La présente invention concerne des compositions polymériques injectables d’acide hyaluronique réticulé par des esters de boronate et fonctionnalisé par des peptides RGD pour l’ingénierie cellulaire et tissulaire.

La demande WO 2014/072330 décrit une composition polymérique comprenant :

- un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction hydroxyle est greffée par de l’acide phénylboronique, et

- un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction hydroxyle est greffée avec l’hydroxyle d’un groupe comprenant un cis-diol, de préférence le maltose.

Ce sont les fonctions hydroxyle de l’acide hyaluronique qui sont greffées. La préparation de ces polymères nécessite le greffage de bras espaceurs (« linkers » en anglais) porteurs de groupe thiol sur l’acide phénylboronique et sur le maltose, et le greffage de groupes porteurs d’une fonction alcène sur l’acide hyaluronique. Ces greffages complexifient le procédé de préparation des polymères.

La demande WO 2018/024793 décrit une composition polymérique comprenant :

- un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par un groupe comprenant un boroxole et

- un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée avec la fonction amine d’un composé comprenant un diol.

Cette demande éloigne l’homme du métier d’utiliser un polymère acide hyaluronique greffé par de l'acide phénylboronique. En effet, elle enseigne qu’un hémiester boronate a une plus grande affinité envers les diols que l'acide phénylboronique, et que les gels obtenus à partir d’un hémiester boronate ont un module de conservation G’ plus élevé, et des propriétés de gel améliorées. La composition polymérique décrite a ainsi un pouvoir auto-réparant exacerbé par rapport aux compositions polymériques dans lesquels le polymère acide hyaluronique est greffé avec de l’acide phénylboronique au lieu du boroxole. Les inventeurs de la présente demande ont toutefois observé que l’affinité élevée de l’hémiester boronate envers les diols a des inconvénients : les gels selon WO 2018/024793 peuvent être difficiles à stériliser car le polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par groupe comprenant un boroxole n’est pas stable dans les conditions de stérilisation à l’autoclave (dégradation probable du polymère), si bien qu’il ne permet plus la formation d’un gel lorsqu’il est mélangé avec le polymère acide hyaluronique greffé par un composé diol. Lorsque ces compositions polymériques comprennent une phase aqueuse, elles forment des hydrogels. Ceux-ci ressemblent à la matrice extra-cellulaire naturelle, et ont de ce fait l’avantage d’être utilisables dans des applications biomédicales. Cela étant, l’étalement et la viabilité des cellules incorporées dans ces hydrogels ne sont pas suffisantes.

Il existe un besoin de fournir des compositions polymériques capables de contenir des cellules, permettant un contrôle du comportement des cellules, notamment de leur étalement et de leur prolifération, et adaptables en fonction du type de cellules utilisées, tout en maintenant le caractère injectable et auto-réparant des compositions polymériques décrites ci-dessus.

A cet effet, selon un premier objet, l’invention concerne une composition polymérique comprenant un mélange de :

a) un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par de l’acide 3-aminophénylboronique (« HA-PBA-xRGD » ci-après), et

b) un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par du 1 -amino-1 -deoxy-D-fructose (« HA-fructose-yRGD » ci-après) ou par du gluconamide (« HA-gluconamide-zRGD » ci-après),

sous réserve qu’au moins un desdits polymères soit greffé par un peptide RGD.

Dans la composition polymérique, le polymère HA-PBA-xRGD et le polymère HA- fructose-yRGD, ou bien le polymère HA-PBA-xRGD et le polymère HA-gluconamide- zRGD, sont liés l’un à l’autre par des fonctions ester boronate entre l’acide boronique du polymère HA-PBA-xRGD et le motif saccharidique soit fructosamine (1 -amino-1 -deoxy-D- fructose) du polymère HA-fructose-yRGD, soit gluconamide (glucose sous sa forme ouverte) du polymère HA-gluconamide-zRGD.

Par « acide hyaluronique » ou « HA », on entend de l’acide hyaluronique sous forme neutre ou de sel (hyaluronate), et ce, quelle que soit sa charge et la nature de son(ses) contre-ion(s). Il peut par exemple s’agir de hyaluronate de sodium. L’acide hyaluronique peut être d’origine animale ou non animale. Les sources d'origine non animale comprennent les levures et de préférence les bactéries qui permettent de produire l’acide hyaluronique par voie biotechnologique. La masse molaire moyenne en masse (Mw) de l’acide hyaluronique est typiquement dans la gamme de 1 à 3000 kg/mol, mais d’autres masses molaires moyennes en masses sont possibles.

La composition polymérique comprend un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par de l’acide 3-aminophénylboronique, dit polymère HA-PBA-xRGD. L’acide 3-aminophénylboronique est greffé à l’acide hyaluronique par une liaison amide formée entre l’amine de l’acide 3- aminophénylboronique et une fonction carboxylate de l’acide hyaluronique.

La composition polymérique comprend également un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée soit par du 1 -amino-1 -deoxy-D-fructose (polymère HA-fructose-yRGD), soit par du gluconamide (polymère HA-gluconamide- zRGD).

Le gluconamide est greffé à l’acide hyaluronique par l’intermédiaire d’un bras espaceur qui lie une fonction carboxylate de l’acide hyaluronique à la fonction amine du gluconamide, de préférence par des liaisons amides. De préférence, ce bras espaceur a la formule -NH-L- dans laquelle :

- le groupe terminal -NH forme, avec une fonction carboxyle de l’acide hyaluronique, une liaison amide (formée par réaction d’une fonction carboxylate du HA et de l’amine),

- L représente une chaîne carbonée comprenant de 2 à 10 atomes de carbones et éventuellement interrompue par un ou plusieurs atomes d’oxygène (typiquement de 1 à 5 atomes d’oxygène). L représente notamment un groupe -(CH ₂ ) _n - dans lequel n représente un nombre entier de 1 à 10, de préférence de 1 à 4, ou un groupe -(CX-CX-OJ _m -CX-CX- dans lequel m représente un nombre entier de 1 à 4, de préférence 1 ou 2.

