Die Serinprotease uPA (Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator) ist für verschiedene physiologische und pathologische Prozesse verantwortlich, wie etwa den proteolytischen Abbau von extra- zellulärem Matrixmaterial, das für die Invasibilität und Wan- derung von Zellen sowie für die Geweberemodellierung notwendig ist. uPA bindet mit hoher Affinität (KD=10-1°-10-9M) an den mem- branständigen uPA Rezeptor (uPAR) auf der Zelloberfläche.

Die Bindung von uPA an seinen Rezeptor ist an vielen invasiven biologischen Prozessen wie etwa der Metastasierung bösartiger Tumoren, der Trophoplastenimplantation, Entzündungen und An- giogenese beteiligt. Daher sind Antagonisten von uPA in der Lage, die Invasivität, Metastasierung und Angiogenese von Tumoren zu hemmen. uPA-Antagonisten können als Mittel zur Therapie invasiver und metastasierender Krebserkrankungen ein- gesetzt werden, bei denen uPA und uPAR an den invasiven Foci von Tumoren auftreten (Dano et al. : The receptor for urokinase plasminogen activator : Stromal cell involvement in extracellu- lar proteolysis during cancer invasion, in : Proteolysis and Protein Turnover, Barrett, A. J. und Bond, J., HRSG, Portland Press, London, 1994,239), z. B. bei Krebserkrankungen von Brust, Lunge, Darm und Ovarien. Darüber hinaus können uPA- Antagonisten auch für andere Zwecke eingesetzt werden, bei denen eine Hemmung der proteolytischen Aktivierung von Plasmi- nogen erforderlich ist, beispielsweise zur Bekämpfung von

Krankheiten wie Arthritis, Entzündungen, Osteoporose, Retino- pathien und zur Kontrazeption.

Der uPA Rezeptor ist in WO 90/12091 sowie in den Veröffentli- chungen Ploug et al., J. Biol. Chem. 268 (1993), 17539 und Ronne et al., J. Immunol. Methods 167 (1994), 91 beschrieben. uPA wird als einzelkettiges Molekül (pro-uPA) synthetisiert und enzymatisch in einen aktiven zweikettigen uPA überführt.

Das uPA Molekül besteht aus drei strukturell unabhängigen Domänen, der N-terminal lokalisierten wachstumsfaktorartigen Domäne (GFD, uPA 1-46), einer Kringelstrukturdomäne (uPA 45 -135) und der Serinproteasedomäne (uPA 159-411). GFD und die Kringeldomäne bilden zusammen das sogenannte aminotermi- nale Fragment von uPA (ATF, uPA 1-135), das durch weitere proteolytische Spaltung von zweikettigem uPA erzeugt wird. ATF bindet an den uPA Rezeptor mit einer ähnlichen Affinität wie uPA.

Die rezeptorbindende Region von uPA erstreckt sich über den Bereich der Aminosäuren 12 bis 32, da ein Peptid, welches die Aminosäurereste 12 bis 32 von uPA enthält (wobei Cystein an Position 19 durch Alanin ersetzt ist) mit ATF um die Bindung an den uPA Rezeptor kompetiert (Appella et al., J. Biol. Chem.

262 (1987), 4437-4440). Weiterhin wurde dort gezeigt, daß dieses Peptid auch nach Zyklisierung durch Verbrückung der beiden Cysteinreste an den Positionen 12 und 32 eine Affinität für den uPA Rezeptor zeigt. In einem alternativen Ansatz wur- den von Goodson et al., (Proc. Natl. Acad. USA 91 (1994), 7129-7133) antagonistische uPA-Peptide für den uPAR mittels Musterung einer Bakteriophagen-Peptidbibliothek identifiziert.

Diese Peptide zeigten keine ersichtliche Sequenzhomologie zu der natürlichen uPAR-bindenden Sequenz von uPA.

