织动员出来 的储存脂肪， 都必 须通过血液循环才能输送到其他组织。 血液中的甘油三酯含量与小肠对脂肪的吸收和 合 成有直接的关系。研究发现 FAM3B因子在小肠中表达， 因此本发明人对小肠中 FAM3B基 因表达与血液中的甘油三酯含量之间的关系进 行了深入的研究， 结果发现， 在高脂词料 喂的小鼠中， FAM3B基因的表达高于正常小鼠，而且血中甘油� ��酯含量也高于正常小鼠。 通过小干扰核酸抑制 FAM3B基因在小肠中表达， 血液中的甘油三酯含量也明显降低。 由 此可以看出， FAM3B因子可能参与小肠甘油三酯的吸收 /合成， 因此， FAM3B基因有可 能是高血脂的发生的关键因素， FAM3B基因的抑制剂可以用来预防 /治疗高血脂。

基于上述发现， 本发明人完成了本发明。

本发明的第一个目的是提供 FAM3B基因的抑制剂。

本发明的第二个目的是提供一种含有所述抑制 剂的细胞。

本发明的第三个目的是提供一种含有所述抑制 剂的载体。

本发明的第四个目的是提供一种含有所述抑制 剂的抑制剂组合物。

本发明的第五个目的是提供一种抑制 FAM3B基因的表达或抑制 FAM3B基因产物的 促进脂质生成活性的方法。

本发明的第六个目的是提供一种预防和 /或治疗由 FAM3B基因表达介导的疾病的方 法。

本发明的第七个目的是提供所述抑制剂在制备 用于预防和 /或治疗由 FAM3B基因表 达介导的疾病的药物中的应用。

为了实现本发明的第一个目的， 本发明提供了一种抑制剂， 其中， 该抑制剂能够抑 制 FAM3B基因的表达， 以降低 FAM3B基因的表达产物的水平； 或者该抑制剂能够与 FAM3B基因的表达产物结合， 以降低 FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性。

为了实现本发明的第二个目的， 本发明还提供了一种细胞， 其中， 该细胞含有本发 明提供的抑制剂。

为了实现本发明的第三个目的， 本发明还提供了一种载体， 其中， 该载体含有本发 明提供的抑制剂。

为了实现本发明的第四个目的， 本发明还提供了一种抑制剂组合物， 该抑制剂组合 物含有本发明提供的抑制剂作为活性成分。

为了实现本发明的第五个目的，本发明还提供 了一种抑制 FAM3B基因的表达或抑制 FAM3B基因产物的促进脂质生成活性的方法， 其中， 该方法包括使用本发明提供的抑制 剂或抑制剂组合物， 以降低 FAM3B基因的表达产物的水平； 或者使 FAM3B基因的产物 的促进脂质生成的活性降低。

为了实现本发明的第六个目的， 本发明还提供了一种预防和 /或治疗由 FAM3B基因 表达介导的疾病的方法， 其中， 该方法包括： 抑制患者的 FAM3B 基因的表达， 以降低 FAM3B基因的表达产物的水平;或者使 FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性降低。

为了实现本发明的第七个目的， 本发明还提供了所述抑制剂在制备用于预防和 /治疗 由 FAM3B基因表达介导的疾病的药物中的应用。

本发明揭示了 FAM3B基因在由 FAM3B基因表达介导的疾病中的重要作用，从而� �� 预防和 /或治疗由 FAM3B基因表达介导的疾病 （例如， 脂肪肝和由高血脂引发的疾病） 提供一种有效的途径。 附图说明

图 1显示了本发明所提供的 10个鼠源小干扰核酸在体外对 FAM3B 活性靶点的筛选 结果。

图 2显示了本发明所提供的 FAM3B-46样品经静脉给药治疗后， 小鼠肝脏脂肪化程 度的油红 0和 HE染色检测。

图 3显示了本发明所提供的 FAM3B-43到 FAM3B-46样品经静脉给药后对小鼠肝脏 FAM3B mRNA表达抑制效果的检测。

图 4显示了本发明所提供的人源 FAM3B-11到 FAM3B-42样品在体外对细胞 FAM3B mRNA抑制效率的检测。

图 5显示了本发明所提供的人源 FAM3B-17、 FAM3B-2K FAM3B-25、 FAM3B-16、 FAM3B-27 FAM3B- 19 FAM3B-30 FAM3B- 34和 FAM3B-36样品在体外对细胞 FAM3B 蛋白水平抑制效率的检测。

图 6显示了本发明所提供的人源 FAM3B-30样品对诱导的 HepG2细胞脂肪累积抑制 效果的检测。 图 7 显示了本发明所提供的 FAM3B-46 样品经静脉给药后对小鼠小肠 FAM3B mRNA表达抑制效果的检测。

图 8显示了本发明所提供的 FAM3B-46样品按照不同剂量，经静脉给药后小鼠� ��脏 组织甘油三酯和胆固醇水平的检测。

图 9显示了本发明所提供的 FAM3B-46样品按照不同剂量， 经静脉给药后， 对小鼠 血液中甘油三酯和胆固醇水平的检测。 具体实施方式

本发明人对 FAM3B基因进行了详细的研究，发现 FAM3B基因的产物可能参与了由 FAM3B基因表达介导的疾病的过程；并对 FAM3B基因的序列进行了研究，发现 FAM3B 基因的核苷酸序列与 SEQ ID No 1所示的核苷酸序列的同一性可以为 90%以上。 基于上 述发现， 本发明提供了一种抑制剂， 其中， 该抑制剂能够抑制 FAM3B基因的表达， 以降 低 FAM3B基因的表达产物的水平； 或者该抑制剂能够与 FAM3B基因的表达产物结合， 以降低 FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性。

本发明中，对能够抑制 FAM3B基因的表达或者能够与 FAM3B基因的表达产物结合 的抑制剂的种类没有特别的限制， 只要能够实现沉默 FAM3B基因的表达或抑制 FAM3B 基因的促进脂质生成的功能即可。 例如， 所述抑制剂的例子包括但不限制于： 小干扰核 酸、 反义寡核苷酸、抗体、 活性有机化合物、 以及能够抑制 FAM3B基因的表达或能够与 FAM3B基因的表达产物结合的其他抑制剂种类。

根据本发明的一个方面， 所述抑制剂可以为一种或多种反义寡核苷酸， 反义寡核苷 酸为长度为 14-30bp的单链 DNA分子， 并且所述反义寡核苷酸与 FAM3B基因的核苷酸 序列中相配对的核苷酸序列具有 90%以上同一性。

根据本发明的另一个方面， 所述抑制剂可以为一种或多种抗体， 所述抗体可以为单 克隆抗体或多克隆抗体， 既可以是鼠源性抗体也可以是人源化抗体。 从结构上来看， 既 可以是单链抗体也可以是其他抗体类似物， 例如， 包括但不限于核酸适配子 （aptamer) 或 Affibody等。

相应地，本发明还提供了所述的抑制剂在制备 用于诊断由 FAM3B基因表达介导的疾 病的诊断试剂中的应用， 其中， 所述抑制剂为一种或多种抗体， 所述抗体可以为单克隆 抗体或多克隆抗体。 所述疾病可以为脂肪肝， 也可以为高血脂引起的疾病， 其中， 所述 血脂是指血清中的甘油三酯和 /或胆固醇。