Par exemple, le bras espaceur a la formule -NH-(CH ₂ -CH ₂ -0) ₂ -CH ₂ -CH ₂ -, le groupe terminal -NH formant, avec une fonction carboxyle de l’acide hyaluronique, une liaison amide (formée par réaction d’une fonction carboxylate du HA et de l’amine), et le groupe -ex terminai étant relié au groupe -NH- terminal du gluconamide. Le 1 -amino-1 -deoxy-D- fructose est greffé à l’acide hyaluronique par une liaison amide formée à partir de l’amine du 1 -amino-1 -deoxy-D-fructose et de la fonction carboxylate de l’acide hyaluronique.

Selon une première alternative, la composition polymérique comprend un polymère HA-PBA-xRGD et un polymère HA-fructose-yRGD, le polymère HA-PBA-xRGD et/ou le polymère HA-fructose-yRGD étant greffé(s) par un peptide RGD. Une telle composition polymérique est également nommée « HA-PBA-xRGD / HA-fructose-yRGD » ci-après. Cette alternative est particulièrement préférée car les liaisons entre le HA-PBA-xRGD et le HA-fructose-yRGD sont très fortes, ce qui pourraient s’expliquer par le fait que l’acide boronique du polymère HA-PBA-xRGD se complexe en trois points sur le motif saccharidique 1 -amino-1 -deoxy-D-fructose, alors que dans la plupart des compositions polymériques décrites dans l’art antérieur, l’acide boronique greffé sur le premier acide hyaluronique ne se complexe qu’en deux points sur le groupe cis-diol greffé sur le second acide hyaluronique. Dans cette première alternative, la composition polymérique est généralement exempte de polymère HA-gluconamide-zRGD. Selon une seconde alternative, la composition polymérique comprend un polymère HA-PBA-xRGD et un polymère HA-gluconamide-zRGD, le polymère HA-PBA-xRGD et/ou le polymère HA-gluconamide-zRGD étant greffé(s) par un peptide RGD. Une telle composition polymérique est également nommée « HA-PBA-xRGD / HA-gluconamide- zRGD » ci-après. Dans cette seconde alternative, la composition polymérique est généralement exempte de polymère HA-fructose-yRGD.

Quelle que soit l’alternative considérée, les inventeurs ont observé que les compositions polymériques comprenant un polymère HA-PBA et soit un polymère HA- fructose, soit un polymère HA-gluconamide permettent d’obtenir des gels plus stables que ceux obtenus avec des compositions polymériques comprenant un polymère HA-PBA et un polymère HA-[dérivé de saccharide autre que la fructosamine ou le gluconamide].

A titre illustratif, [Fig 4] la figure 4 montre qu’une composition polymérique comprenant

- un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par de l’acide 3-aminophénylboronique (« HA-PBA »), et

- un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par du glucose bloqué dans sa forme cyclique,

n’est pas un gel (G”>G’).

Cette stabilité améliorée et/ou cette possibilité d’obtenir un gel s’expliqueraient par l’existence de liaisons ester boronate particulièrement fortes entre l’acide boronique du polymère HA-PBA-xRGD et le motif saccharidique soit fructosamine (1 -amino-1 -deoxy-D- fructose) du polymère HA-fructose-yRGD, soit gluconamide (glucose sous sa forme ouverte) du polymère HA-gluconamide-zRGD. Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les inventeurs supposent que ces deux dérivés saccharidiques spécifiques sont susceptibles de se complexer avec l’acide boronique en trois points grâce à la forme « ouverte » non cyclique du saccharide qui présente une très grande flexibilité, avec formation d’un ester boronate tricovalent, alors que les autres dérivés saccharidiques forment généralement un ester boronate bicovalent avec l’acide boronique, donc moins stable.

Le degré de substitution (DS) est le nombre de mole moyen de substituant toutes les 100 unités disaccharide de répétition de l’acide hyaluronique, ce substituant étant l’acide phénylboronique (ci-après « PBA ») pour le polymère HA-PBA-xRGD, la fructosamine pour le polymère HA-fructose-yRGD, et le gluconamide pour le polymère HA-gluconamide- zRGD. Pour chacun des trois polymères (indépendamment les uns des autres), le degré de substitution est généralement de 5 à 70 mol%, préférentiellement de 10 à 50 mol%. Il a été observé expérimentalement que ces gammes de DS permettent d’obtenir un comportement de type « gel » par analyse des propriétés rhéologiques en mode dynamique (module de stockage (G’) > au module de perte (G”) sur toute la gamme de fréquence explorée (0,01 -10 Hz)). Le degré de substitution peut être mesuré par RMN.

Dans la composition polymérique, le rapport molaire :

- des groupes PBA du polymère HA-PBA-xRGD par rapport à la fructosamine du polymère HA-fructose-yRGD, ou bien

- des groupes PBA du polymère HA-PBA-xRGD par rapport au groupe gluconamide du polymère HA-gluconamide-zRGD,

est généralement de 10/1 à 1/10, notamment de 5/1 à 1/5, de préférence de 1/3 à 3/1 , de manière particulièrement préférée de 1/2 à 2/1 , idéalement de 0,8 à 1 ,2. Le nombre de moles de PBA greffé sur le HA-PBA-xRGD est préférentiellement le plus proche possible soit du nombre de mole de fructose du HA-fructose-yRGD, soit du nombre de mole de gluconamide du HA-gluconamide-zRGD, afin d’optimiser la formation de liaisons ester boronate et obtenir une complexation optimale par mélange des solutions de HA-PBA- xRGD et soit HA-fructose-yRGD soit HA-gluconamide-zRGD à volume égal.