In neueren Veröffentlichungen (Rettenberger et al., Biol.

Chem. Hoppe-Seyler 376 (1995), 587-594) ; Magdolen et al., Eur.

J. Biochem. 237 (1996), 743-751 ; Goretzki et al., Fibrinolysis

and Proteolysis 11 (1997), 11-19) sind weitere Untersuchungen an der uPAR-Bindungsregion des uPA beschrieben. Dabei wurden die Reste Cysl9, Lys23, Tyr24, Phe25, Ile28, Trp30 und Cys31 als wichtige Determinanten für eine uPA/uPAR-Wechselwirkung identifiziert. Als wirksamster Inhibitor wurde in diesen Un- tersuchungen ein uPA-Peptid mit den Aminosäuren 16 bis 32 von uPA identifiziert.

Magdolen et al. (1996) supra, analysieren die uPAR-Bindungs- region des uPA-Moleküls unter der Verwendung eines Peptids mit den Aminosäuren 14 bis 32 von uPA und davon abgeleiteten Pep- tiden. Diese sowie auch die von anderen Arbeitsgruppen ver- wendeten Peptide (vgl. z. B Appella et al. (1987) supra) weisen jedoch eine relativ geringe Affinität zum uPAR auf.

WO-A-94/22464 offenbart Peptide mit einer Länge von 6 bis 18 Aminosäuren, die aus dem Bereich der Aminosäuren 14 bis 33 von uPA stammen. Es wird beschrieben, daß kurze von uPA abgelei- tete Peptide (uPA 21-29 und uPA 21-26) in der Lage sind, das Wachstum von Keratinozyten zu beeinflussen. Zwar wird in WO-A- 94/22464 auf einen möglichen Einsatz der beanspruchten Peptide für die Blockierung der uPA/uPAR-Wechselwirkung hingewiesen, es werden jedoch keinerlei Daten oder Hinweise auf derartige Bindungsstudien gezeigt. Darüber hinaus enthalten die als bevorzugt genannten Peptide uPA 21-29 und uPA 21-26 nicht die minimale uPAR-Bindungsregion im uPA-Molekül, welche den Se- quenzbereich der Aminosäuren 19 bis 31 umfaßt. Die Beeinflus- sung des Wachstums von Keratinozyten durch diese kurzen Pep- tide beruht somit sehr wahrscheinlich nicht auf einer uPA/- uPAR-Wechselwirkung.

Ein Nachteil der bisher bekannten uPA-Peptidinhibitoren be- steht darin, daß sie eine relativ geringe Affinität der Bin- dung an den uPA Rezeptor zeigen, die für eine therapeutische Anwendung nicht ausreichend ist. Aufgrund dessen besteht ein großes Bedürfnis nach neuen uPA-Peptidantagonisten, die eine höhere Affinität zum Rezeptor aufweisen.

Überraschenderweise wurde in quantitativen Untersuchungen festgestellt, daß das lineare Peptid uPA (19-31) und zyklische Derivate dieses Peptids eine deutlich verbesserte Affinität der Bindung an den uPA-Rezeptor zeigen.