根据本发明的另一个方面，所述抑制剂可以为 能够抑制 FAM3B基因的表达或者能够 与 FAM3B基因的表达产物结合的一种或多种活性化� ��物。

根据本发明的另一个方面， 所述抑制剂可以包括一种或多种小干扰核酸， 该小干扰 核酸为双链 RNA 分子， 包括正义链和反义链， 所述小干扰核酸的反义链包含能够与 FAM3B基因的 mRNA序列互补的区域， 该区域的长度小于 30个核苷酸。 优选情况下， 所述小干扰核酸的反义链中， 能够与 FAM3B基因的 mRNA序列互补 的区域的长度可以为至少 15个核苷酸。 所述 FAM3B基因中， 能够与所述小干扰核酸的 反义链互补的区域如 SEQ ID Nos: 2-33中之一所示。

在本发明的一个优选实施方式中， 所述小干扰核酸的核苷酸序列包含 FAM3B-1 至 FAM3B-32中之一所示的核苷酸序列， 或者所述小干扰核酸的核苷酸序列包含 FAM3B-1 至 FAM3B-32中之一所示的核苷酸序列的修饰产物， 其中，

FAM3B-1 正义链： 5，-GCCUGCUCAAGGUGGUGUUdTdT-3，

反义链： 5，-AACACCACCUUGAGCAGGCdTdT-3，；

FAM3B-2 正义链： 5，-UUCGUGGUCUUCGCCUCCUUGdTdT-3，

反义链： 5，-CAAGGAGGCGAAGACCACGAAdTdT-3，；

FAM3B-3 正义链： 5，- CCUGCUCGCAGAGCUCAUUdTdT-3，

反义链： 5， - AAUGAGCUCUGCGAGC AGGdTdT-3，；

FAM3B-4 正义链： 5，- CCAGUGCUGCCUAUAGCAUdTdT-3，

反义链： 5， - AUGCUAUAGGC AGCACUGGdTdT-3 '；

FAM3B-5 正义链： 5，- UGACACCUAUGCCUACAGGUUdTdT-3，

反义链： 5， - AACCUGUAGGCAUAGGUGUCAdTdT-3，； FAM3B-6 正义链： 5，- UACAGGUUACUCAGCGGAGGUdTdT-3，

反义链： 5， - ACCUCCGCUGAGUAACCUGUAdTdT-3 '； FAM3B-7 正义链： 5，- AUCUGCUUUGAGGAUAACCUAdTdT-3，

反义链： 5，- UAGGUUAUCCUCAAAGCAGAUdTdT-3，；

FAM3B-8 正义链： 5，- UGGGAGAACAGCUGGGAAAdTdT-3，

反义链： 5'- UUUCCCAGCUGUUCUCCCAdTdT-3 '；

FAM3B-9 正义链： 5，- GGAAAUGUUGCCAGAGGAAdTdT-3，

反义链： 5 ' - UUCCUCUGGCAACAUUUCCdTdT-3 '；

FAM3B-10 正义链： 5，- GCCAUUGUCAACUAUGUAAdTdT-3，

反义链： 5， - UUACAUAGUUGACAAUGGCdTdT-3 '；

FAM3B-11 正义链： 5，- CUCUGGACCGAUGACAAAGdTdT-3，

反义链： 5， - CUUUGUCAUCGGUCC AGAGdTdT-3 '；

FAM3B-12 正义链： 5，- GCUCUUCAUGGUGACCUAUdTdT-3，

反义链： 5，- AUAGGUCACCAUGAAGAGCdTdT-3，；

FAM3B-13 正义链： 5，- GCACAAGACUGAAUAACGAdTdT-3，

反义链： 5， - UCGUUAUUCAGUCUUGUGCdTdT-3 '；

FAM3B-14 正义链： 5，- GCCAUAGAAGCACUUGGAAdTdT-3，

反义链： 5， - UUCCAAGUGCUUCUAUGGCdTdT-3 '；

FAM3B-15 正义链： 5，- GCACUUGGAAGUAAAGAAAdTdT-3， 反义链: UUUCUUUACUUCCAAGUGCdTdT-3 '； FAM3B-16 正义链 AGUAAAGAAAUCAGGAACAdTdT-3 ' 反义链: UGUUCCUGAUUUCUUUACUdTdT-3 '； FAM3B-17 正义链 GGUCUAGCUGGGUAUUUAUdTdT-3 ' 反义链: AUAAAUACCC AGCUAGACCdTdT-3，； FAM3B-18 正义链 UCCGAAAUUCAGAGAGAAAdTdT-3 ' 反义链: UUUCUCUCUGAAUUUCGGAdTdT-3 '； FAM3B-19 正义链 GAUCAACCACUCUGAUGCUdTdT-3 ' 反义链: AGCAUCAGAGUGGUUGAUCdTdT-3 '； FAM3B-20 正义链 GCUAAGAACAACAGAUAUUdTdT-3 ' 反义链: AAUAUCUGUUGUUCUUAGCdTdT-3 '； FAM3B-21 正义链 CUGCAGAGAUCCAGAUAGAdTdT-3 ' 反义链: UCUAUCUGGAUCUCUGC AGdTdT-3 '； FAM3B-22 正义链 CCAGAUAGAAGGCUGCAUAdTdT-3 ' 反义链: UAUGCAGCCUUCUAUCUGGdTdT-3 '； FAM3B-23 正义链 CUGCAUACCCAAAGAACGAdTdT-3 ' 反义链: UCGUUCUUUGGGUAUGCAGdTdT-3 '； FAM3B-24 正义链 GAGUAAAUGUGUUCUGUAUdTdT-3 ' 反义链: AUACAGAACACAUUUACUCdTdT-3 '； FAM3B-25 正义链 AAACAAAUGCAGCUGGAAUdTdT-3 ' 反义链: AUUCCAGCUGCAUUUGUUUdTdT-3 '； FAM3B-26 正义链 GCCCAUAUUUGAUGAGUAUdTdT-3 ' 反义链: AUACUCAUCAAAUAUGGGCdTdT-3 '； FAM3B-27 正义链 GUUGUAAACCAAUGAACAUdTdT-3 ' 反义链: AUGUUCAUUGGUUUACAACdTdT-3 '； FAM3B-28 正义链 GUAGUGAAGAUGUCAAUUAdTdT-3 ' 反义链: UAAUUGACAUCUUCACUACdTdT-3 '； FAM3B-29 正义链 GAUGUC AAUUAGC AGGAAAdTdT-3 ' 反义链: UUUCCUGCUAAUUGACAUCdTdT-3 '； FAM3B-30 正义链 GCAGGAAACUAAAAUGAAUdTdT-3 ' 反义链: AUUCAUUUUAGUUUCCUGCdTdT-3 '； FAM3B-31 正义链 GAAAGAGGGUUGGGAGAAAdTdT-3， 反义链: UUUCUCCCAACCCUCUUUCdTdT-3，； FAM3B-32 正义链 AGACAGCCCUGCAGAGAGAdTdT-3 ' 反义链: UCUCUCUGCAGGGCUGUCUdTdT-3 优选地， 所述小干扰核酸的核苷酸序列为 FAM3B-3、 FAM3B-7、 FAM3B-1 FAM3B-15 FAM3B-16 FAM3B-17 FAM3B-20 FAM3B-24、 FAM3B-26或 FAM3B-31 所示的核苷酸序列。