Par « greffé par un peptide RGD », on entend que le polymère acide hyaluronique est greffé par un moins un groupe porteur d’un peptide comprenant la séquence arginine- glycine-acide aspartique (RGD). Ce peptide permet de promouvoir l’adhésion cellulaire. Le peptide peut comprendre d’autres aminoacides. Le « peptide RGD » comprend typiquement 3 à 20 aminoacides, notamment 4 à 15 aminoacides, de préférence 5 à 15 aminoacides, sous réserve qu’au moins trois d’entre eux constituent ensemble la séquence RGD. Les acides aminés contigus à la séquence RGD sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les acides aminés naturels. De préférence, au moins 50% des acides aminés contigus à la séquence RGD sont des résidus polaires choisis parmi Gly, Ser, Thr et Tyr. Par exemple, l’acide hyaluronique peut être greffé par un peptide GRGDY ou GRGDS.

Au moins un des polymères de la composition polymérique est greffé par un peptide RGD. Le polymère HA-PBA-xRGD comprend un nombre de moles moyen « x » de peptides RGD pour 100 unités disaccharide de répétition de l’acide hyaluronique. Le polymère HA- fructose-yRGD comprend un nombre de moles moyen « y » de peptides RGD pour 100 unités disaccharide de l’acide hyaluronique. Le polymère HA-gluconamide-zRGD comprend un nombre de moles moyen « z » de peptides RGD pour 100 unités disaccharide de l’acide hyaluronique x, y et z sont également nommés « densité de peptide RGD ». x, y et z sont indépendamment les uns des autres un nombre généralement compris de 0 à 50 mol%, notamment de 0 à 40 mol%, typiquement de 0 à 30 mol%, de préférence de 0 à 20 mol%. Comme au moins un des polymères de la composition polymérique est greffé par un peptide RGD :

- lorsque le polymère b) est le polymère HA-fructose-yRGD, x et y ne représentent pas tous les deux 0,

- lorsque le polymère b) est le polymère HA-gluconamide-zRGD, x et z ne représentent pas tous les deux 0.

Lorsque les polymères HA-PBA-xRGD et soit HA-fructose-yRGD, soit HA- gluconamide-zRGD sont mélangés en quantités égales, le nombre de moles moyen « c » de peptides RGD pour 100 unités disaccharide de répétition de l’acide hyaluronique de la composition polymérique est égal à :

(x+y)/2 lorsque le polymère b) est le HA-fructose-yRGD, ou

(x+z)/2 lorsque le polymère b) est le HA-gluconamide-zRGD.

Il est donc aisé de moduler le nombre de moles moyen « c » de peptides RGD pour 100 unités disaccharide de répétition de l’acide hyaluronique de la composition polymérique selon l’invention en ajustant celui de chacun des polymères qu’elle contient (en ajustant x et soit y soit z).

Dans un premier mode de réalisation, le polymère HA-PBA-xRGD est greffé par un peptide RGD, et soit le polymère HA-fructose-yRGD, soit le polymère HA-gluconamide- zRGD est exempt de peptide RGD. Dans ce mode de réalisation, x est différent de 0 et soit y est 0, soit z est 0. c est alors égal à x/2.

Dans un deuxième mode de réalisation, soit le polymère HA-fructose-yRGD, soit le polymère HA-gluconamide-zRGD est greffé par un peptide RGD, et le polymère HA-PBA- xRGD est exempt de peptide RGD. Dans ce mode de réalisation, soit y, soit z est différent de 0 et x est 0. c est alors égal à y/2 lorsque le polymère b) est le polymère HA-fructose- yRGD, ou c est égal à z/2 lorsque le polymère b) est le polymère HA-gluconamide-zRGD.

Dans un troisième mode de réalisation, le polymère HA-PBA-xRGD est greffé par un peptide RGD, et soit le polymère HA-fructose-yRGD, soit le polymère HA-gluconamide- zRGD est greffé par un peptide RGD. Dans ce mode de réalisation, x et soit y soit z sont différents de 0. c est alors égal à (x+y)/2 lorsque le polymère b) est le polymère HA-fructose- yRGD, ou c est égal à (x+z)/2 lorsque le polymère b) est le polymère HA-gluconamide- zRGD.

Le plus souvent, la composition polymérique comprend une solution aqueuse. Elle se présente alors sous forme d’hydrogel.

La somme des concentrations de polymères HA-PBA-xRGD et HA-fructose-yRGD dans la solution aqueuse, ou bien la somme des concentrations de polymères HA-PBA- xRGD et HA-gluconamide-zRGD dans la solution aqueuse, est généralement comprise de 1 à 100 mg/mL, notamment de 2 à 50 mg/ml_, de préférence de 5 à 30 mg/ml_, de manière particulièrement préférée de 10 à 30 mg/mL.

Le pH de la solution aqueuse de la composition polymérique est généralement de 7,0 à 10,0, notamment de 7,0 à 9,0, de préférence de 7,0 à 8,0, de manière particulièrement préférée de 7,0 à 7,5.

La solution aqueuse est typiquement une solution tampon, par exemple un tampon phosphate salin (0,15 M NaCI) (dont le pH est de 7,4), du DPBS (tampon phosphate de Dulbecco), ou un milieu de culture cellulaire, qui est adapté en fonction du type de cellules de la composition polymérique, par exemple du milieu de culture DMEM (milieu minimum essentiel de Eagle) pour des fibroblastes.

L’affinité élevée des motifs saccharidiques du polymère HA-fructose-yRGD ou du polymère HA-gluconamide-zRGD pour le PBA du polymère HA-PBA-xRGD permet d’obtenir un comportement de type « gel » de la composition polymérique HA-PBA- xRGD/HA-fructose-yRGD ou HA-PBA-xRGD/HA-gluconamide-zRGD. Le comportement de type « gel » est déduit de mesures rhéologiques en mode dynamique et est défini par le fait que module de stockage (G’) est supérieur au module de perte (G”) sur toutes les fréquences de 0,01 à 10 Hz. Les propriétés rhéologiques de la composition polymérique sont peu impactées par la fonctionnalisation par un peptide RGD, et donc par les valeurs de x, y, z et c.