Die Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Peptide als uPA-An- tagonisten, die mit hoher Affinität an uPAR binden, wird durch experimentelle Daten belegt. Besonders bevorzugt sind dabei zyklische Peptide, die sich durch nicht im nativen uPA-Molekül vorkommende Verbrückungen, insbesondere Disulfidbrücken, aus- zeichnen.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Peptide der allgemeinen Strukturformel (I) : X1-[X2]n-X3-X4-K-Y-F-X5-X6-I-X7-W-[X8]m (I) worin X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 und X8 Jeweils eine Aminocarbonsäure, vorzugsweise eine α-Aminocarbonsäure bedeuten, n und m jeweils unabhängig 0 oder 1 sind, K eine Aminocarbonsäure, vorzugsweise eine a-Aminocarbon- säure mit einer Lysin-Seitenkette bedeutet, Y eine Aminocarbonsäure, vorzugsweise eine a-Aminocarbon- säure mit einer Tyrosin-Seitenkette bedeutet, F eine Aminocarbonsäure, vorzugsweise eine a-Aminocarbon- säure mit einer Phenylalanin-Seitenkette bedeutet, I eine Aminocarbonsäure, vorzugsweise eine a-Aminocarbon- säure mit einer Isoleucin-Seitenkette bedeutet, W eine Aminocarbonsäure, vorzugsweise eine a-Aminocarbon- säure mit einer Tryptophan-Seitenkette bedeutet, und die monomeren Bausteine über-CONRl-oder-NRlCO-Bindungen verknüpft sind, wobei Rljeweils unabhängig Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet, und pharmazeutisch verträgliche Salze und Derivate davon.

Neben Peptiden, die eine Sequenz der Strukturformel (I) ent- halten, sind auch pharmazeutisch verträgliche Salze und Deri- vate davon als uPA-Antagonisten geeignet. Als Derivate kommen dabei insbesondere solche Verbindungen in Betracht, die an reaktiven Gruppen der Seitenkette oder/und des N-bzw. C-Ter- minus, z. B. an Amino-oder Carbonsäuregruppen, modifiziert sind. Beispiele für solche Modifikationen sind eine Acylie- rung, z. B. eine Acetylierung von Aminogruppen oder/und eine Amidierung oder Veresterung von Carbonsäuregruppen.

Als Bausteine für die erfindungsgemäßen Peptide verwendeten Aminocarbonsäuren können natürliche Aminosäuren bzw. deren Enantiomere oder auch nichtnatürliche, d. h. nicht genetisch codierte Aminosäuren wie etwa-Aminobuttersäure, ß-Alanin eingesetzt werden.

Die monomeren Bausteine sind über Säureamidbindungen NRlCO oder CONRl verknüpft, d. h. die Peptidsequenzrichtung kann umgekehrt werden (Retropeptide). Rl kann wie in nativen Polypeptiden Was- serstoff bedeuten. Andererseits kann Rl jedoch auch einen Al- kylrest, z. B. Methyl oder Ethyl, und insbesondere Methyl be- deuten, da durch eine N-Alkylierung der Amidbindung oftmals eine starke Aktivitätsbeeinflussung bewirkt werden kann (vgl. z. B. Levian-Teitelbaum et al., Biopolymers 28 (1989), 51-64).

Als monomere Bausteine können die a-Aminocarbonsäuren in Form von L-Enantiomeren oder/und D-Enantiomeren eingesetzt werden.

Durch die Änderung der Chiralität kann die Raumstruktur der erfindungsgemäßen Peptide modifiziert werden, wodurch eben- falls eine Aktivitätsbeeinflussung möglich wird. Besonders bevorzugt sind Retro-inverso Peptide, d. h. Peptide, die in einer umgekehrten Sequenzrichtung vorliegen und D-Aminosäuren als monomere Bausteine enthalten. Bei diesen D-Inversostruktu- ren haben die funktionellen Seitenketten eine ähnliche räum- liche Orientierung wie die in der nativen Peptidsequenz, sie können jedoch aufgrund des Vorhandenseins von D-Aminosäuren schlechter biologisch abgebaut werden und haben daher Vorteile

als Arzneimittel (vgl. hierzu beispielsweise Wermuth et al., J. Am. Chem. Soc. 119 (1997), 1328-1335 und die darin genann- ten Zitate).

Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Peptide zyklische Verbindungen, wobei insbesondere die monomeren Bausteine Xl und X7 oder Xl und X8 miteinander verbrückt sein können. Diese Verbrückung ist vorzugsweise eine nichtnatürliche Verbrückung, d. h. eine in natürlichem uPA nicht vorkommende Verbrückung.