最优选地， 所述小干扰核酸的核苷酸序列为 FAM3B-11、 FAM3B-15、 FAM3B-17、 FAM3B-20禾 B FAM3B-24。

根据本发明， 所述修饰为如下修饰中的至少一种：

( 1 ) 对核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修 饰；

(2) 对核苷酸序列中的核糖的 2'-OH的修饰；

(3 ) 对核苷酸序列中的碱基的修饰。

所述化学修饰为本领域技术人员所公知， 所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键 中的氧进行修饰， 包括硫代磷酸修饰， 如式 1所示； 和硼烷化磷酸盐修饰， 如式 2所示。 两种修饰都能稳定小干扰核酸结构， 保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中 2'-OH的修饰， SP， 在核糖的羟基位置引入某些 取代基， 例如， 2'-氟代修饰， 如式 3所示； 2'-氧甲基修饰， 如式 4所示； 2'-氧亚乙基甲 氧基修饰， 如式 5所示； 2,4'-二硝基苯酚修饰， 如式 6所示； 锁核酸 (LNA)， 如式 7所示； 2'-氨基修饰， 如式 8所示； 2'-脱氧修饰， 如式 9所示。

H，

(4) 

(12) (13)

优选情况下， 所述修饰使修饰后的小干扰核酸在细胞内抵抗 核酸酶水解的能力增 强。

此外， 为了促进小干扰核酸进入细胞， 可以在以上修饰的基础上， 在小干扰核酸正 义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团，亲脂 性的基团包括以共价键与小干扰核酸结合， 如末端引入胆固醇、 脂蛋白、 维生素 E等， 以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与 细胞内的 mRNA发生作用。

因此， 在一个优选实施方式， 其中， 所述小干扰核酸的正义链末端连接有胆固醇分 子。

在另一个优选实施方式， 其中， 所述小干扰核酸的正义链和反义链中的至少一 个链 与配体连接。

同时， 小干扰核酸也可以进行非共价键修饰， 如通过疏水键或离子键结合磷脂分子、 多肽、 阳离子聚合物等增加稳定性和生物学活性。

本发明提供的小干扰核酸的制备方法包括小干 扰核酸序列的设计和小干扰核酸的制 备。

所述小干扰核酸的设计是指选择 FAM3B 基因的 cDNA 序列 （ SEQ ID NO. 1 ) (Genebank登记号为 NM_058186)为模板，针对 FAM3B基因的的保守区，选取 15-27bp 的核苷酸序列， 设计相应的小干扰核酸。

所述针对 FAM3B基因的小干扰核酸序列设计按以下原则进� ��：

在 FAM3B基因的 cDNA序列的 l-1384bp的范围内选取 15-27bp长度的核苷酸序列。 15-27bp的核苷酸序列的选取主要参考以下几项� �则： （1 ) GC含量在 35-60%之间， （2) 避免处于重复序列或低复杂性序列区域内， （3 )避免出现 4个以上的连续碱基序列， （4) 避免含有单核苷酸多态性位点， （5 ) 避免处于读码框起始密码和终止密码的 50-100bp区 域之内， 除此之外， 还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质。 通过 BLAST分析， 将候 选小干扰核酸靶位点同人类基因序列进行同源 性比对， 排除同其它基因有很大的序列同 源性 （14个以上碱基） 的序列， 以确保候选小干扰核酸靶位点不会对其他非相 关基因发 生抑制作用， 而仅对 FAM3B基因具有特异的抑制作用。 最后将这样获得的 15-27bp核苷酸序列的 3'末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为 小干扰核酸序列的正义链， 在此 15-27bp核苷酸序列的互补序列的 3'末端加上两个脱氧 胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链 。

根据本发明， 所述小干扰核酸的制备方法为本领域技术人员 所公知， 例如， 所述小 干扰核酸可以通过化学合成得到， 或者通过质粒和 /或病毒载体的表达而得到。

所述小干扰核酸序列的合成可以采用化学合成 的方法， 或者委托专门从事核酸合成 的生物技术公司合成， 如委托上海 GenePharma公司进行合成。

一般来说，所述化学合成的方法包括以下四个 过程：（1 )寡聚核糖核苷酸的合成；（2) 脱保护； （3 ) 纯化分离； （4) 脱盐。

例如， 具有 FAM3B-1所示的核苷酸序列的小干扰核酸的化学� �成的具体步骤如下：

( 1 )寡聚核糖核苷酸的合成：寡聚核糖核苷酸的� �成是在自动 DNA/RNA合成仪（例 如， Applied Biosystems EXPEDITE8909)上进行， 根据 FAM3B-1所示的核苷酸序列的顺 序将对应的核苷酸逐个连接起来。由于小干扰 核酸是由一段 15-27个寡聚核糖核苷酸和 2 个脱氧胸苷酸组成。 因此， 起始物为固相连接的 5'-0-对二甲氧基-胸苷， 具体的每一个 循环合成可分为四步来完成， 第一步是将与固定连接的胸苷上 5'位的保护基在三氯乙酸 的作用下洗脱； 第二步在活性催化剂 S-乙基四唑的作用下， 将 5'-0-对二甲氧基三苯甲基 -胸苷亚磷酰胺偶联至已脱去保护的上一个胸� �上， 形成二胸苷亚磷酸三酯， 偶合时间、 偶合次数均按仪器厂家提供的程序来完成；第 三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在 0.05M 碘水作用下， 氧化成二胸苷磷酸三酯； 第四步是乙酰化， 将固相上的少量未反应的活性 基团 （例如， 羟基和胺基） 在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺， 从而达到封闭的作用， 以 减少整体副产物的产生， 重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2) 脱保护

将合成好的固相小干扰核酸放入至一个可以密 封的小瓶中， 并加入 1毫升的乙醇 /胺 (体积比为 1 : 3), 然后密封， 置于 55-70°C温箱中， 孵育 2-30小时， 取出溶液， 并将固 相再次用双蒸水洗脱， 收集洗脱液， 并干燥去除溶剂。 然后， 加入 1毫升四丁基氟化铵 的四氢呋喃溶液 （1M)， 室温放置 4-12小时， 再经过乙醇沉淀， 得到小干扰核酸的粗产 物。

(3 ) 纯化分离

将小干扰核酸的粗产物溶解于 2毫升的乙酸铵水溶液中， 然后经过 C18高压液相色 谱的分离， 按照 C18高压液相色谱的标准程序， 运用梯度洗脱的方法， 收集小干扰核酸 主产物（洗脱液 A: 0.1M乙酸铵； 洗脱液 B: 20重量 ¾^ 0.1M乙酸铵和 80重量％的乙 腈），除去主产物中的溶剂，并加入 5毫升 80重量％的乙酸水溶液，在室温静置 15分钟， 然后将此溶液按照 DEAE-5PW交换柱的标准程序进行阴离子交换的分� �� （DEAE-5PW, 阴离子交换柱）， 即可得到纯度在 90重量％以上的小干扰核酸 （梯度洗脱， 洗脱液 A: 0.025M的 Tris-HCl， 0.025M的 NaCl， pH = 8， 5重量％的乙腈； 洗脱液 B: 0.025M的 Tris-HCl, 2.0M的 NaCl， pH = 8， 5重量％的乙腈）。

(4) 脱盐

纯化的小干扰核酸经过透析， 除去盐份， 随后将小干扰核酸溶液进行过滤消毒和干 燥结晶。 然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸经过退 火处理形成稳定的双链小干扰核 酸，其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核 苷酸混合溶解在 1-2毫升的缓冲液中（lOmM Tris, pH = 7.5-8.0, 50mM NaCl)， 将此溶液加热至 95°C， 然后缓缓将此溶液冷却至室温， 最后将此溶液存放在 4°C冰箱中保存， 以备随时使用。