Le caractère dynamique des liaisons esters boronate entre les chaînes d’acide hyaluronique du polymère HA-PBA-xRGD et du polymère HA-fructose-yRGD ou HA- gluconamide-zRGD confère aux hydrogels un caractère auto-réparant. A titre illustratif, les hydrogels peuvent être injectés à travers une aiguille de petit diamètre (typiquement de diamètre de 0,1 à 0,4 mm) et récupérer rapidement ses propriétés mécaniques après l'injection. Lorsque le polymère est poussé dans l’aiguille d’une seringue, les liaisons réversibles formées entre le PBA du polymère HA-PBA-xRGD et les unités saccharide du polymère HA-fructose-yRGD ou HA-gluconamide-zRGD se cassent, puis se reforment une fois que le polymère est éjecté hors de l’aiguille. Le polymère est avantageusement malléable jusqu’à ce que les liaisons se reforment. En l’occurrence, avantageusement, la cinétique des réactions engagées est suffisamment lente pour permettre une mise en forme de la composition polymérique, et ce, de façon reproductible, et suffisamment rapide pour maintenir cette forme. Ceci rend la composition polymérique particulièrement adaptée pour des utilisations comme encre, notamment comme bio-encre, pour l’impression, notamment l’impression 3D, en particulier la bio-impression 3D, comme détaillé ci-après.

La composition polymérique peut comprendre des cellules, notamment des fibroblastes, par exemple des fibroblastes humains. Généralement, les cellules sont présentes à sa surface et/ou sont dispersées au sein de la composition polymérique. En ajustant la densité de peptide RGD (à savoir c, et donc x et soit y soit z), il est avantageusement possible de contrôler le comportement des cellules, en particulier le degré d’étalement et de prolifération des cellules dans la composition polymérique.

La composition polymérique peut comprendre un ou plusieurs agent(s) thérapeutique(s).

La composition polymérique peut comprendre en outre un alginate de sodium, qui est un polysaccharide capable de gélifier en présence d’ions calcium. Elle comprend alors un mélange de trois polymères : HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD/alginate de sodium ou HA-PBA-xRGD/HA-gluconamide-zRGD/alginate de sodium. La concentration en alginate de sodium dans la composition polymérique est généralement de 0,01 à 5,0% (m/v), de préférence de 0,1 à 2,0 % (m/v)). La présence d’alginate de sodium impacte peu les propriétés rhéologiques de la composition polymérique. Une telle composition polymérique est particulièrement adaptée comme bio-encre pour faire de l’impression, comme explicité ci-après. De telles compositions polymériques peuvent être mises en forme conjointement avec des cellules.

Selon un deuxième objet, l’invention concerne un procédé de préparation de la composition polymérique définie ci-dessus comprenant le mélange :

a) d’un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par de l’acide 3-aminophénylboronique, et

b) d’un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par du 1 -amino-1 -deoxy-D-fructose ou par le gluconamide

sous réserve qu’au moins un desdits polymères soit greffé par un peptide RGD, dans une solution aqueuse dont le pH est de 7,0 à 10,0, notamment de 7,0 à 9,0, de préférence de 7,0 à 8,0, de manière particulièrement préférée de 7,0 à 7,5.

Le mélange est donc effectué à un pH proche du pH physiologique.

Généralement, on mélange une solution aqueuse du polymère HA-PBA-xRGD et soit une solution aqueuse de HA-fructose-yRGD, soit une solution aqueuse de HA- gluconamide-zRGD.

Lorsque la composition polymérique à préparer contient des cellules, celles-ci peuvent être introduites dans la solution aqueuse du polymère HA-PBA-xRGD et/ou soit dans la solution aqueuse de HA-fructose-yRGD, soit dans la solution aqueuse de HA- gluconamide-zRGD avant leurs mélanges.

Le procédé de préparation quasi-instantané des compositions polymériques par simple mélange de polymères HA-PBA-xRGD et soit HA-fructose-yRGD, soit HA- gluconamide-zRGD, permet d’encapsuler facilement des cellules sans les endommager et sans qu’elles n’aient le temps de sédimenter. Les propriétés d’adhésion cellulaire des compositions polymériques peuvent facilement être modulées en fonction de la densité de peptide RGD de la composition polymérique (donc en fonction de c), qui dépend des densités de peptide RGD (x, y et z) des polymères HA-PBA-xRGD, HA-fructose-yRGD et HA-gluconamide-zRGD qu’elle contient. Il est ainsi possible de faire varier aisément la densité de peptide RGD dans la composition polymérique en adaptant x du HA-PBA-xRGD et soit y, soit z du HA-fructose-yRGD ou du HA-gluconamide-zRGD, ce qui est primordial pour contrôler le comportement des cellules de la composition polymérique.

Selon un troisième objet, l’invention concerne un kit comprenant :

a) un premier contenant comprenant un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par de l’acide 3-aminophénylboronique, et

b) un second contenant comprenant un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par du 1 -amino-1 -deoxy-D-fructose ou par le gluconamide, sous réserve qu’au moins un desdits polymères soit greffé par un peptide RGD.

Ce kit est adapté pour préparer la composition polymérique définie ci-dessus par mélange des deux polymères. Les modes de réalisations décrits ci-dessus sont applicables. Par exemple, le premier contenant peut comprendre en outre une solution aqueuse. De même, le second contenant peut comprendre en outre une solution aqueuse.

Selon un quatrième objet, l’invention concerne l’utilisation de la composition polymérique définie ci-dessus, pour la culture cellulaire, la transplantation de cellules ou la thérapie cellulaire.

Ces applications nécessitent que la composition polymérique contiennent des cellules ou qu’on en ajoute à celle-ci. Selon les cellules utilisées, l’une des compositions HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD ou HA-PBA-xRGD/HA-gluconamide-zRGD peut être plus adaptée que l’autre.