Sie kann beispielsweise über die Seitenketten der jeweiligen a-Aminocarbonsäurereste erfolgen, wobei eine Verbrückung über Disulfidbindungen, z. B. zwischen zwei Cysteinresten (entspre- chend einer Verbrückung von Cys19 und Cys31 der natürlichen uPA- Sequenz) besonders bevorzugt ist. Andere Arten der Zyklisie- rung zwischen Aminosäureseitenketten sind jedoch auch möglich, z. B. Amidbindungen zwischen einer Aminosäure mit einer- Aminoseitengruppe, z. B. Lys und einer Aminosäure mit einer Carbonsäureseitengruppe wie etwa Asp oder Glu. Weiterhin kann die Disulfidbrücke auch durch eine Alkylen-Brücke ersetzt werden, um die chemische Stabilität zu erhöhen. Darüber hinaus sind auch Verknüpfungen von einer Aminosäureseitenkette mit dem Peptidrückgrat, z. B. Verknüpfung einer Omegaaminoseiten- gruppe mit dem C-terminalen Ende bzw. Verknüpfung einer Car- bonsäureseitengruppe mit dem N-terminalen Ende möglich. Auch eine Verknüpfung von N-und C-Terminus ist möglich.

Außerdem können anstelle der Disulfidbrücke auch sogenannte Turn-Mimetika (Haubner et al., J. Am. Chem. Soc. 118 (1996), 7884-7891) oder Zuckeraminosäuren (Graf von Rödern et al., J.

Am. Chem. Soc. 118 (1996), 10156-10167) eingesetzt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegen- den Erfindung weisen die Peptide die allgemeine Strukurformel (II) auf : X1-X2-X3-X4-K-Y-F-X5-X6-I-X7-W-X8 (II)

worin Xl, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X, K, Y, F, I und W wie zuvor definiert sind und Xl und X8 miterinander verbrückt sind.

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen Peptide die allgemeine Strukturformel (III) auf : X1-X3-X4-K-Y-F-X5-X6-I-X7-W (III) worin X1, X3, X4, X5, X6, X7, K Y, F, I und W wie zuvor definiert sind und X'und und X7 miteinander verbrückt sind.

Die monomeren Bausteine Xl bis x8 weisen vorzugsweise folgende Bedeutungen auf : X1 und -falls vorhanden- X8 sind α-Aminocarbonsäurebausteine mit einer SH-Seitenkette, insbesondere mit einer Cysteinsei- tenkette.

X2 ist-falls vorhanden-vorzugsweise eine a-Aminocarbonsaure mit einer aliphatischen und ungeladenen Seitenkette, z. B.

Valin, Leucin oder Isoleucin, insbesondere Valin.

X3-falls vorhanden-und XS sind a-Aminocarbonsäuren mit einer aliphatischen hydrophilen Seitenkette wie etwa Serin oder Threonin, insbesondere Serin.

X'und X6 sind vorzugsweise α-Aminocarbonsäuren mit einer ali- phatischen hydrophilen Seitenkette, insbesondere einer Amid- seitenkette wie etwa Asparagin oder Glutamin, insbesondere Asparagin.

X7 ist bei Verbindungen der Strukurformel (II) vorzugsweise eine basische a-Aminocarbonsäure, insbesondere Histidin. Bei Verbindungen der Strukturformel (III) ist X7 eine a-Aminocarb- onsäure mit einer SH-Seitengruppe, insbesondere Cystein.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeu- tische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens ein Pep- tid wie zuvor definiert gegebenenfalls zusammen mit pharma- zeutisch üblichen Träger, Hilfs-oder Verdünnungsmitteln ent- hält. Insbesondere werden die erfindungsgemäßen Peptide zur Herstellung von uPA-Antagonisten verwendet, die sich auch zur Tumorbekämpfung eignen.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kön- nen in beliebiger Form vorliegen, beispielsweise als Tablet- ten, als beschichtete Tabletten oder in Form von Lösungen oder Suspensionen in wässrigen oder nichtwässrigen Lösungsmitteln.