除化学合成外， 小干扰核酸还可通过质粒和 /或病毒载体的表达而得到， 得到具有发 夹结构的 shRNA, 其长度为 50-90个核苷酸。 shRNA的结构为：

两端为酶切位点（例如 BamHI和 EcoRI)，中间为一段 loop序列（例如 GAAGCTTG), 通过克隆技术将其插入到用相应内切酶酶切过 的载体中， 再整合到染色体中， 即可稳定 表达小干扰核酸，

例如， 5 '-GATCCG-正义链 GAAGCTTG-反义链 TTTTTTGGAATT-3 '。

本发明还提供了一种细胞， 其中， 该细胞含有本发明提供的抑制剂。 所述细胞可以 为常用的哺乳动物细胞， 例如人体细胞。

本发明还提供了一种载体， 其中， 该载体含有本发明提供的抑制剂。

本发明还提供了一种抑制剂组合物， 其中， 该抑制剂组合物含有本发明提供的抑制 剂作为活性成分。

优选情况下， 所述抑制剂组合物还可以含有载体， 该载体的用量没有特别的限制， 例如， 相对于 100重量份的所述抑制剂， 所述载体的含量可以为 100-10000000重量份。 所述载体的种类可以在很大范围内改变， 例如， 可以为脂质体、 纳米粒、 多肽复合物、 蛋白复合物、 脂类复合物、 阳离子高分子、 树状结构的多聚物以及其他高分子和大分子 材料中的一种或几种。

根据本发明的一个方面， 所述药物组合物可以为注射液。

本发明中， 所述注射液还可以含有药学上可接受的辅料， 所述药学上可接受的辅料 的量可以在很大范围内改变， 优选情况下， 相对于 100重量份的抑制剂， 所述药学上可 接受的辅料的含量为 100-10000000重量份。

本发明中，对所述药学上可接受的辅料没有特 别的限制，例如，可以是 pH值为 4.0-9.0 的磷酸缓冲液、 pH值为 7.5-8.5 的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液、 生理盐水或 pH为 5.5-8.5 的磷酸盐缓冲液， 优选情况下， 所述药学上可接受的辅料为 pH值为 4.0-9.0的磷 酸缓冲液。

根据本发明， 所述注射液还可以含有保护剂和 /或渗透压调节剂； 以所述注射液为基 准， 所述保护剂的含量为 0.01-30重量％， 所述保护剂选自肌醇、 山梨醇和蔗糖中的一种 或几种； 所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透 压为 200-700毫渗摩尔 /千克， 所 述渗透压调节剂为氯化钠和 /或氯化钾。 当注射本发明所述药用组合物时， 注射用量可以为本领域常用的剂量， 例如， 单次 注射 l-1000mg/kg体重； 在具体的使用中， 所述剂量可以由医师根据各种参数、 尤其根 据待治疗患者的年龄、 体重和病症的严重程度来确定。

本发明还提供了一种抑制 FAM3B基因的表达或抑制 FAM3B基因产物的促进脂质生 成活性的方法， 其中， 该方法包括使用本发明提供的抑制剂或抑制剂 组合物， 以降低 FAM3B基因的表达产物的水平;或者使 FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性降低。

本发明还提供了一种预防和 /或治疗由 FAM3B基因表达介导的疾病的方法， 其中， 该方法包括： 抑制患者的 FAM3B基因的表达， 以降低 FAM3B基因的表达产物的水平； 或者使 FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性降低。� ��述抑制患者的 FAM3B基因的 表达， 以降低 FAM3B基因的表达产物的水平； 或者使 FAM3B基因的产物的促进脂质生 成的活性降低的方法没有特别的限制，本领域 的技术人员在理解本发明的内容的情况下， 可以进行合适的选择， 例如， 该方法可以包括： 向患者给药本发明提供的抑制剂或抑制 剂组合物。

在一种优选的实施方式中， 所述所述由 FAM3B基因表达介导的疾病为脂肪肝。 在另一种优选的实施方式中，所述由 FAM3B基因表达介导的疾病为高血脂引起的疾 病， 其中， 所述血脂是指血清中的甘油三酯和 /或胆固醇。

本发明还提供了所述抑制剂在制备用于预防和 /或治疗由 FAM3B基因表达介导的疾 病的药物中的应用。优选地，所述由 FAM3B基因表达介导的疾病为脂肪肝或者为由高� �� 脂引起的疾病， 其中， 所述血脂是指血清中的甘油三酯和 /或胆固醇。

下面结合实施例进一步说明本发明， 除非特别说明， 本发明所用到的试剂、 培养基 均为市售商品。 实施例 1

人源 FAM3B基因小干扰核酸的设计与合成

选择序列相对保守的人源 FAM3B基因 cDNA序列（Genbank登记号为 NM_058186)

( SEQ ID NO. 1 )的 l-1384bp的范围内选取 19-21bp长度的核苷酸序列。在获得的 19-21bp 核苷酸序列的 3'末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干� ��核酸序列的正义链， 在此 19-21bp 核苷酸序列的互补序列的 3'末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干� ��核酸 序列的反义链。 核苷酸序列见表 1。

选取 19-21bp核苷酸序列的选取主要参考以下几项原� �：

( 1 ) GC含量在 35-60%之间；

(2) 避免处于重复序列或低复杂性序列区域内；

(3 ) 避免出现 4个以上的连续碱基序列；

(4) 避免含有单核苷酸多态性位点；

(5) 避免处于读码框起始密码和终止密码的 50-100bp区域之内。 除此之外， 还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质。通 过 BLAST分析， 将小干扰 核酸靶位点同人基因组序列进行同源性比对， 排除同其它基因有很大的序列同源性 （14 个以上碱基） 的序列， 以确保小干扰核酸不会对其他基因发生抑制作 用。

设计完成的小干扰核酸由上海吉玛 （GenePharma) 公司进行化学合成。 实施例 2

鼠源 FAM3B基因小干扰核酸的设计与合成

为了进行动物实验， 选择序列相对保守的小鼠 FAM3B基因 cDNA序列 （Genbank 登记号为 NM_020622) ( SEQ ID NO. 44) 的 l-871bp的范围内选取 19-21bp长度的核苷 酸序列， 按照实施例 1中的原则进行 siRNA设计， 核苷酸序列见表 2。

设计完成的小干扰核酸由上海吉玛 （GenePharma) 公司进行化学合成。 实施例 3小干扰核酸化学修饰

为了增强小干扰核酸的稳定性， 提高给药的肝靶向， 针对鼠源 FAM3B基因小干扰 核酸进行化学修饰设计， 设计原则是： 对小干扰核酸正义链的 U、 C和 G核苷酸戊糖的 2'-OH进行 2'-氧甲基修饰， 末端连接胆固醇； 反义链 U和 C 核苷酸戊糖的 2'-OH进行 2'-氟代修饰， 并委托上海吉玛公司合成化学修饰的小干扰核 酸。 修饰的小干扰核酸 FAM3B-43至 FAM3B-46序列信息见表 3。 实施例 4

鼠源 FAM3B基因小干扰核酸活性细胞水平鉴定

( 1 ) 含小干扰核酸靶位点质粒构建

将小干扰核酸对应靶点的 DNA Oligo 连接到含有双荧光报告基因的高效表达载体 siQuant,转化 ToplO感受态细胞，最后按照 Promega说明书用质粒提取试剂盒提取质粒。