La réponse cellulaire des cellules des compositions polymériques selon l’invention est améliorée par rapport à celle de cellules de compositions polymériques obtenues à partir de compositions polymériques comprenant des polymères identiques excepté qu’ils ne sont pas greffés par un peptide RGD. Par exemple, les cellules s’étalent dans les compositions polymériques selon l’invention, alors qu’elles restent rondes dans des compositions polymériques comprenant des polymères identiques excepté qu’ils ne sont pas greffés par un peptide RGD.

La densité optimale en peptide RGD ( « c » défini ci-dessus, qui dépend de x et soit de y soit de z) de la composition polymérique dépend du type de cellules utilisées. En effet, la densité optimale de peptide RGD dans un hydrogel varie selon le type cellulaire. Il est donc particulièrement intéressant de disposer d’hydrogels avec des densités de peptide RGD modulables. Avantageusement, selon le type de cellules utilisées, la densité en peptide RGD « c » de la composition polymérique peut être adaptée au cas par cas, en ajustant simplement x et/ou soit y, soit z, pour optimiser le comportement cellulaire en fonction des cellules spécifiques utilisées.

Selon un cinquième objet, l’invention concerne l’utilisation de la composition polymérique définie ci-dessus, dans le mode de réalisation dans lequel elle comprend un alginate de sodium, comme encre, notamment comme bio-encre, pour l’impression, notamment l’impression 3D, en particulier la bio-impression 3D, ou pour l’ingénierie tissulaire.

En tant que constituant essentiel de la matrice extracellulaire, l'acide hyaluronique est un biopolymère de choix pour l’élaboration de modèles d’objets biologiques, comme des tissus, par bio-impression. Néanmoins, son utilisation à l’état de gel passe par sa réticulation. La méthode de réticulation classiquement utilisée en ingénierie tissulaire consiste à modifier l'acide hyaluronique par des groupements méthacrylates permettant sa gélification par irradiation UV. Toutefois, l'utilisation de la lumière UV peut être dommageable à la survie cellulaire. Au contraire, l’utilisation de la composition polymérique selon l’invention comme bio-encre ne requiert pas d’irradiation UV.

Selon un sixième objet, l’invention concerne une méthode de préparation d’un objet comprenant les étapes consistant à :

i) mettre en forme la composition polymérique telle que définie ci-dessus, notamment par extrusion, de préférence par une imprimante 3D,

ii) mettre en contact la composition polymérique mise en forme avec une solution aqueuse comprenant des ions calcium.

La méthode permet en particulier de préparer un objet ayant une forme géométrique définie grâce à une imprimante 3D.

Par « imprimante 3D », on entend un système permettant de déposer de manière programmée une quantité de composition polymérique en un point défini par ses coordonnées dans les trois dimensions de l’espace. L’imprimante 3D peut imprimer par extrusion, laser ou jet d’encre.

Une forte demande existe dans le domaine de la bio-impression pour des hydrogels imprimables biocompatibles et biodégradables, et également compatibles avec plusieurs modalités d’impression (extrusion, laser, jet d’encre, stéréolithographie). Pouvoir imprimer en 3D un objet à base d’hydrogel ayant une forme géométrique définie de manière automatisée à l’aide d’une imprimante est aujourd’hui un défi. C’est ce que l’on appelle la « bio-impression ». L’hydrogel est un élément clé dans les technologies de bio-impression, jouant non seulement un rôle structural dans la fabrication de l’objet mais également biologique, en transmettant des signaux biochimiques aux cellules afin qu’elles survivent et se développent dans l’objet formé. S’il existe actuellement plusieurs types de bio imprimantes disponibles sur le marché, le développement de la bio-impression se trouve néanmoins limité par le manque d’hydrogels biocompatibles, personnalisables et modifiables en fonction des tissus/organes visés et adaptés à la production à grande échelle. Les compositions polymériques selon l’invention permettent avantageusement de réaliser de la bio-impression et présentent tous les avantages recherchés.

L’étape de mise en forme par une imprimante 3D comprend typiquement le dépôt, couche par couche, de la composition polymérique (contenant de préférence des cellules).

La mise en contact de l’étape ii) est généralement effectuée par immersion de l’objet mis en forme dans une solution aqueuse comprenant des ions calcium. L’étape ii) permet d’obtenir l’objet. L’étape ii) conduit à la formation d’un réseau interpénétré doublement réticulé par des liaisons esters boronate entre les polymères HA-PBA-xRGD et HA- fructose-yRGD ou bien HA-PBA-xRGD et HA-gluconamide-zRGD, et par des réticulations ioniques de l’alginate de calcium. Les polymères HA-PBA-xRGD et soit HA-fructose-yRGD soit HA-gluconamide-zRGD permettent d'obtenir une haute fidélité d'impression, tandis que l’alginate de sodium est utilisé comme composant structurel, assurant à l’objet mis en forme une bonne stabilité mécanique.

Selon un septième objet, l’invention concerne un objet susceptible d’être obtenu par la méthode définie ci-dessus. L’invention concerne également un objet comprenant : a) un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par de l’acide 3-aminophénylboronique,

b) un polymère acide hyaluronique dont au moins une fonction carboxylate est greffée par du 1 -amino-1 -deoxy-D-fructose ou par du gluconamide,

sous réserve qu’au moins un desdits polymères a) et b) soit greffé par un peptide RGD, c) un alginate de calcium, et

d) éventuellement des cellules.

Cet objet peut notamment être un tissu, par exemple un tissu dermique, ou un organe.

Lorsque l’objet contient des cellules, avantageusement, leur viabilité cellulaire est élevée, la prolifération cellulaire est élevée et le degré d'étalement des cellules est élevé.