Die Peptide werden vorzugsweise oral oder parenteral in einer flüssigen oder festen Form verabreicht. Bei Verabreichung in flüssiger Form wird Wasser vorzugsweise als Trägermedium ver- wendet, das gegebenenfalls Stabilisatoren, Löslichkeitsver- mittler oder/und Puffer enthält, die üblicherweise für Injek- tionslösungen verwendet werden. Solche Zusatzstoffe sind bei- spielsweise Tartrat-oder Boratpuffer, Ethanol, Dimethylsulf- oxid, Komplexierungsmittel wie etwa EDTA, Polymere wie etwa flüssiges Polyethylenoxid, etc.

Bei Verabreichung in fester Form können feste Trägersubstanzen wie etwa Stärke, Lactose, Mannitol, Methylcellulose, Talkum, hochdisperses Siliciumoxid, hochmolekulare Fettsäuren wie etwa Stearinsäure, Gelatine, Agar, Calciumphosphat, Magnesiumstea- rat, tierische und pflanzliche Fette oder feste hochmolekulare Polymere wie etwa Polyethylenglykole eingesetzt werden. Wei- terhin können die Formulierungen zu oralen Applikation sofern gewünscht auch Aroma-und Süßstoffe enthalten.

Die verabreichte Dosis hängt vom Alter, Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten, von der Art und der Schwere der Erkran- kung, von der Art der Behandlung, von der Häufigkeit der Ver- abreichung und der Art der gewünschten Wirkung ab. Die täg- liche Dosis der aktiven Verbindung ist üblicherweise 0,1 bis 50 mg/Kilogramm Körpergewicht. Normalerweise sind 0,5 bis 40

und vorzugsweise 1,0 bis 20 mg/kg/Tag in einer oder mehreren Dosen ausreichend, um die gewünschten Wirkungen zur erreichen.

Weiterhin soll die Erfindung durch die im Nachfolgenden be- schriebenen Beispiele und Figuren erläutert werden.

Es zeigen : Figur 1 die mengenabhängige Hemmung der Bindung von pro-uPA an einen zelloberflächenassoziierten uPAR durch syn- thetische Peptide ; Figur 2 die Kompetition synthetischer Peptide mit ATF um die Bindung an uPAR ; Figur 3A die Struktur von cyclol9~3l uPA 19-31 (rechts) im Ver- gleich zur Struktur der entsprechenden Domäne aus nativem uPA und Figur 3B die Struktur verschiedener zyklischer Peptidderivate von cyclol93l uPA 19-31 Beispiele 1. Methoden 1.1 Festphasenpeptidsynthese Lineare Peptide wurden auf einem 2-Chlortritylharz (Barlos et al., Int. J. Pept. Protein Res. 37 (1991), 513 bis 520) unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 431 A Peptidsynthe- sizers bzw. eines multiplen Peptidsynthesizers Modell Syro II (MultiSynTech) synthetisiert. Unter Anwendung der orthogonalen Fmoc-Strategie (Carpino und Han, J. Org. Chem. 37 (1972), 3404-3409 ; Fields und Noble, Int. J. Peptide Protein Res. 35 (1990), 161-214) wurden die Aminosäureseitenketten mit den Schutzgruppen Trityl (Asn, Cys, Gln und His), tert.-Butyloxy-