(2) HEK293a细胞的培养

用含有 10%胎牛血清、 2mM L-谷胺酰胺、 ΙΟΟμ/ml青霉素、 lOi^g/ml链霉素的 DMEM 培养液在 37°C条件下， 及 C0 ₂ 含量为 5 %的培养箱中进行培养， 每 48小时传代， 更换新 鲜培养基。

(3 ) HEK293a细胞的转染

按照 Lipofectamine ^TM 2000脂质体 （Invitrogen) 说明书进行转染， 将对照质粒、 含小 干扰核酸靶位点的质粒和对应小干扰核酸 （FAM3B-33至 FAM3B-42) 分别进行共转染， 小干扰核酸的最终浓度为 10 nM。 以无关小干扰核酸作为阴性对照： （正义链： 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3； 反义链： 5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 )， 转染后 24小时弃培养基， 收集细胞， 进行双荧光素酶活性检测。

(4) 活性检测 PBS缓冲液冲洗细胞 3次， 每次 5min _; 加入细胞裂解液， 充分裂解后加入荧光素 酶催化底物显色 10min， 加入终止液检测荧光信号强度， 并计算小干扰核酸的抑制率， 结果如图 1所示。

从图 1可以看出， 本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-33至 FAM3B-42能够高效抑制 FAM3B靶点活性，特别是小干扰核酸 FAM3B-34、 FAM3B-35、 FAM3B-38 FAM3B-39 FAM3B-40、 FAM3B-41和 FAM3B-42对 FAM3B基因的抑制活性分别达到 80-97%，说明 本发明提供的小干扰核酸针对 FAM3B基因位点有很好的抑制活性。 实施例 5

小干扰核酸治疗动物脂肪肝

( 1 ) 小鼠脂肪肝模型的诱导。 C57BL/6J 小鼠 （购自北京大学医学部实验动物科学 部）， 雄性， 8-10周龄， 10只， 分两组 （正常饮食和 MCD饮食）。 MCD (高脂、 蛋氨酸 一胆碱缺乏） 饮食是本领域研究非酒精性脂肪肝常用的方案 。 处理 10-16周， 得到小鼠 脂肪肝模型。

(2) 小干扰核酸治疗脂肪肝

将实施例 3中修饰后的 FAM3B-43至 FAM3B-46小干扰核酸 1.2mg (0.09μηιο1) 溶 解于 1.5ml无 RNA酶的无菌生理盐水中， 配制成浓度为 60μηκ)1/ί的小干扰核酸溶液， 并与载体材料按照一定比例混合。将混合处理 后的小干扰核酸加入到 5ml无 RNA酶的无 菌生理盐水（小干扰核酸浓度为 0.25mg/ml) 中， 得到注射液。 分别使用注射液通过常规 的尾静脉注射对步骤 （1 ) 得到的脂肪肝模型小鼠进行注射， 注射的体积为 10ml的注射 液 I kg体重， 空白对照组注射相同体积的生理盐水， 每 3天注射 1次。

(3 ) 小干扰核酸治疗脂肪肝效果检测

治疗 15天后处死动物留取肝脏组织切片检测脂质聚� �� （油红 0染色， 石蜡切片 HE 染色）， 结果如图 2; 图 2结果显示， 小干扰核酸 FAM3B-46能够有效降低小鼠肝脏脂肪 化程度， 并在 2.5mg/kg、 5mg/kg和 10mg/kg有良好的剂量依赖关系

提取肝脏组织 RNA， real-time PC 方法检测小干扰核酸 FAM3B-43至 FAM3B-46 对肝脏 FAM3B mRNA的抑制率，结果如图 3所示。本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-43 至 FAM3B-46 能够显著降低肝脏 FAM3B 基因的表达； 特别是通过小干扰核酸 FAM3B-45、 FAM3B-46对肝脏 FAM3B基因表达抑制率均达到了 60%以上。

从上述实验可以看出， 本发明提供的抑制物通过抑制 FAM3B基因的表达， 或者抑 制 FAM3B基因的产物的活性， 能够显著的抑制肝细胞内脂质聚积， 可用于预防和 /或治 疗脂肪肝。 实施例 6

小干扰核酸抑制 HepG2细胞 FAM3B表达

( 1 ) HepG2细胞的培养

用含有 10%胎牛血清、 2mM L-谷胺酰胺、 380ug/ml G418的 DMEM完全培养基， 在 24孔细胞培养板上以 IxlO ⁵ 个细胞 /孔的密度接种 HepG2细胞 （购自 ATCC)， 在温度 为 37°C及 C02含量为 5 %的培养箱中进行培养， 每 72小时传代、 更换新鲜培养基。

(2) 小干扰核酸的转染

在转染前 24小时， 用 0.25%的胰酶消化细胞， 计数， 然后以 lx 10 ⁵ 个细胞 /ml的浓度 接种到 24孔板， 每孔 1000μ1。使用 Invitrogen公司的 Lipofectamine ^TM 2000脂质体对实施 例 1得到的小干扰核酸 FAM3B-1至 FAM3B-32分别进行转染， 以无关小干扰核酸（正义 链 ： 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ； 反 义 链 ： 5-ACGUGACACGUUC GGAGAATT-3 ) 作为阴性对照。

(3 ) 小干扰核酸对 FAM3B基因 mRNA表达的抑制作用

转染 24h后， 收集细胞， 按照 Promega说明书提取总 RNA， 通过 real-time PC 分 别检测 （2) 中转染了小干扰核酸 FAM3B-1至 FAM3B-32的 HepG2细胞中 FAM3B基 因 mRNA的表达量。 FAM3B的引物为： 上游引物： 5，-aatccctgctcttcatggtg-3，， 下游引物： 5 '-gagttccaagccttttgctg-3 '； 以 β-actin 作为内参基因， 其引物为： 上游引物： 5 '-ctgggacgacatggagaaaa-3 ' , 下游引物： 5 '-aaggaaggctggaagagtgc-3 根据下式计算小干扰 核酸抑制活性， 结果如图 4所示。

小干扰核酸抑制活性 = [1- (小干扰核酸转染后的 FAM3B基因的拷贝数 /小干扰核酸 转染后的 β-actin拷贝数） /(对照孔 FAM3B基因的拷贝数 /对照孔 β-actin拷贝数 )] <100%。

从图 4可以看出， 本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-1至 FAM3B-32能够显著抑制 HepG2 细胞中 FAM3B基因的表达， 特别是通过小干扰核酸 FAM3B-20、 FAM3B-1K FAM3B-24、 FAM3B-15、 FAM3B-17对 HepG2细胞 FAM3B mRNA抑制率均达到了 80 %以上， 说明本发明提供的小干扰核酸能够显著抑制 HepG2细胞 FAM3B基因的表达。

(4) 小干扰核酸抑制 FAM3B蛋白表达

按照实施例 6步骤 （2)转染的细胞， 培养 48h后， 用蛋白提取裂解液裂解细胞， 提 取总蛋白， 按照 Western blot标准程序进行检测。 对于 FAM3B蛋白的检测， 转移膜用兔 源抗 FAM3B的抗体（R&D systems)进行孵育，二抗是过氧化物酶标记的马� ��兔抗体（中 衫金桥）； 内参对照 β-actin的检测抗体为： 一抗是鼠源抗 β-actin抗体， 二抗采用过氧化 物酶标记的羊抗鼠抗体， 结果进行灰度比较， 如图 5。从图 5可以看出， 本发明提供的小 干扰核酸 FAM3B-20、 FAM3B-1K FAM3B-24、 FAM3B-15、 FAM3B-17 能够显著抑制 HepG2细胞中 FAM3B的蛋白表达。 实施例 7