FIGURES

[Fig 1 ] La figure 1 représente le module élastique (G’) (symboles pleins) et le module visqueux (G”) (symboles vides) (en mode dynamique - en Pa) de trois compositions polymériques HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD sous forme d’hydrogels en fonction de la fréquence (en Hz). Les trois compositions polymériques HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD ont différentes densités c de peptides RGD :

- c = 0 mol%, x = 0 mol%, y = 0 mol% (polymères non greffés par des peptides RGD - comparatif) (ronds),

- c = 5 mol%, x = 5 mol%, y = 5 mol% (carrés),

- c = 12,5 mol%, x = 10 mol%, y = 15 mol% (triangles).

[Fig 2] La figure 2 représente le module élastique (G’) (symboles pleins) et le module visqueux (G”) (symboles vides) (en mode dynamique et en Pa) de deux compositions polymériques sous forme d’hydrogels :

- HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD (exempt d’alginate - triangles),

- HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD/alginate de sodium (étoiles),

chacune avec une densité de peptide RGD c = 12,5 mol%, x = 10 mol%, y = 15 mol%, en fonction de la fréquence (en Hz).

[Fig 3] La figure 3 fournit trois photographies de compositions polymériques HA- PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD/alginate de sodium dans du PBS mise en forme par extrusion :

- à la fin de l’étape de mise en forme par extrusion et avant l’étape d’immersion dans une solution aqueuse de CaCh (images A et B), et

- lors de la mise en contact avec une solution aqueuse de CaCh (image C).

[Fig 4] La figure 4 représente le module élastique (G’) (symboles pleins) et le module visqueux (G”) (symboles vides) (en mode dynamique et en Pa) :

- d’une composition polymérique HA-PBA/HA-glucose (exempt de groupes RGD et exempt d’alginate - symboles gris),

- de l’acide hyaluronique (non modifié) (symboles noirs),

en fonction de la fréquence (en Hz).

EXEMPLES

Exemple 1 : Préparation de composition polymériques

1 .1 . Synthèse du polymère HA-gluconamide-zRGD (avec z = 0)

A une solution de Boc-1 -amino-DOOA (0,1 13 g, 0,45 mmol) dans du DMF (25 mL), une solution de D-glucono-1 ,5-lactone (0,081 g, 0,45 mmol) dans du DMF (20 mL) est ajoutée goutte à goutte pendant environ 3 h. Après agitation pendant une nuit à température ambiante, le solvant est évaporé sous pression réduite et le sirop transparent résultant est séché dans une étuve sous vide (60 mbars, 40 °C) afin d’obtenir le Boc-1 -amino-DOOA- gluconamide (0,178 g, 92 %).

RMN ¹ H (400 MHz, D20, 25 °C) du Boc-1 -amino-DOOA-gluconamide: 5H (ppm) 4,35 (1 H, H2), 4,15 (1 H, H3), 3,88 à 3,72 (10H, H4-H6 et Hb-Hd), 3,65 (2H, He), 3,55 (2H, Ha), 3,32 (2H, Ht), 1 ,5 (9H, Hg).

L'élimination du groupe protecteur Boc est ensuite réalisée par traitement acide du Boc-1 -amino-DOOA-gluconamide (0,055 g, 0,13 mmol) dans du TFA (0,6 mL, 7,77 mmol) pendant 5 min à température ambiante. Le milieu réactionnel est neutralisé par addition de NaOH 1 M goutte à goutte, à une température entre 0-4 °C, et le solvant est ensuite éliminé sous pression réduite. La déprotection complète du groupe amine permettant d’obtenir le 1 -amino-DOOA-gluconamide est confirmée par analyse RMN ¹ H.

Le HA-gluconamide-zRGD est ensuite synthétisé par une réaction d’amidation entre le HA (grade pharmaceutique, d’origine non-animale, fourni par CONTIPRO, M _w = 400-500 kg/mol) et le 1 -amino-DOOA-gluconamide, en utilisant le DMTMM (chlorure de 4-(4,6- Dimethoxy-1 ,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium) comme un agent de couplage. La réaction consiste à ajouter le DMTMM à une solution de HA dans un mélange eau/DMF (3/2, v/v). Après 15 min d'agitation à température ambiante, le 1 -amino-DOOA-gluconamide est ajouté, le pH du milieu réactionnel est ajusté à 6,5 avec une solution de NaOH 0,5 M et la réaction est laissée sous agitation pendant 65 h à température ambiante. Une fois la réaction terminée, le conjugué HA-gluconamide-zRGD (avec z = 0) est purifié par diafiltration et le produit est récupéré par lyophilisation.

Selon ces conditions, le HA-gluconamide-zRGD (avec z = 0) est obtenu avec un Degré de Substitution (DS) de 10 mol% déterminé par analyse RMN ¹³ C et à partir de la cinétique de réaction (Tableau 1 ). Cette méthode consiste à quantifier le taux d’amines primaires libres dans le milieu réactionnel en fonction du temps en utilisant le réactif TNBS (acide 2,4,6-trinitrobenzenesulfonique). [Chem 1 ]

HO H oc- -am no- Goutte à goutte HO, _in 7

(3 h + 1 nuit)

DMF, t.a. Boc-1 -amino-DOOA-gluconamide

HA-gluconamide

Schéma 1 : Schéma réactionnel illustrant la synthèse du polymère HA-gluconamide-zRGD (avec z = 0).

1.2. Synthèses des polymères HA-PBA-xRGD (avec x = 0) et HA-fructose-yRGD (avec y = 0)

Les polymères HA-PBA-xRGD (avec x = 0) et HA-fructose-yRGD (avec y = 0) (Schéma 2) sont respectivement synthétisés par une réaction de couplage peptidique entre le HA et GARBA (acide 3-aminophénylboronique) ou la fructosamine (1 -amino-1 -deoxy-D- fructose), contenant des groupements amines primaires libres. Pour cela, GARBA ou la fructosamine sont ajoutés à un mélange eau/DMF (3/2, v/v) contenant du DMTMM et du HA selon les conditions du tableau 1 , et le pH est ajusté à 6,5 avec une solution de NaOH 0,5 M. Après agitation pendant 24 h à température ambiante, les polymères sont purifiés par diafiltration et les produits sont récupérés par lyophilisation. Cette procédure permet de synthétiser des HA-PBA-xRGD (avec x = 0) et HA-fructose-yRGD (avec y = 0) avec un DS de 15 mol% déterminé par analyse RMN ¹ H ou à partir de la cinétique de réaction en utilisant le TNBS (Tableau 1 ).