carbonyl (Lys und Trp), tert.-Butyl (Asp, Glu, Ser, Thr und Tyr), Acetamidomethyl (Cys) und 2,2,5,7, 8-Pentamethylchroman- 6-sulfonyl oder 2,2,4,6, 7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sul- fonyl (Arg) blockiert. Die Kupplung erfolgte bei Raumtempera- tur in Dimethylformamid unter Verwendung eines dreifachen Überschusses von 2-(lH-Benzotriazol-1-yl)-1, 1, 3, 3-tetramethy- <BR> <BR> <BR> luroniumtetrafluoroborat/1-Hydroxybenzotriazol/Fmoc-Aminosä ure mit 2,5 Äquivalenten von N-Ethyldiisopropylamin in N-Methyl- pyrrolidon. Die Fmoc-Gruppe wurde durch sequenzielle Behand- lung der Harze mit einem Überschuß von 40 % bzw. 20 % Piperi- din in Dimethylformamid entfernt. Die Abspaltung der Peptide und die Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen wurde gleich- zeitig durch Behandlung mit 82,5 % Trifluoressigsäure/5 % Phenol/2,5 % Ethandithiol/5 % Thioanisol/5 % H20 (0 °C/1 h ; Raumtemperatur/lh) durchgeführt. Im Fall von mit 2,2,5,5,7, 8- Pentamethylchroman-6-sulfonyl-geschützten Arg-Gruppen wurden die Peptide für zusätzliche 12 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Die rohen Peptide wurden mit Diethylether bei-30 °C präzipi- tiert, in Methanol gelöst, wie zuvor präzipitiert, in tert.- Butanol gelöst und lyophilisiert. Tryptophan enthaltende Pep- tide wurden zusätzlich mit 5 % Essigsäure für 2 h vor der Lyophilisierung behandelt.

Die Peptide wurden durch HPLC unter Verwendung einer Reverse Phase C-18 Säule (Nucleosil 1005-C18) oder einer YMC-Pack ODS Säule gereinigt. Die Zyklisierung erfolgte durch eine Disul- fidbrückenbildung über die Cysteinreste. Die hierzu erforder- liche Oxidation wurde durch Aufnehmen von 0,1 bis 0,3 mg/ml der gereinigten linearen Peptide in 80 % Wasser und 20 % DMSO (Vol/Vol) und Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck nach 10 h durchgeführt. Die zyklischen Peptide wurden erneut durch HPLC wie zuvor beschrieben gereinigt.

1.2 Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse Die gereinigten und entsalzten Peptide wurden auf dem HPLC- System 140 B (Applied Biosystems, Foster City, USA) analy-

siert. Die UV-Absorption wurde mit einem UVIS 200 Detektor (Linear Instruments, Reno, USA) bei 206 nm gemessen. Die Chro- matographie erfolgte auf einer Aquapore 3 y (Applied Biosy- stems, Foster City, USA) Reverse Phase Säule (1 mm x 50 mm) mit einer Durchflußrate von 20 Hl/min. Das Lösungsmittelsystem war 0,1 % TFA in Wasser (A) und 0,1 % TFA in Acetonitril (B).

Das HPLC System war an eine Atmosphärendruck-Ionisationsquelle gekoppelt, die an ein Tandem-Quadrupolinstrument API III (Sciex, Perkin Elmer, Thornhill, Kanada) angeschlossen war.

Die Quadrupol M/Z-Skala wurde mit den Ammoniumadduktionen von Polypropylenglykol kalibriert. Die durchschnittlichen Massen- werte wurden von den M/Z-Peaks in den Ladungsverteilungsprofi- len der mehrfach geladenen Ionen berechnet (Covey et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2 (1988), 249-256 ; Fenn et al., Science 246 (1989), 64-71).

Die Aminosäureanalyse wurde nach der Ninhydrinmethode unter Verwendung des Analysesystems 6300 (Beckman Instruments, Fu- llerton, USA) nach Hydrolyse der Peptide durch die TFA-HCl- Dampfphasenmethode (Tsugita et al., J. Biochem. 102 (1987), 1593-1597) durchgeführt, die eine quantitative Bestimmung der Peptidkonzentration erlaubt.