小干扰核酸抑制 HepG2细胞脂质聚积

( 1 ) HepG2细胞脂质聚积的诱导

以每孔 2x l0 ⁴ 细胞 /lmL接种于 24孔培养板， 每孔加入 20%医用脂肪乳剂 2ml/L， 培养 48小时。 终止培养， 进行油红 0染色， 观察细胞内脂质情况， 具体操作如下： PBS 冲洗细胞 3次， 每次 5min; 50%异丙醇固定细胞 lmin; 油红 0染液染色 lOmin; 蒸馏水 冲洗细胞 3次， 每次 lmin; 显微镜下观察和采集照片。 正常情况下细胞应没有或有少量 着色， 医用脂肪乳剂诱导后细胞内大量脂质聚积， 油红 0染色后镜下可见红色脂滴。

(2) HepG2细胞脂质聚积抑制效果的检测

检测小干扰核酸 FAM3B-20对细胞内脂质聚积的抑制效果， 具体步骤如下： 以每孔 lxlO ⁴ 细胞 /lmL接种于 24孔培养板， 20%医用脂肪乳剂诱导 48小时后， 每孔分别加入 小干扰核酸和 Lipofectamine ^TM 2000脂质体 （Invitrogen) 进行转染， 小干扰核酸的最终浓 度为 50 nM。 以无关小干扰核酸 （正义链： 5-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3; 反义 链： 5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 )作为阴性对照。转染后 48小时弃培养基， 进 行油红 0 染色。具体操作参照步骤 (1)。通过计算机彩色图像分析系统上进行灰度 分析（灰 度值越小， 油红染色越深， 脂肪沉积面积越大， 强度越大）， 结果如图 6所示。

从图 6可以看出， 本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-20能够显著抑制肝细胞内脂质 聚积。

从上述实验可以看出，本发明提供的抑制物通 过抑制 FAM3B基因的表达，或者抑制 FAM3B 基因的产物的活性， 能够显著的抑制肝细胞内脂质聚积， 可用于预防和 /或治疗 脂肪肝。 实施例 8小干扰核酸治疗人脂肪肝的效果

将特殊修饰的小干扰核酸经过一定的制剂加工 ， 开展治疗脂肪肝的人体实验。 所选 的受试者均为中度到重度的脂肪肝患者， 给药治疗前， 先对病人的病情和生理状况做严 格评价。 以 lmg/kg体重 /3天的给药剂量， 通过静脉给药， 治疗一段时间后， 15天， 30 天， 60天后， 比较治疗前后病情和生理状况的变化， 对该发明的小干扰核酸制剂治疗脂 肪肝的效果进行评价。 实施例 9抗 FAM3B抗体治疗脂肪肝的效果

我们通过表达和纯化 FAM3B蛋白， 并免疫小鼠， 产生了抗 FAM3B多克隆抗体。 抗体效价为 1:10000。 抗体经过 protein A柱纯化之后， 得到的 IgG组分， 用于对小鼠的 注射。注射量控制在每公斤体重 O.lug至 10mg之间， 并发现此抗体使脂肪肝具有明显的 降低、 并使血液 TG (甘油三酯） 水平有一定的降低。 我们进一步制备了抗人 FAM3B多 克隆抗体、 单克隆抗体、 单链抗体、 并进行了该抗体的人源化。 已经开始人源化的单克 隆抗体和单链抗体在动物中对降低脂肪肝程度 以及降低各种血脂指标的研究。 实施例 10小鼠高血脂模型的建立

小鼠高脂血症模型采用高脂词料致高血脂症法 ， C57BL/6J小鼠维通利华订购，雄性， 3周龄。 高脂词料配方如下： 基础词料 83.5%、 猪油 12%、 1% 胆固醇， 10%猪油， 0.2% 丙硫氧嘧， 0.3 %脱氧胆酸钠， 5% 蔗糖， 由军事医学科学院实验动物中心依据加工生产 。 处理 3-4周， 得到小鼠高血脂模型。 实施例 11 FAM3B基因小干扰核酸抑制肝中 F基因蛋白质表达

FAM3B 基因小干扰核酸 FAM3B-46 在利用胆固醇 （cholesterol) 标记或用脂质体 (liposome)包被后， 通过尾部注射注入高血脂模型小鼠体内。 连续 7天注射， 每天注射 一次， 7天后取材。 注射标准剂量分别为是每公斤体重 2.5mg、 5mg和 10mg。 其他剂量 如每公斤体重 O.lmg小核酸 -每公斤体重 50mg小核酸也在尝试中。 标准剂量的小核酸 药物能将肝中的 FAM3B的蛋白表达降低 40%而对照的与 FAM3B不相关的小核酸不能明 显降低肝中 FAM3B的蛋白的表达。 实施例 11 FAM3B基因小干扰核酸抑制肠中 F基因 mRNA表达

FAM3B基因小干扰核酸 FAM3B-46在利用胆固醇标记或用脂质体包被后，� ��过尾部 注射注入高血脂模型小鼠体内。连续 7天注射， 每天注射一次， 7天后取材。注射标准剂 量分别为是每公斤体重 2.5mg、 5mg和 10mg。其他剂量如每公斤体重 O.lmg小核酸 -每公 斤体重 50mg小核酸也在尝试中。 标准剂量的小核酸药物能将肠中的 FAM3B的 mRNA 表达降低 45%而对照的与 FAM3B不相关的小核酸不能明显降低肠中 FAM3B的 mRNA 的表达， 结果如图 7。

实施例 12 FAM3B基因小干扰核酸抑制肠中 F基因蛋白质表达

FAM3B基因小干扰核酸 FAM3B-46在利用胆固醇标记或用脂质体包被后，� ��过尾部 注射注入高血脂模型小鼠体内。注射标准剂量 分别为是每公斤体重 2.5mg、 5mg和 10mg。 连续 7天注射， 每天注射一次， 7天后取材。 其他剂量如每公斤体重 O.lmg小核酸 - 每 公斤体重 50mg小核酸也在尝试中。标准剂量的小核酸药� �能将肠中的 FAM3B的蛋白表 达降低 30%而对照的与 FAM3B不相关的小核酸不能明显降低肠中 FAM3B的蛋白的表 达。 实施例 13 FAM3B基因小干扰核酸抑制肝中 TG和胆固醇水平

FAM3B基因小干扰核酸 FAM3B-46在利用胆固醇标记或用脂质体包被后，� ��过尾部 注射注入高血脂模型小鼠体内。注射标准剂量 分别为是每公斤体重 2.5mg、 5mg和 10mg。 连续 7天注射， 每天注射一次， 7天后取材。 其他剂量如每公斤体重 O. lmg小核酸至每 公斤体重 50mg小核酸也在尝试中。 甘油三酯 （TG) 和胆固醇检测试剂盒采用中生北控 生物科技股份有限公司产品， 用 SABA/18全自动生化分析仪测定。 测定方法参照中生北 控试剂说明书， 取血前禁食 16小时。 每公斤体重 5mg和 10mg小核酸能将肝中的 TG水 平降低 20-40%而对照的与 FAM3B不相关的小核酸不能明显降低肝中 TG的水平。同时， 检测了肝脏中胆固醇水平， 结果显示每公斤体重 10mg 小核酸能将肝中的胆固醇水平降 低 15-30%而对照的与 FAM3B不相关的小核酸不能明显降低肝中胆固醇� ��水平， 结果如 图 8所示。 实施例 14 FAM3B基因小干扰核酸抑制血液中 TG和胆固醇水平