[Chem 2]

HA-PBA HA-fructose

Schéma 2 : Structures chimiques des polymères HA-PBA-xRGD avec x = 0 et HA- fructoseyRGD avec y = 0.

[Tableau 1]

aDS déterminé par RMN ¹ H (10 mol% de précision).

bDS estimé à partir de la cinétique de réaction en utilisant le TNBS.

^C DS déterminé par RMN ¹³ C (20 mol% de précision).

Tableau 1 : Conditions de réaction et DS pour les polymères HA-PBA-xRGD, HA-fructose- yRGD et HA-gluconamide-zRGD. 1.3. Synthèse des polymères HA-PBA-xRGD avec x ¹ 0, HA-fructose-yRGD avec y ¹ 0 et HA-gluconamide-zRGD avec z ¹ 0

Les polymères HA-PBA-xRGD, HA-fructose-yRGD et HA-gluconamide-zRGD sont synthétisés par couplage peptidique à partir de peptides RGD (contenant une fonction amine primaire) à l’aide de l’agent de couplage DMTMM (Schéma 3). Pour cela, le peptide GRGDS utilisé comme exemple est ajouté dans une solution d’eau/DMF (3/2, v/v) contenant le DMTMM et le polymère HA-PBA-xRGD avec x = 0, le polymère HA-fructose- yRGD avec y = 0 ou le polymère HA-gluconamide-zRGD avec z = 0 préalablement solubilisé (tableau 2). Le pH du milieu réactionnel est ajusté à 6,5 par l’ajout d’une solution de NaOH 0,5 M et la réaction est laissée sous agitation à température ambiante pendant 24-30h. Une fois la réaction terminée, les polymères HA-PBA-xRGD, HA-fructose-yRGD et HA-gluconamide-zRGD sont purifiés par diafiltration et les polymères sont récupérés par lyophilisation.

La méthode décrite ci-dessus permet de contrôler le taux de greffage de peptides RGD sur les polymères, de manière à obtenir des valeurs de x, y et z compris entre 1 et 30 mol% déterminés par RMN ¹ H et également à partir de la cinétique de réaction en utilisant le TNBS (Tableau 2).

[Chem 3]

-g uconam e-

Schéma 3 : Schéma réactionnel illustrant la synthèse des polymères HA-PBA-xRGD, HA- fructose-yRGD et HA-gluconamide-zRGD par greffage du peptide GRGDS.

[Tableau 2]

Rapport Rapport molaire

molaire DMTMM/HA

x, y ou z Couplage Rendement

Polymère RGD- (mol%) (%) (%)

NH2/

DMTMM

HA-PBA-xRGD,

HA-fructose- yRGD ou

0,5 0,02-0,06 1 -30 ^{a b} 50-70 >80

HA- gluconamide- zRGD ^a x, y ou z déterminé par RMN ¹ H (10 mol% de précision).

b x, y ou z estimé à partir de la cinétique de réaction en utilisant le TNBS.

Tableau 2 : Conditions de réaction pour les synthèses des polymères HA-PBA-xRGD, HA- fructose-yRGD et HA-gluconamide-zRGD.

1 .4. Préparation d’une composition polymérique comprenant des cellules pour la culture cellulaire

Les polymères HA-PBA-xRGD, HA-fructose-yRGD ou HA-gluconamide-zRGD sont solubilisés à 15 g/L dans du DPBS (Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline) sous agitation pendant 2-4h.

Les compositions polymériques utiles pour la culture cellulaire sont préparées comme suit. La solution aqueuse de HA-PBA-xRGD est d’abord déposée dans des inserts placés dans des plaques de culture 24 puits.

Une solution aqueuse de HA-fructose-yRGD ensemencée avec des cellules est préparée. Une solution aqueuse de HA-gluconamide-zRGD ensemencée avec des cellules est préparée.

Ensuite, les compositions polymériques comprenant des cellules (concentration totale de polysaccharide = 15 g/L; rapport molaire PBA/saccharide = 1/1 ) sont directement formées dans chaque puits par l’ajout d’une solution aqueuse de HA-fructose-yRGD ou de HA-gluconamide-zRGD ensemencée avec des cellules. Le mélange des polymères HA- PBA-xRGD et HA-fructose-yRGD, ou bien des polymères HA-PBA-xRGD et HA- gluconamide-zRGD au sein de chaque puits conduit à la formation de la composition polymérique sous forme d’hydrogel.

1 .5. Préparation d’une composition polymérique comprenant de l’alginate de sodium et des cellules pour la bio-impression

L’alginate provient de Alfa Aesar (A18565).

Des solutions :

- de polymère HA-PBA-xRGD contenant de l’alginate de sodium,

- de polymère HA-fructose-yRGD contenant de l’alginate de sodium,

- de polymère HA-gluconamide-zRGD contenant de l’alginate de sodium,

ont été préparées par agitation pendant 2-4h dans du DPBS (Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline) ou dans du milieu de culture DMEM (concentration de polysaccharide entre 10-30 g/L). Les solutions ont une concentration finale en alginate de sodium entre 0,1 et 2,0 % (m/v)). Une fois les cellules ensemencées dans la solution du polymère HA-fructose-yRGD ou dans la solution du polymère HA-gluconamide-zRGD, les compositions polymériques HA-PBA-xRGD/ HA-fructose-yRGD / alginate de sodium ou bien HA-PBA-xRGD/ HA- gluconamide-zRGD / alginate de sodium (concentration totale de polysaccharide = 10-30 g/L; rapport molaire PBA/fructosamine ou rapport molaire PBA/ gluconamide = 1 /1 ou 1 /2 ou 2/1 ) utiles comme bioencres sont directement formées dans des cartouches pour l’extrusion.