1.3 Durchflußzytometrie Die Kapazität der synthetischen Peptide zu Hemmung der uPA/- uPAR-Wechselwirkung wurde mittels Durchflußzytometrie an dem FACScan Durchflußzytometer (Becton-Dickinson, Heidelberg, Deutschland) unter Verwendung der humanen Promyeloidzellinie U937 als Quelle für zellulären nativen uPAR bestimmt (Chuchu- lowski et al., Fibrinolysis 6, Suppl. 4 (1992), 95-102 ; Magdo- len et al., (1996), supra). Die U937 Zellen wurden mit 1 mM Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) für 48 h stimuliert. Nach Stimulierung mit PMA exprimieren die U937 Zellen beträchtliche Mengen an zelloberflächenassoziiertem uPAR.

Die stimulierten Zellen wurden mit 50 mM Glycin-HC1, 0,1 NaCl, pH 3,6 für 1 min bei Raumtemperatur behandelt, um endogenen rezeptorgebundenen uPA zu dissoziieren. Anschließend wurde der saure Puffer durch 0,5 M HEPES-100 mM NaCl, pH 7,5 neutrali- siert. Die Zellen wurden dann sofort zweimal mit PBS/0, 1 % Rinderserumalbumin (RSA) gewaschen und für 10 min bei Raumtem- peratur und 300 x g zentrifugiert. Die Zellen wurden in PBS/0, 1 % RSA resuspendiert, auf eine Konzentration von 106 Zellen pro ml eingestellt und simultan mit 16 ng FITC-konju- giertem pro-uPA und unterschiedlichen Mengen der synthetischen Peptide für 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Vor der Ana- lyse wurde Propidiumiodid, ein Fluoreszenzfarbstoff, der spe- zifisch doppelsträngige DNA bindet, zu jeder Probe gegeben, um die Lebensfähigkeit der analysierten U937 Zellen zu bestimmen.

Die beschädigten, Propidiumiodid-markierten Zellen wurden von der Analyse ausgeschlossen.

1.4 Festphasen uPAR/uPA-Bindetest Zusätzlich zu den durchflußzytometrischen Analysen wurde ein Festphasen ATF-Ligandenbindetest zur Untersuchung der Wechsel- wirkungen von synthetischen Peptiden mit uPAR durchgeführt.

Hierzu wurden Mikrotiterplatten mit rekombinantem humanem uPAR aus CHO Zellen (Wilhelm et al., FEBS Lett. 337 (1994), 131- 134 ; Magdolen et al., Elektrophoresis 16 (1995), 813-816) beschichtet und die restlichen proteinbindenden Stellen mit 2 % RSA (Gew/Vol) abgesättigt. Nach Inkubation mit den Proben (0,6 ng ATF zusammen mit 15 Hg synthetischem Peptid pro ml) und mehrfachen Waschschritten wurde die Menge an ATF, die an den auf der Mikrotiterplatte immobilisierten uPAR gebunden hatte, unter Verwendung eines biotinylierten monoklonalen Mausantikörpers gegen die Kringeldomäne von ATF (Nr. 377, Ame- rican Diagnostica, Greenwich, CT, USA) und anschließender Zugabe von Avidin-Peroxidase-Konjugat und 3,3', 5, 5'-Tetrame- thylbenzidin/H202 als Substrat für die Peroxidase bestimmt. Das Vorhandensein von synthetischen Peptiden, die mit der ATF-

Bindung an uPAR kompetieren, verringert den Umsatz des chromo- genen Substrats.

2. Ergebnisse 2.1 Bestimmung der uPAR Bindungskapazität von synthetischen Peptiden durch quantitative durchflußzytometrische Analyse Es wurde die inhibitorische Kapazität der Peptide uPA12-32 [C19A] (Appella et al., (1987), supra), des sogenannten Klon 20-Pep- tids AEPMPHSLNFSQYLWYT (Goodson et al., (1994), supra), wel- ches das wirksamste aus einer Phagen Peptidbibliothek identif- zierte Peptid war, und des von der Wildtyp uPA-Sequenz abge- leiteten synthetischen Peptid uPA1632 verglichen.