FAM3B基因小干扰核酸 FAM3B-46在利用胆固醇标记或用脂质体包被后，� ��过尾部 注射注入高血脂模型小鼠体内。注射标准剂量 分别为是每公斤体重 2.5mg、 5mg和 10mg。 连续 7天注射， 每天注射一次， 7天后取材。 其他剂量如每公斤体重 O. lmg小核酸 - 每 公斤体重 50mg小核酸也在尝试中。标准剂量的小核酸药� �以及每公斤体重 10mg小核酸 能将血液中的 TG水平降低 25-50%而对照的与 FAM3B不相关的小核酸不能明显降低血 液中 TG 的水平， 而检测血液中的胆固醇结果显示标准剂量的小 核酸药物以及每公斤体 重 10mg小核酸能将血液中的胆固醇水平降低 25-50%而对照的与 FAM3B不相关的小核 酸不能明显降低血液中胆固醇的水平， 结果如图 9所示。 表 1

编号 小干扰核酸的核苷酸序列 攻击范围 靶位点

FAM3B-1 正义链 5， - GCCUGCUCAAGGUGGUGUUdTdT- 3， 166-184 SEQ ID: NO. 2 反义链 5， - AACACCACCUUGAGCAGGCdTdT- 3，

FAM3B-2 正义链 5， -UUCGUGGUCUUCGCCUCCUUGdTdT-3 ' 183-203 SEQ ID: NO. 3 反义链 5 ' -CAAGGAGGCGAAGACCACGAAdTdT-3 '

FAM3B-3 正义链 5， - CCUGCUCGCAGAGCUCAUUdTdT- 3， 224-242 SEQ ID: NO. 4 反义链 5， -AAUGAGCUCUGCGAGCAGGdTdT-3 '

FAM3B-4 正义链 5 ' - CCAGUGCUGCCUAUAGCAUdTdT- 3 ' 259-277 SEQ ID: NO. 5 反义链 5， -AUGCUAUAGGCAGCACUGGdTdT-3 '

FAM3B-5 正义链 5， - UGACACCUAUGCCUACAGGUUdTdT- 3， 359-379 SEQ ID: NO. 6 反义链 5 ' -AACCUGUAGGCAUAGGUGUCAdTdT-3 '

FAM3B-6 正义链 5， - UACAGGUUACUCAGCGGAGGUdTdT- 3， 372-392 SEQ ID: NO. 7 反义链 5， -ACCUCCGCUGAGUAACCUGUAdTdT-3 '

FAM3B-7 正义链 5， -AUCUGCUUUGAGGAUAACCUAdTdT-3 ' 414-434 SEQ ID: NO. 8 反义链 5， - UAGGUUAUCCUCAAAGCAGAUdTdT- 3，

FAM3B-8 正义链 5 ' -UGGGAGAACAGCUGGGAAAdTdT-3 ' 439-457 SEQ ID: NO. 9 反义链 5， -UUUCCCAGCUGUUCUCCCAdTdT-3 '

FAM3B-9 正义链 5 ' -GGAAAUGUUGCCAGAGGAAdTdT-3 ' 453-471 SEQ ID ： 反义链 5， - UUCCUCUGGCAACAUUUCCdTdT- 3， NO. 10

FAM3B-10 正义链 5， -GCCAUUGUCAACUAUGUAAdTdT-3 ' 480-498 SEQ ID ： 反义链 5， - UUACAUAGUUGACAAUGGCdTdT- 3， NO. 11

FAM3B-11 正义链 5 ' -CUCUGGACCGAUGACAAAGdTdT-3 ' 548-568 SEQ ID ： 反义链 5， - CUUUGUCAUCGGUCCAGAGdTdT- 3， NO. 12

FAM3B-12 正义链 5， - GCUCUUCAUGGUGACCUAUdTdT- 3， 596-614 SEQ ID ： 反义链 5， - AUAGGUCACCAUGAAGAGCdTdT- 3， NO. 13

FAM3B-13 正义链 5， -GCACAAGACUGAAUAACGAdTdT-3 ' 625-643 SEQ ID ： 反义链 5， - UCGUUAUUCAGUCUUGUGCdTdT- 3， NO. 14

FAM3B-14 正义链 5， -GCCAUAGAAGCACUUGGAAdTdT-3 ' 654-672 SEQ ID ： 反义链 5， - UUCCAAGUGCUUCUAUGGCdTdT- 3， NO. 15

FAM3B-15 正义链 5 ' -GCACUUGGAAGUAAAGAAAdTdT-3 ' 663-681 SEQ ID ： 反义链 5， - UUUCUUUACUUCCAAGUGCdTdT- 3， NO. 16

FAM3B-16 正义链 5 ' -AGUAAAGAAAUCAGGAACAdTdT-3 ' 672-690 SEQ ID ： 反义链 5 ' -UGUUCCUGAUUUCUUUACUdTdT-3 ' NO. 17

FAM3B-17 正义链 5， - GGUCUAGCUGGGUAUUUAUdTdT- 3， 700-718 SEQ ID ： 反义链 5 ' - AUAAAUACCCAGCUAGACCdTdT- 3 ' NO. 18

FAM3B-18 正义链 5 ' - UCCGAAAUUCAGAGAGAAAdTdT- 3 ' 744-762 SEQ ID ： 反义链 5， - UUUCUCUCUGAAUUUCGGAdTdT- 3， NO. 19

FAM3B-19 正义链 5， - GAUCAACCACUCUGAUGCUdTdT- 3， 764-784 SEQ ID ： 反义链 5， - AGCAUCAGAGUGGUUGAUCdTdT- 3， NO. 20

FAM3B-20 正义链 5， - GCUAAGAACAACAGAUAUUdTdT- 3， 780-798 SEQ ID ： 反义链 5， - AAUAUCUGUUGUUCUUAGCdTdT- 3， NO. 21 FAM3B-21 正义链 5 ' -CUGCAGAGAUCCAGAUAGAdTdT- 3 ' 808-826 SEQ ID ： 反义链 5， - UCUAUCUGGAUCUCUGCAGdTdT- 3， NO. 22