1 .6. Comportement rhéologique en mode dynamique selon les densités de peptide RGD c, x, y et z.

Le comportement rhéologique des différentes compositions polymériques sous forme d’hydrogels a été étudié avec un rhéomètre à plateaux coniques (AR2000EX de TA Instruments). Toutes les mesures rhéologiques en mode dynamique ont été vérifiées en fonction de la déformation pour s'assurer que les expériences ont été effectuées dans la région viscoélastique linéaire. Un cône possédant un diamètre de 2 cm et un angle de 4° a été utilisé pour les échantillons viscoélastiques. Pour éviter l’évaporation de l’eau, le système de mesure a été entouré d’une huile silicone à faible viscosité (50 mPa.s) soigneusement ajoutée aux bords du cône.

[Fig 1 ] La figure 1 fournit les module élastique (G’) et module visqueux (G”) de trois compositions polymériques HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD sous forme d’hydrogel, avec des nombres de moles moyen de peptides RGD pour 100 unités disaccharide de répétition de l’acide hyaluronique :

- c = 0 mol%, x = 0 mol% et y = 0 mol% (comparatif, composition polymérique dont les deux polymères sont exempts de RGD)

- c = 5 mol%, x = 5 mol%, y = 5 mol%, ou

- c = 12,5 mol%, x = 10 mol%, y = 15 mol%.

[Fig 1 ] La figure 1 montre que les densités de peptide RGD (donc c, x, y et z) impactent très peu le comportement rhéologique de la composition polymérique.

1 .7. Comportement rhéologique en mode dynamique en l’absence et en présence d’alginate de sodium

La méthode de mesure est identique à celle du paragraphe précédent.

[Fig 2] La figure 2 fournit les module élastique (G’) et module visqueux (G”) de deux compositions polymériques sous forme d’hydrogel :

- HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD/alginate de sodium,

- HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD, avec dans les deux cas c = 12,5 mol%, x = 10 mol% et y = 15 mol%.

La présence d’alginate impacte peu les propriétés rhéologiques des compositions polymériques sous forme d’hydrogel.

Exemple 2 : Etalement de fibroblastes (MEF) dans des hydrogels possédant différentes densités de peptides RGD (c= 0 mol%, 5,0 mol% ou 12,5 mol%)

L’étalement de fibroblastes (MEF) a été déterminé en réalisant des images microscopiques de fibroblastes ensemencés dans les hydrogels HA-PBA-xRGD/HA- fructose-yRGD après 7 jours de culture cellulaire à 37 °C (marquage des cellules vivantes à la calcéine).

Dans la composition polymérique comparative exempte de RGD (c = x = y = 0, ou bien c = x = z = 0), les cellules observées par microscopie confocale étaient rondes. Au contraire, dans la composition polymérique selon l’invention (avec une composition polymérique dans laquelle c= 5 mol%, x = 5 mol% et y = 5 mol% et une composition polymérique dans laquelle c = 12,5 mol%, x = 10 mol% et y = 15 mol%, les images de microscopie confocale ont montré que les cellules ont proliféré et s’allongent, ce qui démontre l’adhésion et l’étalement des fibroblastes en 3D.

Exemple 3 : Impression en utilisant la composition polymérique comme encre par la technique d’extrusion

3.1 . Préparation d’objets imprimés

La composition polymérique sous forme d’hydrogel de l’exemple 1 .4 formée dans des cartouches pour l’extrusion a été extrudée à travers une aiguille de diamètre de 0,2 mm pour former des objets extrudés ([Fig 3] figure 3, images A et B). Les objets extrudés ont été immergés dans une solution aqueuse contenant du CaCh à 0,5 %(m/v) ([Fig 3] figure 3, image C)

3.2. Viabilité cellulaire dans les objets imprimés

La viabilité cellulaire avant et après impression de fibroblastes (NIH-3T3 eGFP) ensemencés dans les compositions polymériques sous forme d’hydrogels (bio-encres) après 7 jours de culture cellulaire à 37 °C a été testée avant et après impression (test Live- Dead réalisé à l’aide d’un microscope d’épi-fluorescence pour le comptage des cellules : marquage des cellules vivantes à la calcéine et des cellules mortes à l’iodure de propidium). [Tableau 3]

Tableau 3 : Viabilité cellulaire (%) de fibroblastes (NIH-3T3 eGFP) à J7 dans la composition polymérique sous forme d’hydrogel avant impression et dans l’objet mis en forme 5.3. Adhésion/étalement des fibroblastes dans les objets imprimés

L’étalement de fibroblastes humains a été déterminé en réalisant des images microscopiques en épi-fluorescence de fibroblastes humains dans les objets imprimés HA- PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD/alginate de calcium obtenus à partir des compositions polymériques sous forme d’hydrogels HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD/alginate de sodium dans lesquelles les fibroblastes ont été ensemencés après 7 jours de culture cellulaire à 37 °C (marquage des cellules vivantes à la calcéine).

Dans l’objet obtenu à partir de la composition polymérique comparative exempte de RGD (HA-PBA-xRGD/HA-fructose-yRGD/alginate de calcium avec c = x = y = 0, ou bien HA-PBA-xRGD/HA-gluconamide-zRGD/alginate de calcium avec c = x = z = 0), les cellules observées par microscopie en épi-fluorescence étaient rondes.

Au contraire, dans l’objet obtenu à partir de la composition polymérique selon l’invention (à partir d’une composition polymérique dans laquelle c= 5 mol%, x = 5 % et y = 5 mol% et à partir d’une composition polymérique dans laquelle c = 12,5 mol%, x = 10 mol% et y = 15 mol%), les images ont montré l’adhésion et l’étalement les fibroblastes en 3D.