Hierzu wurden die gereinigten Peptide durch Massenspektrosko- pie analysiert, durch Aminosäureanalyse quantifiziert und dann gemäß der in 1.3 beschriebenen Methode durchflußzytometrisch auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der Bindung von fluores- zenzmarkiertem pro-uPA an den uPA Rezeptor auf U937 Zellen getestet. Dabei wurde gefunden, daß pro-uPA von zelloberflä- chenassoziiertem uPAR durch alle drei synthetischen Peptide in einer dosisabhängigen Weise verdrängt wurde (Fig. 1). Ein etwa 15.000 bzw. 12.000 molarer Überschuß an uPA12-32 [Cl9A] bzw. Klon 20 Peptid führte zu einer 50 % igen Hemmung der Bindung von uPA. Das Peptid uPA1632 zeigte eine 4-bis 5-fach höhere Affi- nität an uPAR verglichen mit den zwei anderen Peptiden : Ein etwa 3.000-facher molarer Überschuß reichte aus, um eine 50 % ige Hemmung zu erhalten.

Weiterhin wurde festgestellt, daß das lineare Peptid uPA19-31 überraschenderweise einen IC50-Wert von ca. 0, 8 µM zeigt, während der IC50-Wert für uPA16-32 ca. 3,2 HM beträgt.

2.2 Bestimmung der uPAR-Bindekapazität von synthetischen Peptiden in einem Mikrotiterplatten-Festphase-Liganden-Binde- test.

Es wurde eine Reihe von Peptiden mit variablen Sequenzberei- chen aus dem rezeptorbindenden Bereich von uPA synthetisiert, die ausgehend von uPA1032 zunehmend vom Aminoterminus verkürzt wurden. Zur Bestimmung der inhibitorischen Kapazität dieser Peptide wurde der unter 1.4 beschriebene Mikrotiterplatten- Festphasenbindetest verwendet. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 2 dargestellt.

Aus Fig. 2A ist ersichtlich, daß die Peptide uPA10-32, uPA12-31, uPA1432und uPA1632wirksam die Bindung von ATF an uPAR inhibie- ren. Die Peptide uPA17-32 und uPA18-34 zeigten deutlich verrin- gerte uPAR-Bindekapazitäten. Das Peptid uPA2034 zeigte über- haupt keine Bindung an den uPAR. In einem weiteren Versuch wurde die Bindekapazität der Peptide uPA19-31, uPA18-30, uPA20-32 und uPA20-30 getestet. Das Ergebnis dieses Versuchs ist in Fig.

2B dargestellt. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß uPA19-31 mit höherer Affinität als das längere Peptid uPA1632 an den uPAR bindet. Die anderen getesteten linearen Peptide zeig- ten keine signifikante Bindekapazität.

Das zyklische Peptid cyclo19,31uPA19-31, welches eine intramoleku- lare Disulfidbindung zwischen den Cysteinresten an den Posi- tionen 19 und 31 enthält, war überraschenderweise immer noch in der Lage, die Bindung von uPA an den uPA Rezeptor zu hem- men. Cyclo19,31uPA19-31 war darüber hinaus in seiner Bindeaktivi- tät signifikant stabiler nach längerer Aufbewahrung in wäss- riger Lösung oder wiederholten Einfrier/Tau-Zyklen verglichen mit dem linearen Peptid uPA19-31.

2.3 Synthese von modifizierten zyklischen uPA Peptiden Unter Verwendung von cyclo19,31uPA19-31 als Leitstruktur wurde eine Serie weiterer zyklischer Peptide hergestellt, in denen bestimmte Aminosäuren deletiert und/oder durch andere Amino- säuren substituiert waren. Die Strukturen der neuen syntheti- sierten Peptidvarianten sind Fig. 3 gezeigt.