FAM3B-22 正义链 5 ' - CCAGAUAGAAGGCUGCAUAdTdT- 3 ' 818-836 SEQ ID ： 反义链 5， - UAUGCAGCCUUCUAUCUGGdTdT- 3， NO. 23

FAM3B-23 正义链 5 ' -CUGCAUACCCAAAGAACGAdTdT- 3 ' 830-848 SEQ ID ： 反义链 5， - UCGUUCUUUGGGUAUGCAGdTdT- 3， NO. 24

FAM3B-24 正义链 5 ' -GAGUAAAUGUGUUCUGUAUdTdT- 3， 869-887 SEQ ID ： 反义链 5， - AUACAGAACACAUUUACUCdTdT- 3， NO. 25

FAM3B-25 正义链 5， - AAACAAAUGCAGCUGGAAUdTdT- 3， 888-906 SEQ ID ： 反义链 5， - AUUCCAGCUGCAUUUGUUUdTdT- 3， NO. 26

FAM3B-26 正义链 5 ' - GCCCAUAUUUGAUGAGUAUdTdT- 3， 939-957 SEQ ID ： 反义链 5， - AUACUCAUCAAAUAUGGGCdTdT- 3， NO. 27

FAM3B-27 正义链 5 ' -GUUGUAAACCAAUGAACAUdTdT- 3， 967-985 SEQ ID ： 反义链 5， - AUGUUCAUUGGUUUACAACdTdT- 3， NO. 28

FAM3B-28 正义链 5 ' - GUAGUGAAGAUGUCAAUUAdTdT- 3 ' 1038-1056 SEQ ID ： 反义链 5， - UAAUUGACAUCUUCACUACdTdT- 3， NO. 29

FAM3B-29 正义链 5， - GAUGUCAAUUAGCAGGAAAdTdT- 3， 1046-1064 SEQ ID ： 反义链 5， - UUUCCUGCUAAUUGACAUCdTdT- 3， NO. 30

FAM3B-30 正义链 5 ' -GCAGGAAACUAAAAUGAAUdTdT- 3， 1057-1075 SEQ ID ： 反义链 5 ' -AUUCAUUUUAGUUUCCUGCdTdT-3 ' NO. 31

FAM3B-31 正义链 5 ' -GAAAGAGGGUUGGGAGAAAdTdT- 3 ' 1111-1129 SEQ ID ： 反义链 5， - UUUCUCCCAACCCUCUUUCdTdT- 3， NO. 32

FAM3B-32 正义链 5 ' - AGACAGCCCUGCAGAGAGAdTdT- 3 ' 1189-1207 SEQ ID ： 反义链 5 ' -UCUCUCUGCAGGGCUGUCUdTdT- 3 ' NO. 33 所述攻击范围是指该小干扰核酸反义链与 SEQ ID: N0.1互补结合的相应位置。 表 2

编号 小干扰核酸的核苷酸序列 攻击范围 靶位点

FAM3B-33 正义链 5， - UCCAGGAACAGAUAUGCAGdTdT- 3， SEQ ID ：

732-750

反义链 5， - CUGCAUAUCUGUUCCUGGAdTdT- 3， NO. 34

FAM3B-34 正义链 5， - AUCAACCACUCAGAUCAAUdTdT- 3， SEQ ID ：

714-732

反义链 5 ' - AUUGAUCUGAGUGGUUGAUdTdT- 3， NO. 35

FAM3B-35 正义链 5， - CCAGCACUCUCUACAACAUdTdT- 3， SEQ ID ：

208-226

反义链 5 ' -AUGUUGUAGAGAGUGCUGGdTdT- 3， NO. 36

FAM3B-36 正义链 5， - GCCGCGACAAGUAUGCCAAdTdT- 3， SEQ ID ：

462-480

反义链 5， - UUGGCAUACUUGUCGCGGCdTdT- 3， NO. 37

FAM3B-37 正义链 5， - GCCAAUGGCCAAGUUCAUUdTdT- 3，

503-521

反义链 5， - AAUGAACUUGGCCAUUGGCdTdT- 3，

FAM3B-38 正义链 5 ' -GCCAUAGAAGCCCUUGGAAdTdT-3 ' SEQ ID ：

603-621

反义链 5， - UUCCAAGGGCUUCUAUGGCdTdT- 3， NO. 39

FAM3B-39 正义链 5， - GCAAAGAAAUCAAGAACAUdTdT- 3， 622-640 SEQ ID ： 反义链 5 ' -AUGUUCUUGAUUUCUUUGCdTdT- 3， NO. 40

FAM3B-40 正义链 5 ' -GAAUGUGGCAAGAGGGAUAdTdT- 3 ' SEQ ID ：

404-422

反义链 5， - UAUCCCUCUUGCCACAUUCdTdT- 3， NO. 41

FAM3B-41 正义链 5， - UCAGAAAUCGAGAGAGAAAdTdT- 3， SEQ ID ：

693-71 1

反义链 5， - UUUCUCUCUCGAUUUCUGAdTdT- 3， NO. 42

FAM3B-42 正义链 5 ' -CCGAAGCAUUGGAGAGAGAdTdT- 3 ' SEQ ID ：

227-245

反义链 5， - UCUCUCUCCAAUGCUUCGGdTdT- 3， NO. 43 所述攻击范围是指该小干扰核酸反义链与 SEQ ID: N0.44互补结合的相应位置。 表 3 :

备注： 斜体为 OM修饰、 F修饰、 硫代修饰或者胆固醇修饰。 图 1显示了本发明所提供的 10个鼠源小干扰核酸在体外对 FAM3B 活性靶点的筛选 结果。从图 1可以看出： FAM3B-33至 FAM3B-42具有较高的 FAM3B基因抑制活性， 特 别是小干扰核酸 FAM3B-34、 FAM3B-35、 FAM3B-38 FAM3B-39 FAM3B-40 FAM3B-41 禾口 FAM3B-42对 FAM3B基因的抑制活性分别达到 80-97%。

图 2显示了本发明所提供的 FAM3B-46样品经静脉给药治疗后， 小鼠肝脏脂肪化程 度的油红 0和 HE染色检测。 从图 2可以看出： 给药 FAM3B-46治疗 15天， 肝脏脂肪化 程度显著降低， 并与给药量有良好的剂量依赖关系。

图 3显示了本发明所提供的 FAM3B-43到 FAM3B-46样品经静脉给药后对小鼠肝脏 FAM3B mRNA 表达抑制效果的检测。 从图 3 可以看出： 本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-43至 FAM3B-46能够显著抑制小鼠肝脏中 FAM3B基因的表达。

图 4显示了本发明所提供的人源 FAM3B-1到 FAM3B-32样品在体外对细胞 FAM3B mRNA 抑制效率的检测。 从图 4 可以看出： 本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-1 至 FAM3B-32 能够显著抑制 HepG2 细胞中 FAM3B 基因的表达， 特别是通过小干扰核酸 FAM3B-20、 FAM3B-1 K FAM3B-24、 FAM3B-15禾 Π FAM3B-17对 HepG2细胞 FAM3B mRNA抑制率均达到了 80 %以上。 图 5显示了本发明所提供的小干扰核酸样品在体� �对细胞 FAM3B蛋白水平抑制效 率的检测。从图 5可以看出：本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-20、 FAM3B-11、 FAM3B-24、 FAM3B-15和 FAM3B-17能够显著抑制 HepG2细胞中 FAM3B蛋白水平， 抑制率均达到 了 80%以上。

图 6显示了本发明所提供的 FAM3B-30样品对诱导的 HepG2细胞脂肪累积抑制效 果的检测。 从图 6可以看出： 本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-20能够显著抑制 HepG2 细胞脂肪累积。

图 7 显示了本发明所提供的 FAM3B-46 样品经静脉给药后对小鼠小肠 FAM3B mRNA表达抑制效果的检测。 从图 7可以看出： 本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-46能 够显著抑制小鼠小肠中 FAM3B基因的表达， 剂量依赖关系良好。

图 8显示了本发明所提供的 FAM3B-46样品按照不同剂量，经静脉给药后小鼠� ��脏 组织甘油三酯和胆固醇水平的检测。 从图 8 可以看出： 本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-46 能够明显降低小鼠肝脏中的甘油三酯和胆固醇 含量， 且对甘油三酯的抑制效 果有较好的剂量依赖关系。

图 9显示了本发明所提供的 FAM3B-46样品按照不同剂量， 经静脉给药后， 对小鼠 血液中甘油三酯和胆固醇水平的检测。 从图 9 可以看出： 本发明提供的小干扰核酸 FAM3B-46能够显著降低小鼠血液中的甘油三酯和� ��固醇水平， 并且较好的量效关系。 从上述实验结果可以看出， 本发明提供的抑制剂能够有效地用于预防和 /或治疗由 FAM3B基因的表达介导的疾病， 例如， 脂肪肝以及由高血脂引发的疾病。